3.1. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA A PLAGAS Y ENFERMEDADES
Las plantas, como otros seres vivos, se encuentran sometidas a condiciones am-bientales cambiantes, en muchas ocasiones a condiciones desfavorables, ante las cuales deben adaptarse para sobrevivir. Son muchos los organismos potencialmen-te perjudiciales para la planta, desde agentes infecciosos (virus, viroides, bacterias, hongos), hasta organismos consumidores de vegetales (insectos, nematodos). En la figura 1, se ilustran las grandes diferencias que se observan al comparar el tamaño de posibles organismos patógenos para las plantas con el tamaño de una célula vegetal. Cualquiera de estos organismos es capaz de interferir de una u otra manera en los procesos normales del desarrollo, crecimiento o reproducción de una planta.
En la naturaleza, sin embargo, la situación más frecuente es aquella en la que una planta no es el huésped natural de un organismo potencialmente patógeno, con lo cual no se produce ningún efecto perjudicial en la planta. Por el contrario, cuando una planta es huésped natural, se establece una interacción entre ambas partes, planta y patógeno, que puede concluir bien en el desarrollo de una enfer-medad (interacción planta-patógeno de tipo compatible), bien en una resistencia frente al patógeno agresor (interacción planta-patógeno de tipo incompatible).
Las enfermedades causadas por patógenos y plagas son la causa más im-portante de pérdidas en las cosechas, pudiendo representar hasta el 30-40% de las pérdidas en todo el mundo, y si a esto se añaden las pérdidas que se produ-cen en periodos postcosecha, el porprodu-centaje asciende al 60-70%. No hay que ol-vidar que existe una limitación en la superficie cultivable de la tierra, por no de-cir una reducción progresiva de la misma a causa de la erosión del suelo, acumulación de productos tóxicos, etc. Por otra parte, la población mundial si-gue en continuo crecimiento. Ello hace que sea imprescindible la utilización de nuevas variedades de especies vegetales, sobre todo en aquellas especies desti-nadas a la alimentación, variedades que resulten más productivas, mejor adap-tadas al entorno, o más resistentes al ataque de patógenos y plagas.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Evidentemente, el control de enfermedades en plantas puede y debe abor-darse contemplando diferentes estrategias, el éxito o fracaso de cada una de ellas dependerá del problema concreto frente al que nos enfrentemos. Históricamente, la solución al problema de las enfermedades y las plagas se ha abordado con di-ferentes estrategias. En muchos casos la utilización de las técnicas tradicionales de entrecruzamiento de especies para la obtención de variedades resistentes ha resultado útil para la mejora genética de especies concretas. Hasta finales el si-glo XIX, los agricultores dependían exclusivamente de prácticas de cultivo or-ganizadas, esto es, de la alternancia de cultivos. El tratamiento con agentes quí-micos se inicia en la década de 1870 con la utilización de insecticidas (compuestos
APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 81
derivados del cobre y arsénico). Un hito importante fue la aparición del DTT (diclorodifeniltricloroetano), momento a partir del cual las compañías químicas rápidamente expandieron sus áreas de investigación hacia el desarrollo de pes-ticidas sintéticos. Estos agentes fueron extensamente utilizados en el periodo de 1940 a 1960. Fue entonces cuando surgió la crisis de los pesticidas, como consecuencia directa del uso indiscriminado de estos agentes, los cuales estaban siendo responsables de la aparición de resistencias en los organismos que se pretendían combatir, de la destrucción de poblaciones naturales beneficiosas, y de la deterioración progresiva del medio ambiente, además del impacto negativo que se observaba en la alimentación humana. Una nueva solución surgió, esta vez por parte de la comunidad de entomólogos, con el uso de programas integrados para el control de plagas (IPM, «Integrated Pest Management»). De esta manera, las plagas que afectan a los cultivos pueden ser combatidas mediante el empleo de enemigos naturales, es decir, mediante el empleo de organismos que son depredadores naturales del organismo perjudicial (lucha biológica o control biológico de plagas).
En la actualidad, son muchos los programas que se han desarrollado para el control de plagas y enfermedades. Por citar un ejemplo, mencionar el importante papel que los ácaros fitoseidos desempeñan en el control biológico de las pobla-ciones de ácaros fitófagos en cultivos de vid y frutales. En el caso del control de en-fermedades producidas por hongos, probablemente el ejemplo que mejor ilustra esta estrategia es el empleo de cepas del hongo Trichoderma para combatir hon-gos fitopatógenos. No obstante, el diseño de programas para el control integrado de plagas es lento en cuanto a su desarrollo y además resulta de difícil implanta-ción en la comunidad de agricultores. Para un agricultor resulta más complejo in-troducir un programa diseñado para el control biológico de una plaga concreta que, por ejemplo, seguir un calendario predeterminado de tratamientos químicos.
82 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
3.1.1. Mecanismos de defensa en plantas
Las plantas presentan diferentes tipos de defensas. Entre ellas se encuentran las defensas «pasivas», que consisten en acumular en sus tejidos compuestos que pueden resultar tóxicos para microorganismos o fitófagos. Así, en muchos órga-nos (frutos, hojas, tubérculos) se acumulan compuestos fenólicos y taniórga-nos en ele-vadas concentraciones, compuestos que poseen propiedades antifúngicas frente a fitopatógenos {Botrytis, Phytophthora, Fusarium). Las saponinas son un ejem-plo de metabolitos con propiedades antifúngicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. No está claro, sin embargo, que una planta sea resistente a un pa-tógeno concreto por el mero hecho de acumular este tipo de compuestos.
En la mayoría de los casos, sin embargo, se produce una respuesta de defensa «activa» por parte de la planta, respuesta que está asociada a importantes cambios en la expresión génica.Todo ello conduce a la puesta en marcha de una serie de pro-cesos bioquímicos, que constituyen lo que se ha definido como resistencia inducida.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 83
defenderse de patógenos. Desde un punto de vista práctico, la elevada especifi-cidad que presentan las resistencias basadas en el modelo gen-a-gen, hace que en muchos casos no se disponga de variedades comerciales resistentes a cepas de patógenos establecidos localmente. Sin embargo, la disponibilidad de genes de resistencia tiene una clara aplicación para la mejora de las propiedades de resis-tencia en plantas transgénicas. Por citar un ejemplo, la introducción del gen de resistencia N de tabaco (el gen N que confiere resistencia al virus TMV en taba-co) en plantas de tomate ha permitido obtener líneas de tomate resistentes a TMV. Otro éxito de la biología molecular ha sido la aplicación de las técnicas de marcadores moleculares ligados a genes de resistencia para la identificación y se-lección temprana de genotipos en programas de mejora vegetal.
La situación más frecuente en la naturaleza es aquella en la cual la planta manifiesta resistencia frente a un patógeno o a un fitófago (insectos o nemato-dos) en función de la activación de mecanismos generales de defensa, o resistencia inducida. Este es un proceso complejo y a su vez altamente coordinado que está asociado a importantes alteraciones de la expresión génica en la planta huésped. En definitiva, se basa en la inducción de la expresión de genes de defensa, proceso que se desencadena como consecuencia directa del ataque por patógenos o predadores. En estas situaciones, no se trata de resistencias condicionadas genéticamente, y por tanto no presentan especificidad en cuanto a los genotipos del huésped y del patógeno. Es importante por tanto diferenciar un gen de resistencia de un gen de defensa vegetal.
