Perfiles de metilación de genes lozalizados en la región crítica del Síndrome de Down en el DNA de madres sanas y sus hijos con Síndrome de Down en la ciudad de Cali [recurso electrónico]

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(1)PERFILES DE METILACIÓN DE GENES LOCALIZADOS EN LA REGIÓN CRÍTICA DEL SÍNDROME DE DOWN EN EL DNA DE MADRES SANAS Y SUS HIJOS CON SÍNDROME DE DOWN EN LA CIUDAD DE CALI.. MYRIAM DIANORA FAJARDO COLORADO, B.Sc.. UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE SALUD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS - 7670 SANTIAGO DE CALI 2017.

(2) PERFILES DE METILACIÓN DE GENES LOCALIZADOS EN LA REGIÓN CRÍTICA DEL SÍNDROME DE DOWN EN EL DNA DE MADRES SANAS Y SUS HIJOS CON SÍNDROME DE DOWN EN LA CIUDAD DE CALI.. MYRIAM DIANORA FAJARDO COLORADO, B.Sc.. Trabajo de investigación como requisito para optar al título de: MAGISTER EN CIENCIAS BIOMÉDICAS. Director FELIPE GARCÍA VALLEJO. Ph.D. Codirector JULIO CESAR MONTOYA VILLEGAS. Ph.D.. UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE SALUD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS - 7670 SANTIAGO DE CALI 2017.

(3) AGRADECIMIENTOS. A mi director de tesis, el doctor Felipe García Vallejo, por haber sido mi guía principal a lo largo de esta investigación y por darme la oportunidad de seguir trabajando a su lado. Sus orientaciones y enseñanzas han fortalecido grandemente mi proceso formativo, tanto a nivel personal como científico. A mis padres y a mi tía por las oportunidades que me han brindado para salir adelante, además de toda la confianza depositada en mis capacidades. Profundo agradecimiento a los profesores Julio Cesar Montoya, Adalberto Sánchez y José María Satizábal, por su apoyo incondicional, sus enseñanzas y orientaciones durante mi proceso académico. Mi más sincero agradecimiento al doctor Jairo Alarcón por su compromiso y la confianza brindada en la realización de este trabajo. A la doctora Lina Moreno por su apoyo y dedicación para establecer el vínculo con las madres y los pacientes con síndrome de Down. Al laboratorio GENOMICS por su participación en la atención de los pacientes y la toma de muestras. Al profesor Nelson Toro, director del Grupo de Investigación en Estudios Ecogenéticos y de Biología Molecular de la Universidad del Valle, por haberme brindado la oportunidad de trabajar en su laboratorio. Al profesor Rafael Tovar, docente de la escuela de estadística de la Universidad del Valle, por su enseñanza y aporte en los análisis estadísticos. A los profesores de la Maestría en Ciencias Biomédicas, especialmente a la Dra. Cecilia Aguilar y al Dr. Andrés Castillo por sus orientaciones, su dedicación y disposición en la enseñanza. Y finalmente, mi inmensa gratitud a la Universidad del Valle y a la Universidad Autónoma de Occidente, por el apoyo financiero para poder llevar a cabo esta investigación..

(4) ÍNDICE Página RESUMEN INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 14 1. GENERALIDADES SOBRE LA EPIGENÉTICA .................................................. 16 1.1 IMPORTANCIA PRÁCTICA ..................................................................................... 17 1.2 IMPRONTA GÉNICA ................................................................................................. 18 1.3 METILACIÓN DEL ADN ........................................................................................... 19 2. LA METILACIÓN DEL ADN Y SU IMPLICACIÓN EN EL SÍNDROME DE DOWN ................................................................................................................................. 21 3. RECURSOS BIOINFORMÁTICOS Y EXPRESIÓN CEREBRAL ..................... 26 4. OBJETIVOS................................................................................................................ 27 4.1. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 27. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 27 5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 28 5. 1 COMPONENTE BIOINFORMÁTICO ..................................................................... 28 5.1.1 Minería de datos .................................................................................................... 28 5.1.2 Análisis de conglomerados ................................................................................ 28 5.2 COMPONENTE EXPERIMENTAL EPIGENÉTICO ............................................. 28 5.2.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN ................................................................................ 29 5.2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................................... 29 5.2.3 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Y CUANTIFICACIÓN DE ISLAS CpG ..... 30 5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................ 32 5.3.1 Análisis descriptivo de los datos ..................................................................... 32 5.3.2 Identificación de la distribución de probabilidad para la verosimilitud de los datos ............................................................................................................................ 33 5.3.3 Identificación y elicitación de la distribución a priori ................................. 33 5.3.4 Selección de los mejores modelos para cada grupo de estudio ............. 33 5.3.5 Prueba de hipótesis entre los grupos de estudio ........................................ 34 5.3.6 Elicitación de los hiperparámetros de la distribución a priori y cálculo de los parámetros de la distribución a posteriori .................................................. 34.

(5) 5.3.7 Prueba de hipótesis entre los grupos de estudio ........................................ 35 6. RESULTADOS ......................................................................................................... 136 6.1 COMPONENTE BIOINFORMÁTICO .................................................................... 136 6.1.1 ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS ................................................................. 136 6.2 COMPONENTE EXPERIMENTAL EPIGENÉTICO ............................................. 37 6.2.1 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LOS DATOS ...................................................... 37 6.2.2 COMPARACIÓN DE LAS MEDIANAS DE LOS PORCENTAJES DE METILACIÓN ENTRE LOS PACIENTES CON SD Y EL GRUPO CONTROL. .... 38 6.2.3 COMPARACIÓN DE LAS MEDIANAS DE LOS PORCENTAJES DE METILACIÓN ENTRE MADRES SANAS DE PACIENTES CON SD Y EL GRUPO CONTROL. ......................................................................................................................... 51 7. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 67 8. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 78 9. PERSPECTIVAS - RECOMENDACIONES .......................................................... 79 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 80 ANEXOS ............................................................................................................................. 97.

(6) LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Diseño de la placa de PCR-RT. Cada placa contenía 96 pozos con las sondas de las secuencias promotoras de cada gen. Mo: pozos para muestras sin enzimas de restricción, la muestra presenta la cantidad total de ADN genómico para la detección en PCR-RT (tratamiento 1). Ms: pozos para muestras tratadas con enzimas de restricción MSRE las cuales son sensibles a la metilación. No son capaces de romper citosinas metiladas, dejando intacto al ADN metilado (tratamiento 2). Md: pozos para muestras tratadas con enzimas de restricción MDRE las cuales son dependientes de metilación. Rompen secuencias de ADN metilado (tratamiento 3). Msd: pozos para muestras tratadas con ambas enzimas (MSRE y MDRE) por lo cual se digiere todo el ADN (tanto metilado como no metilado). Esta reacción mide el fondo y la cantidad de ADN que se colocó inicialmente y que se resiste a ser degradado, o sea, refractario (tratamiento 4). ....................................... 31 Figura 2. Análisis de conglomerados de la expresión de los 9 genes DSCR a lo largo de las distintas estructuras del cerebro humano. Las regiones con mayor expresión se encuentran en una escala de 0.1 a 3.0 (rojo), mientras que las zonas donde hay baja expresión tienen una escala de -0.1 a -3.0 (verde). ......................................... 136 Figura 3. Medianas de los porcentajes de metilación del gen SIM2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. ........................................................................... 39 Figura 4. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen SIM2 y por hijo. .......................................................................................................... 40 Figura 5. Medianas de los porcentajes de metilación del gen RCAN1 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 41 Figura 6. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen RCAN1 y por hijo. ...................................................................................................... 41 Figura 7. Medianas de los porcentajes de metilación del gen PRMT2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 42 Figura 8. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PRMT2 y por hijo. ...................................................................................................... 42 Figura 9. Medianas de los porcentajes de metilación del gen CSTB en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. ........................................................................... 43 Figura 10. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen CSTB y por hijo. ......................................................................................................... 44.

