EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CEPAS ÁCIDO LÁCTICAS COMERCIALES, SOBRE BACTERIAS CAUSANTES DE MASTITIS BOVINA

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EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CEPAS ÁCIDO LÁCTICAS COMERCIALES, SOBRE BACTERIAS CAUSANTES DE MASTITIS BOVINA.

Agudelo García, Eider1, Gutiérrez Ramírez, Luz Adriana2*, Bedoya Mejía, Oswaldo3, Montoya

Campuzano, Olga Inés4

1Ingeniero Biológico, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín;

ehagudelog@unal.edu.co

2*Docente Corporación Universitaria Lasallista; lugutierrez@lasallistadocentes.edu.co

3Docente Corporación Universitaria Lasallista; osbedoya@lasallistadocentes.edu.co

4Docente Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín; oimontoy@unal.edu.co

Resumen

La mastitis es una inflamación de la glándula mamaria, que produce cambios en el tejido glandular y en la composición bioquímica de la leche, como resultado de infecciones bacterianas, generalmente. Muchos microorganismos se han identificado en distintos casos de mastitis bovina, pero géneros como Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus

presentan mayor incidencia y hasta ahora se han considerado resistentes a una gran variedad de antibióticos. Desde hace algún tiempo se utilizan las bacterias ácido lácticas (BAL), como conservantes de alimentos, porque producen sustancias antimicrobianas como el ácido láctico, el etanol y péptidos denominados bacteriocinas, entre otras, las cuales inhiben el desarrollo de un gran número de bacterias patógenas. El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad antimicrobiana de cepas ácido lácticas comerciales, sobre bacterias causantes de mastitis bovina, de manera in vitro, y proponer algunas pruebas de campo con las BAL que presenten mejor potencial antimicrobiano. Para esto, se implementó el método de difusión en agar, inoculando con un hisopo la cepa de estudio en cajas de Petri con agar Müeller-Hinton, por el método de agotamiento en superficie, y luego depositando discos impregnados del sobrenadante del cultivo líquido de la BAL. Los resultados mostraron halos de inhibición de 5mm producidos por el sobrenadante de

Lactococcus lactis sobre E. coli, pero muy poca actividad sobre S. agalactiae.

Palabras clave: Mastitis subclínica, S. agalactiae, S. aureus, E. coli, BAL, bacteriocinas, método de difusión en agar.

Abstract

Mastitis is an inflammation of the mammary gland, which produces changes in the glandular tissue and the biochemical composition of milk, generally as a result of bacterial infections. Many microorganisms have been identified in various cases of bovine mastitis, but strains such as Streptococcus agalactiae and Staphylococcus aureus have a higher incidence and so far have been considered resistant to a variety of antibiotics. For some time the lactic acid bacteria (LAB) are used as food preservatives because they produce antimicrobial

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substances such as lactic acid, ethanol and peptides called bacteriocins, among others, which inhibit the development of a large number of pathogenic bacteria. The objective of this research was to evaluate the antimicrobial activity of commercial lactic acid strains on bovine mastitis causing bacteria, in vitro, and propose some field tests with BAL presenting better antimicrobial potential. For this, the diffusion method was implemented in agar, inoculating with a swab the strain to be studied in petri dishes with Mueller-Hinton agar, by the surface exhausting method and then depositing discs impregnated with the supernatant liquid culture of BAL. The results showed inhibition halos of 5mm produced by the supernatant of

Lactococcus lactis on E. coli, but very little activity on S. agalactiae.

Keywords: Subclinical Mastitis, S. agalactiae, S. aureus, E. coli, BAL.

I. Introducción

La mastitis se define como una inflamación de la glándula mamaria, que produce cambios en el tejido glandular y en la composición bioquímica de la leche, cuya causa más frecuente son las infecciones bacterianas. Con base a los síntomas de la enfermedad, la mastitis bovina puede clasificarse como clínica o subclínica; la tipo clínica se detecta por hinchazón, dolor y enrojecimiento de la ubre, presencia de bacterias en ella, coágulos y/o grumos en la leche, dándole una apariencia anormal, alterando su contenido y rendimiento; y en algunos casos, puede haber un aumento de la temperatura rectal, letargo, anorexia e incluso la muerte del animal (Bedolla y Ponce, 2008).

En la mastitis subclínica hay una inflamación de la glándula mamaria, sin cambios evidentes en la leche o la ubre.

