Aislamiento y serotipificación de cepas de Pasteurella sp , en terneros

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(1)AISLAMIENTO Y SEROTIPIFICACION DE CEPAS DE PASTEURELLA SP •• EN TERNEROS. Rafael Neira. M.V. M.Sc.: Gloria Soto C., Bacterl6loga; Janelh Villa mizar Z., Bacterlologo; Jose D. Mogollon G. M.V. Ph. D.'. RESUMEN EI prop6slto del presente trabaJo fue alslar cepas de Pasteurella sp de las fosas nasales de temeros enfermos 0 de portadores sanos, perteneclentes ados flncas de la Sabana de Bogota, con el fin de determmar los blOIiPOS y serollpos presentes Se delermln6, ademas, la presenCia de antlcuerpos anti P. haemo/yflca por medlo de la tecnlca de hemoaglutlnacl6n Indlfecta y se reallzaron pruebas de senslblhdad anbbl6t1ca Se anallzaron 150 muestras correspondlenles a hlsopos nasales y 87 sueros sanguineos. Sa alslaron 18 cepas de P haemolytlca y 84 cepas de P mul/oada y sa Identlflcaron los serotlpos de las muestras de P haemolytlca por medlo de la IIkOica de coagluhnacl6n. Se enconlr6 un 61 11 % de cepas perteneclentes al serotlpo A 1 Y 16 67% del serotlpo A2. Se delectaron cuatro cepas no tlplficables La mayoria de sueros de campo reacclonaron can el serotlpo A1 (4483%) Y con el serotlpo A2 (21 84%) Sin embargo, un 919% de sueros fueron POSltlVOS para ambos serobpos 1 y 2 Los serotlpos capsulares de P mulloclda se determmaron por el test de aCTIflavlOa (serotlpo D) y el test de hlaluromdasa (Serollpo A ) Se encontr6 que un 90 48% de las cepas de P multoclda perteneclan al serotlpo 0 y un 9 52% al serotlpo A La senslblhdad antOlbl611ca para las cepas de Pasteurella sp alsladas, se determm6 par la prueba de dlfuslon en agar con discos La mayona de los alslamlentos de P. mulloclda. P haemo/yflca, fueron suscepbbles a la danofloxaclna nllrofurontatna y el c1oranfemcol mlenlras Que algunas cepas mostraron una moderada reslstencla a la pentcilina Se concluy6 que tanto la P. haemo/ytlcacomo la P mul/oclda, colonlzan la flora de los temeros portadores, los cuales pueden estar desempeiiando un papellmportante en la epldemlologla de la Jnfeccl6n (pasteurellosIs neum6ntcas) en el Mea geografica esludlada Palabras claves adicionales: PasteurellosIs bOVina, alslamlenlo, serotlpificacI6n, portadores sanos. ABSTRACT. ISOLATION AND SEROTYPIFICATION OF PASTEURELLA STRAINS IN CALVES The purpose of thIS study was to Isolate strains of Pasteurella sp from the nasal passages, of apparently normal calves belonging to two dairy farms of the Savanna of Bogota, 10 recognize Itle blotypes and serotypes that may be associated with pneunomla Serum samples were also evaluated for antibodies to P heamo/ytlca by indirect Haemagglutlnabon test A total of 150 nasal swabs and 87 serum samples were analyzed Eighteen strals of Pasteurella haemolytlca and 84 stnans of Pasteurella mu/tooda were recovered P. haemo/ytlca strains were serotyped by the coaggluttlnatlOn test Eleven of them (61 11%) strains belonged to serotype A 1 and three (16 67%) to serotype A2 Four straIns were non-typable Most field sera reacted with serotype A1 (4883%) and serotype A2. (21 84%) However, 9 19% of the sera reacted both to serotype 1 and 2 Capsular serotypes of P multOCldawere determined by the acrdlavlne (serotype D) and hyaluronidase test (serotype A) It was found that 90 48% of the stranrs belonged to P mu/tOCldaserotype 0, and 9 52% to serotype A Anhblobc susceptibility for Pasteurella sp Isolates were established by the agar. Proyectos de MedlcJna Bovma y Medlclna Porcma, ICA-Celsa A A 29743 Santa Ie de Bogota. 165.

