TESIS Que para obtener el grado de. Maestro en Ciencias

Programa de Estudios de Posgrado

TESIS

Que para obtener el grado de

Maestro en Ciencias

Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales

P r e s e n t a

(Orientación Acuicultura)

CONCENTRACIÓN DE LECTINA EN LA

HEMOLINFA DEL CAMARÓN BLANCO (Litopenaeus vannamei) EXPUESTO A DIFERENTES

INMUNOESTIMULANTES

Miriam Victoria Martín Manzo

Comité tutorial de tesis

 Director de tesis: Dr. Angel Isidro Campa Córdova

 Co-tutor: Dr. Felipe de Jesús Ascencio Valle

 Co-tutor: Dr. Edgar Zenteno Galindo

Comité revisor de tesis

 Dr. Angel Isidro Campa Córdova

 Dr. Felipe de Jesús Ascencio Valle

 Dr. Edgar Zenteno Galindo

Jurado de Examen de Grado

 Dr. Angel Isidro Campa Córdova

 Dr. Felipe de Jesús Ascencio Valle

 Dr. Edgar Zenteno Galindo

 Suplente: Dra. Norma Y. Hernández S.

RESUMEN

La lectina del suero del camarón blanco (L. vannamei) se purificó por cromatografía de afinidad, utilizando estroma de eritrocitos de rata fijados con glutaraldehido. En el análisis de la lectina en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes se identificaron cuatro fracciones de 83.14, 64.01, 46.16 y 33.29 kDa. La lectina aglutina eritrocitos de diferentes especies (conejo, rata, humano, cobayo y hámster) y tiene una mayor actividad aglutinante con los eritrocitos de ratón. La actividad aglutinante aumentó en presencia de Ca

, así como en presencia de eritrocitos tratados con tripsina o con sialidasa. La actividad hemaglutinante fue inhibida por glucosamina, fucosa, glucosa y galactosa. Se evaluó el efecto de dos mezclas de bacterias del género Bacillus (2x10

cel ml

), de la levadura Debaryomyces hansenii (1x10

cel ml

) y del inmunoestimulante comercial laminarina (0.5 mg L

) en la concentración de lectina en la hemolinfa del camarón blanco L. vannamei.

Los tratamientos se agregaron directamente al agua de los camarones cada 3 días. El bioensayo tuvo una duración de 14 d, se extrajo hemolinfa con anticoagulante de tres camarones por cada tratamiento a las 24, 48 y 72 h después de aplicados los tratamientos.

La concentración de lectina de los camarones se determinó por ELISA, utilizando anticuerpos monoclonales contra la lectina de Macrobrachium rosenbergii (crustácea decápoda). Nuestros resultados confirman que los anticuerpos reconocen epítopes comunes con camarón, pero no se identificaron diferencias significativas entre la concentración de lectina en el plasma de L. vannamei expuestos a diferentes tratamientos y los organismos control sin tratamiento.

Palabras clave: Litopenaeus vannamei, lectina, inmunoestimulantes

ABSTRACT

The lectin from the serum of the shrimp Litopenaeus vannamei was purified by affinity choromatography on glutarldehyde-fixed stroma from rat erythrocytes. Analysis of the lectin by polyacrylamide gel electrophoresis under reductive conditions showed four fractions of 83.14, 64.01, 46.16 and 33.29 kDa. The lectin agglutinates erythrocytes of different species (rabbit, rat, human, guinea pig and hamster) and has the higher agglutinating activity for mouse erythrocytes. The agglutinating activity increases in the presence of Ca

, as well as with erythrocytes treated with tripsin or sialidase. The hemagglutinating activity was inhibited by glucosamine, fucose, glucose and galactose. It was evaluated the effect of two mixes of Bacillus bacteria genus (2x10

cel ml

), the yeast Debaryomyces hansenii (1x10

cel ml

) and the commercial immunostimulant laminarin (0.5 mg L

) on the concentration of lectin in the shrimps´ hemolymph. The treatments were directly added to the shrimps´ water every 3 days. The experiment lasted 14 d; hemolymph was extracted with anticoagulant from three shrimps of each treatment at 24, 48, and 72 h after the treatments. The shrimps´ lectin concentration was determined by ELISA using monoclonal antibodies generated against Macrobrachium rosembergii lectin. Our results confirm that the antibodies recognize common epitopes with shrimp, but we didn’t indentify significant differences between the lectin concentration in the plasma of the treated white shrimps (L. vannamei) and the lectin concentration in the plasma of the control organisms without treatment.

Key Words: Litopenaeus vannamei, lectin, immunostimulants

DEDICATORIAS

A todas esas personas, que han llenado mi corazón de sonrisas, que han hecho de mi mundo un mundo mejor, que han reído y llorado conmigo, que han alentado mis sueños y que me han compartido de su tiempo, haciendo de mi una mejor persona.

A Dios por haberme otorgado el regalo de la vida

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. por permitirme realizar este trabajo y por la extensión de la beca.

A CONACYT por apoyarme económicamente con la beca número 243633 y darme la oportunidad de realizar este trabajo.

Al proyecto PAPIIT (IN226211-3) y al proyecto CONACYT (129932) por financiar en parte está investigación.

Al departamento de bioquímica de la Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México por permitirme realizar una estancia en su laboratorio y por todas las facilidades que me dieron para desarrollar el proyecto.

A todas las personas que trabajan en el laboratorio de patología del CIBNOR: por todas las facilidades brindadas para la realización de este trabajo.

