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Determinación de la secuencia del gen clonado para descartar posibles errores en la amplificación.

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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

BIOLOGÍA MOLECULAR DE BIOTECNOLOGÍA – AÑO 2017

En el transcurso de los trabajos prácticos (TPs) se realizarán las siguientes técnicas de Biología Molecular:

1) Transformación de la bacteria Escherichia coli (cepa JM109) con distintos plásmidos.

2) Selección de las bacterias transformadas por resistencia a antibióticos y complementación-α con el vector pGEM-T Easy.

3) Minipreparación de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina.

4) Digestión de los plásmidos con enzimas de restricción y cuantificación del ADN obtenido.

5) Amplificación de un gen a partir de un plásmido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

6) Preparación de extractos conteniendo una proteína recombinante y análisis de las proteínas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE).

Estas técnicas serán aplicadas en algunas etapas de la estrategia utilizada para el clonado y expresión del gen de Ferredoxina NADP(H) reductasa (FNR) de la bacteria patógena Leptospira interrogans en células de E. coli.

En forma simplificada la estrategia consiste en:

• Aislamiento de ADN genómico de Leptospira interrogans.

• Amplificación por PCR del gen

LepFNR

de aproximadamente 0,95 kpb usando como molde el ADN genómico de Leptospira interrogans, la enzima Taq polimerasa y dos cebadores específicos.

Un cebador introduce un sitio de restricción PstI en el extremo amino.

• Clonado del producto de PCR en el vector pGEM-T Easy.

• Determinación de la secuencia del gen clonado para descartar posibles errores en la amplificación.

• Subclonado en fase del fragmento digerido con PstI que incluye el gen FNR, en un vector de expresión derivado del pET32b que denominamos pET-BM.

• Expresión de la proteína de fusión.

Actividades a realizar durante los trabajos prácticos

-Durante los laboratorios nos enfocaremos en los pasos resaltados en negrita.

-Durante el transcurso de los TP se resolverán problemas tipo y se discutirán los resultados obtenidos para la elaboración del informe final.

Condiciones para regularizar la materia Biología Molecular

-Aprobación de las pruebas semanales relacionadas con los laboratorios a desarrollar.

-85% de asistencia a los laboratorios.

-Aprobación del parcial o recuperatorio.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº1 (Semana 21/08)

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para realizar la transformación se debe cultivar la bacteria en un medio rico adecuado para su crecimiento, el que será suplementado posteriormente con el antibiótico que permite seleccionar las bacterias transformadas. El medio de cultivo que se usa es el caldo Luria Bertani (LB).

Los alumnos de cada comisión se dividirán en cuatro grupos: A, B, C y D. Cada grupo deberá preparar la cantidad de medio suficiente para realizar todos los prácticos.

Pesar los distintos componentes siguiendo las instrucciones del docente y a continuación se esterilizarán los medios de cultivo en un autoclave. Durante el transcurso de la esterilización deberán controlar la temperatura de manera que el autoclave se mantenga a 1,1 atmósferas de presión durante 20 minutos. Una vez esterilizados los medios de cultivo se deben retirar del autoclave, rotular y conservar hasta que se realice la transformación.

Reactivos y soluciones

-Medio Luria-Bertani (LB): NaCl 5 g/l, peptona de caseína 10 g/l y extracto de levadura 5 g/l.

Autoclavar.

-LB-Agar: ídem LB + Agar 20 g/l. Autoclavar.

1. Amplificación por PCR del gen FNR de Leptospira interrogans

El gen que codifica para la enzima Ferredoxina NADP(H) reductasa (FNR) de la bacteria patógena Leptospira interrogans (LepFNR), de aproximadamente 950 pb, fue amplificado por PCR, utilizando como molde el ADN genómico de Leptospira interrogans, la enzima Taq polimerasa y los oligonucleótidos cebadores específicos que se detallan a continuación.

Secuencia nucleotídica del gen LepFNR

atgcattcgctcatgaaaccgactagagaacctcaaatcaatttattcaaaaaatccaacccttacaaagc aaaagtaatcagcaatgttctattgactccggaaaccggaaccggaaaaagacccaaaaaagaaggagaag cgctcgttcatagaattgtacttgcaattgatcactctgcttatccatacgtaatcggacaaagtggagga gttatacctcccggagaagatcccgaaaaaaaagcaaaaggtttagcagatgttggatataccgtaagact ttattccattgcttctccaagttattctttcggaatgaaagaggacaatatagaattcattattaaaagag acaacatatatgatgaaaatggaaacattcaattcaaaggtgtttgttccaattatatgtgcgacctgaaa ccaggtgatgaagtaaccatgactgggccttctggaaaaaaatttcttcttcctaatacagatttcagtgg agatattatgtttcttgcaactggaactgggatcgctccttttatcggaatgagtgaagaacttttagaac acaaactcatcaaatttactgggaacatcactctcgtttatggagcaccttattctgatgaactagtaatg atggactatctgaaaggtttagaatctaaacataaaaatttcaaattaataaccgcaatctcgagagaaga aaaaaattctttcgatggcggaagaatgtacatttctcacagagtccgtgaacaagccgaagcagtaaaaa agattttaaatggaggcggacggttttatatctgtggtggacctaagggaatggagaaaggtgtaattgaa gaaattcaaaaaatttcaggaaacacgggaacttatgaagaattcaaacatcatttagaaggagcccatca attatttgtggaaacatattga