3.1.2. Resistencia inducida frente a patógenos y fitófagos
Durante varias décadas, entomólogos y fitopatólogos han investigado de manera independiente las respuestas de las plantas bien frente a fitófagos bien frente a patógenos. A medida que se van conociendo los mecanismos molecula-res por los cuales las plantas se protegen frente a estos organismos, molecula-resulta ca-da vez más claro que se trata de procesos relacionados entre si.
La resistencia inducida en plantas presenta una serie de características ge-nerales. Un primer aspecto a considerar, es que en el proceso de resistencia in-ducida participan múltiples mecanismos y vías metabólicas, todo ello integrado de una manera sumamente coordinada. Un segundo aspecto, es la falta de es-pecificidad que se observa tanto en cuanto a los agentes inductores como a los organismos que resultan afectados por la respuesta de la planta. Como se verá a lo largo de este capítulo, esta idiosincrasia en la respuesta defensiva de las plan-tas es lo que en cierto modo permite modificar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos y plagas mediante transformación genética. Se de-sarrollan a continuación con más detalle cada uno de estos aspectos.
1. La resistencia inducida en plantas viene determinada por diferentes vías y mecanismos. Frecuentemente, la resistencia frente a
pa-84 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
tógenos se manifiesta mediante la respuesta hipersensible. En este caso, las células que se encuentran en la proximidad del foco de infección su-fren una muerte controlada, hecho que contribuye a limitar la progresión de la infección del tejido. Hay un aparente paralelismo entre el fenóme-no de muerte celular programada que se produce en la respuesta hiper-sensible con el proceso de apoptosis en el sistema animal. Sin embargo, en muchos sistemas planta-patógeno la resistencia se produce en ausencia de esta respuesta hipersensible. Por otra parte, la resistencia puede ser loca-lizada, esto es, limitada al punto de infección o de ataque por un fitófago; en otros casos, se observa una resistencia sistémica, en zonas de la planta alejadas del punto de infección. Frecuentemente, se observa un efecto de Ímmunización en la planta según el cual una planta que ha estado expuesta y, ha superado una infección, se encuentra protegida frente a infecciones posteriores y no únicamente frente al patógeno inicial sino también fren-te a otros patógenos. Asimismo, esta profren-tección se manifiesta no sólo en el tejido inicialmente infectado, sino también en puntos distantes de la planta. Este fenómeno es conocido como resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Acquired Resistance»). Por último, mencionar que al-gunas respuestas defensivas se desencadenan rápidamente, en cuestión de minutos u horas; otras por el contrario, se producen al cabo de varios dí-as después de la inducción. Esta diversidad de fenómenos y respuestdí-as po-ne de manifiesto que la resistencia frente a patógenos y fitófagos se basa en la expresión de múltiples mecanismos que se integran en un proceso general coordinado de resistencia inducida.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 85
3.1.3. Las plantas sintetizan compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida
Las plantas desarrollan diferentes estrategias defensivas que van dirigidas a contrarrestar el paso o penetración del patógeno, o el consumo de las mismas por fitófagos. Una primera línea de defensa frente a patógenos es la creación de barreras físicas, a través del reforzamiento de la pared celular. Por ejemplo, se sabe que el metabolismo de los fenilpropanoides desempeña un papel impor-tante en la respuesta de defensa frente a patógenos (la incorporación de com-puestos fenólicos en la pared celular es una de las reacciones de defensa que ocurre más rápidamente). La lignificación, junto con la incorporación de prote-ínas estructurales en la pared (proteprote-ínas ricas en hidroxiprolina, proteprote-ínas ricas en glicina), tiene como resultado el reforzamiento de la pared vegetal y por lo tanto tiene un efecto obstaculizador a la penetración del patógeno. La forma-ción de depósitos de callosa en papilas, es una reacforma-ción que se observa frecuen-temente, tanto en respuesta al ataque por patógenos como en respuesta a heri-da (efecto que se produce cuando un fitófago se alimenta de la planta).
Asimismo, las plantas tienen la capacidad de sintetizar compuestos, metabo-litos o proteínas, que poseen ya un efecto nocivo directo sobre el organismos agresor, esto es, compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida. Desde el punto de vista bioquímico, estos compuestos son de naturaleza muy heterogénea. Las fitoalexinas, compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, son también productos del metabolismo de los fenilpropanoides. Cada especie vegetal produce fitoalexinas características, cuya síntesis depende de la activación transcripcional de los genes que codifican para los diferentes enzimas involucrados en su biosíntesis (fenilalanina.amonio liasa, 4-cumarato:CoA ligasa, etc). Por citar unos ejemplos, la camalexina y la pisatina son fitoalexinas producidas por Arabidopsis y guisante, respectivamente. La síntesis y acumulación de fitoalexinas en los puntos de infección es una respuesta rápida por parte de la planta.
En líneas generales, dentro de la respuesta de defensa que conduce hasta la síntesis y acumulación de productos con actividad antimicrobiana o insecticida pueden distinguirse diferentes etapas:
lúe-86 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
go en el citoplasma, que culminan en el núcleo de la célula vegetal con la inducción de la expresión de genes de defensa (Fig. 2). Las primeras re-acciones que se observan son alteraciones en el flujo de iones a través de la membrana (entrada de H+ y Ca 2+, salida de K+ y Cl~), y producción de moléculas reactivas de oxígeno (por la acción del complejo de oxidasas dependientes de NADPH , y peroxidasas). Más recientemente, se ha po-dido comprobar como el óxido nítrico, un poderoso activador de la res-puesta inmune animal, tiene una función importante en la resres-puesta de-fensiva de las plantas frente a patógenos. Estas moléculas (especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico), no sólo pueden tener un efecto tóxi-co directo sobre el patógeno, sino que además pueden actuar tóxi-como mo-léculas señalizadoras para la activación de mecanismos de defensa (res-puesta hipersensible, activación de la expresión de genes de defensa). —2a etapa: Transmisión de la señal hasta el núcleo de la célula vegetal. El
proceso que se desencadena con el reconocimiento del organismo agre sor al nivel de la membrana citoplasmática, hasta la activación trans- cripcional de genes de defensa, tiene todavía muchos puntos oscuros. Se sabe que participan procesos de fosforilación y defosforilación de pro teínas, procesos que son dependientes de los niveles de Ca++ citoplas- mático (Fig. 2). Por otra parte, se han identificado factores de transcrip ción que participan en la regulación de la expresión de genes de defensa concretos. La acumulación de los transcritos correspondientes a genes de defensa se detecta ya desde los minutos hasta las primeras horas, en el caso de aquellos genes cuya expresión se activa localmente en torno al lugar de infección o del ataque por un fitófago. En el caso de genes que se expresan sistémicamente, la acumulación de los transcritos de ge nes de defensa se observa desde las primeras horas hasta varios días más tarde. Quedan, sin embargo, muchos aspectos por aclarar para poder co nocer como se integran todos estos procesos dentro de la célula vegetal. —3a etapa: Acumulación de compuestos capaces de contrarrestar la pene
APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 87
Pcroxinlh'ico _ _ _ -.. Rcsistencia Sistemica Adquirida
( mediada por Acido Salicilico )
r
Oxido Nitrico Membrana plasmatica Acido IInoleicoFigura 2. Componentes principaLes de La cadena que se inicia con el reconocimiento del pat6geno par
re-ceptores especfficos de la membrana pLasmatica y conduce hasta La activaci6n de La expresi6n de genes de defensa en el nucleo de la celula vegetal. Adaptado a partir de Somssich y Hahlbrock (1998).