A mis asesores Dr. Angel Campa, Dr. Edgar Zenteno, Dr. Felipe Ascencio: por sus atenciones, su orientación, apoyo e interés durante el desarrollo del trabajo y por compartir su conocimiento y experiencia.

Ali Pereyra Morales: por su valioso apoyo técnico brindado durante el desarrollo de este proyecto.

A la Dra. Concepción Agundis: por todas sus atenciones, apoyo y ayuda durante mi

estancia en la UNAM, por compartir su conocimiento y experiencia conmigo, por

brindarme su confianza y cariño y por apoyarme en los momentos difíciles,

motivándome a seguir adelante y no perder la esperanza.

A Arturo Sierra: por su ayuda y enseñanza inicial en las técnicas de laboratorio, por todas sus sugerencias y comentarios realizados durante la realización de este proyecto.

A Irasema E. Luis Villaseñor: por sus enseñanzas en técnicas de microbiología, por su valiosa ayuda y apoyo durante el desarrollo del bioensayo y por brindarme su amistad

A Alí, José Luis (el niño fiel), Oscar (Joserra): por enseñarme técnicas de laboratorio, por ayudarme y darme consejos durante la realización de este trabajo, por hacer ameno el trabajo de laboratorio con sus ocurrencias y por brindarme su amistad.

A Pablito: por su gran ayuda y apoyo durante el desarrollo del bioensayo.

A todo el personal de Posgrado: por su trato amable y por orientarme y aclarar todas mis dudas sobre los trámites administrativos.

A mis profesores del CIBNOR: por compartir su conocimiento en diferentes áreas, contestar mis dudas y motivarme a seguir aprendiendo.

A Horacio Sandoval por su trato amable y disponibilidad para ayudar en el laboratorio de cómputo.

Al personal de la biblioteca: por todo el apoyo brindado con el material bibliográfico y por su trato amable.

A mis padres: porque gracias a su apoyo, esfuerzo y cariño he podido soñar y

cumplir mis sueños, he aprendido que nada es imposible y que la felicidad existe.

Siempre estarán en mi corazón y les estaré eternamente agradecida por creer en mí y por ayudarme en todo momento.

A mi chulada de abuela: por tu amor, cariño y compresión; y por todos tus consejos que me han hecho reflexionar y tomar mejores decisiones.

A mi hermana Alejandra: por todas las aventuras que hemos compartido desde que éramos pequeñas, porque a pesar de la distancia te has mantenido cerca, escuchándome y apoyándome cuando más lo he necesitado y porque sé que siempre podré contar contigo.

A mi novio Abel: por devolverme ese brillo en mis ojos, llenar mis días de alegría, por apoyarme y ayudarme en todo lo que has podido desde que nos conocimos, por escucharme y resolver mis dudas existenciales y por brindarme tu amor sincero.

A la memoria de mi abuelo materno: porque fuiste un ejemplo de lucha y superación y por todo el amor que me diste.

A la memoria de mis abuelos paternos: por haberme querido tanto y por los momentos felices que compartimos.

A Edith Martínez: por su amistad, afecto y apoyo incondicionales a lo largo de estos años.

A Maria Amparo Bornacini: por los momentos que hemos compartido desde la niñez.

A mis compañeros de maestría por todos los momentos compartidos durante estos

años, haciéndome el camino más ameno y lleno de experiencias positivas.

CONTENIDO

RESUMEN... I  ABSTRACT ... II  DEDICATORIAS ... III  AGRADECIMIENTOS ... IV  CONTENIDO ... VII  LISTA DE FIGURAS ... IX  LISTA DE TABLAS ... X 

La camaronicultura en México ... 1 

Enfermedades que afectan la camaronicultura en México ... 2 

Respuesta inmune del camarón ... 2 

Lectinas ... 4 

Inmunoestimulantes ... 5 

ANTECEDENTES ... 7 

Inmunoestimulantes (β-1,3 glucanos y peptidoglucanos) utilizados en camarón ... 7 

Lectinas identificadas en camarones ... 9 

JUSTIFICACIÓN ... 11 

OBJETIVO... 11 

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 11 

HIPÓTESIS ... 11 

MATERIALES Y MÉTODOS ... 12 

Obtención de los organismos ... 12 

Obtención del suero de camarón ... 12 

Aislamiento y Purificación de la lectina ... 12 

Determinación de Proteínas ... 13 

Determinación del peso molecular de la lectina. ... 13 

Actividad hemaglutinante de la lectina ... 14 

Especificidad ... 15 

Preparación de los Inmunoestimulantes ... 15 

Cultivo de juveniles de L. vannamei tratados con inmunoestimulantes comerciales y D. hansenni.  ... 16 

Obtención de hemolinfa ... 16 

Determinación de la concentración de lectina ... 17 

Análisis Estadísticos ... 18 

RESULTADOS ... 19 

Aislamiento de lectina por cromatografía de afinidad ... 19 

Determinación de proteínas ... 20 

Determinación del peso molecular de la lectina. ... 20 

Actividad hemaglutinante ... 21 

Especificidad ... 22 

Determinación de la concentración de lectina ... 23 

DISCUSIÓN ... 26 

CONCLUSIONES ... 35 

LITERATURA CITADA ... 37   

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Perfil de elusión de la lectina de Litopenaeus vannamei del suero de los camarones por cromatografía de afinidad utilizando una columna con estroma de eritrocitos de rata. Densidad óptica a 280 nm (línea sólida) y actividad hemaglutinante (línea punteada) en la presencia de eritrocitos de conejo al 2%. ... 19 Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con urea de la lectina purificada. Carril (a):

