ANTIBIOGRAMA MOLECULAR PEL DIAGNÒSTIC DE LA RESISTÈNCIA EN TUBERCULOSI

SCMIMC

Societat Catalana de Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica. Febrer 2010

Mateu Espasa

Microbiologia, UDIAT-CD Corporació Sanitària Parc Taulí

DIAGNÒSTIC DE LA RESISTÈNCIA

EN TUBERCULOSI

ANTIBIOGRAMA MOLECULAR TB

I. OBJECTIU:

9 Conèixer possible utilitat antibiograma molecular en TB II. INTRODUCCIÓ:

9 Gens associats a resistència

9 Situació epidemiològica resistència (Mundial/Catalunya) 9 III. AVALUACIÓ TÈCNIQUES EXISTENTS:

9 Tècniques amplificació àcids nucleics-hibridació 9 Avantatges vs Desavantatges

IV. CONCLUSIONS:

9 Tècniques detecció directa fiables

9 Genotip vs fenotip sensibilitat

BASES MOLECULARS RESISTÈNCIA I

FÀRMAC GEN / PROTEÏNA

ACCIÓ MUTACIONS FREQÜÈNCIA

MUTACIONS

ISONIAZIDA katG

activació isoniazida • codó 315 (AGC-ACC: Ser-Thr).

• deleccions parcials del gen.

30-50%

inhA

síntesi àcids micòlics paret micobacteriana, enzim NADH

depenent. Àc. nicotínic bloqueig de la zona d’ unió

NADH

• zona reguladora del gen, extrem 5’ (zona d’unió del ribosoma) -

posició -15 (C*T).

• mutacions gen estructural.

15-30%

zona intergènica oxyR-ahpC

oxyR - gen regulador ahpC - activitat peroxidasa

En MTC inactius per mutacions de base

• presència de mutacions en la zona intergènica - activació síntesi gen ahpC. Mutacions de

compensació - mutacions katG

5-10%

kasA / sintetasa transportadora

de grups alkil

síntesi àcids micòlics paret micobacteriana

• mutacions en els codons 66, 269, 312, 413.

(dubtosa la seva relació amb resistència)

5%

BASES MOLECULARS RESISTÈNCIA II

FÀRMAC GEN / PROTEÏNA

ACCIÓ MUTACIONS FREQÜÈNCIA MUTACIONS

RIFAMPICINA rpoB / síntesi subunitat β ARN

polimerasa

Transcripció - síntesi protèica

• zona codons 432-458:

c. 456 (Ser-Leu) / c. 451 (His-Lys) / c. 441 (Val-Asp)

95%

PIRAZINAMIDA pncA / pirazinamidasa

activació pirazinamida, medi àcid

• mutacions o deleccions en una zona de 186aa.

70%

ETAMBUTOL embB

transferasa -

proteïna transmembrana

transport àcids micòlics - síntesi paret micobacteriana

• codó 306 (Met-Ile/Val) 50-70%

ESTREPTOMICINA

traducció - síntesi protèica

• nucleòtids 530 i 915 - zona interacció proteïna

12S rib.

5-10%

rpsL / proteïna

ribosomal 12S

Traducció - síntesi protèica

• codons 43 i 88 (AAG- AGG; Lys-Arg)

50-60%

QUINOLONES

ADN girasa

superenrollament ADN • mutacions zona 40aa - codons 90-94

40-80%

9 Resistència apareix des de introducció d’antibiòtics antiTB.

9 Dècada ‘90 brots MDR-TB → “Emergència Mundial” (OMS-1993)

9 4th WHO Antituberculosis Drug Resistance report (2002-2007)

9 50% de MDR-TB → Xina i India.

9 7% de MDR-TB → Rússia.