Cebadores diseñados para la amplificación por PCR

LepPstI (F): 5´-AACTGCAGGTatgcattcgctcatgaaaccgactaga- 3´

LepEcoRI (R): 5´-CGGAATTCtcaatatgtttccacaaataattgatgggctc- 3´

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El cebador LepPstI contiene el sitio de restricción PstI que luego se utilizará para el clonado en el vector de expresión pET-BM. El cebador LepEcoRI contiene el sitio EcoRI pero este sitio no será utilizado para el clonado en el vector pET-BM.

2. Clonado del producto de PCR en el vector pGEM-T Easy (Promega)

La enzima Taq polimerasa tiene la particularidad de incorporar un desoxinucleótido de adenina en los extremos 3’ de los fragmentos amplificados, de manera independiente de molde.

Esta propiedad de la enzima es utilizada para el clonado directo de los productos de PCR en los vectores de la serie pGEM-T y pGEM-T Easy (Promega), los cuales se encuentran linealizados y poseen un desoxinucleótido de timina en cada uno de sus extremos 3’ (Figura 1). Estos vectores de alto número de copia poseen además un sitio de múltiple clonado (SMC) dentro de la región codificante del péptido-α de la enzima β-galactosidasa. La inactivación insercional del péptido-α por incorporación de un producto de PCR permite así la identificación directa de los clones recombinantes mediante selección en placas indicadoras conteniendo X-Gal e IPTG.

Como se muestra en la Figura 1, la incorporación del gen LepFNR en el vector pGEM-T Easy puede producirse en dos orientaciones (cualquiera de los desoxiadenilatos terminales del producto de PCR puede aparearse con cualquier desoxitimidilato terminal del vector). De acuerdo a la orientación en la cual se introduzca el inserto en el vector, el sitio de restricción para la enzima PstI del producto de PCR quedará distal (orientación 1) o adyacente (orientación 2) al sitio de restricción PstI que posee el vector. Esto determinará la posibilidad de extraer el inserto del vector mediante digestión con PstI para el posterior subclonado del mismo en el vector de expresión pET-BM. La orientación de la inserción es verificada mediante mapeo de restricción y/o PCR.

Figura 1. Clonado del gen LepFNR en el vector pGEM-T Easy. Se muestra el mapa del vector y las posibles orientaciones en que puede incorporarse el producto de PCR. SMC: sitio de múltiple clonado, F:

cebador LepPstI, R: cebador LepEcoRI.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº2 (Semana 28/08)

TRANSFORMACIÓN DE LA BACTERIA Escherichia coli POR EL MÉTODO DE CaCl

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1. Preparación de células competentes

Inocular el día previo 1 colonia de E. coli JM109, aislada a partir de una caja de Petri con medio Luria-Bertani agar (LB-agar), en 2 ml de caldo LB. Crecer durante la noche a 37°C, con agitación (lo efectúa personal del Área).

 Inocular 500 μl del cultivo en frascos conteniendo 10 ml de caldo LB. Crecer a 37°C con agitación hasta DO = 0,2 (≈ 1 h)

Se necesita 1 ml de cultivo para cada transformación y cada grupo realizará tres.

 Fraccionar en alícuotas de 1 ml en tubos de microcentrífuga estériles y centrifugar (5 min a 5.000 rpm). Sacar muy bien el sobrenadante.

 Resuspender las células en 0,5 ml de CaCl

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0,1 M previamente enfriado.

 Centrifugar 5 min a 5.000 rpm y descartar el sobrenadante.

2. Transformación.

 Resuspender las células en 100 μl de CaCl

2

0,1 M y agregar el ADN:

Cada grupo realizará tres transformaciones:

Tubo 1: 5 μl de una mezcla de ligación de pGEM-T Easy y el fragmento amplificado por PCR del gen LepFNR *.

Tubo 2: plásmido pGEM-T Easy que fue ligado y circularizado (control positivo).

Tubo 3: sin ADN (control negativo).

Con el objetivo de evaluar la influencia de la cantidad de ADN en la eficiencia de transformación cada grupo utilizará distintas cantidades de plásmido en el control positivo (plásmido pGEM-T Easy recircularizado):

- Grupos A y B: 10 μl de pGEM-T Easy recircularizado (0,05 ng/μl).