(2) REVISTA leA, Vol. 28, Abril- Junio 1993 disk dilfusion tost Most P multocid.1and P h.7emolytlco Isolates woro susceptible to danofJoxacln, nilrolu· mnion nnd cioranlenlcol, but some strams showed moderate resistance to penicilin It was concluded that both P multocld.7 and P h.7{)mo~1ico colonize the calves nasal passages These healthy earners may play a role in tho epidemiology 01 the pneumonic pasteurellosis in tile geographical area studied Addllfonal Key Words: Calves, pasleurellosis, serolrpillcallon, isolalron, C<lrners. La Pasteurella haemo/ytlca y la Pasteurella multoclda, han sldo ampllamente reconocldas como patogenos Importantes del tracto resp,ratono de los bovinos, asociadas con neumonias. Esta nemonias, debido a su componente etlologlco multifactorial, 5e conocen comLinmente como "complejo resp'ratono de los bovlnos" En paises donde su presentaclon se relaclona con el transporte de los antmales hacfa los SttlOS de mercadeo se denomlna tamblen "Flebre de Embarque". (Bryson, 1991, Glynn y Smith, 1988, Gourlay e/ ai, 1989; Mannhelm, 1984) Entre los factores etlologlcos Involucrados en el "complejo resplratono de los bovinos", descartando el transporte como factor estresante, eXlste un buen nLimero catalogados como predlsponentes, entre los cuales se deben destacar las caractenstlcas anatomicas y flslologlcas del aparato resplratorlo de los bOVlnos, el tlpO de maneJo e Infecclones vrrales preexistentes que partlclpan como Inmunodepresores del sistema resplratono para que se actuen agentes tnfecclosos determlnados Este tfpo de neumonias se conoce actualmente con el nombre de "Neumoma enzootlca de los terneros" Los terneros examlnados en el presente estudio estaban sometidos a condiciones de maneJo y medlo amblente que no generan est res. Se podria pensar que un pequeno nLimero de terneros se Infectan con P haemolytlca cuando Jovenes, slendo est a bacteria un habltante escaso en la flora nasal, perc 51 los anlmales 5e someten a condiCiones severas de estres, las bactenas 5e multlplican rapldamente, lIegando a constltUirse en uno de los pnnclpales componentes de la flora nasal (Glynn y Smith, 1983). 166. En Colombia, los problemas respiratonos constttuyen una de las pnncipales limitantes de la industna bovina, principalmente en anlmales jovenes. Sin embargo, a pesar de ser frecuentes los diagnosticos de neumonia flbnnosa, septicemia y pasteurelosls, no se conocen estudios acerca del aislamlento y serotlplflcaclon de la Pasteurella sp Por 10 tanto, un mejor desarrollo de la industria bOVina en Colombia implica generar tecnologia para detectar los portadores de mlcroorganlsmos, facllitando la dlsmlnuclon de la Incidencla de la enfermedad y ayudando a lograr una dismlnucion de las perdldas economicas. EI proposlto de este trabajo es contribUfr a la 50lucion del problema, por 10 cual se dlseno el presente expenmento con los slgUientes obJetlVos. alslar cepas de Pasteurella sp de las fosas nasales de terneros enfermos 0 de portadores san os; determlnar la presencia de antlcuerpos antl-? haemo/ytlca, serotlpos A1 Y A2, por medio de la tecnlca de hemoaglutlnaclon Indlrecta, producrr antlsueros policlonales en coneJos para la preparaclon del reactlvo de Cowan's, necesano en la serot'p,flcac,on de las cepas alsladas con la tecnlca de coaglutmaclon. Flnalmente, establecer la 5enslblhdad de las cepas de Pasteurella sp. alsladas, a determrnados anttblotlcOS.. MATERIAlES Y METODOS Poblaci6n bovina y colecci6n de muestras Ef presente estudlO se realiz6 en dos granJas lecheras bovlnas de la Sabana de Bogota Una de elias, ublcada en el mUnI-.