TMV (TMV,
«Tobacco
Mosaic Virus»). La informacion recogida en el
campo de las protefnas PR en muy diferentes sistemas de interaccion
planta/patogeno ha permitido agrupar estas protein as en familias
inde-pendientes, atendiendo a sus secuencias nucleotidicas 0 proteicas,
rela-ciones serologicas 0 a su funcion (Tabla 1). Se ha demostrado
la
activi-dad antifungica, tanto
in vitro como in vivo (plantas transgenicas), para
varias
protein as PRo Este serfa el caso de
las
quitinasas,
~-1,3-glucanasas,defensinas, tioninas y proteinas transportadoras de Ifpidos. Dentro de las
proteinas PR, se ha incluido una familia de proteinas, los inhibidores de
proteinasas (PR 6), cuya funcion esta directamente relacionada con la
proteccion frente al ataque por predadores (insectos, nematodos).
4
aetapa: Transmision
de la sefial para la activacion de la respuesta de
de-fensa en la planta entera. Las plantas activan sus dede-fensas no solo en el
punto concreto en el cual se produce la infeccion 0 el ataque por el
fito-fago (respuesta local), sino tambien en puntos distantes de la planta
(res-puesta sistemica). Se han descrito diferentes moleculas que, de una
ma-nera u otra, estan implicadas en
la
activacion de
los
mecanismos de defensa
a
escala
sistemica. Asi por ejempl0, se sabe que el acido salicflico
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
manifieste la respuesta sistémica adquirida. La posible función de la vía mediada por el ácido salicílico frente a fitófagos es un aspecto más des-conocido. Aunque el ácido salicílico es necesario para que se manifieste la respuesta sistémica adquirida, se piensa que no es la molécula señali-zadora que se mueve a través de la planta. Algunas rizobacterias no pa-togénicas activan una respuesta diferente, no mediada por ácido salicíli-co, y que también protege a la planta frente a virus, bacterias y hongos patogénicos. La particularidad de este mecanismo es que no va asociado a la reacción hipersensible ni a la producción de proteínas PR. Esta res-puesta ha sido definida como resistencia sistémica inducida (ISR, «Indu-ced Systemic Resistance») para diferenciarla del fenómeno de resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Adquired Resistance»). Otra vía de señalización de la respuesta de defensa a escala sistémica
es-TABLA 1 Familia de proteínas PR («Pathogenesis-Related»)
Familia Representante Propiedades/actividad
PR-1 PR-la de tabaco Desconocida
PR-2 PR-2 de tabaco (3-1,3-glucanasa
PR-3 Proteína P, Q de tabaco Quitinasa tipo I, II, IV, V, Vi y VII PR-4 Proteína R de tabaco Quitinasa I y II
PR-5 Proteína S de tabaco Tipo taumatina
PR-6 Inhibidor I de tomate Inhibidor de proteinasas PR-7 Proteína P69 de tomate Endoproteinasas PR-8 Quitinasa de pepino Quitinasa tipo III PR-9 Peroxidasa de tabaco Peroxidasa PR-10 Proteína PR1 de perejil Tipo ribonucleasa PR-11 Quitinasa clase V de tabaco Quitinasa tipo I PR-12 Proteína Rs-AFP3 de rábano Defensina PR-13 Proteína THI2.1 de Arabidopsis Tionina
PR-14 Proteína LTP4 de cebada Proteína transportadora de lípidos
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 89
ta mediada por el etileno. Así, en respuesta a infección o herida se ob-serva una producción importante de etileno en la planta, seguido de un incremento de una serie de compuestos de defensa (lignina, proteínas PR, etc.). El ácido jasmónico. un regulador del crecimiento vegetal, tam-bién interviene en la respuesta de defensa de la planta frente a fitófagos y microorganismos. La sistemina. una hormona polipeptídica vegetal, y no el ácido jasmónico, es la molécula señalizadora que se transporta a través de la planta, activando la producción de jasmonatos. Por último, el ácido abscísico. otra fitohormona reguladora de diferentes procesos fi-siológicos de la planta implicada en estrés abiótico (p.e. sequía), también participa en la respuesta de defensa de las plantas frente a herida, pro-bablemente en una etapa anterior a la vía del ácido jasmónico. Depen-diendo de la especie vegetal, se observan diferencias en cuanto a la par-ticipación de cada una de las posibles rutas de señalización indicadas. En definitiva, frente al ataque por patógenos y fitófagos se produce un re-ajuste importante en los procesos fisiológicos de una planta en el que participan múltiples vías de señalización mediadas por hormonas. Estas mismas hormonas, realizan funciones reguladoras de los procesos fisiológicos propios del desarro-llo de la planta. Por lo tanto, estas hormonas adquieren nuevas funciones con el fin de proporcionar a la planta una defensa rápida y efectiva.Un hecho com-probado es que las diferentes rutas de señalización interaccionan entre ellas, in-teracciones que pueden tener un efecto de sinergismo o de antagonismo. Por ejemplo, en tabaco se observa un efecto sinérgico entre etileno y metiljasmona-to en cuanto a la indución de genes PR. Por otra parte, se ha descrito que el ácido salicílico inhibe la ruta del ácido jasmónico y la acumulación de inhibidores de proteinasas. La existencia de esta multiplicidad de vías de señalización y de conexiones entre las mismas explicaría los efectos de resistencia cruzada que se observan frente a diferentes organismos, patógenos o fitófagos.
3.1.4. Respuesta de defensa frente a insectos
plan-90 BIOTECNOLOGÍA APLICADA ALA AGRICULTURA
ta, disminuyendo de esta manera la calidad nutricional del material del que se mentan. Ello, además de producir un efecto disuasorio tal que el insecto deja de ali-mentarse, en muchos casos conduce a retrasos importantes en el crecimiento e inclu-so a la muerte del insecto. La inducción de la expresión de los genes de inhibidores de proteinasas se observa tanto a escala local como sistémica. De hecho, este ha sido el modelo más exhaustivamente estudiado en relación con las moléculas señalizadoras implicadas en la respuesta sistémica frente a herida en plantas (ácido abscísico, ácido jasmónico y sistemina). Estos estudios se han realizado fundamentalmente en sola-náceas (patata, tomate). Resulta interesante el hecho de que la ruta biosintética que conduce hasta la síntesis del ácido jasmónico en plantas (ruta de los octadecanoides) es similar a la ruta de biosíntesis de prostaglandinas y leucotrinas en animales. De nue-vo nos encontramos ante un paralelismo entre animales y plantas.
Pero además, las plantas se protegen frente a insectos por una vía indirecta, que consiste en la emisión de compuestos volátiles capaces de atraer a depreda-dores o parásitos que son enemigos naturales del fitófago que se encuentra ata-cando a la planta (Fig. 3). Además, la emisión de estos compuestos al entorno es capaz de activar las respuestas de defensa en las plantas vecinas. Más concreta-mente, se ha podido comprobar que en la saliva de determinados fitófagos se en-cuentran compuestos, p.e. la volicitina de las larvas de la polilla Spodoptera exi-gua, que son capaces de inducir la emisión de compuestos volátiles atrayentes de avispas depredadoras cuando las larvas se alimentan de plantas de maíz. De to-do ello se desprende el hecho de que una planta es capaz de discriminar entre una herida mecánica y el mordisco de un fitófago. Si bien los mecanismos por los cuales la planta regula la síntesis de estos compuestos volátiles no son del todo conocidos, se piensa que la vía de los octadecanoides, vía que la planta utiliza para regular la expresión de los inhibidores de proteinasas, también está implicada en este proceso de liberación de compuestos volátiles al medio ambiente.
3.1.5. Aplicaciones de la resistencia inducida en agricultura
pa-APLICACIONES BIOTECNOL6GlCAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 91
t6genos.