- Grupo C: 5 μl de pGEM-T Easy (0,05 ng/μl).

- Grupo D: 3 μl de pGEM-T Easy recircularizado (0,05 ng/μl).

* Tener en cuenta que el fragmento de PCR puede ligarse al pGEM-T Easy en dos orientaciones.

Llamaremos orientación 1 a la que contenga el gen LepFNR flanqueado por los sitios PstI (uno del producto de PCR y el otro del sitio de múltiple clonado del vector) y orientación 2 a la que introdujo el fragmento de forma tal que los dos sitios PstI quedaron próximos.

 Incubar 40 min en hielo.

Mientras dura la incubación preparar un baño a 42°C y las cajas de Petri con LB-agar. Todos los grupos prepararán 3 placas con LB-agar suplementado con ampicilina 0,1 mg/ml, X-gal 60 μg/ml e IPTG 0,1 mM. Para ello deberán fundir el LB-agar, dejar enfriar hasta 45°C, agregar ampicilina, X-gal e IPTG y cargar 15 ml por placa de Petri, inmediatamente. Estas placas pueden guardarse a 4°C durante 1 semana.

 Incubar las células 60-90 seg a 42°C.

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 Poner las células nuevamente en hielo e inmediatamente agregar 0,9 ml de LB. Incubar 30 min a 37°C.

 Centrifugar (5 min a 5.000 rpm) y descartar 900 μl del medio, resuspender el pellet celular en los 100 μl restantes y sembrar sobre el LB-agar. Distribuir utilizando espátula de Drygalski flameada en alcohol (enfriar la espátula previamente).

 Colocar las cajas de Petri en estufa a 37°C durante una noche. Las placas serán analizadas durante la sesión siguiente, haciendo un recuento de colonias en la placa correspondiente al control positivo, para calcular la eficiencia de éste método de transformación.

La eficiencia de transformación (ET) se calcula de la siguiente forma:

ET = UFC/μg ADN

UFC = Unidades Formadoras de Colonias

Reactivos y soluciones

-Solución stock X-gal: 50 mg/ml.

-Solución stock IPTG: 0,5 M en agua estéril.

-Solución stock ampicilina: 100 mg/ml en agua estéril.

Después de por lo menos 12 hs de crecimiento se visualiza en las cajas de Petri la aparición de colonias bacterianas. Se observarán dos tipos de colonias: azules y blancas.

Todas estas colonias representan células transformadas ya que son capaces de crecer en

presencia de ampicilina (resistencia introducida con el vector de transformación).

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TRABAJO PRÁCTICO Nº3 (Semana 04/09)

 Verificar la situación en las placas de la transformación.

 Calcular la eficiencia de transformación en UFC/μg plásmido.

Las colonias de E. coli son viables en medio sólido durante aproximadamente 1 mes a 4°C.

VERIFICACIÓN DE LA PRESENCIA DEL PLÁSMIDO RECOMBINANTE. MINIPREPARACIONES DE ADN PLASMÍDICO POR EL MÉTODO DE LISIS ALCALINA

Día previo: inocular una colonia en tubos de 3 ml de caldo LB con 0,1 mg/ml ampicilina e incubar toda la noche a 37°C con agitación.

Grupos A y B: 1 colonia blanca y una azul.

Grupos C y D: dos colonias blancas.

(Lo efectúa personal del Área)

 Pasar 1,5 ml del cultivo nocturno a tubos de microcentrífuga estériles. Centrifugar las células 2 min a 5.000 rpm. Descartar el sobrenadante, agregar el resto del cultivo y volver a centrifugar.

 Eliminar todo el sobrenadante sin perturbar el pellet. Agregar 100 μl de lisógeno I y resuspender completamente. Incubar 5 min a T.A.

 Agregar 200 μl de lisógeno II (preparar fresco a partir de hidróxido de sodio 10 N y SDS 10 %), mezclar por inversión suave e incubar 5 min en hielo.

 Agregar 150 μl de lisógeno III, mezclar por inversión suave e incubar 5 min en hielo.

 Centrifugar 10 min a 12.000 rpm a 4ºC. Tomar el sobrenadante y pasarlo a tubo de eppendorf nuevo (CUIDADO de no arrastrar nada del pellet blanco).

 Agregar 400 μl de cloroformo y agitar con la tapa bien cerrada (CON CUIDADO)

 Centrifugar 5 min a 12.000 rpm y pasar la fase superior INCOLORA (CUIDADO de no tomar la interfase proteica) a tubo de microcentrífuga limpio.

 Repetir la extracción con cloroformo. Centrifugar y pasar fase superior a tubo limpio.

 Agregar 2,5 vol. de etanol absoluto helado e incubar 15 min en hielo (o freezer).

 Centrifugar 20 min a 12.000 rpm, en frío. Eliminar el sobrenadante (CUIDADO el pellet puede ser muy traslúcido).