(3) NEIRA R., et al Aislamiento y serotipificaci6n ... ciplo de ZipaqulrCl donde se colectaron 120 muestras perteneclenles a terneras entre 30 y 120 dias de edad y la, otra, ublcada en el mUnicipio de Mosquera donde se colectaron 30 muestras de terneras entre 120 y 420 dias de edad. Se tomaran muestras del fonda de la cavidad nasal, mediante el usa de hlsopos dlsen ados especialmente para lograr una buena toma de la muestra en completa esterilidad y se IIevaron allaboratono en medio de transporte cal do Infusion Cerebro Corazon (BHI), con bacitraclna y neomicina (0.5 mgl100 ml cada uno) (Carter y Cole, 1990; Mannheim, 1984.). Ademas de los hlsopos nasales, se tomaran muestras de sangre con el fin de obtener suero para detectar la presencia de anticuerpos contra Ia P haemolyt;ca. Procesamiento de las muestras Las muestras de los hlSOpOS se sembraran en medlo agar BHI can sangre y agar Mac Conkey Se Incubaron a 3rC de 24 a 48 horas. Las colonlas que mostraron la morfologia caracteristlca de la Pasteurella se 50metieron a coloracion de Gram (Carter y Cole, 1990; Mannhelm, 1984). Las colonias Identlflcadas en el mlcroscopio como cocobacllos Gram negatlvos, se subcultlvaron en agar BHI con 5% de sangre de oveJa. Se Incubaron a 3t>C de 24 a 48 horas. Las colonlas, asi en CUItIVO puro, se sometleran a las pruebas bloqulmlcas des- . cntas par Carter y Cole, (1990) De las muestras de sangre se separaron los sueros, los cuales se utillzaron para la determinacion de antlcuerpos anti P haemOly/lca mediante la tecnlca de hemoaglutlnaci6n Indirecta {Mogollon, 1979}.. Serotipificacion de la Pasteurella haemolytica A 1 Y A2. Obtenldos los anti cuerpos pollclonales. y el reactlvo de coagJutlnaclon, S8 procedle a serotlplflcar las dlferentes muestras de campo mediante las tecnlcas de coagula-. cion y aglutlnaclon raplda en placa (Glynn y Wessman, 1978; Mlttal, et aI., 1983). Para la preparaclen del react,vo de Cowan's, se utilize una cepa de Staphylococsembre cus aureusCowan tlPO 1, la cual en caJdo BHI a 37°C durante 24 horas y se subcultlvo en agar Triptlcasa de soya a 3~ par 24 horas. La siembra se recogle en PBS (soluclon fosfato buferada) y se centrifuge a 4 000 rpm durante 20 mlnutos. se. EI pellet se resuspendlo con PBS-formahna al 0 5%, S8 mcubo a temperatura amblente durante tres horas, se realize un lavado con PBS a 3.000 rpm por 20 mlnutos y, por ultimo, se resuspendlo en PBS para aJustar la concentraclon a110% v/v. Se Incubo en bano de maria a BOoC durante Cinco mlnutos. A un ml de la suspenclon anterior se Ie adlclone 0 025 ml de antlsuero especifiCO obtenldo de los conejos (Blberstem ef at, 1958) Se Incube a temperatura amblente durante 30 mlnutos. Se reahzaron dos lavados con PBS a 4.000 rpm durante · 20 mlnutos. EI pellet de la bacteria senslbllizada se resuspendlo y se aJust6 al 10% de transmltancla con PBS que contenia 0.05 ml de Eizlda de Sodlo y 0.1 ml de suero albumma bOVina Ftnalmente, se d,vld,eron en alicuotas y se aJmaceno a 4°C (Mlttal et al 1983). Determinacion de los serotipos capsulares de la P. multocida A las colonlas sospechosas de ser P multocldase les reahzaron las pruebas se~. lectlvas descntas por Carter (1984) de la floculaclen de la acnflavlna para la Ide nllflcaclon del serolipo D y la de la hlaJuronJdasa para la Ident,f,caclon del serotlpo A.. Prueba de sensibilidad antimicrobiana. Una vez Identlflcadas las cepas de y P mul/oclda, se reallzo In prueba de suscepllbilldad anti mlcroblana de Bauer y Kirby (1966), selecloP haemo/y/lca. 167.