Sin embargo, aunque estas son

aparentemente normales, las vacas

infectadas producen menos leche y de menor calidad. Adicionalmente, pueden ser una fuente de infección para otros animales en el hato. Debido a que no hay anormalidades visibles en la leche, esta

infección requiere de pruebas de

diagnóstico especiales para su detección,

siendo la prueba más común el recuento de células somáticas, que revela cambios en la leche debido al proceso inflamatorio, mientras más alto sea el recuento, mayor es el nivel de inflamación en el tejido. Existe la prueba California Mastitis Test (CMT) que permite realizar un recuento de manera rápida. Otra prueba sería medir la

conductividad eléctrica de la leche

(National Mastitis Council, 2013).

En los Estados Unidos, las

pérdidas económicas debido a la mastitis de cualquier tipo, son de 200 dólares por vaca al año, en promedio, y las mermas en la producción de leche pueden variar desde 0 hasta 902 kg, en los 305 días de lactancia bovina. Además, se aumentan los costos laborales, los honorarios veterinarios, los tratamientos médicos, y el riesgo de sacrificio y muerte (Boujenane et al., 2015). Muchos estudios realizados en países productores de leche, como Israel, Francia, entre otros, han mostrado que un 50% de todas las vacas padecen mastitis,

principalmente subclínica, con una

frecuencia de 20 a 50 veces superior a la mastitis clínica. En los hatos de ganado lechero de Escocia, el costo medio anual por este tipo de mastitis es de 100 libras esterlinas por vaca, mientras que en el Reino Unido y los Países Bajos, las

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calculadas entre 42 y 84 libras esterlinas (Bedolla y Ponce, 2008).

En Colombia, en el Altiplano Cundiboyacense, se hizo un estudio que diagnosticó a 2.854 vacas y se encontró que el 35% de los cuartos mamarios fueron positivos para mastitis clínica, con una disminución en la producción de la leche de 1,4 litros al día, lo que equivale a una pérdida de $337.000 por lactancia de 300 días, por cada vaca. En otro estudio se reportó una prevalencia del 33,9% de mastitis subclínica en vacas lecheras del municipio de San Pedro de los Milagros, Antioquia (Trujillo et al., 2011).

Más de 130 microorganismos se han identificado en distintos casos de mastitis bovina, pero de acuerdo a la fuente de origen de la infección, existe una mayor incidencia de ciertos géneros. Así, si la fuente es ambiental, los más

comunes son Escherichia coli,

Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis y Streptococcus uberis, y en el caso de contagio directo entre vacas

prevalece, Staphylococcus aureus,

Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Trueperella pyogenes y

Mycoplasma spp. Además, levaduras tales como Candida spp., se han encontrado en casos aislados en zonas de gran humedad (Cantekin et al., 2015).

Los géneros Streptococcus

agalactiae y Staphylococcus aureus, son bacterias patógenas que pueden vivir en la piel de los pezones y en el interior de la ubre, por poseer propiedades que les permiten sobrevivir y colonizar esos lugares. S. aureus contiene polisacáridos y proteínas de adhesión en la superficie celular, los cuales le conceden una

habilidad especial para construir y

mantener biopelículas en los tejidos del

huésped, logrando superar una amplia gama de circunstancias adversas, como la acción de células de defensa del huésped, escasez de nutrientes, acidez, entre otras (He et al., 2014). Por su parte, S. agalactiae puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo dentro de la glándula mamaria, sin que se presenten síntomas, y transmitirse a las vacas saludables por la falta de higiene en el ordeño (İkiz et al.,

2013). Ambas bacterias, son los

principales patógenos que causan la

mastitis subclínica. En cambio,

Escherichia coli, Streptococcus uberis y

Klebsiella spp., se encuentran por lo general, en el suelo, en los alimentos y en el ambiente en que habitan los bovinos, y el hecho de que se les involucre con los casos de mastitis, refleja una mala higiene en las instalaciones y en el cuidado de los animales.

Para el tratamiento de la mastitis de origen microbiano, se ha utilizado una extensa gama de antibióticos, pero el uso indebido y exagerado provocó la aparición de cepas bacterianas resistentes a estos medicamentos, lo que ha generado gran preocupación en los últimos años (İkiz et al., 2013). Por lo tanto, se han buscado nuevas técnicas y terapias que no involucren el uso de antibióticos sintéticos, pero que sean efectivas contra la enfermedad. Una opción oportuna y rentable, es el uso de microorganismos probióticos que confieren un beneficio a la salud del huésped cuando se los administra en cantidades adecuadas. La mayoría de ellos pertenecen a los géneros

Lactobacillus, Streptococcus o

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antimicrobianas como: el ácido láctico, el

etanol, péptidos denominados

bacteriocinas, entre otras, que actúan sobre un gran número de bacterias

patógenas, ya sea inhibiéndolas o

destruyéndolas (Agudelo, 2013).