 Lavar con 500 μl de etanol 70 %. Centrifugar 5 min a 12.000 rpm, en frío. Repetir el lavado con etanol 70 %. Descartar el sobrenadante lo mejor posible y secar el pellet en la estufa de 37°C.

 Resuspender el pellet en 25 μl de agua miliQ 0,1 mg/ml ARNasa. Incubar 20-30 min a 37°C para que se digiera el ARN. Guardar a -20°C.

Reactivos y soluciones

-Lisógeno I: glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8,0.

-Lisógeno II: NaOH 0,2 N, SDS 1 % (p/v).

-Lisógeno III: acetato de K 3 M pH 5,8.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº4 (Semana 11/09)

OBSERVACIÓN Y ANÁLISIS DEL ADN PLASMÍDICO EN GEL DE AGAROSA

 Lavar y secar una base y un peine adecuados. Armar según las instrucciones del docente.

 Pesar agarosa (al 1 %) y disolverla en buffer TAE 1X calentándolo en horno microondas en potencia mínima. Esperar a que se enfríe a 50°C, agregar bromuro de etidio (0,3 μg/ml) y verterlo en el molde. Una vez frío el gel se retira la cinta envolvente, se coloca en la cuba de electroforesis y se cubre con el buffer TAE 1X.

 Sembrar en el gel de agarosa 5 μl de cada miniprep y 2 μl del marcador de peso molecular λ/HindIII, mezclándolos previamente en buffer de siembra de ADN.

1 μg de λ/HindIII:

PM μg

23130 0,477

9416 0,194

6557 0,135

4361 0,090

2322 0,048

2027 0,042

564 0,012

125 0,003

 Correr en buffer TAE a 75 mA por 2 hs. Visualizar con luz UV en un transiluminador o en un analizador de imágenes. Tomar fotografía del gel y/o guardar la imagen en un diskette.

ADVERTENCIA: Manipular con cuidado todo el material que esté en contacto con bromuro de etidio, agente mutagénico. Utilizar guantes de látex y evitar contaminar material limpio.

Observar manteniendo en todo momento los ojos protegidos de la radiación UV.

Reactivos y soluciones

-TAE: Tris-acetato 40 mM pH 8,0, EDTA 1 mM.

-Bromuro de etidio: 0,3 mg/ml -Agarosa

-ADN fago λ cortado con HindIII (0,5 µg/ul)

-Buffer de siembra ADN: 5 % glicerol, 0.025 % azul de bromofenol, 0.025 % xylene cyanol

Tomar como referencia la banda del marcador de

peso molecular que tenga una migración en el gel

similar a la banda del ADN plasmídico que se

estimará la concentración.

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8

CUANTIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA

Existen varios métodos para cuantificar ADN o ARN con distinta sensibilidad y especificidad.

Si hay ácidos nucleicos en cantidad de microgramos y la muestra es pura, es decir si no tiene contaminantes como proteínas, fenol, u otros ácidos nucleicos, se puede medir espectrofotométricamente la radiación ultravioleta absorbida por las bases a 260 nm. Si la cantidad de ácido nucleico es escasa (nanogramos), y/o contiene impurezas, se puede estimar por técnicas fluorescentes más sensibles usando fluorocromos. Uno de los fluorocromos más usados es el bromuro de etidio que se puede usar para cuantificar ADN o ARN separado electroforéticamente en un gel de agarosa, o en solución comparando con un estándar de concentración conocida.

Para cuantificar el ADN y estimar su pureza por medidas espectrofotométricas se realizan

lecturas a 260 y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la concentración de ácidos

Figura 2. Imagen tomada de Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual (2ª Ed., Cold Spring Harbor Lab.)

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nucleicos en la muestra, teniendo en cuenta que: DO = 1 corresponde a aproximadamente 50 μg/ml de ADN doble cadena, 37 μg/ml de ADN de simple hebra o 40 μg/ml de ARN.

La relación entre las lecturas a 260 nm/280 nm produce una estimación de la pureza de la muestra. Las preparaciones de ADN y ARN puras tienen una relación DO

260

/DO

280

de 1,8-1,9, y de 1,9-2 respectivamente. Si hay una contaminación con proteínas que absorben a 280 nm se obtiene una razón menor. La absorbancia a 230 nm refleja contaminación con fenoles, mientras que a 325 nm sugiere contaminación con partículas o cubetas sucias.

TRABAJO PRÁCTICO Nº5 (Semana 18/09)

DIGESTIÓN DEL ADN PLASMÍDICO CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Una alícuota del ADN plasmídico (3-5 μl) de cada una de las minipreparaciones se usará para digerir con la enzima de restricción PstI. Estas digestiones nos permiten inferir los tamaños de los plásmidos y establecer la orientación en que se introdujo el inserto.