Marcadores moleculares. Carril (b): lectina purificada de camarón L.vannamei. ... 20 Figura 3. Electroforesis SDS-PAGE. Carril (a): Marcadores moleculares. Carril (b): Suero de camarón L.vannamei. Carril (c) Fracción no retenida. Carril (d) Lectina de L.vannamei purificada. ... 21 Figura 4. Curva estándar de lectina de Machrobrachium rosembergii. ... 23 Figura 5. Western blot de lectina de camarón L.vannamei utilzando anticuerpos contra MrL. ... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 6. Muestreo realizado 24 h después de la quinta aplicación del tratamiento. Las

barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p< 0.05 indica diferencias

significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal. . 24

Figura 7. Muestreo realizado 48 h después de la tercera aplicación del tratamiento. Las

barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p<0.05 indica diferencias

significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal. . 25

Figura 8. Muestreo realizado 72 h después de la cuarta aplicación del tratamiento. Las

barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p<0.05 indica diferencias

significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal. . 25

LISTA DE TABLAS

Tabla I.Distribución de la producción en México ... 1

Tabla II. Actividad hemaglutinante de las fracciones retenidas. ... 19

Tabla III. Concentración de proteínas en las diferentes etapas de la purificación de lectina

de L. vannamei contenidas en 300 µL de suero. ... 20

Tabla IV. Actividad hemaglutinante del suero de camarón.. ... 22

Tabla V. Especificidad de lectina. ... 23

INTRODUCCIÓN La camaronicultura en México

La industria del camarón que incluye la captura, acuicultura, procesos y servicios, es la principal pesquería en México desde el punto de vista económico y la que concentra el mayor desarrollo acuícola del país. En el país se producen al año 196 mil toneladas de camarón entero, el 66 % de éstas (130 mil toneladas) provienen de la acuacultura, y el 34%

(66 mil toneladas), corresponden a la captura en altamar y bahías. Esta actividad en conjunto sostiene 225 mil empleos, genera 359 millones de dólares en divisas (SAGARPA, 2010). Los pronósticos de crecimiento en la producción nacional de camarón para el periodo 2008-2015 muestran una tasa media de crecimiento anual de 2.91%, pasando de 197,535 a 241,457 toneladas (Reyes-Moreno et al., 2009).

El consumo nacional muestra una tendencia creciente; en el 2008 se consumieron 156,587 toneladas de camarón en el mercado interno y el consumo per cápita anual presenta una tasa media de crecimiento anual del 13% al pasar de un consumo per cápita de 0.74 kg en 2002 a 1.47 kg en 2008. Las exportaciones de camarón se han incrementado con una tasa media de crecimiento anual del 9.76% al pasar de 30,805 toneladas en 2002 a 53,866 toneladas de camarón peso vivo en 2008 (Reyes-Moreno et al., 2009). Como se indica en la tabla I Baja California Sur tiene el mejor rendimiento de la república mexicana en la producción de camarón.

Tabla I. Distribución de la producción en México

Fuente: Estimaciones FIRA con datos de la Revista Industrial Acuícola 2008 y Comités Estatales de Sanidad   Acuícola 2008 y 2009 

Enfermedades que afectan la camaronicultura en México

Los camarones son afectados por diversas enfermedades, causadas por bacterias, hongos, parásitos y virus. Las enfermedades virales representan uno de los factores limitantes más importantes de la camaronicultura ya que no se cuenta con tratamientos adecuados para su control. Existen 30 virus conocidos, de los cuales a cuatro se les reconoce actualmente por tener un marcado impacto negativo en los laboratorios y granjas de camarón siendo estos:

virus de la necrosis infecciosa hipodermal y hematopoyética (IHHNV), virus del síndrome de taura (TVS), Síndrome del Virus de la mancha blanca (WSSV), virus de la cabeza amarilla (YHV) (CONAPESCA, 2001).

Actualmente, el virus de la mancha blanca (WSSV), se presenta en los estados de Sonora, Nayarit y Sinaloa, el cual ha causado grandes pérdidas en la producción de camarón. En el caso de IHHNV, se registra un caso en Nayarit (SAGARPA, 2012). El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) representa un peligro para la camaronicultura, la mortalidad acumulada por esta infección puede alcanzar 90-100% de 3 a 10 días después de la aparición de los signos clínicos (Morales-Covarrubias et al., 2010). El WSSV se detectó por primera vez en Taiwán, en 1992, y se dispersó rápidamente por el continente asiático;

en 1995 fue registrado en Texas y hasta el año 2000 se confirmó su presencia en México, donde causó mortalidades cercanas a 100% en cultivos de camarón blanco L. vannamei. En Sinaloa se obtuvieron cosechas tempranas y por ende tallas pequeñas de Penaeus vannamei y Penaeus stylorostris en el 2002 y en Sonora, el virus provocó pérdidas importantes cercanas a 15,000 toneladas en el 2005 (Sánchez et al., 2008), disminuyó la producción de camarón un 40% en el 2010 y un 52% en el 2011 (CONAPESCA, 2012).

Respuesta inmune del camarón

Los camarones carecen de una respuesta inmune específica o adaptativa, por lo que

dependen de la respuesta innata para combatir a los agentes extraños. Esta respuesta incluye

la protección por barreras físicas y por los sistemas celular y humoral (Vázquez-Moreno et

al., 1998).