Como ejemplo, cabe citar compuestos
como
el
BTH
y
eIINA,
inducto-re
s de la respuesta mediada por
acido salicflico,
capaces de desencadenar
res-puestas simi lares a la que
se observan en
respuesta a infecci6n por pat6genos.
Es-las molecuEs-las son
ademas
inductoras de la resistencia
sistemica adquirida
y
producen un
efecto
protector
frente
a un
amplio
espectro de pat6genos. La
utili-zaci6n de
elicitores
qufmicos frente a fit6fagos se
encuentra
en una
fase
menos
Com
puestos vohi
tiles
•
f-
M
,rAe
Avispas deprcdadoras
.
...
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,:'".M
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•
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Hedda
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Ruta
oaadeCanOI(leSnH~'(fo'jasm6ilicoFigura 3. Respuesta de defensa de las plantas frente al ataque por fit6fagos. En respuesla al ataque por
insectos fit6fagos y a la herida se induce la expresi6n de genes que codifican para inhibidores de prole
i-nasas. Estos inhibidores lienen efectos nocivos en el proceso digestivo del insecto. causando el retraso en el crecimiento e incluso la muerte deimismo. Ademas la planta que est
a
siendo atacada emile una se-rie de compuestos volatiles que atrae a avis pas, que son enemigos naturales del fit6fago que se esta92 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
desarrollada. Recientemente, se ha comprobado como la aplicación exógena de ácido jasmónico induce resistencia frente a fitófagos en plantas de tomate.
La «vacunación» de una planta con organismos vivos (agentes de control bio-lógico) tiene la ventaja de que proporciona todas las señales ante las cuales la plan-ta reacciona. Sin embargo, la situación más frecuente es que la aplicación de orga-nismos vivos puede resultar de difícil control. De ahí el interés que tiene el desarrollo de métodos de inmunización basados en la utilización de compuestos inductores de la respuesta defensiva en lugar de organismos vivos. A medida que se vaya ampliando nuestro conocimiento acerca de las rutas implicadas en la activación de las respuestas defensivas de las plantas, sin duda se ampliarán las posibilidades para la utilización de inductores químicos en la protección frente a patógenos y/o fitófagos. En último término, la aceptación de agentes químicos como inductores de resistencias en plan-tas por los agricultores vendrá determinada por consideraciones económicas, esto es, dependerá del coste que la utilización de esta estrategia implica para el agricul-tor y de los beneficios que ello representa para las compañías que producen y co-mercializan estos compuestos. Un aspecto negativo acerca del uso de estos com-puestos en agricultura es que su utilización extensiva podría tener consecuencias negativas desde el punto de vista medioambiental.
Sin duda, la utilización de genes de defensa para la transformación de plan-tas y obtención de variedades resistentes a plagas y enfermedades, ha tenido el impacto más importante en la agricultura moderna.
3.1.6. Obtención de variedades transgénicas resistentes a plagas y/o patógenos
Las técnicas de la biología molecular han contribuido enormemente al desa-rrollo y obtención de variedades que presenten mejoradas sus propiedades de re-sistencia frente a infección por patógenos, o frente al ataque por depredadores (insectos, nematodos). En el transcurso de los últimos años se ha recogido una gran cantidad de información acerca de los procesos de defensa naturales de las plantas y se han identificado una colección importante de genes que participan en dichos procesos. Es ahora cuando se están obteniendo los resultados prácticos del trabajo anterior, al aplicarse toda esta información y elementos de trabajo para la mejora genética de especies vegetales de interés en el sector agroalimentario.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 93
frente a otro tipo de patógeno, y ello no únicamente en la especie de la cual pro-viene dicho gen sino también en otras especies. El ejemplo que mejor ilustra es-tos aspeces-tos es la utilización de genes que codifican para quitinasas y |3-l,3-giu-canasas de tabaco, genes cuya expresión se induce en respuesta a infección por el virus del mosaico del tabaco (TMV), y que han sido utilizados para la obtención de resistencias frente a hongos en otras especies, por ejemplo tomate.
Por otra parte, se sabe que la expresión de genes que codifican para proteí-nas de defensa se induce tanto en interacciones de tipo incompatible (resistencia frente al patógeno, incluyendo en respuesta hipersensible) como de tipo compa-tible (susceptibilidad frente al patógeno). Por lo tanto, la resistencia o la suscep-tibilidad frente a un patógeno, es dependiente de diferencias en: a) la intensidad con que se expresan estos genes de defensa; b) el momento o el tiempo durante el cual se expresan; c) los tejidos que los están expresando (expresión local o sis-témica), y d) la correcta combinación de genes que se expresan en cada caso. Por consiguiente, la modificación de cualquiera de estos parámetros (p.e. la sobreex-presión de un gen concreto en la propia planta) nos permite mejorar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos o ataque por insectos.
La utilización de genes de defensa para la obtención de plantas transgenicas empezó a dar sus frutos en especies dicotiledóneas, debido a la facilidad con que estas especies pueden ser transformadas por una bacteria del suelo, Agrobacteñum. Esta bacteria, que infecta de modo natural muchas especies de plantas dicotiledó-neas, es capaz de integrar en el genoma de la planta huésped fragmentos de ADN, es decir, que lleva a cabo un proceso de transformación genética en la planta hués-ped. Las especies monocotiledóneas, y dentro de ellas especies de evidente interés agro-económico como son los cereales, han sido tradicionalmente especies más di-fíciles de transformar. Así pues, durante varios años la posibilidad de obtener plan-tas transgenicas resistentes de especies monocotiledóneas estuvo frenada por la metodología de la transformación propiamente dicha y por la dificultad de rege-nerar plantas fértiles a partir del material transformado. La técnica de bombardeo con microproyectiles ha venido a solucionar muchos de estos problemas. Así, la po-sibilidad de introducir ADN directamente en células, tejidos u órganos regenera-bles proporciona un método adecuado para la transformación de especies de cultivo. Simultáneamente, se han ido desarrollando las técnicas de transformación mediadas por Agrobacteñum, de manera que se ha ampliado significativamente el número de especies susceptibles de ser transformadas por esta metodología. Por ejemplo, se ha conseguido ya que Agrobacteñum transforme cereales (arroz).
qui-94 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
tinasas y |3-l,3-glucanasas el mecanismo por el cual se consiguen las resistencias a hongos está claro, ya que los substratos naturales de estas hidrolasas, quitina y [3-1,3-glucano, son los componentes estructurales mayoritarios de la pared de muchas familias de hongos. Para otras proteínas PR, se desconoce el mecanis-mo exacto por el cual se produce esta resistencia.
