1
MICROBIOLOGIA DE FARMACIA, FCBYF CLASE INAUGURAL 2018.
“El papel de lo infinitamente pequeño en la naturaleza es infinitamente grande”
“El azar favorece a la mente preparada”
L. Pasteur
“He llamado a este principio, por el cual cada pequeña variación, si útil, es preservada, con el término de Selección Natural”.
C. Darwin
“Nada tiene sentido en biología, si no es a la luz de la evolución”
T. Dobzhansky
“Si pude ver mas allá, fue porque estaba parado sobre hombros de gigantes”
Isaac Newton
La Microbiología es la Ciencia que estudia los microorganismos
Distribución de células procariotas sobre nuestro planeta
Ubicación Número (x1028) % del total
Suelos 26 5
Entornos acuáticos 12 2
Subsuelo oceánico 355 69
Subsuelo terrestre 125 24
Importantes hitos históricos
??-Siglo XV: Los años oscuros
Siglo XV-XVI: El desarrollo del método científico. El cuestionamiento, y finalmente la refutación, de las teorías de la generación espontánea;
Siglo XVII: El descubrimiento del mundo de los microbios;
Siglo XIX: El siglo de Oro
El rol de los microbios como transformadores químicos y causa de enfermedades, Desarrollo de los métodos modernos de la Microbiología,
La teoría de la evolución de Darwin
Siglo XX: Desarrollo de los métodos de Biología Molecular y ADN recombinante.
Secuenciación de genomas completos de organismos procariotas y eucariotas, Siglo XXI: ?? Ómicas
Era Oscura. Algunos eventos históricos documentados
~5000 años: Producción de bebidas alcohólicas por fermentación de cereales, miel, uva.
Epidemias, plagas, pestes. Mesopotamia, India, Egipto, China: utilización de sustancias
2
antisépticas y antimicrobianas en el tratamiento de heridas e infecciones (jabones, miel, hongos, sales de cobre).
~350 AC: Teoría aristotélica de la generación espontánea (aceptada hasta el siglo XV):
Aceptación de las enfermedades como castigos divinos o desbalances (los 4 jinetes del Apocalipsis), ergo la higiene o prevención serían innecesarias. Occidente: Teoría de la
“patología humoral” (salud: balance sangre, flema, bilis amarilla y bilis oscura); Oriente: Yin- Yang (salud: armonía).
300-500 DC: En esqueletos en Nubia (entre Egipto y Sudán) detectan rastros de tetraciclinas quelada al calcio de los huesos y muy posiblemente consumida en la dieta. Las tetracicilinas son aisladas de actinomicetos, bacterias Gram-positivas, y poseen propiedades antimicrobianas contra bacterias y protozoos como Plasmodium (malaria), propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, inhibidoras de metaloproteinasas como las participantes en la muy común gingivitis (inflamación y sangrado de encías), etc. Interesantemente, no hay rastros de infecciones en los huesos encontrados en Nubia.
Una potente droga anti-malaria, qinghaosu (artemisinina), extraída de plantas de Artemisia, fue usada por los herbalistas chinos desde hace miles de años como remedio contra diversas enfermedades.
Siglo XV: Renacimiento de las Artes y las Ciencias. Cambios políticos. Cuestionamiento a las teorías de la generación espontánea. Descubrimiento del mundo microbiano
Cuestionamiento de lo Antiguo (poder otorgado por la divinidad). Mayor tolerancia. F. Bacon:
el conocimiento es poder. Surgimiento de Sociedades Científicas: Invisible College en Inglaterra (Newton, Boyle). Nulium in verba: Desarrollo (o invención) del método científico:
El conocimiento basado en la experiencia (Experientia magister est optimum).
1540: Girolamo Francastoro. Morbo gálico o itálico (sífilis) como enfermedad transmisible (seminaria contagium). O sea, concepto de agente causal.