(7) Figura 11. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCAM en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 44 Figura 12. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCAM y por hijo. ..................................................................................................... 45 Figura 13. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCR3 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 46 Figura 14. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCR3 y por hijo. ...................................................................................................... 46 Figura 15. Medianas de los porcentajes de metilación del gen BACE2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 47 Figura 16. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen BACE2 y por hijo. ...................................................................................................... 48 Figura 17. Medianas de los porcentajes de metilación del gen HMGN1 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 48 Figura 18. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen HMGN1 y por hijo. ..................................................................................................... 49 Figura 19. Medianas de los porcentajes de metilación del gen PIGP en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. .................................................................... 50 Figura 20. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PIGP y por hijo. .......................................................................................................... 50 Figura 21. Medianas de los porcentajes de metilación del gen SIM2 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 51 Figura 22. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen SIM2 y por madre. ..................................................................................................... 52 Figura 23. Medianas de los porcentajes de metilación del gen PRMT2 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 53 Figura 24. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PRMT2 y por madre. ................................................................................................. 53 Figura 25. Medianas de los porcentajes de metilación del gen RCAN1 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 54.

(8) Figura 26. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen RCAN1 y por madre. ................................................................................................. 55 Figura 27. Medianas de los porcentajes de metilación del gen BACE2 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 55 Figura 28. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen BACE2 y por madre. ................................................................................................. 56 Figura 29. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCR3 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 57 Figura 30. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCR3 y por madre. ................................................................................................. 58 Figura 31. Medianas de los porcentajes de metilación del gen CSTB en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 59 Figura 32. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen CSTB y por madre. .................................................................................................... 60 Figura 33. Medianas de los porcentajes de metilación del gen PIGP en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ......................................................... 61 Figura 34. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PIGP y por madre. ..................................................................................................... 61 Figura 35. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCAM en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ................................................... 62 Figura 36. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCAM y por madre. ................................................................................................ 63 Figura 37. Medianas de los porcentajes de metilación del gen HMGN1 en madres de niños con síndrome de Down y el grupo control. ................................................... 64 Figura 38. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen HMGN1 y por madre. ................................................................................................ 65 Figura 39. Análisis de conglomerados para los genes BACE2, HMGN1 y PIGP con base en los resultados de Olmos y colaboradores (2016). ........................................ 72.

(9) LISTA DE TABLAS Página Tabla 1. Lista de los 10 genes DSCR escogidos para evaluar la metilación de su región promotora en madres sanas y sus hijos con síndrome de Down. ................ 30 Tabla 2. Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo de madre. ............................................................................................................................ 37 Tabla 3. Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo de hijo. ................................................................................................................................. 38.

(10) LISTA DE ANEXOS Página Anexo 1. Detalle de localización de la Región Crítica del Síndrome de Down entre las bandas q22.12 y q22.2 del cromosoma 21 humano. Se muestra la distribución de algunos genes DSCR que están implicados en la patología asociada con el SD (Montoya et al., 2011). ...................................................................................................... 98 Anexo 2. Nombres y símbolos de las diferentes estructuras del cerebro humano en donde se registraron los valores de expresión (z-score). Las siglas de las subestructuras que presentan mayor expresión se encuentran resaltadas en matices de rojo. ................................................................................................................. 99 Anexo 3. Aval expedido por el Comité Institucional de Revisión de Ética Humana de la Universidad del Valle. ................................................................................................. 103 Anexo 4. Formato de consentimiento y asentimiento informado. ........................... 104.

(11) ABREVIATURAS. ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario ARN: Ácido ribonucleico ATP: Adenosín trifosfato CpG: Regiones de ADN enriquecidas por los dinucleótidos C-G DNMT: ADN-metiltransferasa DS-DM: Genes con metilación diferencial específica DSCR: Región Critica del Síndrome de Down EA: Enfermedad de Alzheimer HDAC: Histona desacetilasa HS: Hijo no afectado con síndrome de Down Hsa21: Genes localizados en el cromosoma 21 de humanos HSD: Hijo afectado con síndrome de Down MBDs: Proteínas con dominio de unión a metil-CpG MDRE: Enzima de restricción dependiente de metilación MI: Meiosis I materna MII: Meiosis II materna MS: Madre sin trisomía 21 con hijo sin síndrome de Down MSD: Madre sin trisomía 21 con hijo con síndrome de Down MSRE: Enzima de restricción sensible a la metilación MTHFR: Enzima Metilenotetrahidrofolatoreductasa MTRR: Enzima metionina sintasa reductasa SAH: S-adenosilhomositeina SAM: S-adenosilmetionina SD: Síndrome de Down TF: Factor de transcripción.

(12) RESUMEN. Las modificaciones epigenéticas están asociadas a la patogénesis de varias enfermedades; dentro de estas modificaciones la desregulación de la metilación CpG, parece ser crucial para la expresión génica. Aunque existen datos de metilación del cromosoma 21, su importancia en el síndrome de Down ha sido poco estudiada. Por esta razón, este estudio analizó los niveles de metilación CpG de las secuencias promotoras de 10 genes localizados en la región crítica del Síndrome de Down (DSCR) en niños con trisomía 21 libre y sus madres. Para ellos se obtuvieron muestras de sangre de los pacientes con SD y de sus madres sanas, las cuales estaban clasificadas en diferentes edades (menores de 20 años, de 21 a 34 años y mayores a 35 años); adicionalmente se incluyó un control pareado compuesto por madres e hijos sanos en los mismos rangos de edad. Del DNA obtenido, se cuantificó el porcentaje de metilación CpG de los 10 promotores a través de PCR en tiempo real y se analizaron los datos. Los resultados obtenidos evidenciaron perfiles diferenciales de metilación en la mayoría de los promotores de los genes DSCR entre los pacientes con síndrome de Down y el grupo control. Igualmente, esas mismas regiones promotoras mostraron diferencias de metilación entre los tres grupos de madres analizadas frente a sus controles. Estos resultados proporcionan evidencia sobre cómo ciertos mecanismos epigenéticos podrían influir tanto en el riesgo de tener un hijo con SD como en la patogénesis del SD misma, además de proponer genes candidatos que podrían contribuir grandemente en el fenotipo neurocognitivo observado en los pacientes con síndrome de Down.. Palabras clave: epigenética; síndrome de Down, metilación de DNA; DSCR; PMRT2; HMNG1..

(13) INTRODUCCIÓN El síndrome de Down es un trastorno genético causado por la presencia total o parcial de una copia extra del cromosoma 21. Dentro de su sintomatología característica se encuentra el marcado déficit cognitivo, además de otras patologías y ciertos rasgos físicos que son propios de la enfermedad (Kazemi et al., 2016; Medina et al., 1999). Debido a ello, muchos estudios han mostrado como una gran variedad de genes del cromosoma 21 posiblemente están implicados en las manifestaciones fenotípicas y patológicas (Antonarakis et al., 2004). Sin embargo, los mecanismos que estarían relacionados con el riesgo de tener un hijo con SD aun no son completamente conocidos. Hasta el momento se ha aceptado que el factor de riesgo más determinante es la edad materna avanzada. No obstante, existen reportes de niños con síndrome de Down en madres jóvenes, que en muchas ocasiones no alcanzan la edad de 25 años (Coppedè, 2009; Abdel-Hady et al., 2015). En consecuencia, las investigaciones más recientes postulan que ciertos procesos epigenéticos estarían jugando un papel trascendental en la etiopatogenia del SD, y probablemente de manera muy significativa en esas madres jóvenes (Coppedè, 2009; Božović et al., 2015). Estas observaciones se basan en el hecho de que la etapa del desarrollo temprano es altamente susceptible a eventos epigenéticos. Eso quiere decir que durante este periodo la tasa de síntesis de DNA es alta y los patrones de metilación son establecidos, al igual que los mecanismos de impronta genética, generando que el fenotipo responda a determinados estímulos internos y externos, tales como infecciones microbianas, factores demográficos, la dieta, el estrés, el consumo de alcohol, entre otros. En este contexto, el periodo gestacional se ve influenciado y determinado por el ambiente, el genotipo y la interacción que se produce entre ambos, generando así, que los patrones epigenéticos puedan ser alterados y que de esa manera se afecte la expresión de genes críticos asociados a procesos fisiológicos y patológicos (Morgan et al., 2005; Alegría-Torres et al., 2011). Actualmente, muchas investigaciones han mostrado que una restricción proteica, de grasas o de vitaminas del grupo B, afecta la metilación del DNA y las histonas durante la etapa gestacional (Silva-Zolezzi et al., 2017; Longo et al., 2017; Furuse et al., 2017; Won et al., 2017). Se ha reportado que la deficiencia en folato da como resultado una metilación aberrante del DNA, además de mutaciones puntuales, rotura de cromosomas y aumento de la frecuencia de micronúcleos, recombinación cromosómica defectuosa y aneuploidía (James et al., 1999; Mills et al., 2012). Por su parte la deficiencia de vitamina B-12 pude inducir la hipometilación del promotor de algunos genes y reprimir su transcripción (Choi & Friso, 2010). Diferentes estudios han mostrado que los reguladores epigenéticos también intervienen en procesos neuronales complejos tales como el aprendizaje y la memoria, lo que ha dado lugar a la hipótesis de que parte del fenotipo del síndrome de Down se programa de manera epigenética durante el primer trimestre del 14.