Mientras que en el campo de las resistencias frente a hongos o bacterias ya se han obtenido resultados importantes mediante manipulación de la expresión de genes que codifican para proteínas de defensa de origen vegetal, no es éste el caso para las resistencias frente a virus. Únicamente, una proteína de la fami-lia de las proteínas inactivadoras de ribosomas (proteínas RIP, o «Ribosome Inactivating Protein»), al ser introducida en plantas de tabaco y patata protege parcialmente frente a varios virus no relacionados. Desgraciadamente, las plan-tas transgénicas muestran fenotipos anormales, aparentemente a causa de efec-tos tóxicos del producto del transgén. Más recientemente se ha comprobado que la expresión en plantas de tabaco de una forma mutada de esta proteína RIP tie-ne efectos protectores frente a virus sin que cause efectos tóxicos para la plan-ta. Los logros más espectaculares obtenidos en la protección frente a virus pro-vienen de estrategias diferentes. En este campo, se han conseguido muy buenos resultados en las resistencias definidas como «resistencias derivadas de patóno» («Pathogen Derived Resistance») basadas en la introducción de material ge-nético viral en el genoma de la planta huésped. Así, en 1986 se demostró por pri-mera vez que plantas transgénicas que expresan la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV) mostraban resistencia frente aTMV. Este mecanismo de resistencia determinado por la expresión de la proteína de cu-bierta ha sido observado para otros diferentes virus (CMV, «Cucumber Mosaic Virus», etc.). Se han descrito además resistencias mediadas por la introducción de otras secuencias virales, tanto secuencias codificantes (replicasas, proteínas de movimiento) como secuencias no codificantes (secuencias antisentido, ge-nomas defectivos y secuencias de ARN satélite). Se sabe ahora que en muchos casos estos mecanismos de resistencia se encuentran mediados por ARN. Se trata de procesos de degradación específica de las moléculas de ARN virales como consecuencia de la formación de moléculas híbridas (doble cadena de ARNs), mecanismos similares al fenómeno de cosupresión o silenciamiento post-trans-cripcional de genes endógenos por parte de la célula vegetal.
ac-APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 95
tualidad se está dedicando un esfuerzo importante hacia la identificación de ge-nes de defensa de origen no vegetal para la mejora genética de plantas.
La idea de utilizar genes que codifican para proteínas o péptidos con acti-vidad antimicrobiana, que se producen en la respuesta natural de defensa de otros organismos para aumentar las propiedades de resistencia en plantas am-plia las posibilidades, y representa una estrategia alternativa a la utilización de genes de defensa de origen vegetal. Los organismos que potencialmente pueden resultar de mayor interés como fuente suministradora de genes antimicrobia-nos pueden ser hongos antagonistas o micoparásitos, como es el caso de Tri-choderma spp.. Estos hongos, que por otra parte son frecuentemente utilizados como controladores biológicos de hongos patógenos, han evolucionado específicamente para atacar a otros hongos del suelo, pero no a las plantas. Los genes que codifican para péptidos que participan en la respuesta inmune de insectos (defensinas, cecropinas) son también candidatos válidos para ser utilizados como transgenes en la mejora genética de plantas. A diferencia de lo que se observa con los genes de defensa de origen vegetal, los resultados ya obtenidos con la introducción de genes de defensa de origen no vegetal en plantas indican que las plantas transgénicas quedan protegidas frente a un espectro más amplio de patógenos.
La utilización de genes de origen no vegetal es precisamente una de las es-trategias que ha dado mejor resultado en relación a la protección frente al ata-que por insectos. Este es el caso de los genes ata-que codifican para toxinas con ac-tividad insecticida de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (genes Sí). Así por ejemplo, los genes Bt han sido expresados en diferentes plantas dicotiledó-neas, tabaco, tomate, patata, así como en monocotiledódicotiledó-neas, maíz y arroz. De he-cho, es bien conocido el caso del maíz Bt, cultivo protegido frente al taladro, y uno de los primeros cultivos transgénicos que han sido comercializados.
96 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
presenten diferentes propiedades inhibitorias, es decir que inhiban diferentes tipos de actividades proteolíticas digestivas de los insectos.
La línea de investigación más actual va en la dirección de poder manipular mediante transformación genética vías concretas de señalización para la activa-ción de las respuestas de defensa. Ello permitirá regular la expresión de varios genes de defensa simultáneamente. La utilización de esta estrategia requiere no obstante un conocimiento preciso de la ruta de señalización que se desea modi-ficar, así como, de las posibles rutas secundarias que puedan resultar afectadas.
3.1.7. Nueva generación de plantas transgénicas
Son relativamente pocos los años que han transcurrido desde que se intro-dujo en el mercado mundial el primer cultivo modificado genéticamente (1995). En el año 1996, agricultores de Estados Unidos y Canadá sembraron maíz tole-rante al taladro, el maíz Bt. En 1999, aproximadamente el 50% del maíz, algodón y soja cultivado en Estados Unidos ha sido modificado genéticamente (bien para producir la proteína insecticida Bt, bien para introducir resistencia a herbicidas). Los cultivos transgénicos con los que más ensayos de campo se han realizado son algodón, maíz, cañóla, melón, patata, soja, tomate y tabaco. Las ventajas que se derivan de la utilización de estas variedades modificadas genéticamente incluyen el incremento en la producción y la reducción en el uso de productos químicos en el campo (pesticidas), con el consiguiente beneficio que ello supone para la con-servación del medio ambiente y la reducción de los costes de producción.
Paralelamente, durante este corto periodo de tiempo, la biotecnología ve-getal aplicada a la mejora de plantas ha sufrido un espectacular avance. Las ca-racterísticas de las nuevas variedades de plantas transgénicas, están significati-vamente mejoradas con respecto a las que se liberaron inicialmente. Se han superado así algunos de los aspectos criticados sobre la producción de plantas transgénicas que han sido el origen de importantes debates públicos que, en ma-yor o menor grado, dificultan la aceptación de estas tecnologías por la sociedad. En la percepción pública de los cultivos modificados genéticamente existen du-das y preocupaciones, en aspectos que quizás la comunidad científica no ha con-tribuido a aclarar suficientemente, pero ante los cuales existen soluciones con una base científica bien fundada. Sin entrar en detalles técnicos, examinaremos algunos de los aspectos considerados negativos en las plantas transgénicas de primera generación y las soluciones encontradas para cada uno de ellos.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 97
constitutivos capaces de dirigir la expresión de genes antifúngicos o insecticidas en niveles importantes en los diferentes tejidos de la planta transgénica. Por el con-trario, la nueva generación de plantas transgénicas se basa en la utilización de pro-motores inducibles. De esta manera, el gen se expresará únicamente en aquellos momentos en los que es requerida la presencia de su producto (proteína antifún-gica o insecticida), o sea, cuando la planta se encuentra infectada por un patógeno o cuando es atacada por un fitófago. También con relación al promotor que se emplea para la transformación, otro aspecto al que se presta una atención especial es que el promotor confiera una expresión de tejido controlada, y no una expresión generalizada en todos los tejidos de la planta. Ello permite que la proteína antimicrobiana o insecticida se produzca únicamente en los tejidos de la planta que son susceptibles de ser atacados por el agente agresor, pero no en tejidos u órganos que se destinan al consumo humano. Por citar un ejemplo, es posible obtener una planta transgénica de maíz o arroz que exprese un gen insecticida (gen Bt, gen para un inhibidor de proteinasas) en las hojas y el tallo, tejidos de los que se alimentan las larvas de insectos, pero que dicho gen no se exprese en el grano.
Una crítica muy generalizada en la opinión pública es la incorporación de ge-nes que confieren resistencia a antibióticos en el genoma de las plantas transgéni-cas. La función de estos antibióticos es esencial en la etapa inicial del proceso para la obtención de plantas transgénicas ya que permiten la selección del material que ha sido transformado (permite el crecimiento de las células transformadas, frente a las que no lo han sido, en medios apropiados). Dejando aparte el hecho de que no se ha podido demostrar la existencia de transferencia génica horizontal, es-to es de que un gen de una planta pueda ser transferido a otros microorganismos, se han desarrollado estrategias que permiten prescindir de la utilización de genes de resistencia a antibióticos. Así por ejemplo, se pueden utilizar genes de selección que confieren resistencia a herbicidas o genes que producen fitohormonas. Otra alternativa válida es llevar a cabo la co-transformación del material vegetal con dos vectores diferentes, uno portador del gen de interés (antifúngico, insecticida) y el otro portador del gen para la selección del material transformado. De esta ma-nera, los genes se integran independientemente en el genoma de la célula vegetal para dar lugar a transformantes primarios portadores de ambos genes. Por tanto, es posible segregar (eliminar) el gen de selección de una línea transgénica, que-dando únicamente presente en su genoma el gen de interés, en generaciones pos-teriores. En definitiva, se trata de utilizar técnicas de transferencia de ADN más depuradas, que permitan introducir el gen de interés (angifúngico, insecticida) pe-ro no genes indeseables (p.e. genes de resistencia a antibióticos).
cloroplas-98 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
to). El genoma de cloroplasto se hereda por vía maternal, de manera que el po-len no contiene ADN de cloroplastos.