El género Lactococcus produce

bacteriocinas como la nisina,

lactococcinas y diplococcinas, las cuales son de gran importancia industrial, por su acción bactericida, y una de las especies con mayor capacidad antibacteriana es

Lactococcus lactis (Ajunwa et al., 2014). En estudios relacionados con esta

especie, se han identificado varias

lactococcinas con buena acción

antibacteriana, además, de los

mecanismos de expresión génica (Vukotic

et al., 2015). La nisina es la única bacteriocina que ha sido aprobada para uso alimentario en más de 50 países (Lee

et al., 2013), ya que es sensible a la

α-quimotripsina, es estable al calor y a pH bajos, y no es tóxica (Kumar et al., 2012).

Por otra parte, la especie

Lactobacillus rhamnosus produce bacteriocinas termoestables, de bajo peso molecular, que pertenecen a la clase II. Las bacteriocinas de esta clase afectan a las bacterias mediante la formación de poros en la membrana citoplasmática, la cual al permeabilizarse, genera una pérdida de moléculas de ATP que perturba la fuerza motriz de protones y, finalmente, produce la muerte celular (Yue et al., 2013), lo cual le brinda la capacidad de

inhibir varios patógenos potenciales

(Coman et al., 2014).

A diferencia de la mayoría de los

antibióticos, que son metabolitos

secundarios, las bacteriocinas son

sintetizadas en los ribosomas y son sensibles a las proteasas, además,

generalmente, son inofensivas para el huésped (Yang et al., 2014). Por lo

anterior, son los metabolitos más

estudiados en las últimas tres décadas, en la comunidad científica y en la industria, y

se han desarrollado diversas

investigaciones sobre su detección,

producción, forma de acción, propiedades bactericidas y microorganismos inhibidos o sensibles a ellas (Agudelo, 2013).

De esta manera, las BAL usadas como probióticos, son buenas candidatas en la implementación de nuevas técnicas para el tratamiento de la mastitis, pues podrían ser inyectadas en los cuartos de la ubre, un ambiente donde pueden vivir diversos microorganismos, especialmente BAL, y evaluar si hay una inhibición de las bacterias relacionadas con la enfermedad.

El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad antimicrobiana de cepas ácido lácticas comerciales, sobre bacterias causantes de mastitis bovina, y de acuerdo con los resultados obtenidos, proponer una evaluación in vivo de las cepas que presenten mejor potencial antimicrobiano.

II. Materiales y Métodos

Cepas. BAL: Lactococcus lactis y

Lactobacillus rhamnosus. Como cepas patógenas se utilizaron: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y

Escherichia coli ATCC 8739. S. agalactiae, aislada de una bovina enferma, fue donada por el Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Antioquia, Colombia.

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rhamnosus, se reactivaron en los caldos: Cerebro Corazón (BHI), MRS y M17, se incubaron a 37 °C durante 3 días en

cámara de anaerobiosis. Luego se

inocularon en cajas de Petri con agar MRS y M17, por el método de agotamiento en superficie, y se incubaron bajo las mismas condiciones.

Las cepas patógenas se

reactivaron en caldo BHI, a 37 °C por 48 horas. Después cada una se inoculó en

los respectivos medios de cultivo

selectivos sólidos, así: Staphylococcus aureus en Baird-Parker; Streptococcus agalactiae en sangre y Escherichia coli en

MacConkey, por el método de

agotamiento en superficie. Se incubaron a 37 °C durante 24 horas y luego se procedió a hacer coloración de Gram y otras pruebas de rigor para cada una de ellas, para corroborar la pureza de las cepas.

Preparación de cepas para el ensayo. Lactococcus lactis se cultivó en caldo M17, a 37 °C durante 72 horas, en condiciones de anaerobiosis. Lactobacillus rhamnosus se cultivó en caldo MRS, a 37 °C durante 72 horas, en anaerobiosis.

S. aureus y E. coli se cultivaron en agar nutritivo y S. agalactiae, por ser altamente exigente, en agar sangre a 37 °C durante 24 horas.

Preparación de inóculos de acuerdo al patrón de McFarland de 0,5.