Los virus y los componentes virales como el ADN y ARN generados en las

células infectadas pueden ser reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones

(PRR) del camarón como las lectinas. Después del reconocimiento de los virus, los PRR promueven una respuesta antiviral adecuada que incluye la respuesta celular y la respuesta humoral (Liu et al., 2009) (Vázquez-Moreno et al., 1998) (Yang et al., 2008). Dentro de la respuesta celular los hemocitos hialinos pueden fagocitar el virus y formar esferoides (gigantescas masas de células fagocitarias) en tejido conectivo y en el Órgano Linfoide (Anggraeni et al., 2000) y dentro de la respuesta humoral se activan los siguientes factores:

 Factor anti-lipopolisacárido (ALF): Esta proteína se ha identificado principalmente en el órgano linfoide y corazón, pero también en branquias, hemocitos y hepatopáncreas de los camarones. Se desconoce su mecanismo de acción en camarones, pero en los cangrejos, actúa inhibiendo la adhesión de virus a las células, lo cual sugiere que ALF actúa durante la fase inicial de la entrada del virus (Liu et al., 2009).

 Factor transductor de señal y activador de la transcripción (STAT): proteína que induce la expresión de varios genes para la producción de citocinas. Sin embargo el gen ie1 del virus emplea el sistema STAT del camarón como un factor de transcripción, aumentando su expresión y resultando en la activación de su promotor en las células del huésped (Liu et al., 2009).

 Lisozima: enzima que se encuentra expresada principalmente en el hepatopáncreas;

tiene actividades hidrolíticas contra proteoglicanos (Pei-Feng et al., 2009)

 Producción del anión superóxido: este radical libre es producido intracelularmente

en los hemocitos y como resultado del sistema profenoloxidasa en la hemolinfa (la

quinona generada en el proceso puede entrar en un ciclo redox enzimática y no

enzimática produciendo los correspondientes radicales semiquinona y generando el

anión superóxido) (Philipp et al., 2011). El anión superóxido puede matar

directamente al organismo invasor, no distingue entre células propias y no propias,

lo que implica que son capaces de causar daño en caso de actuar en espacios

extracelulares. Este radical es regulado por mecanismos que incluyen moléculas

antioxidantes como el ácido ascórbico y enzimas antioxidantes como la superóxido

dismutasa y peroxidasas (Pei-Feng et al., 2009)

 Hemocianina: Se purificó hemocianina del camarón P. monodon mediante cromatografía de afinidad utilizando como ligando al WSSV previamente purificado. Se ha visto que tiene actividad antiviral contra 6 virus de peces, afectando la replicación de los virus, pero no es capaz de destruirlos, por lo que su mecanismo antiviral se desconoce (Zhang et al., 2004).

 Lectina tipo C (LvCTL1): las lectinas son proteínas o glicoproteinas que aglutinan diversos grupos celulares, bacterias y virus, están involucradas aparentemente en el reconocimiento y fagocitosis de agentes patógenos y células como opsoninas (Freire Marques y Barraco, 2000).

Lectinas

Las lectinas (del latin legere: buscar o escoger) son proteínas o glicoproteínas que actúan como unidades de reconocimiento; reconocen de manera específica a los carbohidratos de superficie de membrana y desencadenan diferentes mecanismos de defensa como son:

activación del estallido respiratorio, inducción del sistema profenoloxidasa, aglutinación, fagocitosis mediada por opsonización y encapsulación de virus, bacterias y hongos, además algunas lectinas pueden presentar actividad antimicrobiana (Vázquez-Moreno et al., 1998;

Xian-Wei et al., 2012). Las lectinas se expresan principalmente en los hemocitos y hepatopáncreas (Zarian, 2007).Las lectinas han sido identificada en el suero de prácticamente todos los crustáceos decápodos y en la membrana de los hemocitos, así como en gránulos citoplasmáticos, sugiriendo que las lectinas son sintetizadas por los hemocitos y posteriormente liberadas al hemocele (Vazquez-Moreno et al., 1998).

Las lectinas han sido clasificadas de acuerdo a algunas propiedades químicas como

lectinas tipo C, que requieren de calcio para su funcionamiento y las Lectinas tipo S, las

cuales requieren de tioles libres para su estabilidad (Freire Marques y Barraco, 2000).

Inmunoestimulantes

Los inmunoestimulantes, se encuentran disponibles como tratamientos alternativos, actuando como moléculas de alarma que activan el sistema inmune. La mayoría son compuestos químicos los cuales se encuentran como elementos estructurales de bacterias, micelios de hongos y levadura (Zarian, 2007). Los inmunoestimulantes ofrecen los siguientes beneficios, reducir la mortalidad debido a patógenos oportunistas, prevenir enfermedades por virus y mejorar la resistencia a parásitos (Alpuche et al., 2005) y se pueden clasifican de la siguiente manera: elementos estructurales de bacterias (lipopolisacáridos, lipopétptidos, glicoproteínas capsulares, muramilpéptidos, peptitodglucanos), productos de bacterias ß-1,3 glucano (Curdlan) y micelios de hongos (Krestin, Lentinan, Schizophyllan, Scleroglucan, SSG, VitaStim), B-1,3/1,6 glucanos de la pared celular de levaduras, estructuras complejas de carbohidratos (glicanos) de varias fuentes biológicas incluyendo algas como el fucoidan, péptidos presentes en extractos de ciertos animales o a partir de la hidrólisis enzimática de proteínas de peces, nucleótidos, productos sintéticos (bestatin, FK-156, FK- 565, Levamisole) (Zarian, 2007).