1665: Francesco Redi: Omne vivum ex ovo
1673:Descubrimiento documentado del mundo microbiano: Anton Van Leeuwenhoek y sus
“animáculos”. Paradójicamente el hallazgo renace las teorías de generación espontánea. Recién en 1860 L. Pasteur y J. Tyndall asestan el “golpe final”: Los microbios derivan de otros microbios.
1715: Timoni y Pilarini (Univ. Padua): Aprenden en China la variolización (inmunización contra viruela). Concepto de que el agente causal de enfermedades puede ser contenido.
1796: Jenner: vacunación con “viruela de las vacas”, con menor mortalidad. El agente causal puede ser domesticado.
Siglo XIX: Siglo de Oro de la Microbiología. Los microbios como agentes causantes de enfermedades y transformaciones químicas
A principios del siglo XIX, la ausencia métodos de aislamiento y cultivo de bacterias en
“estado puro” (a partir de un solo microbio aislado) lleva a postular que los mismos pueden variar tanto en forma como en fisiología (pleomorfismo).
1817: B. Bizio estudia al microscopio la “Sangre de Cristo”, manchas rojas sobre el pan bendecido utilizado en las misas. Describe la Serratia marcescens, a la que erróneamente cataloga como “fungus”, y que puede multiplicarse sobre polenta en condiciones de humedad y temperatura adecuadas. Los microbios pueden cultivarse.
1844: I. Semmelweis. Mortalidad por fiebre puerperal en parturientas. Concepto de antisepsis e higiene.
3
1848: C. Ehrenberg inocula manchas rojas de “Sangre de Cristo” sobre papas, pan, y queso suizo, utilizando recipientes de lata con atmósfera húmeda. Obtiene cultivos, a los que estudia al microscopio introduciendo el término bacteria (pequeños bastones).
1850. H. Hoffman experimenta con sustratos: pan y papas hervidas para tener caldos estériles y luego poder inoculados con levaduras. Concepto de medios de cultivo esterilizados.
1850. Joseph Schröter experimenta con sustratos: papas, almidón, pasta de harina, pan, albúmina de huevo, carne, para crecer bacterias cromogénicas (que producen pigmentos). Encuentra que las colonias forman otras colonias de características similares, observación contraria al pleomorfismo.
1850: J. Lister, L. Tait (Inglaterra). Medidas de higiene en operaciones
1858. C. Darwin y A.R. Wallace. Teoría de la Evolución (Lectura presentada ante la Sociedad Linneana de Londres): “Sobre la tendencia de las especies a crear variedades, así como sobre la perpetuación de las variedades y de las especies por medio de la selección natural”. Concepto de variabilidad y selección.
1859: C. Darwin publica su libro “El origen de las especies mediante la selección natural, o la conservación de las razas favorecidas en la lucha por la vida”.
1861: L. Pasteur formula el primer medio de cultivo líquido: 100 g agua destilada, 10 g azúcar de caña, 1 g tartrato de amonio y 1 g de cenizas de levadura (minerales, básicamente fosfato de potasio). Hoy podríamos definirlo como un medio mínimo: una fuente de carbono (sacarosa, y quizás tartrato), una fuente de nitrógeno (amonio), sales minerales. Descubre que las levaduras pueden usar azúcar de caña (sacarosa) como fuente de carbono, pero no CO2 como las plantas.
Concepto de sustratos específicos de crecimiento y de distintos metabolismos en distintos organismos.
1863-1868: C. Davaine observa “bacteridios” en sangre de enfermos de ántrax, y C. Eberth los aísla. Concepto de colonización.
1863: L. Pasteur estudia las "enfermedades del vino". Descubre la fermentación láctica y bacterias que transforman, en ausencia de aire, glucosa en ácido butírico dando lugar a “vinos grasos” de mal gusto (la vie sans l'air, ahora sabemos que se trata de Clostridium acetobutilicum). Concepto de anaerobiosis y de la existencia de rutas metabólicas específicas en microbios.
1869: L. Pasteur identifica al protozoo Nosema bombycis como agente causal de la epidemia de pebrina que afecta al gusano de seda.