(4) REVISTA ICA, Vol. 28, Abril- Junio 1993. nando como medio de cultivo esttmdar el agar Mueller Hmton. Los agentes antimicrobiales utillzados en los sensidiscos fueron: peniclhna, 10 unidades; gentamieina, 10 meg; cloranfenicol, 30 mcg; trimethopnm Sulfa, 27.75/1.25 meg; ampicillna, 10 mcg; nitrofurantoina, 300 meg; ceftiofur, 30 mcg y danof/oxaeina, 5 mcg.. Serotipificacion capsular de las cepas P. mullocida De los 84 aislamientos de P. multocida, ocho (9.52%) pertenecieron al serotipo capsular A y 76 (90.48%) al serotipo capsular D (Tabla 2). TABLA 2. Determinacion del serotipo capsular de las cepas Pasteurella multoclda alsladas en la Sabana de Bogota.. RESULTADOS. De las 150 muestras tomadas, se aislaron e identlfJcaron 18 cepas de P. haemolytica (12.0%), las cuales se caracterizaran mediante sus rasgos de crecimlento y las pruebas bioquimicas complementanas. Todos los alslamientos de P. haemoly, fica se efectuaron en terneros de 120-420 dias de edad, mlentras que en los terneras de 30-120 dias de edad, que se encontraban en unidades de confinamiento, no se lagro alslar la bacteria. De P mu//oclda se aislaron 84 cepas (56.00%), Indlstintamente de ambos grupas de animales. Estas se identificaron mediante las caracteristlcas de crecimiento y pruebas bloquimicas complementarias respectlvas. En ninguna de las muestras tomadas se logro el aislamlento de mas de una cepa.. ~. rei. ~. c. .... Serotipo D. Serotipo A. Reslstentes. Sensibles. 0. ::::I. ] l:. No. Casos. 76. Porcentaje 9048. No. Casos 8. Porcentaje 952. Serotlpo D. Serotipo A. Resistentes. Sensibles. to. C. :;. = rei. "l:. u. <. No. Casos. Porcentaje. 76. 9048. No. Casos 8. Porcentaje 952. De las 18 cepas de P. haemolytlca asladas, once (61.11 %) pertenecleron al seratlpo 1 y tres pertenecieron al serotlpo 2 (16.67%). Se encoritraron cuatro cepas (22.2%) no tlplflcables (Tabla 1).. Las cepas que presentaron reacclon posltiva a Ja floculaclon de la acriffavina, fueron negatlvas para la de capsulacion de la hlaluronldasa Y Vlceversa, 10 cual indica que una misma cepa de P. mu//ocida no puede pertenecer al mismo tiempo a los serotlpos A yD.. TABLA 1. Serotipificacion de las cepas de Pasteurella haemolytica aisladas en la Saban a de Bogota.. Identificacion de anticuerpos Anti P. haemolytica A 1 Y A2.. Serotipificacion de P. haemolytica. Serotipo. Casof18. A1. 11. A2. 3. NT". 4. No tlplflcables. 168. Porcentaje 61 11 1667 2222. Se trabaJaron 87 sueros de los cuales 39 (44 83%) fueron positivos para el serotlPO A 1 Y 19 (21 84%) fueron POSltlVOS para el serotlpo A2. AI mlsmo tlempo se obtuvleron acho (9.19%) sueros pOSltlvoS tanto para el serotlpo A1 como para el A2..