(14) embarazo. Muchas investigaciones han postulado que la trisomía 21 ejerce sus efectos pleiotrópicos mediante la desregulación de un modificador epigenético, en donde tal modificador podría estar localizado en la región crítica del síndrome de Down del cromosoma 21 (Coppedè, 2009). Sin embargo, en la actualidad es muy poco lo que se conoce con relación a los reguladores del epigenoma neuronal que nos puedan dar respuestas confiables sobre cuáles son las bases de la cognición (Korzus, 2010). Ante este panorama surgen preguntas de ¿Cómo estos reguladores intervienen en el mantenimiento de la homeostasis, influenciando la expresión de un grupo muy grande y heterogéneo de genes entre los que estarían los genes vitales (House-keeping) y otros no neuronales? o ¿Cómo un programa epigenético específico que regula genes neuronales están directamente involucrados en la determinación de la conectividad, aprendizaje y memoria? (Singh-Taylor et al., 2017; Sanchez-Mut et al., 2017). Por tal motivo, se necesitan más estudios que permitan correlacionar los cambios epigenéticos en la enfermedad y la salud, además de poder caracterizar esas marcas específicas del DNA en diferentes edades que puedan revelar la predisposición a ciertas patologías (Beyan et al., 2012; El Hajj et al., 2016; Coppedè, 2016; Mentis, 2016) Adicionalmente, en estudios previos a nivel bioinformático se ha podido caracterizar el ambiente genómico de la Región Crítica del Síndrome de Down (Montoya et al., 2011), además del comportamiento transcripcional de 38 genes localizados en la DSCR en todas las estructuras de un cerebro humano normal (Montoya et al., 2014). Con ello se ha observado que estos genes presentan una expresión diferencial a lo largo de áreas muy importantes del telencéfalo, las cuales están involucradas en el procesamiento de datos básicos referidos a la conducta, aprendizaje, memoria y control motor. Es importante resaltar que los genes analizados están implicados en procesos de diferenciación neuronal, desarrollo del sistema nervioso, regulación de procesos apoptóticos a nivel cerebral, entre otros. Sin embargo, aún falta profundizar más sobre cómo los factores epigenéticos tales como la metilación, pueden estar asociados en la etiopatogenia de este trastorno, especialmente en las madres jóvenes de niños con SD. Con el fin de establecer si existen variaciones en los perfiles de metilación a nivel intra e inter grupal, en este trabajo se compararon los perfiles de metilación de 10 de los 38 genes DSCR en madres sin trisomía 21 de diferentes edades y sus hijos con síndrome de Down, con un grupo control compuesto por madres e hijos sin trisomía 21 en los mismos rangos de edad. Los resultados ayudaron a determinar cómo los procesos de metilación CpG influyen en esta patología, además poder identificar poblaciones en riesgo.. 15.

(15) 1. GENERALIDADES SOBRE LA EPIGENÉTICA El término “epigenética” fue acuñado por Conrad Waddington en 1939. Surgió a partir de la combinación del prefijo griego “epi" (traducido literalmente como "arriba") y la palabra del griego antiguo "génesis" (origen), en un intento de explicar la interacción entre la genética y el medio ambiente y la influencia de estos procesos en el desarrollo (Pascual & Roa, 2013). A finales del siglo 20, la epigenética floreció hasta transformarse en una subdisciplina de la biología ampliamente reconocida, pero se había convertido casi en sinónimo de "herencia epigenética” (Wu & Morris, 2001). Hoy en día, la epigenética se concibe como aquellos cambios heredables colectivos en el ADN, en las histonas y en las funciones genómicas que no incluyen cambios en la secuencia de nucleótidos (secuencia primaria del ADN), pero que modifican la estructura y condensación de la cromatina, modificando así la expresión génica y por ende el fenotipo (Chahwan et al., 2011; Tollefsbol, 2011; García et al., 2012). La epigenética describe los mecanismos mediante los cuales se diferencian los múltiples tejidos de un organismo multicelular. Este proceso se logra mediante el uso de marcas moleculares que son detectables, las cuales generan alteraciones que afectan la actividad transcripcional de los genes y una vez establecidas, son relativamente inalterables en las siguientes generaciones (Morgan & Whitelaw, 2008). Aunque los cambios epigenéticos se transmiten de padres a hijos a través de la línea germinal y se conservan a través de sucesivas divisiones celulares, estos cambios heredables son potencialmente reversibles y son altamente sensibles a la fase del desarrollo y a las influencias ambientales (Casanova, 2013; McDonald, 1994). No existen criterios sencillos para distinguir entre los fenómenos genéticos y epigenéticos. En general, la genética actualmente abarca la transmisión y el procesamiento de información en el ADN, mientras que la epigenética trata su interpretación e integración con información de otras fuentes (Jablonka & Lamb, 1989). De otra parte, la epigenética comprende los sistemas de interacciones que conducen a resultados fenotípicos previsibles y generalmente funcionales, e incluye procesos de auto-organización espontánea que dependen de las propiedades físicas y químicas de los ambientes internos y externos (Jablonka & Lamb, 1995). Además, incluye estudios de las redes reguladoras celulares que confieren estabilidad fenotípica, los cambios regulados por el desarrollo en el ADN tales como los que se observan en el sistema inmune, los mecanismos de memoria celular que implican cambios heredables en la cromatina y la metilación del ADN, y las propiedades de auto-propagación de algunas conformaciones de proteínas y estructuras celulares (Jablonka & Lamb, 1989). La epigenética abarca una amplia variedad de mecanismos que ejercen programas de expresión génica a largo plazo (Delcuve et al., 2009), entre estos mecanismos 16.

(16) se encuentran la metilación del ADN (Jones, 2012), la modificación química de las histonas y variantes de las histonas, el complejo remodelador de cromatina dependiente de ATP, los complejos trithorax (TrxG) y Polycomb (PcG) (Bartke et al., 2010), y una variedad de ARN no codificante, entre los cuales se encuentran los pequeños ARN de interferencia (siARN) y microARN (miARN) (Bourc’his & Voinnet, 2010). Los efectos combinados de estos procesos definen la estructura de la cromatina en un locus particular y, por lo tanto, su potencial actividad transcripcional (Law & Jacobsen, 2010). 1.1 IMPORTANCIA PRÁCTICA Una de las razones del reciente crecimiento de la epigenética es que tanto las empresas comerciales, así como la comunidad académica, están teniendo un interés activo en lo que ocurre más allá del nivel de ADN. Actualmente se considera que la epigenética podría revolucionar áreas de la ciencia como la medicina y la agricultura, como también ha demostrado tener otras implicaciones biológicas, incluidas las prácticas de ecología y conservación (Jablonka & Lamb, 1989). Respecto al campo de la medicina, dichos mecanismos epigenéticos han adquirido gran importancia debido a que se asocian fuertemente con enfermedades tanto complejas como comunes (García et al., 2012). Las modificaciones epigenéticas están relacionadas con diferentes tipos de cáncer, ciertas enfermedades ligadas a la edad adulta, los efectos transgeneracionales de los perturbadores endocrinos, las radiaciones ionizantes, la exposición al humo de cigarrillos y la contaminación de la atmósfera, la dieta, la fecundación in vitro, el envejecimiento y el comportamiento de las mujeres embarazadas, entre otros (Casanova, 2013). Durante la década de 1990 hubo un interés renovado en la asimilación genética. Esto condujo a la elucidación de las bases moleculares de las observaciones de Conrad Waddington, donde el estrés ambiental causó una asimilación génica de ciertas características fenotípicas en moscas de la fruta del género Drosophila. Desde entonces, los esfuerzos de investigación se han centrado en desentrañar los mecanismos epigenéticos relacionados con estos tipos de cambios (Brouwer, 2012). El comprender y descifrar dichos mecanismos favorecería el entendimiento del papel protagónico del ambiente y la conducta en el desarrollo humano (Casanova, 2013), como también facilitaría el estudio del impacto en la salud de generaciones futuras (la epigenética tiene un claro impacto en la salud del individuo así como en la de su descendencia) y develaría información acerca de la evolución humana (García et al., 2012). Al menos tres mecanismos, incluyendo la metilación del ADN, la modificación postraduccional de las histonas y los ARN no codificantes (ncRNA) asociados al silenciamiento de genes, son actualmente considerados como los iniciadores y mantenedores del cambio epigenético (Egger et al., 2004).. 17.