Por último, el progreso que se observa en los programas de secuenciación de genomas (Arabidopsis, arroz) así como en la cartografía génica en especies vegetales, van a permitir en muy corto plazo de tiempo identificar nuevos genes, tanto genes de defensa como genes de resistencia, además de genes implicados en la regulación de la expresión de los mismos, y que sin duda van a ser de inte-rés para la mejora de especies vegetales de inteinte-rés comercial. El reto que nos presenta ahora el siglo XXI es el ser capaces de llevar a cabo la transición hacia una agricultura sostenible que sincronice el nivel de producción agrícola con las necesidades de la población mundial, tanto en los países actualmente desarro-llados como en países subdesarrodesarro-llados. La diversidad de recursos a nuestra dis-posición, junto con las nuevas técnicas biotecnológicas, nos permiten ser opti-mistas con respecto a la necesidad de alimentos a la que nos enfrentamos. Va a ser necesaria la utilización efectiva y combinada de todos nuestros materiales y recursos tecnológicos para superar este reto. Ello, además de exigir una dedica-ción al tema dentro de la propia comunidad científica, implica la creadedica-ción de programas para la formación de personal científico y técnico de manera que es-ta metodología pueda introducirse en países en vías de desarrollo.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
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AGRAWAL, A. A.;TUZUN,S., y BENT,E. (eds.). 1999. Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores. APS Press.
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STOTZ,H.U.;KROYMANN,J.,y MICHELL-OLDS,T. 1999. «Plant-insect interacions». Curr. Op. Plant Biol. 2: 268-272.
3.2. APROXIMACIONES BIOTECNOLOGÍAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A CONDICIONES AMBIENTALES EXTREMAS*
La disminución en el rendimiento de los cultivos se debe mayoritariamen-te al estrés, que puede ser de tipo biótico (ataque de insectos o patógenos) o abiótico (temperaturas extremas, sequía y salinidad). Este último es, con mucho, el responsable de las mayores pérdidas en la productividad agrícola (Fig. 1). La salinidad y la sequía son problemas especialmente importantes para la agricultura de tierras áridas y semiáridas. Por ejemplo, el problema de la salinidad afecta a 340 millones de hectáreas de suelo cultivado. Los efectos de la sal son lentos y acumulativos, apreciables en plazos que varían desde décadas hasta siglos, y difícilmente reversibles. Solamente el 10% de los terrenos de cultivo en todo el mundo se considera libre de todo tipo de estrés abiótico.
Una manera de incrementar los recursos agrícolas existentes es el empleo de nuevos tipos de cultivo que sean más resistentes a sequía, salinidad, y tem-peraturas extremas, así como la adaptación de nuevos terrenos para el cultivo que permita aumentar la productividad de las especies de interés agronómico.
La mayor dificultad que presenta el abordaje de este problema mediante las técnicas de mejora genética tradicional de las especies es que se trata de un proceso largo y laborioso y que no siempre es posible modificar un carácter de-terminado. Sin embargo la ingeniería genética podrá en breve utilizarse como un método rápido y preciso para conseguir un aumento en la tolerancia al es-trés de la planta. Para ello es necesario conocer los mecanismos básicos que ri-gen la defensa de las plantas frente al estrés y desarrollar estrategias adecuadas para mejorar esta capacidad (Fig. 2).
3.2.1. Respuesta de las plantas al estrés
La sequía, la salinidad y las temperaturas extremas producen en la planta un estrés osmótico directo, mientras que la hipoxia causa un estrés osmótico in-directo debido a alteraciones en la captación y pérdida del agua. La respuesta
100 BlOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULTURA
Salinidad
~----~---,
lones toxicos
Figura J. Los distintos tipos de est res abi6tico son los responsables de las mayo res perdidas en la pro-ductiviclad agricola.
fisiol6gica de la planta al estres osm6tico puede producirse mediante cambios
ffsicos a escala celular, como disminuci6n de
la
turgencia
,
cambio en el volumen
de la celula
0en el contenido en solutos del citoplasma. Estos cambios activan
una ruta de transducci6n de
sefial,
transformando un
estres
ffsico en una
res-puesta bioqufmica. Por
l
a
ruta de transducci6n se envfa
el
mensaje a traves de
una cadena molecular en la que intervienen mensajeros
secundarios
(calcio)
,
y
otros intermediarios como quinasas y fosfatasas, hasta los factores de
trans-cripci6n, que regularan la
expresi6n
de los genes
encargados
de la respuesta al
estres. La hormona vegetal acido abscfsico (ABA) juega un papel importante en
la sefializaci6n del estres osm6tico. Los niveles de ABA
aumentan
en respuesta
al
estres
hfdrico y participan
en
la tolerancia de las plantas
a sequfa,
salinidad
y
frio.
La
expresi6n
de un gran numero de genes es inducida por
ABA y/o
estres.
El estudio de promotores ha identificado un numero limitado de elementos
cis
importantes para
la
regulaci6n del gen. Entre ellos destacan dos tipos: el
ele-mento ABRE
(ABA response
e
l
ement),
de respuesta
a ABA, y el elemento
DRE
(Drought Response Element)
,
de respuesta a sequfa pero independiente de
ABA
y que tienen
un
papel preponderante
en
la regulaci6n genica. El
elemento
ABRE,
esta definido por la secuencia central ACOT y a eJ se linen protefnas del tipo
cre-mallera de leucina (b-Zip). Fue identificado por primera ve
z
en el gen
Em del
tri-go, y
se
ha demostrado que
este elemento
es funcional
en
mafz, trigo, arroz,
taba-co
y
Arabidopsis.
Sin embargo,
el
motivo ACOT se
encuentra
tambien en otros
afini-APROXIMACIONES BTOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 101
Elegir organismo 0 tejidos
que toleren situaciones extremas
•
Aislar
y
clonar genesque confieran tolerancia al estres
•
Caracterizar el producto genico
y
analizar su expresi6n•
Introducir el gen en una planta modelo. Analisis en situaciones de estres
•
Pruebas de campo en cultivos transgenicos
Figura 2. Esquema de L1na aproximaci6n experimental para la obtenci6n de plantas transgenicas me -jor adaptadas a condiciones ambientales adversas.
dad con
las
secuencias que
contienen
esta caja. En otros casos la especifidad de la
respuesta se debe a un segundo elemento
de
ADN, Hamado CE (coupling element),
requerido para
la
respuesta a ABA. Dos elementos
de
este
tipo
se
identificaron
por primera vez en
promotores
de genes
de
cebada. El elemento de
respuesta
a
la
sequfa
,
el elemento DRE
(Drought
Response Element), fue
descrito
y
caracteri-zado en
un
gen
de
Arabidopsis
thaliana
cuya expresi6n se
induce
par estres
hfdri-co, salinidad y
baja
temperatura y
al que regula mediante una ruta independiente
de
ABA. En esta especie, se
han
aislado
distintos
factores
de transcripci6n que
se
unen
ala secuencia DRE y contienen el
motivo
AP2. Hay otros motivos
impor-tant
e
s en la regulaci6n de gen
e
s relacionados con el estres osm6tico
que
han sido
descritos en distintos sistemas y se estan caracterizando
.