Los inmunoestimulantes más utilizados para evaluar los efectos que provocan sobre el sistema inmune de camarones forman parte del grupo de los lipopolisacáridos (LPS), ß 1,3/1,6 glucanos y peptidoglucanos. Estos inmunoestimulantes se unen a los diferentes PRR como son la proteína ligadora de B glucanos (BGBP), proteína ligadora de lipopolisacáridos y glucanos (LGBP) y las homologas proteína/serina proteinasaa (SPH), provocando la degranulación de los hemocitos granulares y semigranulares liberando así diversas proteínas relacionadas con el sistema inmune (Vargas-Albores et al., 1998) como son la proPO, la enzima activadora de ProPO, peroxinectina, péptidos antimicrobianos (peneidinas, péptidos derivados de la hemocianina, histonas), moléculas citotóxicas (lisozimas, esterasas, fosfatasas, fosfolipasas, peroxidasas y proteasas), aglutininas, inhibidores de proteasas entre otras (Aguirre-Guzmán et al., 2009).

Los Lipopolisacaridos (LPS) son estimulantes de la respuesta celular in vitro, además

estimulan a los hemocitos hialinos causando la liberación de la enzima transglutaminasa,

provocando la coagulación del plasma (Vargas-Albores et al., 1998). Sin embargo estos

productos in vivo pueden causar inflamaciones severas y pueden ser tóxicos en

concentraciones ligeramente por arriba de la dosis óptima. Los ß1,3/1,6 glucanos se

encuentran en micelios de hongos y levaduras y la alimentación de camarones con estas

mismas sustancias resulta en un crecimiento más rápido, en mortalidad reducida y mejor

utilización de alimento (Alpuche et al., 2005)

ANTECEDENTES

Inmunoestimulantes (β-1,3 glucanos y peptidoglucanos) utilizados en camarón

Los glucanos han sido ampliamente utilizados como inmunoestimulantes para aumentar la resistencia de crustáceos contra las enfermedades virales. Sukumaran et al. (2010), reportaron que los glucanos (0.2% en el alimento) de las levaduras marinas Debaryomyces hansenii S8, D. hansenii S169 aumentaron la sobrevivencia de las post-larvas P. monodon infectados con WSSV teniendo una supervivencia al día 7 de un 44.42 % y 41.11%

respectivamente (Sukumaran et al., 2010). Sarlin y Philip (2011), obtuvieron una supervivencia al día 7 del 50% de los camarones Fenneropenaeus indicus retados con WSSV al incluir 15% de biomasa de D. hansenii S8 en el alimento. En juveniles del camarón P. monodon alimentados con 10 g kg

ß-1,3 glucanos de Schizophyllum commune en la dieta y retados con WSSV, se consiguió una supervivencia del 65% (Chang et al., 2003).

También se han realizado varios estudios sobre el efecto de los β-1,3 glucanos en algunos factores de la respuesta inmune innata de los camarones. Hong-Xia et al. (2011), le administraron ß-1,3 glucanos derivados de Laminarina digitata a los camarones L.

vannamei y observaron que la administración oral de esos glucanos a una concentración de 1000 mg kg

de alimento por 84 días estimuló el sistema inmune (incrementó la actividad catalasa y actividad lisozima). Campa-Córdova et al. (2005), utilizaron como inmunoestimulantes β-1,6 glucano extraído de Saccharomyces cerevisiae, mezclaron las suspensiones de β-1,6 glucano en agua de mar en 50 L de agua para obtener una concentración final de 0.5 mg ml

y encontraron que 48 h después de la exposición de juveniles de camarón blanco a ese inmunoestimulante por 6 h hubo un incremento significativo en la actividad de la enzima superóxido dismutasa (Campa-Córdova et al., 2005).

Los peptidoglucanos están presentes en la pared celular de las bacterias Gram+ y han

tenido éxito al ser utilizados como imunoestimulantes en los camarones. Peraza-Gómez et

al. (2009), observaron que el uso de una mezcla de bacterias ácido lácticas (1 x10

CFU g

)

aumentó la supervivencia y disminuyó la prevalencia del virus de la mancha blanca en el camarón L. vannamei. Purivirojkul et al. (2006), se dieron cuenta que el peptidoglucano incorporado a la dieta en una dosis de 0.18 g kg

de alimento estimuló la inmunidad de P.

mondon al elevar la actividad fenoloxidasa, el anión superoxido y la actividad bactericida.

En Marsopenaeus japonicus se reportó que al administrar 0.2 mg kg

de peso vivo

obtenido de Bifidobacterium thermophilum por 30 días aumentó la resistencia del camarón

al ser retado con WSSV durante ese periodo, obteniéndose una supervivencia de 97.6% y

20 días después de suspender la dieta con B. thermophilum los camarones empezaron a

morir (Itami et al., 2002). Además en varias investigaciones se ha demostrado que las

bacterias del género Bacillus pueden estimular la respuesta del sistema inmune y/o la

resistencia al virus de la mancha blanca. Li et al. (2009), vieron que al incorporar a la dieta

Bacillus megeterium a una dosis de 10

CFU g

de alimento combinado con 0.2% de

isomalto-oligosacáridos (IMO) por 14 días, aumentó significativamente la supervivencia de

L. vannamei al ser retado contra el WSSV. Además también observaron que algunos

parámetros inmunológicos como fagocitosis, anión superóxido y actividad de la

fenoloxidasa fueron significativamente más altos que los del control. Bacillus

licheniformis y Bacillus subtilis también han mostrado ser buenos estimulantes al

combinarse, ya que al utilizarlos por dos semanas en la dieta a una concentración de 10