(5) NEIRA R., et al Aislumicnto y serotipificaci6n ... Para la interpretaci6n de los resultados se consider6 como positiv~ el titulo 1/4 (GuilIete et al. 1989).. Sensibilidad a los antibi6ticos de las cepas de P. haemolytica y 13.mul/ocida Para la P. haemolytica el mayor numera de casos resistentes se presento frente ala penicilina (22.22%), mientras que frente a la danofloxacina todas las cepas fueron sensibles (100%); se encontr6 una alta sensibilidad frente a la gentamincma (94.44%), c1oranfemcol (94.44%), ampicillna (88.89%), nitrofurantoina (88.89%) cettiofur (88.89%) ya la sulfamethoxazole tnmethoprim (88.89%) (Tabla 3).. TABLA 4. Sensibllidad de las cepas de Pasteurella mulloclda a los agentes antlmlcroblanos. Sensible. No./1B Pemcllina Gentamlclna Cloranfenlcol Amp,clhna Dononoxaclna Nltrofurantolna Ceftlofur Suiramethoxazole Tnmethopnm. 69. Porcentaje. n. 82.14 8452 9762 9286 9881 9881 9167. 78. 9286. 71 82 78 83 83. DISCUSI6N TABLA 3. Sensibilidad de las cepas de Pasteurella haemolytlca a los agentes antimicrobianos. Sensible. No./18 Penlcilina Gentamlclna CloranfenlcoJ Amplclhna Donofloxaclna Nltrofurantoma CeftlOfur SulfamethoxaJe Tnmethopnm. Porcentale. 14 17 17 16 18 16 16. 7778 9444 9444 8889 10000 8889 8889. 16. 8889. La P. multoc/da tambu§n presento la mayor reslstencla frente a la peniciltna (17.86%) y el mayor porcentaje de senslbiltdad frente a la danof!oxaclna, nttrofurantoina y el cloranfenlcol (98 . 81%, 98.81%,97.62%, respectlvamente), y en menor proporclon frente a la gentamlcma (84.52%), ampiciltna (92.86%), ceftlofur (91.67%) y la sulfamethoxale tnmethoprim (92.86%) (Tabla 4 ). Las cepas de P. haemolytlca y de P. mu//oclda han sldo amphamente reconocl· das como pat6genos Importantes del tracto resplratono de los bovlnos (Bryson. 1991; Glynn y Wessman, 1978; Mannhelm, 1984). La presente InvestigacI6n permlttO demostrar la colonizacI6n de las fosas nasales par estas cepas en terneros en conflnamlento y semlconfmamlento, en dos flncas lecheras de la Sabana de Bogota. Se lograron Identlflcar 18 cepas de P haemolytlca y 84 cepas de P. mulloclda de un total de 150 hlsopos nasales colectados. EI balo numero de cepas de P. haemolyt/ca, alsladas en estos grupos de terneros aparentemente sanos, se podria expltcar por una escasa colonlzaclon de las mucosas nasales por este tlPO de Pasteurella, 0 porque la mayoria de los terneras estaban Itbres de bactenas. Tamblen se podria argumentar que Sl el numero de bactenas es escaso, no se pudleron detectar por la faJta de senslblltdad del metodo utlltzado Otra expllcaclon podria ser que la bactena, balo condICiones aparentemente normales, colonlza la cavldad nasal, qUlZelS. 169.