1872. O. Brefeld, botánico alemán, desarrolla el cultivo sobre soporte sólido para obtener cultivos puros de colonias aisladas agregando gelatina al medio de cultivo. Lo utiliza para crecer hongos a partir de esporas. Un problema de la gelatina: solidifica recién debajo de 25 ºC, y al ser una proteína muchos organismos pueden degradarla.
1873. Edwin Klebs desarrolla el método de dilución para obtener cultivos puros.
1870-1875: F. Cohn descubre, usando el concepto del medio de Pasteur, que el crecimiento de levaduras reduce el crecimiento de bacterias. Formula un medio mineral para crecer bacterias selectivamente quitando el azúcar: 20 g agua destilada, 0,1 g fosfato de potasio, 0,1 g sulfato de magnesio, 0,2 g de tartrato de amonio, 0,01 g fosfato de calcio. Demuestra que las bacterias pueden utilizar otros compuestos además de la sacarosa como fuentes de carbono como el tartrato. Prueba otros compuestos incluyendo succinato, lactato, acetato, glucosa, glicerol, y celulosa. Asimismo, prueba urea como fuente de nitrógeno, en lugar de amonio. Describe las
“bacterias del hierro”, que obtienen energía de oxidar Fe(II).
4
1878. J. Lister obtiene, mediante el método de dilución, el primer cultivo puro de Bacterium lactis de un fermento utilizado para obtener leche cultivada, y aisla una sola célula bacteriana mediante la ayuda del microscopio.
1877-1881: Robert Koch identifica al Bacillus anthracis como agente causal del ántrax.
Obtiene cultivos puros del bacilo utilizando como medio de cultivo líquido ocular de buey suplementado con 10% gelatina. Identifica asimismo a la espora como forma diferenciada y resistente del bacilo. Su trabajo es rechazado por la comunidad médica y publicado en una revista de Botánica gracias a F. Cohn. La reproducción posterior de sus resultados por otros científicos (“la prueba del tiempo”) lo lleva a la fama.
Postulados de Koch
1) El agente causal sospechado de una enfermedad debe ser encontrado en cada caso de la misma,
2) El agente causal debe poder ser aislado del enfermo, y cultivado en estado puro, libre de otros organismos,
3) Luego de la inoculación a un animal de experimentación, el agente causal sospechado debe reproducir la enfermedad,
4) El agente causal debe ser aislado del animal experimentalmente infectado.
1877-1882. Koch experimenta con colorantes, basándose en la técnica que Cohn desarrolló en 1848 sobre el teñido de especímenes histológicos con colorantes vegetales. Consigue teñir el Mycobacterium tuberculosis de especímenes pulmonares con azul de metileno, calentando para que el colorante penetre la capa de ceras del bacilo.
1882. Fanny Eilshemius, esposa y asistente de W. Hesse en el instituto de Koch, introduce el agar-agar en lugar de la gelatina en los medios de cultivo.
1884. Hans Christian Gram, botánico y médico danés, publica su tinción diferencial aplicada a teñir bacterias en tejidos pulmonares de pacientes muertos por neumonía. Gram teñía con cristal violeta, aplicada lugol como mordiente, y desteñía con alcohol. Carl Weigert, patólogo alemán, introduce años después la safranina como contacolorante.
1887. R. J. Petri, asistente de Koch, introduce el uso de la famosa cápsula.
1887-1890: Sergei Winogradsky descubre las “bacterias del azufre” (Beggiatoa, Thiotrix), que oxidan H2S produciendo azufre intracelular, definiendo la litotrofía (microbios que se alimentan de piedras, sales inorgánicas). Estudia las bacterias nitrificantes y encuentra que estos litótrofos fijan CO2 en oscuridad para generar compuestos orgánicos, definiendo la quimioautotrofía: bacterias que obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos (Fe(II), H2S, NH4+, NO2¯ ) y que además fijan CO2.