CFU g

junto con 0.2% de IMO se obtuvieron los niveles significativamente más altos de

hemocitos, actividad fenoloxidasa, lisozima, actividad de oxido nítrico sintetasa y de la

superóxido dismutasa que los obtenidos con el control (Zhang et al., 2011). Rengpiptat et

al. (2000), demostraron que al administrar Bacillus S11 en una concentración de 10

CFU

g

a postlarva de 60 días de edad de P. monodon, aumentó la actividad fagocítica al día 60

de tratamiento y al día 30 incrementó significativamente la actividad de la fenoloxidasa,

también observaron que en poslarvas de 10 días de edad, al aplicar el mismo tratamiento

hubo un incremento significativo de número de hemocitos y de actividad de fenoloxidasa

después de 90 días. Sin embargo pocos son los estudios sobre el efecto de los β-1,3

glucanos y de los peptidoglucanos en las lectinas, como el realizado por Sritunyalucksana

et al. (1999), donde utilizaron la fracción lisada de hemocitos de camarón P. monodon que

incluye plasma y sustancias liberadas de los hemocitos, para determinar el efecto del

lipopolisacárido de E.coli, del peptidoglucano y de los β-1,3 glucanos extraídos de laminaria en la enzima fenoloxidasa, la aglutinación y el efecto antibacterial. Encontraron que 0.002% de LPS de E. coli y 0.4% de peptidoglucano estimuló la actividad de la fenoloxilasa y que utilizando de 0.4 a 0.8% de laminaria no tuvo ningún efecto sobre la enzima. Sin embargo el peptidoglucano, lipopolisacarido de E. coli y la laminaria fallaron en incrementar la aglutinación de E. coli y de eritrocitos humanos y tampoco tuvieron efecto antimicrobiano contra V. parahaemolyticus. Sin embargo, Pais et al. (2008), realizaron un estudio que demuestra que la actividad hemaglutinante (contra los eritrocitos de ratón) de la hemolinfa del P. monodon aumentó después del tratamiento con glucanos (obtenidos de Saccharomyces cerevisiae) y una bacterina de vibrio (obtenida de Vibrio harveyi). Lo cual sugiere que las lectinas de la hemolinfa capaces de hemaglutinar eritrocitos de ratón fueron estimuladas por los inmunoestimulantes utilizados.

Lectinas identificadas en camarones

Se han identificado y caracterizado lectinas en varias especies de camarones, algunas de ellas reconocen bacterias y otras reconocen virus, causando su aglutinación, encapsulación y/o fagocitosis. Se ha demostrado que algunas lectinas por su especificidad reconocen y aglutinan diversas especies bacterianas:

 FC-L: se encuentra en la hemolinfa del camarón Fenneropenaeus chinensis y aglutina algunas bacterias Gram negativas (Sun et al., 2003).

 Fc-hsL y FcLec4: se identificaron en el camarón F. chinensis y tiene alta actividad antimicrobiana (Sun et al., 2008) (Xian-Wei et al., 2009).

 LvLec: se encontró en el camarón Litopenaeus vannamei y provoca la aglutinación de Escherichia coli (Sun et al., 2007).

 PmLT: registrado en Penaeus monodon, funciona como PRR incrementando la encapsulación de bacterias por hemocitos (Luo et al., 2006).

Se han identificado que algunas lectinas actúan contra el virus de la mancha blanca al

interactuar con sus glicoproteínas:

 Fclectin: identificada en F. chinensis, aumenta su expresión en los hemocitos 3 h después de ser infectados por el WSSV (Liu et al., 2007).

 LvLT: encontrada en L. vannamei, disminuyó su expresión en el hepatopáncreas 2 horas después de ser infectados por el WSSV, aumentando 4 h después de la infección (Ma et al., 2007).

 FcLec3: encontrada en F. chinensis, interactúa con la glicoproteína VP28 del virus (Xian-Wei et al., 2009).

 LvCTL1: identificada en L. vannamei, se une a glicoproteínas de la envoltura viral (VP95, VP28, VP26, VP24, VP19, VP14) (Zhi-Ying et al., 2009).

 MjLecC, MjLecA, y MjLecB: identificadas en Marsupenaeus japonicus, se unen a

las glicoproteínas VP28, VP26; VP28 y VP28 respectivamente (Kang et al., 2010).

JUSTIFICACIÓN

Los camarones son afectados por diversas enfermedades, dentro de las cuales las enfermedades virales representan uno de los factores limitantes más importantes de la camaronicultura, ya que actualmente han causado un gran impacto negativo sobre la producción de camarón del país y no se cuenta con tratamientos adecuados para su control. Se ha visto que las lectinas reconocen bacterias y virus y que algunos inmunoestimulantes (peptidoglucanos y β-1,3 glucanos) aumentan la supervivencia contra el virus de la mancha blanca y también aumentan otros factores inmunológicos (actividad superóxido dismutasa, fagocitosis, actividad fenoloxidasa, anión superoxido, lizosima, actividad oxido nítrico sintetasa). Por lo que se pretende evaluar el efecto de diferentes inmunoestimulantes aplicados a los camarones en la concentración de lectina en la hemolinfa de L.vannamei, lo cual aportará nuevos conocimientos y alternativas para el control de enfermedades infecciosas.

OBJETIVO

Determinar la concentración de lectina en la hemolinfa del camarón blanco (L.vannamei) expuesto a diferentes inmunoestimulantes.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislar lectina de la hemolinfa del camarón blanco (L.vannamei).