(6) REVlSTA leA, Vol. 28, Abl'il- Junio 199B con la ayuda de fimbnas pero no de gllcocaliz. En cambio, en casos de neumonia severa, se ha demostrado la presencia lanto de fimbnas como de glicocaliz, 10 cual favorece la persistencla de la bacleria en el traclo respiralono (Mark el aI., 1989). En una investigaci6n sobre la colonizacion del P. haemolytlca en fosas nasales en temeros, Glynn y Smith (1983) encontraron que el numero de alslamlentos era mucho mayor en terneros que habian sldo transportados de las flncas a sillos de mercadeo, 0 a fincas dlstantes para IniClar el proceso de engorde. De otro lado, el balO arslamrento de P. haemo/ytlca tamblen se pudo deber al abu-. so en los tratamientos con antlbleticos que reclbian los terneros en conflnamlenlo en la fmca del MUniCIpIO de ZlpaqUlra, ante ca50S mClplentes de enfermedad resplratona o Infecclosa en general La P mu/toclda se ha logrado alslar de pulmones neumenlcos en bovlnos Gourlay el a/ (1989), reprodujeron la neumonia pasleuroleslca bovma con cepas de campo P mu/tocida. En el presente trabalo se encontre una mayor presencia de P mu/loclda en la flora de terneros aparentemente san os, perc se desconoce su posible vlrulencla.. al. (1987), en Cuba, no lograron aislar P. multocida de terneros sanos, pero si obtu-. vieron aislamlento de secreciones nasales de terneros neumon/cos. EI diagn6stico de las enfennedades resplfatonas de los bovinos se realiza mediante el aislamlento, Idenllflcacion y serotlplflcaclon del mlcroorganismo involucrado. En ausencia de la documentacion de la mfecclon (por ejemplo aislamiento bactenologlco), las pruebas serologlcas son utiles para el dlagnostlco retrospectivo. En este estudlo se realize la tecnica de hemoaglutmacion Indirecta {H.I.} para deterininar la presencia de reactores positivos para P haemolytlca en las fmcas estudiadas Se demostro la presencia de anticuerpas anti P. haemo/ytlca en 75.86% de los anlmales estudlados, slendo los reactores POSltivoS al serollpo A1 el mayor numero de elias (44.83%). En cas os expenmentales de neumonia pasteureloslca, produclda par moculacion de P haemo/ytfca, se ha observado que los titulos de H.l progresan en forma slgnlflcativa de 1'2 hasta 1:28 a los 5-8 dias post-Inoculacien, alcanzando un maximo de 1 :256 a los 19 dias, momento en el cual se sacnflcaban los ani males experimentales (Gibbs et aI., 1984).. Hasta el presente se desconoclan en el pais, y en esta zona geognlfJca en particular, los serotlpos existentes tanto de P haemolytlca como P mu/toclda. De las cepas de P. haemo/yllca alsladas, el 61 .11 % (11/18) fueron del serotlpo A1 yel 16.67% (3/18) perteneclo al serotlpo A2. Para mterpretar el significado de los tllulos hemoaglutlnantes hallados, se debe entender que esta prueba detecta, preferenclalmente, antlcuerpos IgM. Los tltulos de H I encontrados oscllaron entre 1 4 Y 1 256. Se podria sugerir que los tltulos altos podnan corresponder a /nfecclones reCientes (alta colonlzaclon nasal), y los tltulos balos podrian corresponder a mfecclOnes pasadas 0 a baja colonlzaclon nasal. No obstante, se reqUieren trabajos mas detail ados para estudmr la dmamlca de reactlvidad serologlca en la poblaclon y poder asi emitir concluslones mas determinantes.. En el caso de la P mulloclda se encontro que el 90 48% correspondlo al serotlpO D y el 9.52% al serotlpo A Martmez et. En relaclon con la senslbilldad a los antlmlcroblales, se observe que las cepas de Pasteurella sp. alsladas fueron sensl-. No obstante, es Imposlble sugenr que los tJPOS de Pastpure//a podrian estar mvolucrados en casas de neumonia en las flncas estudladas, sJempre y cuando se produzcan las condiciones que favorezcan su multlpllcaclon en la c3vldad nasal y la colonlzaclon posterior del pulmon. 170.