1886. U. Gayon (discípulo de Pasteur) y G. Dupetit reportan el aislamiento de cultivos puros de Bacillus denitrificans, los cuales reducen nitrato para generar nitrógeno.
1890. Friedrich Neelsen y Franz Ziehl, basándose en un método de P. Ehrlich, modifican la técnica utilizando el colorante fucsina con el agregado de fenol para teñir Mycobacterium tuberculosis (tinción ácido-alcohol resistente). Esta bacteria posee una alta concentración de ácido micólico en la pared, impidiendo la entrada de cristal violeta.
1900. MacConkey y Hill proponen el agar glucosa peptonado con agregado de sales biliares para probar contaminación fecal en aguas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Gram- positivos. Pronto reemplazan la glucosa por lactosa y agregan un indicador de pH (rojo neutro) para diferenciar Escherichia coli de Salmonella typhi, donde la primera forma colonias rojas por la gran producción de ácidos y la segunda no.
5
1902. Drigalski y Conradi, colaboradores de Koch, introducen el agregado de colorantes
“antisépticos” Encuentran que el cristal violeta en muy pequeñas proporciones inhibe el crecimiento de Gram-positivos sin alterar el de E. coli. Asimismo desarrollan la famosa espátula para inocular medios sólidos con cultivos puros.
(La composición del agar MacConkey hoy es: Peptona de caseína, 17 g; peptona de carne, 3 g;
NaCl, 5 g; lactosa, 10 g; sales biliares, 1,5 g; rojo neutro 0,03 g; cristal violeta: 0,001 g; agar- agar: 13,5 g, agua destilada csp 1000 ml).
1908. C. Eijkman describe como método que E. coli, pero no otras enterobacterias, producen gas de glucosa en medio de cultivo al ser incubadas a 46 ºC (luego se bajó a 44 ºC).
Que nos dejan los microbiólogos del siglo XIX?: Los métodos modernos en microbiología de la Escuela Francesa (Pasteur) y Alemana (R. Koch), los medios selectivos, enriquecidos y diferenciales (Beijerinck, Winogradsky, Würtz), métodos de coloración (C. Gram). Se descubren los agentes microbianos causales de tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), cólera (Vibrio cholerae), difteria (Corynebacterium diphtheriae), tétanos (Clostridium tetani), neumonía (neumococo, Streptococcus pneumoniae), meningitis (meningococo, Neisseria meningitidis), peste bubónica (Pasteurella pestis), sífilis (Treponema pallidum), gonorrea (gonococo, Neisseria gonorrhoeae), todos agentes bacterianos), de la malaria (protozoo, Plasmodium falciparum), la enfermedad del sueño (protozoo, Trypanosoma brucei), etc.
Escuela de Delft: A.J. Kluyver, C.B. van Niel; Escuela de California: R. Stanier, R. Hungate, M. Doudoroff; Escuela de Kostanz: N. Pfenning. Fundación de compañías farmaceúticas- químicas dedicadas a la purificación de productos de plantas, síntesis de productos puros, y medios de cultivo estandarizados.
Desarrollo formal de la Inmunología
1880: Pasteur experimenta la vacunación con B. anthracis, cólera, virus de la rabia.
1890: E. Behring, S. Kitasato reportan la producción y utilización de suero de animales inmunes para el tratamiento del tetános (agente causal: Clostridium tetani).
1891: Behring reporta la "antitoxina diftérica" (agente causal: Corynebacterium diphteriae, "el carnicero de los inocentes”), fabrica antisueros en caballos, y patenta el procedimiento. Los antisueros se producen masivamente a partir de 1892. Recibe en 1901 el Premio Nobel en Fisiología y Medicina.
Desarrollo de la Quimioterapia y Antibioticoterapia
1874: W. Roberts (entre otros) describe propiedades antibacterianas de extractos de cultivos del hongo Penicillium glaucum
1910-1912: P. Ehrlich propone el concepto de las “balas mágicas”, hoy quimioterapia. Junto con A. Bertheim y S. Hata desarrolla los primeros agentes antisífilis eficaces a partir de Atoxyl, una droga altamente tóxica: los organoarsenicales salvarsan y neosalvarsan (compuestos 606 y 914, por el número ensayado). "El éxito en ciencia se alcanza con paciencia, habilidad, dinero, y suerte". Nobel 1908 en Fisiología y Medicina.