2. Determinar la concentración de lectina en la hemolinfa del camarón blanco expuesto a diferentes inmunoestimulantes.

HIPÓTESIS

Si el camarón blanco (Litopenaeus vannamei) es expuesto a diferentes inmunoestimulantes,

la concentración de lectina aumentará en la hemolinfa.

MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de los organismos

Se utilizaron organismos adultos de camarón blanco Litopenaeus vannamei obtenidos de los estanques de mareas Laboratorio del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR, La Paz, Baja California Sur, México). Los camarones fueron aclimatados durante 15 días antes de iniciar los experimentos en tanques de fibra de vidrio de 1,500 litros con agua de mar filtrada (5 μm) a una temperatura de 28 °C y aireación constante.

Los camarones fueron alimentados diariamente ad libitum en la mañana y en la tarde con alimento comercial marca PIASA (35% de proteína).

Obtención del suero de camarón

A cada camarón se le extrajo aproximadamente 1 ml de hemolinfa sin anticoagulante de la base del pleópodo del primer segmento abdominal cerca del poro genital. La hemolinfa fue centrifugada a 16,000 g por 30 min para obtener el suero, el cual se mantuvo en congelación a -4 °C hasta su utilización (Alpuche et al., 2005).

Aislamiento y Purificación de la lectina

La lectina fue purificada por cromatografía de afinidad, utilizando una matriz de eritrocitos

de rata, contenidos en una columna de Sephadex G-25 (15 x 2cm) preparada de acuerdo al

método descrito por Ochoa JL y Kristlansen T (1978), para ello se lisó la sangre de rata

obteniendo los residuos de la membrana de los eritrocitos, éstos se fijaron con

glutaraldehido al 3% toda la noche a 4°C, se bloquearon con glicina 1 M toda la noche a

4°C y se empacaron en una columna conteniendo Sephadex G-25 (Ochoa y Kristlansen,

1978). La columna fue equilibrada con solución salina al 0.9%, se aplicaron 300 µL de

suero de L. vannamei (previamente incubados 20 min a 37°C con 300 µL de CaCl

40 mM)

a la columna a un flujo de 2 ml min

y el material no retenido fue eluído con solución

salina al 0.9% hasta que la densidad óptica a 280 nm de las fracciones colectadas (2 ml)

fuera menor a 0.001. La lectina fue eluída posteriormente de la columna utilizando ácido acético al 3%.

Se determinó actividad hemaglutinante utilizando eritrocitos de conejo y rata al 2% en solución salina-calcio (NaCl 0.85% y Ca 5mM) y absorbancia a 280 nm a cada una de las fracciones colectadas. Las fracciones eluídas con ácido acético que presentaron absorbancia a 280 nm fueron concentradas y dializadas contra solución salina al 0.9%, para poder realizar la aglutinación de eritrocitos de conejo y rata al 2% en solución salina-calcio y TBS-Ca. (TrisHCl 50 mM, NaCl 115 mM, CaCl

10 mM, NaN

0.02%).

Determinación de Proteínas

La determinación de proteínas se realizó por el método de Bradford (1976). Se colocaron 10 µl de muestra en una microplaca y se agregaron 200 µl de la solución de Bradford. La absorbancia se leyó a 570 nm. Utilizando la curva estándar de albúmina sérica bovina se determinó la concentración de proteínas (mg ml

) del suero de camarón, de las fracciones no retenidas y las retenidas que fueron concentradas y dializadas.

Determinación del peso molecular de la lectina

Para identificar el grado de homogeneidad y determinar el peso molecular de la lectina se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con urea de acuerdo al método descrito por Bollag et al. (1996). La lectina purificada (100 µL o 25 µL, según la turbidez de la muestra) fue precipitada con Ácido tricloroacético (TCA) al 20% y acetona, y suspendida en 20 µL de amortiguador de muestra (Tris-HCl 125 mM, Urea 6 M, SDS 4%, Glicerol 20%, azul de bromofenol 0.02%, DTT 0.2 M).

También se realizó una electroforesis del suero, fracción no retenida y fracción retenida de

acuerdo con el método descrito por Laemmli (1970) utilizando geles de poliacrilamida al

10% y dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Se usaron 2 µl de agregado de lectina

(fracción retenida); 20 µg de suero y 20 µg de la fracción no retenida que fueron

precipitados con TCA al 20% y acetona y suspendida en 15 µL de amortiguador (SIGMA).

Posteriormente fueron sometidas a ebullición por 10 min.

Se utilizaron estándares de peso molecular conocido con un rango de 6.5 a 205 kDa (Amersham Biosciences, UK). La migración electroforética se realizó aplicando un voltaje constante de 80V, en amortiguador de corrida (TRIS 0.025 M, glicina 0.190 M, SDS 0.2%). El gel se tiñó con plata utilizando el kit “Bio-Rad Silver Stain” (Bio-Rad, 2011).

La migración relativa (Rf) de los estándares y la muestra se calcularon con la fórmula: Rf=

distancia de migración de la proteína/distancia de migración del colorante, se construyó una curva estándar para calcular el peso molecular de la lectina purificada.