(17) 1.2 IMPRONTA GÉNICA En los organismos diploides, los genes autosómicos se componen de dos copias, o alelos, heredados de ambos padres durante la fertilización. Para la gran mayoría de los genes autosómicos, la expresión se produce a partir de los dos alelos de forma simultánea. Sin embargo, una pequeña proporción (<1%) de los genes están impresos, lo que significa que su expresión depende del origen parental (Reig & Concha, 2012). La impronta genómica se define como la marca epigenética de los genomas parentales de un organismo diploide con respecto a su origen parental (Paulsen & Ferguson, 2001). La impronta genómica afecta la expresión de varias docenas de genes en los organismos, resultando en genes impresos que se expresan de forma preferente a partir de solamente uno de los dos cromosomas parentales. Esto es debido a las instrucciones epigenéticas - estampaciones - que se establecen en las células germinales de los padres (Reik & Walter, 2001). La impronta genómica es un mecanismo genético particularmente importante en mamíferos, y se piensa que influyen en la transferencia de nutrientes para el feto y el recién nacido. En consonancia con este punto de vista, se sabe de hecho que los genes impresos tienden a afectar el crecimiento en el útero y el comportamiento después del nacimiento. Una impronta aberrante perturba el desarrollo y es la causa de diversos síndromes y patologías. El estudio de la impronta también proporciona nuevos conocimientos sobre la modificación epigenética de los genes durante el desarrollo (Reik & Walter, 2001). Probablemente, la modificación epigenética más importante implicada en la impronta en los mamíferos es la metilación de islas CpGs. Los genes impresos se caracterizan por patrones de metilación específicos para cada uno de los alelos parentales (Paulsen & Ferguson, 2001). La metilación del ADN es una de las modificaciones epigenéticas más conocidas y su función es crítica para el establecimiento de la impronta. El patrón global de la metilación genómica es estable y heredable, sin embargo, éste es borrado y re-establecido de una manera sexual dependiente en dos períodos críticos del desarrollo embrionario. Funcionalmente, la mayoría de los genes impresos juegan un papel en el control del crecimiento y el desarrollo embrionario y placentario (Reig & Concha, 2012). Los defectos en los procesos de impronta génica están frecuentemente relacionados con anomalías del desarrollo neurológico y crecimiento, propios de los casos de Prader-Willy, Angelman, de Beckwith-Wiedemann, y los síndromes de Plata-Russel (García et al., 2012). Se cree que otras enfermedades humanas también pueden estar relacionados con el deterioro de la impronta parental, tales como el autismo, trastornos bipolares, la diabetes, la miocardiopatía hipertrófica familiar, la esquizofrenia, e incluso el cáncer (Pascual & Roa, 2013).. 18.

(18) 1.3 METILACIÓN DEL ADN La metilación del ADN se produce en la mayoría de los dinucleótidos CpG en el genoma de mamíferos y es esencial para la viabilidad embrionaria (Newell-Price et al., 2000). La metilación del ADN, entre todos los mecanismos epigenéticos, es probablemente la mejor estudiada y mejor comprendida. Se basa en la adición de un grupo metilo al carbono 5' de un residuo de citosina cuando es seguido por una guanina, constituyendo lo que se conoce como un dinucleótido CpG (Bird, 2002). Estos dinucleótidos CpG se encuentran a una frecuencia más baja de lo esperado al azar en el genoma humano, probablemente debido a la desaminación espontánea de metilcitosinas a timidinas (CpG → TPG), haciéndolos particularmente sensible a las mutaciones o disminuciones. Sin embargo, en algunas regiones conocidas como islas CpG, estos dinucleótidos CpG se encuentran a frecuencias más altas (Pelizzola & Ecker, 2011). Otros tipos de metilación tales como los que se producen en citosinas dentro de un contexto CpNpG o CPA, han sido descritos en las células madre embrionarias de ratones y plantas, pero son raros en tejidos somáticos humanos (Law & Jacobsen, 2010). La metilación del ADN puede ser transmitida de forma estable a las células hijas después de la división celular, influenciando la unión de algunas proteínas y factores de transcripción al ADN, afectando en última instancia la accesibilidad al locus, la estabilidad genética, y la expresión génica (Pelizzola & Ecker, 2011). Por lo tanto, la metilación del ADN ha sido implicada en múltiples procesos celulares, tales como la regulación de genes, la interacción proteína-ADN, la diferenciación celular, y la supresión de elementos transponibles (Pascual & Roa, 2013). Con varias de las proteínas clave ahora conocidas, se ha hecho posible acercarse a la importancia biológica de este sistema epigenético a través de la bioquímica y la genética. Como resultado, se han logrado avances en la comprensión de los mecanismos por los que la metilación del ADN está dirigida a regiones específicas del genoma y es interpretada por las proteínas ligadoras metil-CpG (Klose et al., 2006). La metilación del ADN está asociada con el silenciamiento de la expresión génica. El mecanismo predominante implica la metilación del ADN y el posterior reclutamiento de proteínas ligadoras que reconocen preferentemente el ADN metilado. A su vez, estas proteínas se asocian con histonas deacetilasas y complejos de remodelación de la cromatina para lograr la estabilización de la cromatina condensada (Newell-Price et al., 2000). Estudios recientes han iluminado sobre el papel de la metilación del ADN en el control de la expresión génica y han reforzado sus vínculos con la modificación de histonas y la remodelación de la cromatina (Klose et al., 2006). En los mamíferos, las modificaciones epigenéticas juegan un papel crucial en el mantenimiento de los programas de transcripción celular y la organización de la arquitectura del ADN dentro del núcleo. Se sabe que las aberraciones en el 19.

(19) epigenoma pueden dar lugar a diversas enfermedades. Algunas perjudican el desarrollo normal y otras están estrechamente relacionadas con el desarrollo del cáncer (Esteller, 2011), mientras que otras están relacionadas con alteraciones en el modelado de metilación del ADN o con los sistemas de reconocimiento, como es el caso de algunos síndromes (Pascual & Roa, 2013). Cada vez es más claro que el silenciamiento de genes a través de la metilación de la citosina de los dinucleótidos CpG, trae consigo muchos eventos epigenéticos que cooperan para establecer un ambiente represivo para la expresión génica (Laird, 2010). En términos generales, la metilación en las regiones promotoras se asocia fuertemente con el silenciamiento de genes. Un promotor es la región de ADN que está situada "hacia arriba" del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de un gen e inicia y controla la transcripción de ese gen. La metilación de los promotores impide la unión de los factores de transcripción, y en una segunda etapa, conduce a la condensación de la cromatina, con una represión a largo plazo de la expresión génica (Stewart, 2016).. 20.