El protocolo de corte será elaborado con el docente a cargo, discutiendo el buffer de reacción, cantidad de enzima, tiempo y temperatura de incubación (60-90 min a 37°C), volumen final (se sugieren 25 μl), etc.

Nota: los stocks de las enzimas de restricción tienen una concentración de 10 U/μl, por lo tanto deben ser diluidas en el buffer de corte 1X. Se sugiere una dilución 1/18 y que cada grupo realice la digestión con 2,5 μl. La dilución la preparará el docente a cargo.

Reactivos y soluciones

-Enzima PstI (Promega): 10 U/ul

-Buffer de corte 1X (Buffer H, Promega): Tris-HCl 90 mM, MgCl

2

10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5

VISUALIZACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DIGERIDOS EN GEL DE AGAROSA

Los resultados se analizarán en conjunto, sembrando en un gel de agarosa al 1 %, el volumen de la digestión y 2 μl de los respectivos plásmidos sin digerir. También se incluirá como marcador de tamaño molecular 2 μl de ADN del fago lambda digerido con HindIII. Se observará la linealización de los plásmidos o liberación de inserto de aproximadamente 0,95 kpb según el caso.

Observar cuidadosamente las distintas calles sembradas analizando la presencia de ADN plasmídico sin digerir y las bandas correspondientes a los cortes con las enzimas de restricción.

NOTA: Las enzimas de restricción son muy caras!! Trabajar siempre con guantes, manteniéndolas en una conservadora con hielo, sin contaminarlas con tips usados, y agregarlas en concentración adecuada, después de que todos los reactivos fueron agregados al medio de reacción.

Recordar que una unidad de enzima se define como la cantidad requerida para digerir

completamente 1 μg de ADN en 1 h con el buffer y temperatura recomendados, en 20 μl de

reacción.

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Comparar los tamaños moleculares de los fragmentos obtenidos con los correspondientes al marcador de tamaño molecular y hacer una estimación en kpb de las bandas obtenidas luego de la digestión. Tomar una fotografía o registrar en un diskette la imagen correspondiente.

TRABAJO PRÁCTICO Nº6 (Semana 25/09) ANÁLISIS DE LOS PLÁSMIDOS MEDIANTE PCR

Se utilizarán los ADN plasmídicos obtenidos en la minipreparación como molde para realizar reacciones de PCR con el objetivo de amplificar el inserto y verificar la orientación. Se dispone de los oligonucleótidos M13 Forward y M13 Reverse que hibridan en los bordes del sitio de múltiple clonado del vector. Se utilizará también el oligonucleótido LepPstI correspondiente al extremo 5´ del gen LepFNR.

Se realizarán 8 PCRs por cada comisión. De acuerdo a los resultados obtenidos en la digestión con PstI, 2 grupos trabajarán con una orientación del inserto y los otros 2 trabajarán con la otra orientación, y realizarán las siguientes PCRs:

1) Plásmido con inserto utilizando oligos M13 Forward y LepPstI.

2) Plásmido con inserto utilizando oligos M13 Reverse y LepPstI.

3) Plásmido con inserto utilizando oligos M13 Forward y M13 Reverse.

4) Control negativo: sin molde utilizando oligos M13 Forward y M13 Reverse.

Reactivo Concentración stock Concentración final

ADN de miniprep diluido 1:100 10 μl (10-100 ng)

Buffer 10x 1x

MgCl

2

25 mM 1,5 mM

dNTPs 2,5 mM (c/u) 200 μM (c/u)

Oligo M13 Forward 12,5 pmol/μl 25 picomoles

Oligo M13 Reverse 12,5 pmol/μl 25 picomoles

Oligo LepPstI 12,5 pmol/μl 25 picomoles

Taq polimerasa 5 U/μl 1 U

H

2

O c.s.p. 25 μl

Secuencias de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación Oligo M13 Forward: 5´-TCACACAggAAACAgCTATgAC-3´

Oligo M13 Reverse: 5´-CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC-3´

Oligo LepPstI: 5´-AACTgCAggTATgCATTCgCTCATgAAACCgACTAgA-3´

PstI

NOTA: Todos los reactivos deben permanecer en hielo y deben manipularse con guantes.

Recuerde que es muy importante evitar la contaminación de los mismos. Se sugiere

mantener alejados los tubos conteniendo el ADN plasmídico y agregarlo último al tubo de

reacción.

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Programa de amplificación

Desnaturalización inicial: 2 min 94ºC

Desnaturalización: 0,5 min 94ºC 30 ciclos Anillamiento: 0,5 min 60ºC Extensión: 1,5 min 72ºC Extensión final: 10 min 72ºC

Por cuestiones de tiempo la observación de los productos de PCR en gel de agarosa se realizará en la siguiente citación.