9 Major proporció de MDR en casos nous Æ Països ex-URSS Azerbaijan (22,3%) i Moldàvia (19,4%).

9 XDR-TB → 37 països (països ex-URSS >25 casos)

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

CASOS NOUS CASOS TRACTATS GLOBAL R total 17% (8-12) 35%(24-46) 20% (16-24)

INH-R 10%(8-12) 27.7% (19–37) 13%(16-24)

MDR-TB 3%(2-4) 15%(10-21) 5%(4-7)

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

EPIDEMIOLOGIA MUNDIAL RESISTÈNCIES TB

PREVALENÇA RESISTÈNCIA CATALUNYA (2005-07)

Tractats (n=310) Nous (n=4.566)

Registre de Catalunya – Departament de Salut (Anna Rodés)

Soques INH i/o RMP resistents: nous – n=165 / tractats – n=34

INH (n=92) RMP (n=19)

Diana No. Soc. % Diana No. Soc. %

inhA ^{24 26,1} rpoB ^{17 89,5}

katG ^{44 47,8 Wild Type 2 10,5}

inhA + katG ^{3 3,3}

Mutació més freqüent S531L

Wild Type 21 22,8 Mutacions més freqüents C15T (katG) i S315T1 (inhA)

MDR (n=18)

Diana No. Soc. %

rpoB ^{16 88,9}

inhA ^{3 16,7}

katG ^{15 83,3}

PREVALENÇA RESISTÈNCIA CATALUNYA (2005-06):

Mecanismes Genètics Resistència

y INH-R potencialment detectables Æ 77%

y RIF-R (MDR-TB) potencialment detectables Æ 90%

AVALUACIÓ TÈCNIQUES I.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

9 Ruiz M. et al. J Clin Microb, 2004, 42(4).

Direct Detection of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Auramine-Rhodamine-Positive Sputum Specimens by Real-Time PCR.

• 205 mostres clíniques BK positiu (108 pacients/17 soques resistents)

• Detecció resistència INH (katG/inhA): sensibilitat global 54%! i especificitat 100%.

• Detecció resistència RIF (rpoB) sensibilitat i especificitat 100%. DETECTA 100% MDR-TB.

9 Marin M et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48.

Rapid direct detection of multiple rifampin and isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis in respiratory samples by real-time PCR.

• Optimització PCR temps real per detecció resistència a RIF (rpoB) i INH (katG) en mostra clínica.

• Bona sensibilitat per mostres BK+ i 100% especificitat.

9 Espasa M, et al. J Antimicrob Chemother. 2005, 55(6).

Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes.

• 226 mostres clíniques BK positiu i negatiu (181 pacients/55 soques resistents)

• Detecció resistència INH (katG/inhA): sensibilitat 95% (50% global) i especificitat 100%.

• Detecció resistència RIF (rpoB) sensibilitat i especificitat 100%.

• Sensibiltat en la detecció global de resistència 74% pacients resistents.

y “Casolans” mostres clíniques: Sondes d’ADN fluorescents

AVALUACIÓ TÈCNIQUES II.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

9 Aragón LM. et al. J Antimicrob Chemother 2006. 57.

Rapid detection of specific gene mutations associated with isoniazid or rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using non-fluorescent low-density DNA microarrays.

• Estudi de 46 soques resistents: 41 INH-R (katG/inhA) i 16 RIF-R (rpoB).

• Soques INH-R, concordància 100% per katG i 95% per inhA. Global INH-R 62%

• Soques RIF-R, concordància 93.8% per rpoB.

y “Casolans” soques MTB: “Low Cost and Density (LCD) Microarrays”

AVALUACIÓ TÈCNIQUES III.

Tècniques amplificació ADN

9 Pietzka AT. et al. J Antimicrob Chemoterap 2009, 63.

Rapid identification of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis.

• Estudi de 49 soques MDR-TB. Avaluació només RIF-R (rpoB).

• Sensibilitat del 95.9% , especificitat del 100% i VPN/VPP del 100%.

y “Casolans” soques MTB: “High Resolution Melting (HRM) curves”

AVALUACIÓ TÈCNIQUES IV.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

9 Helb D. et al., J.Clin.Microb. 2010,48(1).

Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology.

9 Cepheid Announces New Diagnostic Technology to Aid World Efforts in Halting the Spread of Mycobacterium tuberculosis (TB)

¾ Estudi sensibilitat (107 mostres Vietnam):

9 100% sensibilitat BK+

9 71% sensibilitat BK- 9 100% especificitat

¾ Estudi detecció Rif-R (64 mostres Uganda):

9 100% sensibilitat (9 soques Rif-R) 9 100% especificitat

y Comercials mostres clíniques: “GenXpert® MTB/Rif (Chepeid)”

AVALUACIÓ TÈCNIQUES V.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

y Comercials mostres clíniques II: “INNOLIPA Rif.TB® (Innogenetics)”

9 Traore H. et al. J Clin Microbiol. 2006 44(12)

Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA and rifampin resistance in clinical specimens from tuberculosis patients by line probe assay.