(7) NEIRA R., et al Aislamiento y serotipificaci6n... bles en un mayor porcentaje a la danofloxacina, nitrofurantoina y al cloranfenicol, mientras que eJ mayor porcentaje de resistencia S9 observ6 con la penicilina.. La antibi6ticos 8-lactamicos (penlcilina y ampicilina) son usados en el tratamiento de enfermedades del tracto respiratorio del ganado, pero el desarrollo de la resistencia bacteriana, atribuible a Ja producci6n de la enzima 8-lactamica, ha reducido el valor de estos agentes terapeuticos. La actlVldad sinergica del sulbactam-amplcilina puede ser usada contra la P. haemo/ytlca resistente a los B-Iactamicos. Aparentemente, el sulbactam-ampicilina y el clorantenicol control~la neumonia produclda por la P. mulfocida resistente a la amplcilina, mientras que la ampicllina por sl sola no. (Farringhton et al. 1987). Con los resultados obtenidos se conc1uy6 que el antlblotJco de mayor resultados in vitrofrente a la Pasteure//asp. tue la danofJoxacina. Fmalmente, se puede aflrmar que la presencia de portadores de P. haemo/yflca P. multoclda en temeros de las fin cas estudiadas podrian desempeiiar un papel Importante en la epidemlologia de las enfermedades al asociarse a la persistencla de la infecci6n en la poblacl6n y a la presentacion de casos de neumonia pasteurol6sica. Por 10 tanto, se sugiere extender los estudios de Pasteurella a otras regiones del pais para determinar los biotlpos y serotlpos actuantes, y la correlaclon eXlstente entre los aislamientos, el maneJo e Infecclones vlrales pre-existentes.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 3.. Bryson, O. G. 1991 Aespiiat:lry disease in catt· Ie and pigs Royal Veterinary college/Pfizer Itda SymposIum London 39-44. 4.. Carter, G. R., Cole, J. R. 1990 Dlagnosllc pmcedures In Vetennary Bacteriology and Mlcology 5th Ed Academic Press San Diego. Caltfomla. 5.. Carter, G. R. 1984 Serotyplng of Pasteurella multoclda. Vet Mlcrobllogy 16 247-258. 6.. Farrlnghton, D. 0 ., Jackson, J. A., Bentley, G. E., Barnes, H. J. 1987 Efficacy of sulbactamampIcillin In an Induced Pasteurella haemolytlca pneumonia model In calves Am J Vet Res 48: 1684-1688. 7.. Gibbs, H. A., Allan, E. M., Wiseman, A., Selman, I. E. 1984 Expenmental produclion of bovine pneumoniC pasteurellosIs Res Vet SCience 37 154-166. 6.. GlIlele, K. G., Glynn, F., Sacks, J. M. 1989 Development and evaluallon of an enzyme-hnked Immunosorbent assay for bOVine antibody (lgG) to Pasteurella haemolytlca am J Vet Re 50: 106-100. 9.. Glynn. F., Wessman G. E. 1978 Rapid plate agglullnatlon procedure for serotyplng PasteureIlahaemolytlcaJ CliniC Mlcrob 7: 142-145. 10. Glynn F., Smith, D. C. 1983 Prevalence of Pasteurella haemolytlca 10 transported calves Am J Vet Res 44 981 -985. 11. Glynn, F., Smith, D. C. 1988 When Pasteurella haemolytlca colOnizes the nasal passages of caUle Vet Med pp 1060·1064. 12. Gourlay, R. N, Thomas, L H. Wild, S. G. 1989 Expenmental Pasteurella haemolytlca pneumonia In calves Res Vet SCience 47 185-189 13. Mannhelm, VI. 1984 Pasteureallaceae famll/y Bergey's Manual of Systemic Bacterology 4th Ed Williams and Wilkins Balhmore/London 14. Martinez, A.; Aznar, E.; Vliia, C. 1987 Pasteu· rel/a mulloc,da In the respiratory tract of calves Revlsta de Salud Animal 9' 7-12 15. Millal, K. R.; HigginS, R.; lariviere, S. 1983 Identification and serotypmg of the Haemophy· Ilus pleuroneumomae by coagluhnalJOn test J Cllnc Mlcrob 18: 1351-1354. 16. Mogollon, J D., 1979 Comparative studies of 1.. 2.. Bauer, A. W.; Kirby, W. M.M.; Sherrls, J. C. 1966 Antibiotic susceptibility testing by standa· nzed single disk method Am J clln Pathol 45 493·496 Bibersteln, E. L.; Meyer, M. E. Kennedy, P. C. 1958 Colonml vanatlon of Pasteurella haemolytlcalsolated from sheep J Bact 76 445·452. serodiagnostic techmques In bOVine cysticercoSIS University of Edlmburgh M Sc TheSIS pp 17-25 17. Mark, D. VI , Olson, M. E.: Acres. S. D ; Costerton. J W 1989 Presence of baclenal glycocalix and flmbnae on Pasleurella haemol}1lca In feedlot cattle With pneumonic pasteurellOSIS Can J Vet Res 53: 167171. 171.

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