1915-1927: El médico costarricense Clodomiro Clorito Picado Twight estudia la acción inhibitoria de los hongos del género Penicillium sobre el crecimiento de estafilococos y estreptococos. Aparentemente reportó su descubrimiento a la Academia de Ciencias de París sin demasiado éxito.
1929: A. Fleming publica sus trabajos sobre la penicilina, producida por el hongo Penicillium notatum. Y persiste en el concepto de su importancia en el tratamiento de infecciones, distribuyendo el hongo a cualquiera que se lo pida para el estudio de la penicilina.
6
1935: Sulfonamidas: G. Domagk, trabajando para la compañía química L. Farbenindustrie, reporta el uso del Rojo de Prontosil para el tratamiento de septicemia estafilococcica y estreptococcica, el cual es introducido masivamente para el tratamiento sistemático de enfermedades bacterianas. Recibe en 1939 el Premio Nobel en Fisiología y Medicina.
1935: Tréfouël, Nitti, y Bouvet, del Instituto Pasteur, demuestran que el prontosil se transforma en sulfonamida en el cuerpo, y en 1940 D. Woods demuestra que la sulfonamida es un inhibidor competitivo del PABA para la dihidropteroato sintasa, inhibiendo así la síntesis de ácido fólico.
(Nota: Ya en esta década se reporta resistencia bacteriana contra las sulfonamidas. Aún así, las mismas siguen utilizándose en el tratamiento de infecciones en humanos, en animales (cerdos), en piscicultura (salmónidos). Las sulfonamidas son baratas de producir y muy estables, y su vertido al medio ambiente por mas de 70 años ha generado que la mayoría de las bacterias hoy posean genes de resistencia a las mismas.
1939. R. Dubos aisla de Bacillus brevis un antimicrobiano al que denomina tirotricina, que es una mezcla de péptidos cortos catiónicos que actúan sobre membranas produciendo lisis celular. La tirotricina se produce actualmente para su utilización en pomadas anti-acné y bactericidas, pero no en inyectables ya que produce lisis de células eucariotas. Hoy se conocen muchos AMPs producidos por todo tipo de organismo como defensa contra microbios.
1940. H. Florey, E. Chain en Oxford logran purificar la penicilina en cantidades suficientes para ensayos clínicos y reportan su utilidad en el tratamiento de la septicemia estafilococcica y estreptococcica. En 1945 ya se producía en forma masiva, y ese año junto con Fleming reciben el Nobel en Fisiología y Medicina.
(Nota: El mismo año el grupo de Fleming reporta la presencia de enzimas bacterianas que inactivan a la penicilina. Asimismo, el mismo alerta que tratamientos cortos o con poca penicilina seleccionan cepas resistentes a la misma.).
1944: A. Schatz y S. Waksman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, una bacteria Gram-positiva (actinomiceto) aislada del suelo. Se utiliza para el tratamiento de Mycobacterium tuberculosis (TB, “La Gran Plaga Blanca”).
(Nota: Durante el tratamiento a pacientes con TB aparecen cepas resistentes a estreptomicina).
El término “antibiótico”, propuesto por Waksman, denota cualquier clase de molécula orgánica que inhibe o mata microbios interaccionando específicamente con blancos celulares microbianos. Así, tanto compuestos naturales como totalmente sintéticos pueden ser definidos como antibióticos.
1949. Dorothy Crowfoot Hodgkin determina la estructura de la penicilina mediante cristalografía de rayos X.
7
1950-1960: La era dorada de producción de antibióticos: 96 producidos por 57 especies de microbios, principalmente actinomicetos.
1960-1970: Los años optimistas: “El fin de las enfermedades infecciosas es solo una cuestión de tiempo”.