9 Tortoli E. et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007 26(1).

Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA directly in clinical specimens and for simultaneous determination of rifampin susceptibility.

9 Quezada CM. et al. J Clin Microbiol. 2007 45(9).

Implementation validation performed in Rwanda to determine whether the INNO-LiPA Rif.TB line probe assay can be used for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in low-resource countries.

9 Ogwang S. et al. BMC Infect Dis. 2009 26(9).

Comparison of rapid tests for detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Kampala, Uganda.

9 Acuna-Villaorduna C. et al. Clin Infect Dis. 2008 47(4).

Cost-effectiveness analysis of introduction of rapid, alternative methods to identify multidrug-resistant tuberculosis in middle-income countries.

9 Ling DI. et al. Eur Respir J. 2008, 32(5).

GenoType MTBDR assays for the diagnosis of MDR-TB: a meta-analysis.

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VI.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

9 Bang D. et al. J Clin Microb, 2006, 44(7).

Rapid Genotypic Detection of RIF and INH-R M.tuberculosis Directly in Clinical Specimens.

9 Somoskovi A. et al. J Clin Microb, 2006, 44(12).

Use of Smear-Positive Samples To Assess the PCR-Based Genotype MTBDR Assay for Rapid, Direct Detection of the M.tuberculosis Complex as Well as Its Resistance to INH and RIF.

9 Hilleman D. et al. Int J Tuberc Lung Dis, 2006, 10 (9).

Application of the Genotype MTBDR assay directly on sputum specimens.

9 Hillemann D. et al. J Clin Microb, 2007, 45(8).

Evaluation of the GenoType MTBDRplus Assay for Rifampin and Isoniazid susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Specimens.

9 Lacoma A. et al. J Clin Microb, 2008, 46(11).

Genotype MTBDRplus Assay for Molecular detection of riframpin and isoniazid resistance in M.tuberculosis strains and clinical samples.

9 Miotto P. et al. J Clin Microbiol, 2008, 46

Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-R M.tuberculosis.

9 Barnard M. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008, 177.

Rapid molecular screening for multidrug-resistant tuberculosis in a highvolume public health laboratory in South Africa.

9 Nikolayevskyy V. et al. BMC Clin Pathol 2009, 9(2).

Performance of the Genotype® MTBDRPlus assay in the diagnosis of tuberculosis and drug resistance in Samara, Russian Federation.

y Comercials mostres clíniques: “Genotype® MTBDR/plus (HAIN)”.

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VII.

Comparació tècniques ràpides fenotípiques/mol.leculars

9 Bwanga F., et al. BMC Infectious Diseases 2009, 9(67).

Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: A meta-analysis

META-ANÀLISIS LITERATURA DE TÈCNIQUES FENOTÍPIQUES i GENOTÍPIQUES DIRECTES EN MOSTRA CLÍNICA

1. FENOTÍPIQUES:

9 Nitrate Reduction Assay (NRA) – 4 treballs

9 Microscopic Observation Drug Susceptibility (MODS) – 6 treballs 2. GENOTÍPIQUES:

9 Genotype MTBDR i MTBDRplus (HAIN®) – 3 i 5 treballs

¾ Bona correlació de totes per detecció de INH-R, RIF-R I MDR-TB.

¾ Fenotípiques són menys complexes i barates.

¾ Genotípiques són més ràpides.

AVALUACIÓ TÈCNIQUES VIII.

Tècniques amplificació ADN i hibridació sondes

y Comercials mostres clíniques: “Genotype® MTBDRplus/INNOLIPA® Rif.TB”

9 Estudis a diferents països amb diferents realitats epidemiològiques de TB.

9 Tots els treballs amb sensibilitat, especificitat, VPP i VPN

>90% per la detecció de soques MDR(mostres BK+).

9 Utilitat en mostres contaminades i soques perdudes.

9 Existeix un percentatge (5-10%) de mostres amb possibles infeccions mixtes de soques sensibles i resistents – implicacions clíniques?.

9 Prova diagnòstica proposada per OMS/FIND/CDC.

9 Falta treball d’intervenció clínica (en curs??).

AVALUACIÓ TÈCNIQUES IX.