Los productos
proteicos
de
los
genes
que
se inducen
par
el estres se
pue-den clasificar en dos grupos, aquellos que protegen directament
e
del estres
am-biental y aquellos
que intervienen
en
la regulaci6n de la
expresi6n genica y la
transducci6n
de la
seiial en
la respuesta al
estres. El
primer grupo incluye
pro-tefnas que
funcionan
protegiendo
a
las celulas
contra
la deshidrataci6n como
osmoprotec-102 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
toras (osmolitos), proteínas de la embriogénesis tardía LEA (late embryogene-sis abundant), chaperonas, proteínas anticongelantes, y enzimas detoxificantes. El segundo grupo de productos génicos incluye factores de transcripción, proteína quinasas y enzimas involucradas en el metabolismo de los fosfoinosítidos.
3.2.2. Mejora de la tolerancia al estrés en plantas
Para mejorar la tolerancia de la planta al estrés mediante la ingeniería gené-tica se han utilizado genes que incrementan su expresión en condiciones de se-quía y salinidad, y codifican proteínas relacionadas con la protección de las célu-las frente al estrés. Entre ellos se incluyen genes que codifican enzimas que catalizan la conversión de substratos naturales en productos con propiedades os-moprotectoras, enzimas modificadores de las propiedades de la membrana, proteínas inducidas durante el estrés hídrico etc. Sin embargo, la adaptación al estrés implica cambios en distintos procesos fisiológicos y es por tanto improbable que un único producto génico sea suficiente para solucionar el problema. Como veremos a continuación, en la práctica se han obtenido tolerancias parciales en plantas transgenicas sobreexpresando un único gen protector, por lo que parece que será necesario introducir un grupo de genes en la planta transgénica para conseguir un nivel más elevado de tolerancia al estrés. En principio, la activación simultanea de varios genes involucrados en la resistencia al estrés se puede conseguir mediante la obtención de una planta transgénica que sobre exprese un único gen regulador como una quinasa, una fosfatasa o un factor de transcripción. En este contexto, para aproximaciones biotecnológicas cualquier proteína reguladora de la ruta de transducción desde el receptor de la señal de estrés hasta los factores de transcripción inducibles son potencialmente interesantes. También los genes que controlan el metabolismo del ABA son importantes pues un aumento hormonal puede desencadenar la inducción de los genes involucrados en la tolerancia al estrés. Experimentos recientes utilizando estas estrategias han conseguido resultados importantes que se describen a continuación (Fig. 3 y Tabla 1).
3.2.3. Aumento de la producción de compuestos osmoprotectores
ce-APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 103
Gen protector
Tolerancia al estn3s Tolerancia al est res
Figura 3. Dos tipos de estrategia para mejorar la tolerancia de la planta a condicones ambientales ad-versas (Busk, P.; Figueras, M.; Jessop, A.; Goday, A .. y Pages, M. 1998. Regulation of abscisic acid and
wa-ter slI'ess response genes. Genetic and environmental manipulation of horricultural crops (Cockshull, K.E.;
Seymour, G.B.. yThomas, B., editores). pp.143-156. CAB International UK.
lular) y
su
habilidad para
estabilizar
membranas
y/o
estructuras
macromolecu-lares. Debido
a
la relativa
simplicidad
de las rutas de sfntesis de los
osmolitos,
su
alteraci6n en plantas transgenicas se ha realizado
en
distintas
especies
y ha
dado lugar a la
obtenci6n
de fenotipos con mayor tolerancia a estres. Sin
em-bargo,
las concentraciones de solutos alcanzadas no son suficientes para
expli-car el efecto
osmoprotector como unico factor en la tolerancia.
En tabaco
se
introdujo el gen mltd 1 (manitol-l-fosfato
deshidrogenasa)
de
E.
coli
,
obteniendose
una
acumulaci6n
de 100 mM manitol y una tolerancia
mo-derada
a salinidad.
Dado que la concentraci6n de manitol
alcanzada
no
es
sufi-cientemente alta
para
explicar
un
ajuste
osm6tico, la tolerancia se
atribuy6 a
las
propiedades
osmoprotectoras de
este
compuesto. Muchos
organism os
acumu-Ian prolina en respuesta
al estres. La
expresi6n
en
tabaco de
I-pirrolina-5-car-boxilato
sintetasa (P5CS)
de Vigna
aconitifolia
dio
como
resultado un incremento
de
prolina y un
aumento en
la resistencia
al estres
hfdrico.
EI
mecanismo por
el
que la prolina confiere tolerancia
a
la desecaci6n no ha sido
aclarado. Una
po-s
ible
explicaci6n es
que la prolina
sirva
como almacen de carbona
y
nitr6geno
y
que
facilite
la recuperaci6n de las plantas tras
el
estres.
Plantas
transgenicas
de tabaco que
expresan el
gen
sacB
de Bacillus subtilis, que codifica una
fruc-tosil transferasa, muestran acumulaci6n de fructanos y un
aumento
de biomasa
que
confiere
una mayor tolerancia
en
condiciones de
estres
hfdrico.
La
expre-si6n
heter610ga
en
plantas de tabaco del
gen
TPSI
(trehalosa-6-fosfato
sinteta-sa)
de
Saccharomyces cerevisiae
produce la
acumulaci6n
de trehalosa pero
en
cantidades que no explican la tolerancia como un mero ajuste osm6tico. Las
plantas
transgenicas presentan
alteraciones
de varios caracteres (reducci6n
en
tamafio,
hojas lanceoladas, menor contenido en sacarosa) y tolerancia al estres
hfdrico. Esto apoya la hip6tesis de que
,
al margen de una posible funci6n
osmo-protectora, la introducci6n en tabaco del gen TPSI
altera el
metabolismo de
104 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
TABLA 1
Transgenes utilizados en plantas transgénicas para mejorar su tolerancia a distintos tipos de estrés
Síntesis de manitol 1992 Protección contra estrés por salinidad Acumulación de fructano 1995 Aumento de la tolerancia a sequía
Acumulación de prolina 1995 Aumento de la tolerancia al estrés por salinidad
Síntesis de glicina betaína 1997 Aumento de la tolerancia al estrés por temperatura y salinidad Síntesis de proteínas LEA 1996 Protección al estrés por salinidad y sequía
Transportador de potasio 1994 Aumento de la discriminación Na+/K+ en levadura Síntesis de trehalosa 1996 Aumento de tolerancia a sequía
Aumento de glutatión 1996 Protección contra salinidad y baja temperatura Acumulación de ononitol 1997 Aumento de tolerancia a sequía y salinidad
Acumulación de sorbitol 1998 Alta acumulación de sorbitol, lesiones necróticas en hojas Sobre expresión de
factores de transcripción
1999 Aumento simultáneo de la tolerancia a distintos tipos de estrés; sequía, frío y salinidad
Adaptado de Bohnert, H.J.; Su, H., y Shen, B. (1999). Molecular mechanisms of salinity tolerance. Molecular res-ponses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants. Shinozaki, K., y Yamaguchi-Shinozaki, K., editores, pp. 29-62. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA.