Pero…
Uso racional!! Los antimicrobianos llevan su propio caballo de Troya.
1) A partir de 1960 la resistencia bacteriana a antimicrobianos emerge como problema importante y se agrava. Aparecen fenómenos como la resistencia múltiple (MR) a antimicrobianos (mas de 5 grupos distintos de antimicrobianos) o la resistencia extrema a todos los antimicrobianos disponibles de uso clínico. En particular, los patógenos MR del grupo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp.), reconocidos por la Organización Mundial de la Salud como un problema muy grave que requiere de intensa I+D para abordarlo. Y en la actualidad casi no se descubren nuevos antibióticos, sino que los esfuerzos se centran en modificar químicamente a los pre-existentes.
2) Los efectos ecológicos del vertido ambiental de antimicrobianos utilizados para el tratamiento de enfermedades y para suplemento alimenticio de animales de consumo, Su efecto sobre la selección, diseminación y evolución de factores de resistencia localizados en bacterias ambientales
8 Siglo XX:
Desarrollo de la metodología del ADN recombinante
1928: F. Griffith descubre el "principio transformante" en el neumococo (S. pneumoniae):
La herencia puede aislarse físicamente de la célula
1944: O. Avery, C. McLeod, M. McCarty: el ADN es el principio transformante La herencia tiene bases químicas
1945: A. Hershey, S. Luria, M. Delbrück (Phage Group). Cold Spring Harbor.
Nacimiento de la Biología Molecular.
1953: J. Watson, F. Crick: estructura del ADN La Doble Helice, el Dogma Central
1965. Linus Pauling, Premio Nobel 1954, y Emile Zuckerkandl, determinan la secuencia de aminoácidos de la hemoglobina, y postulan que el índice de divergencia entre dos secuencias de aminoácidos de una proteína que cumple la misma función en distintos organismos (o de su gen) es constante en el transcurso de la evolución.
Concepto de cronómetros moleculares.
1970: Teoría neutralista de Kimura.
1970: C. Woese. El RNA ribosomal (rRNA) como cronómetro universal.
El Gran Árbol de la Vida. Tres dominios: Eucaria, Arquea, Bacteria.
1972: P. Berg produce ADN recombinante Genes individuales pueden “clonarse” en E. coli 1973: S. Cohen, H. Boyer: primera biblioteca de genes
Podemos conservar TODO el genoma de un organismo en forma de clones separados formando una “Biblioteca” de genes
1983: J. Gusella: marcador genético de enfermedades
Podemos asociar enfermedades genéticas a una región del ADN 1983: K. Mullis: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Podemos “amplificar” fragmentos particulares de ADN
1990: El Proyecto Genoma Humano (HuGO), estimado completo en 2005 Podemos conocer la secuencia completa de cualquier genoma
1995: Primer Genoma completo de una bacteria:
Haemophilus influenzae (2 Mb)
1996: Primer Genoma completo de un microbio eucariota unicelular:
Saccharomyces cerevisiae (12 Mb)
1998: Primer Genoma completo de un eucariote pluricelular:
Caenorhabditis elegans (97 Mb)
2000: Genoma completo de la mosca de la fruta:
Drosophila melanogaster (180 Mb)
2000: Secuencia completa de los cromosomas 21 y 22 humanos
2000: Secuencia completa del genoma de una planta: Arabidopsis thaliana (110 Mb) 2001: Secuencia completa de un genoma humano: Homo sapiens (3400 Mb)
2002: Secuencia completa del genoma de arroz; Oriza sativa (5000 Mb) 2005: >150 genomas procariotas fragmentados
2010: Desarrollo de metodologías de secuenciación rápida de genomas. Metagenómica
2012: Genomas de animales: rata, perro, chimpancé, cerdo, pollo, etc. Genomas de plantas:
Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Zea mays, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Glycine max, Lotus japonicus, etc.
2015-2018: miles de genomas procariotas casi completos, muchos de ellos “cerrados” (PacBio).