Para cada cepa patógena cultivada previamente en agar nutritivo y agar sangre, se procedió a tomar con un asa estéril varias de las colonias formadas para depositarlas en un frasco con

solución salina estéril y luego se

homogeneizó con un agitador tipo vórtex; lo anterior se repitió hasta obtener una

turbidez similar a la del patrón de McFarland de 0,5, que equivale a una concentración de 1,5 x 108 bacterias/mL,

aproximadamente. De esta manera se obtuvieron 3 patrones de turbidez, uno de cada cepa patógena.

Obtención del sobrenadante. Los cultivos de Lactococcus lactis en caldo M17, y Lactobacillus rhamnosus en caldo MRS, se vertieron, individualmente, en tubos Falcon estériles de 15 mL y se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos, a una temperatura de 4 °C.

Antibiograma. Se implementó el Método Kirby-Bauer o Método de difusión en agar, utilizando agar Müeller-Hinton en caja de Petri. De la solución patrón de cada cepa de estudio (S. aureus, S. agalactiae y E. coli), se tomó con un hisopo de algodón estéril y se inoculó por el método de agotamiento en superficie sobre el agar Müeller-Hinton, en tres direcciones distintas en ángulo de 60°,

hasta quedar completamente

homogeneizado. Luego se depositaron 3 discos equidistantes; en un extremo equidistante se depositó 1 disco como control negativo, y en la parte inferior (derecha e izquierda) se depositaron los

otros 2 discos, los cuales fueron

impregnados del sobrenadante del cultivo líquido de la BAL a evaluar. Este procedimiento se hizo por duplicado.Cada cultivo se llevó a una nevera a 4 °C, durante 1 hora, y posteriormente se incubó a 37 °C durante 24 - 48 horas. Pasado este tiempo, se analizó la presencia o ausencia de halos de inhibición de crecimiento, alrededor de los discos impregnados (Forbes et al., 2009).

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discos, fueron realizados en una cámara de bioseguridad de flujo vertical, para garantizar las condiciones requeridas de asepsia.

III. Resultados

Reactivación de cepas. Para comprobar la pureza de las cepas de estudio, se procedió a reactivar cada una de ellas en caldo BHI, M17 y MRS, los dos últimos exclusivamente para las BAL. A todas las cepas inoculadas en caldo BHI, se les observó las características de cultivo, que fue una turbidez uniforme, con sedimentación moderada en el fondo del medio de cultivo. En el caldo M17 y MRS, se observó una turbidez uniforme y sedimentación en ambos medios. Sin

embargo, Lactococcus lactis presentó mayor turbidez y sedimentación en el medio de cultivo M17, en comparación con el crecimiento en el caldo MRS.

Posteriormente, L. lactis se inoculó en agar M17 y MRS. En el primero se observó colonias de tamaño mediano, circulares, de color blanco, de bordes

lisos, convexas y con consistencia

cremosa, en el segundo se observó

colonias un poco más pequeñas,

circulares, de color blanco brillante, de bordes lisos, convexas y con consistencia cremosa,figura 1.

L. rhamnosus se inoculó en los mismos medios de cultivo, y en ellos se observó colonias pequeñas, circulares, de color blanco brillante, de bordes lisos, convexas y con consistencia cremosa.

Figura 1. A: Lactococcus lactis en M17. B: Lactococcus lactis en MRS.

El crecimiento de las cepas

patógenas, en los medios de cultivo, fue así: S. aureus, en el medio de cultivo

Baird-Parker, se observó colonias

pequeñas, circulares, de color negro

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bordes lisos, convexas y con consistencia

cremosa, y alrededor un halo

transparente. E. coli en agar MacConkey, creció formando colonias pequeñas, de forma irregular, de color rosado brillante,

de bordes lisos, convexas y con

consistencia cremosa.

Preparación de cepas para el ensayo. Las cepas de S. aureus y E. coli

se inocularon en agar nutritivo, la primera

creció formando colonias pequeñas,

circulares, blanquecinas, de bordes lisos, convexas y con consistencia cremosa. E. coli creció formando colonias medianas,

circulares, de color blanquecino

translúcido, de bordes ondulados,

convexas y con consistencia cremosa. S. agalactiae, por ser altamente exigente, se inoculó en agar sangre, y mostró el crecimiento descrito anteriormente.

El comportamiento de las BAL inoculadas en caldos, a 37 °C durante 72 horas antes, fue así: L. lactis en el caldo

M17, presentó turbidez uniforme y

sedimentación en el fondo del medio. L. rhamnosus en el caldo MRS, presentó un crecimiento uniforme con sedimentación.