TRABAJO PRÁCTICO Nº7 (Semana 02/10)

OBSERVACION DE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN EN GEL DE AGAROSA Y CLASE DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS

Se preparará un gel de agarosa al 1 % y se sembrarán 15 μl de cada una de las reacciones realizadas. También se incluirá como marcador de tamaño molecular 2 μl del ADN del fago lambda digerido con la enzima de restricción HindIII.

Realizar la corrida electroforética durante 1 h a 75 mA.

Observar los tamaños de los fragmentos obtenidos en el gel y obtener una fotografía del

mismo.

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12

TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 (Semana 09/10)

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS Y SEPARACIÓN DE LAS MISMAS UTILIZANDO GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS

INTRODUCCIÓN – ASPECTOS TEÓRICOS.

Expresión de proteínas en E. coli.

Muchas proteínas de baja abundancia pueden ser expresadas en altos niveles en Escherichia coli a través del uso de vectores de expresión especialmente diseñados. Aunque se han construido muchos vectores de expresión diferentes, todos ellos toman ventaja de los mecanismos moleculares que controlan la transcripción y la traducción en E. coli.

Vectores de expresión con un promotor fuerte regulable.

Los vectores de expresión en E. coli más comúnmente usados son construidos mediante la ligación de un vector plasmídico básico, el cual contiene un origen de replicación (ORI) y un gen de resistencia a antibiótico que permite su selección, a una secuencia de ADN que funciona como un promotor fuerte regulable. Un promotor es una secuencia de ADN donde la ARN polimerasa inicia la transcripción. En un promotor fuerte regulable, la transcripción se inicia muchas veces por minuto bajo condiciones específicas.

Un ejemplo de este tipo de vectores de expresión contiene un fragmento clonado del cromosoma de E. coli que incluye el promotor lac y la transcripción a partir del mismo sólo ocurre cuando se adiciona lactosa, o un análogo de la misma como el isopropil-tiogalactósido (IPTG), al medio de cultivo. Generalmente, se utiliza IPTG debido a que éste no puede ser metabolizado y por lo tanto, su concentración no cambia a medida que las células crecen. Luego de la adición de IPTG, el gen de interés que se encuentra bajo el control del promotor lac se transcribe en ARNm, el cual luego se traduce generando muchas copias de la proteína que codifica.

Proteínas de fusión

Cuando se intenta expresar genes en sistemas heterólogos es frecuente encontrarse con el hecho de que la proteína buscada se degrade, con lo que se obtienen bajos niveles útiles. Para solventar este problema, uno de los “trucos” consiste en lograr proteínas híbridas, de fusión, en las que nuestra proteína heteróloga (o la parte funcional que nos interesa) está unida covalentemente con una proteína estable del propio hospedador, lo que la protege del ataque de proteasas del mismo. Para conseguir estas proteínas de fusión, hay que hacer una construcción génica en la que unimos, en la fase de lectura adecuada, un gen del hospedador con el gen que queremos expresar.

Un ejemplo de vectores de expresión utilizados para tal fin es la serie pET-32 (a, b y c) que

fue desarrollada para clonar y expresar ADN bajo el control del promotor reconocido

específicamente por la T7 ARN polimerasa. El sistema pET usa el promotor del bacteriófago T7

para dirigir la expresión del gen de interés. Como la ARN polimerasa de E. coli no reconoce el

promotor T7, no hay prácticamente transcripción del gen de interés en ausencia de una fuente

de la T7 ARN polimerasa. De esta forma se evita la transcripción basal que ocurre en sistemas

basados en promotores de de E. coli (lac, tac) y que dificulta la expresión de proteínas que

resultan tóxicas para la célula hospedadora. Para la expresión del gen en estudio, la célula

hospedadora debe poseer el gen que codifica para la T7 ARN polimerasa. Se utiliza

generalmente la cepa de E. coli BL21 DE3 pLysS que posee: (1) el gen de la T7 ARN polimerasa

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13

(lisógeno λDE3) que está bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG; (2) el gen que codifica para la T7 lisozima (plásmido pLys) el cual es un inhibidor natural de la T7 ARN polimerasa y reduce así la habilidad de transcribir el gen de interés en células no inducidas. La serie pET-32 posee una versión mejorada del promotor T7 que es el promotor T7lac que posee además una secuencia a la cual se une el represor lac, reduciendo efectivamente la transcripción basal en células no inducidas de la T7 ARN polimerasa y así proveyendo un segundo sistema de control de la expresión de dicho gen. Los plásmidos como el pET-32 que tienen este promotor T7lac también poseen una copia del gen lacI para asegurar que haya suficiente cantidad de represor. Además esta cepa tiene la ventaja de ser deficiente en las proteasas lon y ompT.