(20) 2. LA METILACIÓN DEL ADN Y SU IMPLICACIÓN EN EL SÍNDROME DE DOWN El síndrome de Down es una alteración cromosómica numérica (presencia de tres copias parciales o totales del cromosoma humano 21 (Hsa21)) y es la causa más común de discapacidad mental en humanos y la anomalía cromosómica congénita con mayor frecuencia de supervivencia (Hook et al., 1983; Casanova, 2013). Tiene una prevalencia en la población general de 1/600 a 1/1000 nacidos vivos, convirtiéndose en una importante causa del gasto de recursos en los programas nacionales de salud pública. Además, es el prototipo para el estudio de la aneuploidía humana (Korenberg et al., 1994). Los fenotipos de SD son complejos y variables. Incluyen deterioro cognitivo, cardiopatías congénitas, anomalías cráneo-faciales, y anomalías congénitas gastrointestinales (Hook, 1982; Kuhn et al., 2010). De igual manera incluye también un conjunto característico de rasgos faciales y físicos (musculo-esqueléticos), defectos de los sistemas inmunológico y endocrino, un mayor riesgo de leucemia infantil y una demencia de tipo Alzheimer (Korenberg et al., 1994). El impacto del síndrome de Down en las capacidades de desempeño es en la mayoría de los aspectos comparable al de otras condiciones que causan discapacidad intelectual. Sin embargo, las debilidades relativas en algunos aspectos del lenguaje y la memoria verbal son específicos de esta etiología, y hay una necesidad imperiosa de comprender la base subyacente para este perfil (Silverman, 2007). La etiología embrionaria del SD se asocia a la no disyunción cromosómica en la meiosis I en los gametos maternos, lo cual genera una copia extra ya sea parcial o total del cromosoma 21 (Montoya et al., 2008). A pesar que los estudios experimentales que utilizan tejidos derivados de individuos con SD han confirmado que la expresión de genes trisómicos se incrementa en ~50%, es decir, son consistentes con la dosificación génica (Mao et al., 2003) la explicación molecular para este fenómeno no es conocida. El único factor epidemiológico aceptado para el SD hasta el momento es la edad materna avanzada. No obstante, hay una alta incidencia de SD procedente de madres jóvenes, por lo cual en la actualidad varias investigaciones han propuesto que ciertos errores metabólicos en el ciclo del folato pueden ser un posible factor de riesgo de SD, especialmente las mutaciones genéticas en la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y en la metionina sintasa reductasa (MTRR) (Montoya et al., 2008). Estos estudios indican que las mujeres que tienen un hijo SD a una edad temprana pueden tener una predisposición genética a la mala segregación cromosómica tanto en las células somáticas como en las células germinales. Otros estudios han confirmado el aumento del daño cromosómico en las células sanguíneas de las mujeres que han tenido un niño con SD a una edad temprana y han señalado un posible papel de los polimorfismos en los genes para la metabolización del folato en. 21.

(21) afectar tanto a los cromosomas (daño) y el riesgo para desarrollar SD (Migliore et al., 2009). El metabolismo del folato es necesario para la síntesis del principal agente de metilación del ADN: S-Adenosilmetionina (SAM). Actualmente se sabe que, en los ratones, los suplementos de donantes de metilo maternos durante la gestación pueden alterar el fenotipo de la descendencia vía metilación de islas CpG específicas (Waterland & Jirtle, 2003). Sin embargo, hace 10 años, se sugirió que el deterioro del metabolismo del folato, resultante de la presencia de un polimorfismo funcional del gen de la metilenotetrahidrofolato reductasa, podría ser un factor de riesgo materno para tener un infante con SD (James et al., 1999). Se tiene como hipótesis que una cromatina centromérica estable de ADN podría depender de la herencia epigenética de patrones de metilación centroméricos específicos y de la unión de proteínas metilo-sensibles específicas para mantener la arquitectura del ADN de orden superior necesaria para el montaje de los cinetocoros. Por lo tanto, se ha sugerido que la hipometilación pericentromérica, resultante de una ingesta inadecuada de folato y/o un metabolismo alterado del folato, podría perjudicar la formación del cinetocoro, dando como resultado una no disyunción cromosómica (Migliore et al., 2009; James et al., 1999). Actualmente se conoce que la sobre-expresión de algunos genes específicos sensibles a la dosis no es la única causa, sino que también el trastorno es debido a la desregulación de elementos genéticos no codificadores, por la expresión anormal de genes que, incluso, no pertenecen al cromosoma 21, y por un conjunto de influencias epigenéticas (Vilardell et al., 2011; Flórez, 2016). Hace más de 50 años que se demostró que el síndrome de Down era el resultado de la trisomía 21, pero aún se está lejos de entender cómo esta aneuploidía cromosómica conduce al espectro de fenotipos propios de este síndrome. Una hipótesis reciente involucra a la epigenética, argumentando que el cromosoma adicional 21 podría actuar en trans para producir perturbaciones de red dentro de las células, conduciendo así a alteraciones epigenéticas donde se incluyen cambios en la metilación del ADN, los cuales se propagarían a las células hijas en los tejidos en desarrollo (Kerkel et al., 2010). Dentro de este grupo de genes con metilación diferencial específica SD (DSDM), se han encontrado casos de codificación de señales claves para la transducción de proteínas y los factores de transcripción (TFs) necesarios para el desarrollo y la función de linfocitos, los cuales probablemente juegan un papel en la inmunodeficiencia leve y en el aumento a la susceptibilidad a los trastornos autoinmunes en SD (Mendioroz et al., 2015). De esta manera, se ha planteado que los fenotipos neurológicos observados en SD pueden no ser del todo debidos al desequilibrio genómico generado por la triplicación de los genes Hsa21, sino también debido a influencias adicionales sobre genes asociados dentro de una red dada y a la modificación de la expresión génica causada por factores epigenéticos como la metilación de ADN (Lu & Sheen, 2011), lo cual ha sido planteado por numerosos estudios epigenéticos en donde se ha 22.

(22) encontrado una alta probabilidad de que la metilación del ADN tenga efectos significativos en la disfunción del neurodesarrollo en el SD (Lu & Sheen, 2013). La metilación del ADN en la posición 5 de las citosinas, tiene el efecto específico de reducir la expresión génica al impedir físicamente la unión de proteínas transcripcionales al gen en sí mismo o, mediante el reclutamiento de complejos de proteínas incluyendo las proteínas con dominio de unión a metil-CpG (MBDs), histona desacetilasas (HDACs) y otras proteínas de remodelación de la cromatina (Bestor, 2000). Además, los factores ambientales tales como toxinas químicas o estrés oxidativo pueden acumularse con el tiempo y tener un efecto sobre la transcripción de genes. En conjunto, estos procesos modifican la transcripción del ADN y pueden afectar muchos procesos del desarrollo neurológico (Lu & Sheen, 2013). La metilación del ADN se refiere a un proceso de modificación del ADN que implica la transferencia enzimática de un grupo metilo a partir de un donante de metilo (S-adenosilmetionina) al carbono 5 de la citosina en los sitios 5'-CpG-3'. Las enzimas que llevan a cabo esta reacción se llaman metiltransferasas de ADN (DNMTs). Hay cinco miembros de esta familia: DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B y DNMT3L. DNMT1 es responsable del mantenimiento de la metilación del ADN, mientras que DNMT3A y DNMT3B están implicadas en la metilación "de novo" del ADN. Las enzimas DNMT2 están involucradas en la metilación del ARN. La DNMT3L (ADN metiltransferasa tipo 3) no tiene actividad enzimática, pero puede estimular a DNMT3A y activar a DNMT3B (Suetake et al., 2004). La metilación del ADN puede ocurrir en cualquier sitio CpG en el genoma, pero la metilación en las regiones promotoras, mediante distintos reguladores, por lo general causa reducción en la expresión de genes (Gopalakrishnan et al., 2008) y, por tanto, afecta muchos procesos fisiológicos. En este contexto, las proteínas que afectan a la maquinaria de metilación en SD podrían alterar la expresión de genes y contribuir al fenotipo del SD (Lu & Sheen, 2013). Varios análisis han propuesto dicho papel de la metilación del ADN en el fenotipo del síndrome de Down, observando alteraciones sustanciales que se producen durante la diferenciación de las células madre, lo que indica que estos efectos epigenéticos también podrían ser importantes no sólo durante el desarrollo cortical y general, sino también en procesos patológicos de SD (Brunner et al., 2009). Varias publicaciones han mostrado cambios globales en la metilación del ADN en SD (Kerkel et al., 2010). Por ejemplo, las proteínas individuales en Hsa21 tales como beta amiloide (la proteína codificada por Hsa21) pueden inducir hipometilación global (Chen et al., 2009). Una comparación entre la metilación normal y la metilación SD en los leucocitos adultos de SD y los linfocitos T, usando perfiles basados en microarrays se identificó un pequeño subconjunto de genes con metilación alterada, implicados en el desarrollo de linfocitos y específico para las células de la población con SD (Lu et al., 2016). Entre los genes identificados, cinco candidatos (TMEM131, CD3Z, NOD2 y NPDC1) mostraron correlación con la expresión de ARN, y los cambios de metilación podrían ser recapitulados mediante 23.