Antibiograma con sobrenadante de Lactococcus lactis vs cepas patógenas. Llevado a cabo el procedimiento descrito en la metodología para la realización del antibiograma, se determinó la ausencia o presencia de halos de inhibición alrededor de los discos impregnados del sobrenadante, después de 24 - 48 horas de incubación. En la figura 2 (A y B), se puede observar el comportamiento del sobrenadante de L. lactis sobre Staphylococcus aureus, no se formó ningún halo de inhibición.

Figura 2. A: Antibiograma. Sobrenadante de L. lactis vs. Staphylococcus aureus. B: Duplicado.

En la figura 3 (A y B) no se observa ningún halo de inhibición del sobrenadante de L. lactis sobre Streptococcus

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Figura 3. A: Antibiograma. Sobrenadante de L. lactis vs. Streptococcus agalactiae. B: Duplicado.

En la figura 4 (A) se observan

claramente la formación de halos de

inhibición alrededor de los discos

impregnados con el sobrenadante de L. lactis sobre Escherichia coli.

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En la figura 5 se observa que el tamaño de los halos de inhibición, del

sobrenadante de L. lactis sobre E. coli, era de aproximadamente 5mm.

Figura 5. Medición del halo de inhibición del sobrenadante de L. lactis, sobre E. coli.

Por el crecimiento que presentó S. agalactiae, alrededor de los discos impregnados con el sobrenadante de L.

lactis, se procedió a realizar tinciones de Gram a las colonias que crecieron tanto cerca como lejos de los discos, figura 6.

Figura 6. A: Tinción de Gram de S. agalactiae, alrededor de los discos con sobrenadante de

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Antibiograma con sobrenadante de Lactobacillus rhamnosus vs cepas patógenas. Se implementó el mismo

procedimiento mencionado en la

metodología y se analizó el efecto del

sobrenadante de la BAL. En la figura 7 (A y B), no se observa formación de halos alrededor de los discos impregnados con sobrenadante de L. rhamnosus, el S. aureus creció en todo el medio de cultivo.

Figura 7. A: Antibiograma. Sobrenadante de L. rhamnosus vs. Staphylococcus aureus. B: Duplicado.

En la figura 8 (A y B) se aprecia que no hubo presencia de halos de

inhibición alrededor de los discos

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Figura 8. A: Antibiograma. Sobrenadante de L. rhamnosus vs. Streptococcus agalactiae. B: Duplicado.

En la figura 9 (A y B) se observa que no hubo ningún halo de inhibición alrededor del inoculo de E. coli.

Figura 9. A: Antibiograma. Sobrenadante de L. rhamnosus vs. Escherichia coli. B: Duplicado.

IV. Discusión

El mejor comportamiento de

Lactococcus lactis fue en el medio de cultivo M17, tanto en medio sólido como en caldo; las características morfológicas de la colonia y del microorganismo concordaron con las reportadas en Bergey’s Manual (2009) y en el Manual de Microbiología de Merck (2005). En cuanto a Lactobacillus rhamnosus, presentó un buen comportamiento en los medios de

cultivo MRS, y las características

morfológicas de la colonia y del

microorganismo concordaron con lo

reportado en los mismos manuales.

En la activación y observación de la pureza de las cepas patógenas, se

comprobó que Staphylococcus aureus

creció bien en el agar selectivo Baird-Parker, y las características como forma de las colonias, color y el doble halo alrededor de ellas, concordaron con lo reportado en Bergey’s Manual y en el Manual de Microbiología de Merck. Lo

mismo sucedió con la cepa E. coli

inoculada en agar MacConkey, en la que el color de las colonias y demás características, también, correspondieron con lo descrito en dichos manuales. En cuanto a Streptococcus agalactiae, las características morfológicas de la colonia y

del microorganismo, concordaron

igualmente con la información registrada en ellos.

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La centrifugación refrigerada que se implementó para la obtención de los sobrenadantes de las BAL, es una técnica utilizada para separar las células del

sobrenadante cuando se tienen

suspensiones celulares o soluciones

enzimáticas, debido a que una baja temperatura durante la centrifugación favorece que las proteínas se concentren en el sobrenadante y las células se sedimenten, sin que estas corran el riesgo de lisarse (Gil, 2013).