Cuando un cultivo de células BL21 DE3 pLysS está creciendo en ausencia de IPTG, no hay expresión del gen de interés ya que el represor lac se encuentra unido al promotor del gen que codifica para la T7 ARN polimerasa. Existe una expresión basal de la T7 ARN polimerasa pero la presencia en la célula hospedadora de la T7 lisozima hace que la misma sea inactiva. Existe además un segundo mecanismo de control ya que el represor lac se encuentra también unido al promotor T7lac que controla la expresión del gen de interés. Cuando a este cultivo se le agrega IPTG, esta molécula se une al represor lac y este deja de reprimir la expresión de la T7 ARN polimerasa con lo cual se empieza a expresar la proteína de fusión (Figura 3).

Figura 3. Elementos de control del sistema pET.

El vector pET-32 posee: (1) el promotor T7lac que es un promotor fuerte inducible por IPTG

(2) una secuencia codificante para la proteína tiorredoxina de E. coli (trxA); (3) un sitio de

múltiple clonado; (4) el gen bla que confiere resistencia a ampicilina, el cual permite la selección

del plásmido; (5) un origen de replicación en E. coli (ori); (6) el gen lacI que codifica para el

represor lac; (7) los sitios de reconocimiento para la proteasa sitio-específica trombina y

enteroquinasa entre los dominios de la trxA y la proteína recombinante; (8) una cola de poli-

(14)

14

histidina en el N y C terminal y (9) el terminador transcripcional T7. En la Figura 4 se muestra la estructura del plásmido con su correspondiente sitio de múltiple clonado.

El hecho de que la proteína heteróloga producida en E. coli se exprese como fusión C- terminal a la proteína trxA, permite simplificar el protocolo de purificación ya que la proteína puede ser purificada bajo condiciones no-desnaturalizantes mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz que contenga Ni inmovilizado el cual se une a la cola de poli-histidina. A su vez, el sitio de reconocimiento para proteasa permite que la trxA pueda ser removida de la proteína de interés luego de su purificación.

Subclonado en fase del fragmento digerido con PstI en el vector de expresión pET-BM.

Con el objetivo de proceder al subclonado del gen LepFNR en el vector de expresión pET- BM (que es una modificación del vector pET-32, Figura 4), el vector pGEM-T Easy que posee el inserto en la orientación adecuada (orientación 1) es digerido mediante corte con la enzima PstI.

Se purifica el fragmento conteniendo el gen LepFNR, y se procede a su posterior ligación con el

vector pET-BM cortado con la misma enzima. El producto es utilizado para transformar células

de E. coli JM109, y las colonias resultantes (Amp

r

) pueden contener alguno de los tres tipos de

construcciones: plásmido pET-BM religado o plásmido pET-BM con inserto en cualquiera de las

dos orientaciones posibles (orientaciones 1 y 2). Orientación 1: el gen LepFNR se encuentra

clonado en la misma orientación (y en fase) que la secuencia codificante para Trx del vector,

obteniéndose el producto deseado, Trx-LepFNR. Orientación 2: la fusión se produce en la

orientación opuesta. Esto imposibilita la expresión de la proteína de fusión Trx-LepFNR. La

estrategia de clonado incluye un paso posterior de identificación del plásmido en la orientación

1 (mediante mapeo de restricción/PCR), el cual es utilizado para transformar la cepa de E. coli

BL21 DE3 pLysS que permite la expresión de la proteína recombinante.

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15 Figura 4. Mapa del vector pET-BM que es un derivado del vector de expresión pET-32 (Novagen). Este vector permite la expresión de proteínas como fusión a Trx/poli-His.

Separación de proteínas utilizando geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)

En las proteínas, distintas moléculas de igual tamaño (PM) tienen formas distintas dadas

por la conformación más estable para cada secuencia aminoacídica particular. Por otro lado, la

carga (y por consiguiente, el cociente carga/masa) varía mucho de una proteína a otra. Para

estandarizar la forma y las condiciones de todas las proteínas se utiliza un detergente cargado

negativamente, el dodecilsulfato de sodio (SDS). Este detergente desnaturaliza las proteínas y

las recubre de manera proporcional a su tamaño, otorgándoles un gran número de cargas

negativas que hacen que las moléculas migren hacia el polo positivo de forma inversamente

proporcional al logaritmo de su peso molecular (Figura 5). Por esta razón, a través de una

corrida electroforética es posible estimar el peso molecular de una proteína dada utilizando

marcadores de peso molecular conocido.

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16

Figura 5. Representación esquemática del fundamento de la electroforesis en un SDS-PAGE.

Expresión de la proteína Ferredoxina NADP(H) reductasa de Leptospira interrogans

La Spirochaete Leptospira interrogans es una bacteria parásito de animales y humanos que produce la enfermedad conocida como leptospirosis. La leptospirosis es una patología muy extendida en todo el planeta que provoca episodios similares a la gripe acompañados de lesiones en el hígado y en los riñones, como hemorragias e ictericia. La leptospirosis también posee un gran impacto económico en la industria agropecuaria ya que la enfermedad afecta al ganado induciendo aborto, infertilidad, producción reducida de leche y hasta muerte. La transmisión de las leptospiras se produce a través del contacto directo con animales infectados o por exposición a las aguas contaminadas con la orina de los mismos.