(23) la exposición de linfocitos normales a la droga desmetilación 5-azacitidina. Estos genes son conocidos por desempeñar papeles en el desarrollo de linfocitos (Kerkel et al., 2010). Los estudios en células epiteliales bucales adultas de SD condujeron a la selección de genes diferenciadamente metilados, correlacionados con el deterioro cognitivo (Jones et al., 2013). También se observó hipermetilación global de ADN en muestras de vellosidades de placenta en SD (Jin et al., 2013). Por último, la cuantificación del estado de metilación del ADN en varios tejidos somáticos en SD (cerebro, riñones, pulmones, músculos y piel) sugiere que la metilación del ADN es un proceso de cambio dinámico, temporal y espacial que se define como específico para la edad y el tipo de tejido (Kangaspeska et al., 2008). Por lo cual se ha sugerido que la metilación del ADN podría afectar potencialmente el desarrollo neurológico en SD mediante la modulación de la expresión génica en las neuronas (Feng et al., 2010). Aunque son limitadas las comparaciones entre los resultados encontrados en diferentes tejidos, éstas sugieren un posible cambio de hipermetilación global en la metilación del ADN en la corteza fetal en SD, con grandes diferencias observadas sólo en un pequeño subgrupo específico de los sitios promotores. En estudios actuales, se han realizado perfiles de metilación de ADN en progenitores neurales humanos de SD y se han encontrado cambios epigenéticos globales debido a la trisomía 21 con hipermetilación global (Lu et al., 2016). Se requiere saber si otros genes Hsa21, además de DNMT3L, podrían cambiar la expresión o actividad de varios modificadores epigenéticos incluyendo las DNMTs, MBDs, HDACs o TETs. En general, la modificación epigenética proporciona una capa adicional de complejidad a la red interactiva establecida a partir de la sobre expresión de los genes en Hsa21 (Lu & Sheen, 2013). Estos modificadores también sirven como candidatos atractivos, dados los amplios efectos que potencialmente tienen en un fenotipo particular. Los análisis de genes candidatos sugieren que DNMT3L está sobre-expresado en SD dada su ubicación en el cromosoma 21 (Suetake et al., 2004). Por otra parte, otros estudios han implicado varios genes Hsa21 en la alteración de los sitios de metilación de genes implicados en estas mismas vías. Las vías metabólicas requeridas a través de la regulación epigenética contribuyen directamente a los mecanismos patológicos conocidos identificados en la expresión génica, como el estrés oxidativo, la gliosis y la disfunción mitocondrial. Respecto a esto, los fenotipos cerebrales en SD probablemente surgen de la integración de varios factores genéticos y epigenéticos en el cromosoma 21 (Lu & Sheen, 2011). Se ha demostrado que la trisomía 21 lleva a cambios en la metilación CpG en un conjunto de alrededor de 100 genes en células sanguíneas periféricas de adultos con SD (Kerkel et al., 2010). Más recientemente se ha encontrado en las placentas de SD un fenómeno similar de alteraciones epigenéticas, que afectan a un conjunto diferente de genes con unos pocos solapamientos (Jin et al., 2013). Se han realizado investigaciones en adultos (cerebro y cerebelo) y fetos (cerebro) con y sin 24.

(24) síndrome de Down, complementado con datos para linfocitos T en SD y controles y, los resultados muestran que existe una respuesta epigenética recurrente a la trisomía 21 tanto en las neuronas como en las células cerebrales no neuronales (principalmente gliales), con una ganancia predominante de metilación de CpG en conjuntos discretos de genes en varios cromosomas. La separación de los núcleos de las células en neuronales y no neuronales resulta ser crucial para la identificación de los loci DS-DM en neuronas específicas, y diferentes regiones anatómicas del cerebro han revelado sólo de forma parcial conjuntos de genes DS-DM solapados. Basándose en los datos de los cerebros fetales, muchos de los cambios epigenéticos se inician temprano en el desarrollo del cerebro y afectan a los genes regulados en el desarrollo (Silverman, 2007). De esta manera, la presencia de un cromosoma extra 21 hace que el síndrome de Down sea un trastorno biológicamente complejo. En la actualidad se ha completado la cartografía del cromosoma humano 21 y anotaciones recientes en bioinformática han establecido que Hsa21 alberga más de 600 genes incluyendo no menos de 235 genes codificadores de proteínas y 142 pseudogenes (Sturgeon et al., 2012). La sobre-expresión de cualquiera de estos genes podría influir en el desarrollo en sí mismo, pero estos productos genéticos también pueden interactuar entre sí y con los genes de otros cromosomas para afectar el desarrollo en formas importantes. No obstante, varios estudios con trisomías parciales del cromosoma 21, han sugerido que la alteración de dosificación de una región específica puede contener algunos genes candidatos, en donde su desbalance puede inducir la serie de trastornos relacionados con el SD, así como el marcado déficit cognitivo. Esta región ha sido conocida como “Región Crítica del Síndrome de Down” (anexo 1), y está localizada en el extremo distal del brazo largo del cromosoma 21 (21q22.1-22.3) (Rahmani et al., 1989; Korenberg et al., 1990). Sin embargo, diversos estudios han sugerido que la sola presencia de esta región no explica toda la sintomatología típica, sino que además es necesaria la interacción de manera individual y/o conjunta de diferentes genes que se encuentran fuera de la DSCR en el cromosoma 21 (Mao et al., 2005; Lockstone et al., 2007). A pesar de ello, los estudios revelan que aunque no es suficiente la triple dosis génica de la DSCR, ésta juega un papel crucial en las interacciones genómicas y epigenéticas que intervendrían en la patogénesis del SD; así pues su conocimiento brindará una mayor comprensión sobre los eventos ocurridos a nivel molecular, además de su posible implicación con las disfunciones neurológicas (Rachidi & Lopes, 2007; Montoya et al., 2011).. 25.

(25) 3. RECURSOS BIOINFORMÁTICOS Y EXPRESIÓN CEREBRAL El patrón de expresión de un gen proporciona información indirecta acerca de su función. Por este motivo, se han utilizado micromatrices de ADN para cuantificar la cantidad de expresión de un determinado gen con el fin de elucidar las bases moleculares de los procesos vitales. La utilización de estas herramientas han incrementado la comprensión de los mecanismos involucrados en el desarrollo de tejidos y órganos, e incluso para la caracterización molecular de enfermedades; en su conjunto estos enfoques son útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades ligadas a determinados patrones de expresión y, permitir la identificación de potenciales blancos terapéuticos (López et al. 2002). La base de datos Atlas Allen del Cerebro Humano (http://www.alleninstitute.org) contiene información anatómica y genómica de cerebros humanos, además de datos de niveles de expresión obtenidos de micromatrices de ADNc. Debido a ello es posible obtener información transcripcional de diversos genes referenciados con códigos Entrez Gene, y de esa manera, reunir información sobre la expresión de miles de genes a lo largo de todas las regiones cerebrales.. 26.