3.2.4. Sobreexpresión de proteínas inducidas por estrés
Los genes LEA {Late Embryo genesis Abundant) se identificaron por su ex-presión durante la maduración y desecación de la semilla. La semilla de la planta presenta el mayor grado de tolerancia a la desecación pudiendo perder más de un 80% de su peso en agua. Un dato importante que permitió considerar las proteínas LEA como posibles protectores de la estructura celular durante la de-secación, se obtuvo al estudiar su regulación en condiciones de sequía. Se com-probó que los genes LEA también se expresan en tejidos vegetativos en perio-dos de pérdida de agua como consecuencia de estrés hídrico, salino y de frío. Las proteínas LEA se acumulan en concentraciones muy elevadas y han sido de-tectadas en muchos tipos celulares. Su localización subcelular es predominan-temente citosólica, aunque algunas de ellas se encuentran en el núcleo o en el nucléolo. Su función es, en la mayoría de los casos, desconocida.
ve-APROXIMACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 105
getales. Las plantas transgénicas obtenidas al introducir el gen HVA1 de cebada en arroz, expresan cantidades elevadas de la proteína HVA1 en hojas y presentan una mayor tolerancia al estrés osmótico. El grupo de proteínas LEA al que pertenece HVA1 presentan repeticiones de un motivo compuesto por 11 aminoácidos. Se su-pone que este motivo forma una hélice antipática, la cara hidrofóbica forma pro-bablemente un homodímero, mientras que la cara hidrofílica se encargaría del se-cuestro de iones por lo que su función podría ser la de retener los iones que se acumulan en condiciones de deshidratación celular. Este motivo de 11 aminoácidos se encuentra también presente en proteínas que se inducen por frío y que presen-tan similitud con las proteínas AFPs {antifreezeproteins), aisladas de algunos peces del ártico (platijas), cuya función es la de impedir la formación de cristales de hie-lo en la célula. Sin embargo no se ha conseguido evidenciar una mayor protección a la helada en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan AFPs.
Las proteínas LEA del grupo 2, también llamadas rab (Responsive to ABA) o dehidrinas, poseen un motivo altamente conservado de 15 aminoácidos. Se ha propuesto que puedan tener un papel de agentes solubilizantes con propiedades de chaperonas. En el maíz la proteína rabl7 está fosforilada, y su papel podría ser de mediadora en el transporte de proteínas específicas al núcleo en situacio-nes de estrés. Las plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan la pro-teína rabl7 del maíz en cantidades elevadas en embrión y hojas, presentan una mayor tolerancia al estrés osmótico en las primeras etapas de la germinación.
3.2.5. Mejora de la flexibilidad de la membrana
Existe una alta correlación entre la sensibilidad al frío y el grado de insatura-ción de los ácidos grasos de las membranas plastídicas en plantas superiores. La presencia de dobles enlaces cis en los lípidos de las membranas disminuye la temperatura de transición a 0°C. Así, introduciendo enzimas capaces de catalizar la formación de dobles enlaces en ácidos grasos saturados o mono-saturados, se puede conseguir un fenotipo tolerante a las temperaturas bajas. Esto se comprobó con distintas plantas transgénicas portadoras de dichos enzimas. Plantas transgénicas de tabaco expresando una desaturasa co3 cloroplástica (Fad7) son más resistentes a las temperaturas bajas. Por otra parte, la expresión en plantas transgénicas de una desaturasa inespecífica aislada de Anacystis nidulans que introduce dobles enlaces en distintos lípidos de membrana resultó en un incremento de ácidos grasos D9-monosatura-dos y cuando las plantas transgénicas de tabaco se expusieron a 1°C durante 11 días no se observaron signos de clorosis como sucede en plantas control.
3.2.6. Eliminación de moléculas reactivas
Du-106 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
rante el estrés hídrico, la pérdida de agua en las hojas y el subsiguiente cierre de los estomas dan lugar a una disminución del CO2 disponible y a la producción de especies activas de oxígeno, como radicales superóxido. El aumento de la ac-tividad fotorespiratoria se acompaña también de elevados niveles de acac-tividad glicolato oxidasa, lo cual da lugar a la producción de H2O2. Plantas transgénicas que sobreexpresan genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo, como peroxidasas, catalasas, glutation reductasas (GR) y superóxido dismutasas (SODs) presentan distintos grados de protección al estrés oxidativo y en algu-nos casos se ha observado una mayor tolerancia al estrés abiótico. Esto puede explicarse como consecuencia de una protección cruzada. Plantas transgénicas que sobreexpresan enzimas detoxificantes presentaron un mejor rendimiento y tolerancia a estrés abiótico en las pruebas de campo debido a un aumento ge-neral del sistema de defensa, provocado por el peróxido producido, que también induce la expresión de varios genes que confieren resistencia al estrés hídrico. 3.2.7. Sobreexpresión de componentes de la ruta de transducción de señal
Las rutas de transducción de señal se han estudiado siguiendo estrategias di-ferentes: por un lado, la identificación de componentes moleculares mediadores en-tre la percepción del estrés por la célula hasta la inducción de los genes de toleran-cia a dicho estrés y por otro la caracterización de los factores de transcripción específicos que se unen a secuencias clave de los promotores y regulan la expresión del gen. La obtención de plantas mutantes con mayor sensibilidad o bien con un in-cremento en la resistencia al estrés, así como la sobreexpresión de proteínas indu-cidas por el estrés, ha permitido identificar genes esenciales en la adquisición de to-lerancia y moléculas diana en la transducción de señal de las rutas de protección.
El proceso de transducción de la señal es complejo y hasta el momento al menos cuatro rutas distintas han sido identificadas, 2 que dependen de ABA y otras 2 independientes de esta hormona. También determinados genes son ca-paces de responder a varios tipos de estrés y por tanto pueden ser activados a través de distintas rutas señalizadoras. Las distintas rutas incluyen elementos comunes y otros específicos para cada tipo de estrés. Entre las proteínas identi-ficadas se encuentran factores de transcripción, quinasas, fosfatasas, y una fos-folipasa C específica de fosfatidilinositoles, enzima involucrado en la síntesis de inositol 1,4,5-trifosfato. El inositol trifosfato estimula la liberación de calcio de su almacenaje intracelular, permitiendo su actuación como segundo mensajero.
APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 107
se unen a la secuencia de respuesta a sequía (DRE), aislados de Arabidopsis, al ser sobreexpresados aumentan la tolerancia a distintos tipos de estrés en la planta transgénica: CBF1 aumenta la tolerancia a la helada, DREB1A aumenta la tolerancia a sequía, salinidad y frío. Esta tolerancia se consigue por efecto del exceso del factor de transcripción que induce la expresión simultanea de varios genes que contienen el elemento al que el factor se une en la planta transgéni-ca. También la sobreexpresión de otro tipo de factores ha producido resultados interesantes, así plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan el fac-tor ATHB6, también inducible por ABA, muestran un aumento en su resisten-cia a la desecación. La sobreexpresión del factor alfinl en alfalfa aumenta la to-lerancia a salinidad y la del heat shock factor HSF3 aumenta la termo toto-lerancia.
3.2.8. Perspectivas de futuro
108 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
3.2.9. Agradecimientos
Mi agradecimiento a Laura Frególa y Ángel Sánchez por su ayuda en la ela-boración de este manuscrito. El trabajo de investigación en el estudio de los ge-nes regulados por estrés osmótico en el maíz está financiado por el Plan Nacio-nal de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico con el proyecto BIO 97 1211, por la CIRIT de la Generalitat de Catalunya en el proyecto Suport a Grups de Recerca Consolidats. 1999SGR 00191, y por la Comisión de las Comunida-des Europeas en el programa BIOTECH con el proyecto BI04- CT96-0062.
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