PREPARACIÓN DE EXTRACTOS DE E. coli PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Inocular el día previo 1 colonia de E. coli BL21 DE3 pLysS transformada con el plásmido pET-

BM ó con el plásmido pET-BM-LepFNR, aislada a partir de una caja de Petri con medio LB-

(17)

17

agar, en 2 ml de caldo LB suplementado con ampicilina (100 μg/ml). Crecer durante la noche a 37°C con agitación (lo efectúa personal del Área).

 Inocular 500 μl de los cultivos en cada frasco de 10 ml de LB-ampicilina.

Se trabajará con dos cultivos de cada cepa, uno será inducido con IPTG para la expresión de la proteína recombinante y el otro será el cultivo control no inducido.

 Incubar 1 h a 37°C con agitación (hasta DO aproximada de 0,4). Agregar IPTG a los frascos de cultivo que serán inducidos (concentración final 0,5 mM).

 Incubar 30 min a 37°C y tomar dos muestras de 0,5 ml de cada cultivo (muestra t=30 min).

 Incubar 1 h más a 37°C y luego tomar dos nuevas muestras de 0,5 ml de cada cultivo (muestra t=1,5 hs).

 Centrifugar una de las muestras de cada uno de los tiempos (t=30 min y t=1,5 hs) en microcentrífuga durante 5 min a 5.000 rpm y descartar el sobrenadante. Guardar a -20°C.

 Medir la densidad óptica (DO) a 600 nm de la otra muestra de cada tiempo (t=30 min y t=1,5 hs) para calcular el volumen de buffer de siembra 1X que se utilizará para resuspender las células en el siguiente trabajo práctico.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 (Semana 16/10) PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS

Es común que la electroforesis se realice con 2 tipos de geles, un gel concentrador (de poros grandes) y un gel separador (de poros pequeños). La separación ocurre en el gel separador, donde la migración está determinada por la carga y el tamaño molecular de las partículas. Encima de este gel se sitúa el gel concentrador, generalmente de una menor altura (1/3 del gel separador), en el que la muestra se concentra en una zona muy estrecha, lo que determina la separación en bandas finas en el gel separador y alto poder de resolución.

Gel de separación 15% Gel de concentración 5%

H

2

O destilada 1,15 ml 1,70 ml

Acrilamida/Bis-acrilamida (30:0,8) 2,50 ml 0,42 ml

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 1,25 ml -

Tris-HCl 1 M pH 6,8 - 0,32 ml

SDS 10 % 50 µl 25 µl

APS * 10 % 50 µl 25 µl

TEMED ** 2 µl 2.5 µl

* APS: persulfato de amonio

** TEMED: N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina

(18)

18

Procedimiento para la preparación y siembra de las muestras:

 Descongelar las células y resuspenderlas en el volumen de buffer de siembra 1X calculado de acuerdo a la DO de la siguiente manera:

μl buffer de siembra 1X=(210 x DO)

 Hervir las muestras durante 5 min.

 Sembrar 15 μl de cada muestra en el gel de poliacrilamida-SDS y realizar la corrida electroforética a 30 mA. Agregar también un marcador de peso molecular. Detener la corrida cuando empiece a salir el colorante que migra al frente.

 Luego de la corrida electroforética sumergir el gel en solución fijadora y posteriormente incubarlo en solución de teñido durante 30 min. Desteñir el gel por ebullición en agua durante 10-15 minutos o con solución decolorante hasta observar el patrón de bandas correspondiente.

Reactivos y soluciones

-Buffer de siembra 5X: glicerol 10 % (v/v), Tris-HCl 50 mM pH 6,8, EDTA 1 mM, SDS 2 % (p/v), Azul de bromofenol 0,1 % (p/v), β-mercaptoetanol 1 % (v/v)

-Buffer de corrida 10X: Tris base 30 g/l, glicina 144 g/l, SDS 10 g/l, -Solución fijadora: ácido acético 10 % (v/v)

-Solución de teñido: Coomassie Brilliant Blue R-250 0,05 % (v/v), metanol 50 % (v/v), ácido acético 10 % (v/v)

ADVERTENCIA: Manipular con cuidado la soluciones que contienen acrilamida/bisacrilamida

y TEMED (altamente tóxicos). Utilizar guantes de látex y evitar contaminar material limpio.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 (Semana 23/10)

DISCUSIÓN DE RESULTADOS. INTEGRACIÓN DEL TRABAJO PRÁCTICO ENTREGA DE INFORMES (NECESARIO PARA REGULARIZAR LA MATERIA)

Bibliografía

 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (1987) Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.

 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2º Edición). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Edición 2017, confeccionado por los docentes del área Biología Molecular, carrera Licenciatura en Biotecnología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.

Referencias

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