La mejor actividad antibacteriana de los sobrenadantes, frente a las cepas

patógenas, se observó con el

sobrenadante de Lactococcus lactis sobre

Escherichia coli, el cual produjo halos de inhibición de 5mm, como se aprecia en figura 4 (A). Esto concuerda con reportes recientes de que la especie L. lactis no sólo produce metabolitos con un amplio espectro antibacteriano contra bacterias Gram-positivas, sino que también posee actividad antibacteriana con organismos Gram-negativos, como E. coli en este caso (Kumar et al., 2012). Sin embargo, frente a

Streptococcus agalactiae no hubo un efecto inhibitorio importante como lo muestra la figura 3, en la que se observó

un crecimiento inusual de colonias

alrededor de los discos con el mismo

sobrenadante. La tinción de Gram

realizada a estas colonias mostró que se

trataba del mismo microorganismo,

morfológicamente, pero con un

crecimiento más reducido, como se aprecia en la figura 6 (A), lo que indicó que

S. agalactiae es resistente a algunos metabolitos producidos por L. lactis. Precisamente, en estudios realizados sobre la actividad antibacteriana de la nisina (bacteriocina producida por L. lactis) frente a S. aureus y S. agalactiae, se encontró una resistencia considerable de estas bacterias contra la bacteriocina

(Khosa et al., 2013); una posible razón por la que, en la presente investigación, no se encontró ninguna actividad antibacteriana

sobre S. aureus, por parte del

sobrenadante de L. lactis.

Si bien se conoce que S.

agalactiae es resistente a la nisina, en

esta investigación se observó una

alteración en su crecimiento debido al sobrenadante de L. lactis, y conociendo la gran diversidad de sustancias producidas por el género Lactococcus con actividad antimicrobiana (Ajunwa et al., 2014), es probable que algún metabolito haya afectado el crecimiento normal de la cepa

patógena en mención. También se

conoce, desde hace algún tiempo, que bacteriocinas como la nisina, son activas frente a bacterias Gram-positivas sólo cuando se usan en altas concentraciones o cuando las células diana han sido pretratadas con agentes quelantes como el EDTA (Stevens et al., 1991).

Los resultados obtenidos indicaron

la conveniencia de evaluar el

comportamiento de L. lactis en presencia de otros microorganismos, por ejemplo S. agalactiae, y determinar si en este caso hay un aumento del efecto inhibitorio de la BAL sobre la bacteria patógena, a un largo plazo, sobre todo al considerar que la producción de sustancias con actividad bactericida, por parte de las bacterias, puede potencializarse debido a factores como la presencia de otra bacteria competidora, estrés térmico o de pH, y mecanismos bacterianos que controlan la expresión génica de acuerdo a la densidad celular (López et al., 2008).

La evaluación del sobrenadante de

Lactobacillus rhamnosus, evidenció que los metabolitos producidos durante su

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antibacteriana sobre ninguno de los microorganismos patógenos del estudio:

S. aureus, S. agalactiae y E. coli. Por lo tanto, no se debe tener en cuenta este

microorganismo para tratamientos

biológicos.

Recomendación. De acuerdo con los resultados, se propone evaluar la actividad antimicrobiana de Lactococcus Lactis en vacas diagnosticadas con mastitis subclínica. Lo cual podría llevarse a cabo inyectando vía intramamaria el sobrenadante o el cultivo bacteriano, utilizado como probiótico, y determinando si hay una disminución del número de bacterias patógenas, 72 horas después de ser inyectado. Para esto, pueden ser utilizados métodos como el Recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) en medios de cultivo selectivos para las bacterias de interés, principalmente para

E. coli y S. agalactiae, y el California

Mastitis Test. Es necesario tomar

muestras de leche antes de comenzar con las pruebas, para realizar la debida comparación de la carga bacteriana inicial y final.

V. Conclusiones

 El sobrenadante

obtenido del cultivo de Lactococcus lactis tuvo un efecto inhibitorio sobre Escherichia coli, con la que

se obtuvo halos de

aproximadamente 5mm, lo cual demostró actividad antibacteriana. Tuvo poca o ninguna actividad inhibitoria frente a las dos cepas

Gram-positivas estudiadas, S.

agalactiae y S. aureus.

 El sobrenadante de

Lactobacillus rhamnosus no

presentó ningún efecto

antibacteriano frente a las bacterias patógenas de estudio: S. aureus,

S. agalactiae y E. coli.

 Los resultados in

vitro con Lactococcus Lactis, apoyan la propuesta de evaluar la actividad antimicrobiana de esta cepa en vacas diagnosticadas con mastitis subclínica, con el objetivo de determinar el comportamiento in vivo de la BAL frente a cepas patógenas.

VI. Referencias

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