Aplicació clínica antibiograma molecular

9 O’Riordan P. et al. PLOS ONE, 2008, 3(9).

Rapid Molecular Detection of Rifampicin Resistance Facilitates Early Diagnosis and Treatment of Multi-Drug Resistant Tuberculosis: Case Control Study.

ESTUDI RETROSPECTIU DE LA UTILITAT DEL DIAGNÒSTIC MOLECULAR DE MUTACIONS EN EL rpoB EN PACIENTS DIAGNOSTICATS DE TB (REGNE UNIT).

9 Detecció molecular mutacions rpoB de rutina desde 1997 si BK+:

9 42 casos MDR-TB i 14 amb resultat rpoB Æ diagnòstic precoç 6-7 setmanes.

9 Tendència a menor letalitat i complicacions si diagnòstic precoç.

9 Probable impacte econòmic.

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. Resum

9 Totes les tècniques són vàlides per diagnòstic i detecció resistències en mostra clínica, sobretot MDR-TB i BK+.

9 Mostres baciloscopia positiva (elevada transmisibilitat):

• Sensibilitat >95% pel diagnòstic de tuberculosis.

• Sensibilitat >90% pel diagnòstic de MDR-TB.

• Sensibilitat 70-95% pel diagnòstic de INH-R, però >95% en els casos amb R d’alt nivell (katG).

9 Mostres baciloscopia negativa (menor transmissibilitat):

• Sensibilitat 50-70% pel diagnòstic de tuberculosis.

• Poc estudiat per l’estudi de resistències, és necessari “trencar-s’hi les banyes”?? Passaria per uns criteris clínics molt clars.

• Poc bacilífers Æ menor transmissibilitat.

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. AVANTATGES

™ Rapidesa en la detecció de possibles resistències (2-7 dies vs 40-50 dies), sobretot BK positius.

™ Possible influència positiva en l’epidemiologia:

9 Adequació del tractament dins la primera setmana de diagnòstic. Evitariem possibles transmissions per TB mal tractades, nous casos?

9 Adequació de les pautes de profilaxis.

Evitariem possibles futurs casos nous resistents?

AVALUACIÓ TÈCNIQUES. DESAVANTATGES

™ Limitació en la detecció de resistències a isoniazida:

9 Kits comercials NO inclouen gens INH (INNOLIPA Rif.TB/GenXpert RIF/TB) 9 30-40% soques amb mecanismes genètics de resistència desconeguts, però

pot venir cobert per:

ƒ Detecció de resistència en quasi tots els casos de MDR.

ƒ Soques monoresistents amb baixa resistència a INH Æ quina implicació té en el tractament?.

™ Tecnologia “cara”???? i “sofisticada (països baixa renta)”?.

™ “Baixa prevalença” de resistència en el països amb baixa-mitja incidència – és útil? Podria evitar casos nous Æ mantenir prevalença?

™ Ampliació a altres antibiòtics per diagnòstic XDR-TB Æ tècniques en avaluació: GenoType® MTBDRsl-HAIN, LCR microarrays (TB-BCN).

™ Continuarà sent necessari fer el fenotip (antibiòtics no detectats).

POLÍTIQUES ORGANISMES INTERNACIONALS

™ ORGANITZACIÓ MUNDIAL DE LA SALUT (OMS), 2008

™ CENTER FOR DISEASE CONTROL (CDC), 2009

CONCLUSIONS

9 SI QUE ÉS ÚTIL, I S’HAURIA D’UTILITZAR L’ANTIBIOGRAMA MOLECULAR, SOBRETOT PER LA DETECCIÓ DE SOQUES MDR-TB.

9 POTSER FALTARIEN ESTUDIS D’INTERVENCIÓ?:

¾ VALIDAR-NE LA SEVA UTILITAT CLÍNICA EN LA PRESSA DE DECISIONS TERAPÈUTIQUES (tots els pacients amb sospita TB o grups de risc de resistència).

¾ POSSIBLE IMPACTE EPIDEMIOLÒGIC: prevenir o curar?

¾ POSSIBLE IMPACTE ECONÒMIC.

Societat Catalana de Malalties Infeccioses i Microbiologia Clínica. Febrer 2010

Mateu Espasa

Microbiologia, UDIAT-CD Corporació Sanitària Parc Taulí

ANTIBIOGRAMA MOLECULAR PEL DIAGNÒSTIC DE LA RESISTÈNCIA

EN TUBERCULOSI