(26) 4. OBJETIVOS. 4.1 OBJETIVO GENERAL Analizar, en una muestra poblacional de la ciudad de Cali, Valle del Cauca, los perfiles de metilación CpG en la región promotora de 10 genes localizados en la región crítica del síndrome de Down, tanto en madres sin trisomía 21 de diferentes edades como en sus hijos con síndrome de Down. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS     . Calcular el porcentaje de metilación de la región promotora de 10 genes DSCR en tres grupos de madres sin trisomía 21 y sus hijos con SD. Cuantificar si existen diferencias en los perfiles de metilación entre los grupos de casos y controles para las 10 secuencias promotoras de los genes DSCR. Analizar si hay una asociación en la variable edad materna y en las improntas epigenéticas entre los tres grupos de madres con sus hijos SD. Analizar si el control epigenético de estos genes está asociado a la etiopatogénesis del SD. Construir perfiles de transcripción de los genes DSCR en todas las estructuras del cerebro humano normal, para correlacionar los niveles de expresión génica con la localización cerebral y su implicación con el fenotipo neurocognitivo del SD.. 27.

(27) 5. MATERIALES Y MÉTODOS Este estudio incluyó dos componentes: uno bioinformático y otro experimental epigenético. 5. 1 COMPONENTE BIOINFORMÁTICO Se realizó un pequeño análisis bioinformático en el que se hallaron los valores de transcripción de 9 de los 10 genes DSCR incluidos en este estudio en todas las diferentes estructuras del cerebro humano (ver anexo 2). Los niveles de expresión se extrajeron de la base de datos del cerebro humano del Instituto Allen para las Ciencias del Cerebro. Todos los procedimientos utilizados para la obtención de los datos empleados en este estudio, se consignan de manera extensa en el informe técnico del “Allen Institute for Brain Sciences” (http://help.brainmap.org/display/humanbrain/Documentation). 5.1.1 Minería de datos De la base de datos de micromatrices de ADN del “Allen Brain Atlas” (http://www.brain-map.org) se extrajeron los valores de transcripción de los 9 genes DSCR a partir de cerebros post-morten de individuos adultos sanos. Con ello se registraron los valores de expresión normalizados (z-score), y se consignaron en hojas electrónicas en formato Excel para su posterior análisis. Para cada estructura se tomaron los valores de todas las sondas disponibles y se consideró como dato final la mediana de esos valores. 5.1.2 Análisis de conglomerados A partir de las medianas obtenidas para cada una de las estructuras cerebrales se realizó un agrupamiento jerárquico con el software de uso libre Cytoscape, versión 3.2.0. La representación gráfica de los resultados fue a través de un mapa de calor (heat-map), por medio del plugin clusterMaker con una distancia métrica de correlación de Pearson.. 5.2 COMPONENTE EXPERIMENTAL EPIGENÉTICO La parte experimental corresponde al estudio de los perfiles de metilación de la región promotora de los 10 genes DSCR.. 28.

(28) 5.2.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Para determinar los perfiles de metilación de la secuencia promotora de los 10 genes DSCR, se utilizaron los siguientes criterios de inclusión: 1. Madre sana con hijo afectado de síndrome de Down confirmado por cariotipo (trisomía libre), los cuales sean residentes en Santiago de Cali de diferentes estratos socioeconómicos. 2. Madre sana con hijo no afectado de síndrome de Down, los cuales sean residentes en Santiago de Cali de diferentes estratos socioeconómicos. 3. Tanto los niños con síndrome de Down como los niños sanos deben estar en un rango de edad de mínimo 6 meses y máximo 3 años. 5.2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL Se realizó un control pareado para la variable “edad materna”, y se incluyeron en el estudio los siguientes grupos de muestras provenientes de leucocitos de sangre periférica de cada uno de los participantes: 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas menores de 20 años y su hijo con SD. 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas entre los 21-34 años y su hijo con SD. 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas mayores de 35 años y su hijo con SD. 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas menores de 20 años y su hijo sano. 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas entre los 21-34 años y su hijo sano. 1 muestra de DNA de leucocitos de 2 madres sanas mayores de 35 años y su hijo sano.. Genes incluidos en el estudio Los 10 genes DSCR fueron seleccionados teniendo en cuenta los resultados obtenidos por nuestro grupo de investigación acerca de su expresión génica. Estos genes presentaron los niveles de transcripción (z-score) más altos en estructuras cerebrales estrechamente relacionadas con aprendizaje, memoria, atención y coordinación locomotora (Montoya et al., 2014) (ver tabla 1).. 29.

(29) Tabla 1. Lista de los 10 genes DSCR escogidos para evaluar la metilación de su región promotora en madres sanas y sus hijos con síndrome de Down. Código NCBI. Símbolo. Nombre. Locus. 1827. RCAN1. Regulador de Calcineurina 1. 21q22.1q22.2. 10311. 51227. DSCR3. PIGP. Gen 3 de la región critica del Síndrome de Down Anclaje de fosfatidilglicano de clase P. 21q22.2. 21q22.2. Proceso molecular* Transcripción dependiente de ADN Transporte vacuolar Pre-ensamblaje de GPI en membranas de RE Proteólisis de ectodominio de proteína de membrana. Componente celular** Núcleo Retículo Endoplasmático Integral de membrana. 25825. BACE2. Sitio beta de la enzima de escisión de APP - 2. 21q22.3. 6493. SIM2. “Solo memoria” factor de transcripción 2 de la familia bHLH. 21q22.2 21q22.13. 54014. BRWD1. Bromodominio y dominio WD repetido 1. 21q22.2. 3150. HMGN1. Grupo de alta Movilidad de Unión 1 a Nucleosoma. 21q22.3 21q22.2. 1826. DSCAM. Molécula de adhesión celular del síndrome de Down. 21q22.2. Adhesión celular. Integral de membrana plasmática. 1476. CSTB. Cistatina B. 21q22.3. Comportamiento locomotor adulto. Citoplasma. 3275. PRMT2. Proteína arginina metiltransferasa 2. 21q22.3. Crecimiento de las células en desarrollo. Citoplasma. Diferenciación celular Regulación de la transcripción dependiente de ADN Regulación positiva de la elongación de la transcripción, dependiente de ADN. Aparato de Golgi. Núcleo. Citoplasma. Cromatina. (*) Tomado de la página del correspondiente gen de la base de datos “Genes” Proceso Molecular, del “National Institute for Biotechnology Information” (NCBI). (**) Tomado de la página del correspondiente gen de la base de datos “Genes” Componente, del “National Institute for Biotechnology Information” (NCBI). 5.2.3 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Y CUANTIFICACIÓN DE ISLAS CpG Para el respectivo análisis se tomaron muestras de sangre periférica bajo consentimiento informado de cada uno de los participantes, y con el previo aval del. 30.

(30) comité de ética de la Universidad del Valle (anexos 3 y 4). Los leucocitos se separaron por Ficoll-Hypaque, e inmediatamente se extrajo el DNA utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue de Qiagen, para este paso se siguió el protocolo recomendado por la casa fabricante. Después de esto, se calculó la concentración de DNA en cada una de las muestras con el equipo Thermo Scientific NanoDrop 2000, y se realizó una PCR convencional de beta-globina para evaluar que la muestra amplificara correctamente, esos resultados se verificaron por medio de una electroforesis en el gel de agarosa al 1%. Después de evaluar que las muestras amplificaran se realizó la cuantificación de las islas CpG de cada uno de los promotores de los 10 genes, para ello se diseñaron 24 placas de 96 pozos por medio del kit “EpiTect Methyl II Custom PCR Arrays” de Qiagen. Es importante mencionar que cada placa tenía la capacidad de cuantificar la metilación de la región promotora de los 10 genes DSCR en 2 muestras, y contenían además 2 controles llamados SEC y DEC que sirven para verificar la confiabilidad del ensayo. De esta manera, se sacaron cuatro alícuotas de cada muestra de ADN y se sometieron a diferentes tratamientos de degradación enzimática, para ello se utilizaron las enzimas de restricción MSRE (sensible a la metilación) y MDRE (dependiente de metilación). Posteriormente se depositaron 25 µl de cada uno de los 4 tratamientos (Mo, MS, Md y Msd) en los respectivos pozos tal como lo establece el protocolo de la casa fabricante (Figura 1). Figura 1. Diseño de la placa de PCR-RT. Cada placa contenía 96 pozos con las sondas de las secuencias promotoras de cada gen. Mo: pozos para muestras sin enzimas de restricción, la muestra presenta la cantidad total de ADN genómico para la detección en PCR-RT (tratamiento 1). Ms: pozos para muestras tratadas con enzimas de restricción MSRE las cuales son sensibles a la metilación. No son capaces de romper citosinas metiladas, dejando intacto al ADN metilado (tratamiento 2). Md: pozos para muestras tratadas con enzimas de restricción MDRE las cuales son dependientes de metilación. Rompen secuencias de ADN metilado (tratamiento 3). Msd: pozos para muestras tratadas con ambas enzimas (MSRE y MDRE) por lo cual se digiere todo el ADN (tanto metilado como no metilado). Esta reacción mide el fondo y la cantidad de ADN que se colocó inicialmente y que se resiste a ser degradado, o sea, refractario (tratamiento 4).. 31.

(31) Para cuantificar el porcentaje de citosinas metiladas en cada muestra se utilizó el equipo de PCR en tiempo real CFX96 Real-time system/c-1000 Touch thermal cycler (Bio Rad), y finalmente se extrajeron y se analizaron los resultados de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Dentro de los datos extraídos del equipo de PCR el gen BRWD1 presentó errores en algunas placas (la sonda no era leída por el equipo y marcaba como “error”), debido a ello se decidió no tener en cuenta sus resultados en ningún participante. 5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 5.3.1 Análisis descriptivo de los datos Como primer paso, se realizó un análisis descriptivo de los porcentajes de metilación mediante la determinación de los valores mínimos y máximos presentados para los casos y controles, fijando el gen, el tipo de madre e hijo y teniendo en cuenta todos los grupos de edad de las madres. Debido al número reducido de datos no es recomendable la comparación de los rangos por edades con tan solo dos valores, es por esto que se evaluaron los valores mínimos y máximos tomando para cada gen y tipo de madre o hijo, los datos de los tres grupos de edad. Además de ello, se decidió utilizar estadística bayesiana y el Teorema de Bayes para la estimación de la media, mediana, DIC y regiones de HPD del 95% para los porcentajes de metilación de los diferentes grupos de estudio.. 32.

(32) 5.3.2 Identificación de la distribución de probabilidad para la verosimilitud de los datos Se asoció para la función de verosimilitud de los porcentajes de metilación, una distribución uniforme en el intervalo (0, θ) donde θ corresponde al valor posible del porcentaje y está definido entre 0 y 100. Se escogió esta distribución suponiendo para cada valor del porcentaje de metilación igual probabilidad de ocurrencia. 5.3.3 Identificación y elicitación de la distribución a priori Para la distribución a priori de las madres y de los hijos, se utilizó como distribución conjugada de la uniforme, la distribución Pareto, donde el parámetro de forma se interpreta como la medida de amplitud de la distribución de los porcentajes de metilación y el parámetro de escala como el porcentaje mínimo de los datos de metilación. Con respecto al proceso de elicitación de los dos hiperparámetros de la distribución a priori, se igualó la expresión de la media muestral y la poblacional de la variable, obteniendo una expresión que permitió hallar el valor del parámetro de forma, para lo cual se requirió el uso de valores mínimos y máximos de los datos de información a priori, generando así cuatro escenarios:    . Valor mínimo y máximo de los controles, Valor mínimo y máximo de los casos, Valor mínimo y máximo de los casos y los controles, Promedio de los valores mínimos y promedio de los valores máximos de casos y controles.. De acuerdo a la información brindada por cada uno de los escenarios, se elicitó el valor del parámetro de forma y el parámetro de escala, el cual corresponde al valor mínimo de los datos. Para cada uno de los cuatro escenarios y cada grupo de estudio, se halló el valor de los parámetros de la distribución a posteriori (distribución Pareto) y se procedió a ajustar los modelos para la estimación puntual y por intervalo. El proceso de simulación de los datos de la distribución a posteriori se realizó mediante el programa estadístico R, donde se generaron 10000 números aleatorios de la distribución Pareto para cada modelo y se realizó la estimación de la media, mediana, DIC y regiones de credibilidad del 95%. 5.3.4 Selección de los mejores modelos para cada grupo de estudio Dado al gran número de modelos ajustados entre los cuatro escenarios, se utilizó el DIC como metodología para seleccionar el mejor modelo entre los diferentes 33.

Figure

Tabla 2. Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo  de madre

Tabla 2.

Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo de madre p.36
Tabla 3. Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo  de hijo

Tabla 3.

Valores mínimos y máximos de los porcentajes de metilación por gen y tipo de hijo p.37
Figura 3. Medianas de los porcentajes de metilación del gen SIM2 en pacientes con  síndrome de Down y el grupo control

Figura 3.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen SIM2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control p.38
Figura 4. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen SIM2 y por hijo

Figura 4.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen SIM2 y por hijo p.39
Figura 6. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen RCAN1 y por hijo

Figura 6.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen RCAN1 y por hijo p.40
Figura 5. Medianas de los porcentajes de metilación del gen RCAN1 en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control

Figura 5.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen RCAN1 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control p.40
Figura 7. Medianas de los porcentajes de metilación del gen PRMT2 en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control.

Figura 7.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen PRMT2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. p.41
Figura 8. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen PRMT2 y por hijo

Figura 8.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PRMT2 y por hijo p.41
Figura 9. Medianas de los porcentajes de metilación del gen CSTB en pacientes con  síndrome de Down y el grupo control

Figura 9.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen CSTB en pacientes con síndrome de Down y el grupo control p.42
Figura 10. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen CSTB y por hijo

Figura 10.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen CSTB y por hijo p.43
Figura 11. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCAM en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control.

Figura 11.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCAM en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. p.43
Figura 12. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen DSCAM y por hijo

Figura 12.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCAM y por hijo p.44
Figura 14. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen DSCR3 y por hijo

Figura 14.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCR3 y por hijo p.45
Figura 13. Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCR3 en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control

Figura 13.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen DSCR3 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control p.45
Figura 15. Medianas de los porcentajes de metilación del gen BACE2 en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control.

Figura 15.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen BACE2 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. p.46
Figura 16. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen BACE2 y por hijo

Figura 16.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen BACE2 y por hijo p.47
Figura 17. Medianas de los porcentajes de metilación del gen HMGN1 en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control.

Figura 17.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen HMGN1 en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. p.47
Figura 18. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen HMGN1 y por hijo

Figura 18.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen HMGN1 y por hijo p.48
Figura 20. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen PIGP y por hijo

Figura 20.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PIGP y por hijo p.49
Figura 19. Medianas de los porcentajes de metilación  del gen PIGP en pacientes  con síndrome de Down y el grupo control.

Figura 19.

Medianas de los porcentajes de metilación del gen PIGP en pacientes con síndrome de Down y el grupo control. p.49
Figura 22. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen SIM2 y por madre

Figura 22.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen SIM2 y por madre p.51
Figura 24. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen PRMT2 y por madre

Figura 24.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PRMT2 y por madre p.52
Figura 26. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen RCAN1 y por madre

Figura 26.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen RCAN1 y por madre p.54
Figura 28. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen BACE2 y por madre

Figura 28.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen BACE2 y por madre p.55
Figura 30. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen DSCR3 y por madre

Figura 30.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCR3 y por madre p.57
Figura 32. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen CSTB y por madre

Figura 32.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen CSTB y por madre p.59
Figura 34. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen PIGP y por madre

Figura 34.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen PIGP y por madre p.60
Figura 36. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen DSCAM y por madre

Figura 36.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen DSCAM y por madre p.62
Figura 38. Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del  gen HMGN1 y por madre

Figura 38.

Mediana y regiones HPD del 95% para los porcentajes de metilación del gen HMGN1 y por madre p.64
Figura  39.  Análisis  de  conglomerados  para  los  genes  BACE2,  HMGN1  y  PIGP  a  partir de los resultados de Olmos y colaboradores (2016)

Figura 39.

Análisis de conglomerados para los genes BACE2, HMGN1 y PIGP a partir de los resultados de Olmos y colaboradores (2016) p.71

Referencias

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