Actividad hemaglutinante de la lectina

Se obtuvieron eritrocitos de ratón, rata, conejo, hámster y cobayo del Bioterio de la

Facultad de Medicina de la UNAM y eritrocitos humanos tipo A, B y O del banco de

sangre del IMSS, México. Se evaluó la actividad hemaglutinante de lectinas de camarón de

acuerdo al método descrito por Alpuche et al. (2005) para Litopenaeus setiferus. La sangre

de las diferentes especies se colectó con heparina y los eritrocitos fueron lavados 3 veces

con PBS y centrifugados (800 g por 10 min). Para determinar la actividad hemaglutinante

se realizaron diluciones dobles seriadas en PBS y en solución salina-calcio (NaCl .85% y

CaCl

5mM) del suero de camarón en platos U de microtitulación, a las cuales se les

colocaron 25 µl de eritrocitos al 2% en PBS. La actividad hemaglutinante se reportó como

el inverso de la última dilución que mostró actividad aglutinante visible. Los ensayos de

hemaglutinación también se realizaron en presencia de eritrocitos tratados previamente con

sialidasa (0.1 U de sialidasa tipo V de Clostridium perfringens (SIGMA Chem. Co., St

Louis Mo., USA) por 0.5 ml de paquete de eritrocitos incubados a 37°C por 30 min,

usando como control positivo la lectina Arachis Hypogaea (SIGMA)) y con tripsina (0.5

mg de tripsina SIGMA por 0.5 ml de paquete de eritrocitos incubados 1 h a temperatura

ambiente, usando como control positivo lectina de amaranto).

Especificidad

La especificidad de la lectina por los azúcares se determinó comparando la actividad inhibitoria de varios carbohidratos (D-Galactosa, D-Galactosamina, N-Acetil-D- Galactosamina, D-Glucosa, D-Glucosamina, N-Acetil-D-glucosamina, D-Manosa, D- manosamina, L-fucosa). Se realizaron diluciones dobles seriadas en solución salina-Calcio del suero de camarón en platos U de microtitulación, se incubaron 30 min a 37°C con 25 µL de azúcares a 400 mM. Inmediatamente después, se añadieron 25 µL de eritrocitos de conejo al 2% en PBS. La capacidad inhibitoria se expresó en porcentaje de inhibición, que corresponde al porcentaje que disminuyó la actividad hemaglutinante inicial que fue de 512 UHA.

Preparación de los Inmunoestimulantes

La cepa probiótica de levadura, Debaryomyces hansenii (cepa, DHHBCS005), obtenida de

la Colección de Levaduras Marinas del CIBNOR, fue cultivada en 500 ml del medio YPD-

caldo (DIFCO), a 30 °C, por 48 h. La levadura fue suspendida en agua de mar estéril con

0.9% de NaCl y se determinó la concentración utilizando una densidad óptica de 540 nm en

colorímetro (Linson 3) hasta llegar a una absorbancia de 1 para obtener una concentración

de 1×10

UFC ml

. A partir de la concentración obtenida, se realizaron las diluciones

requeridas en los bioensayos para utilizar una concentración final de 1 x10

UFC ml

.

Bacterias del género Bacillus (B. teauilensis, B. liqueliformis, B. endophyticus), aisladas del

intestino de L. vannamei (Irasema E. Luis Villaseñor, CIBNOR) fueron cultivadas en 500

mL de caldo marino, a 30°C por 24 h. Las bacterias fueron suspendidas en agua de mar

estéril con 0.9% de NaCl y se determinó la concentración utilizando el colorímetro

(Linson3) hasta llegar a una absorbancia de 0.7 para obtener una concentración de 1×10

cel ml

. A partir de la concentración obtenida, se realizaron diluciones requeridas en los

bioensayos para utilizar hasta concentración final de 1 x10

cel ml

de cada una de las

cepas bacterias. Se hicieron dos mezclas de bacterias: Mezcla 1 YC5-2: Bacillus tequilensis

(1x10

cel ml

) y YC3-C Bacillus liqueliformis (1X10

cel ml

); Mezcla 2 YC3-B: Bacillus endophyticus (1x10

cel ml

) y C2-2: Bacillus endophyticus (1x10

cel ml

).

Se utilizó la laminarina como inmunoestimulante comercial, β-1,3 glucano, extraída de Laminaria digitata, (SIGMA # Cat. L-9634). Las suspensiones de β-1,3 glucano se mezclaron en 10 L de agua de mar para obtener una concentración final de 0.5 mg L

. Cultivo de juveniles de L. vannamei tratados con inmunoestimulantes comerciales y D.

hansenni

Para evaluar la respuesta inmune en juveniles expuestos a inmunoestimulantes, se colocaron grupos de 15 camarones con peso promedio de 5 ± 0.1 g en tanques de fibra de vidrio con capacidad de 30 L con agua de mar filtrada a 1µm con aireación constante manejando una temperatura de 28°C ± 0.5. Al primer grupo de camarones se le agregó laminarina a una concentración de 0.5 mg L

, al segundo grupo se trató con la mezcla 1 de bacterias a una concentración de 2x10

cel ml

, el tercer grupo fue tratado con la mezcla 2 a una concentración de 2x10

cel ml

, el cuarto grupo se utilizó D. hansenni a una concentración de 1×10

UFC ml

y un quinto grupo se usó como control agregando agua de mar estéril. Todos los tratamientos se agregaron directamente al agua de cultivo cada 3 días. Los camarones fueron alimentados con alimento comercial ad libitum una vez al día.

El bioensayo tuvo una duración de 14 días, los tratamientos se realizaron por triplicado y se tomaron 3 camarones al azar de cada tratamiento a las 24, 48 y 72 h después de la quinta, tercera y cuarta aplicación de los tratamientos respectivamente para cuantificación de lectina.

Obtención de hemolinfa

A cada camarón se le tomó una muestra de aproximadamente 0.2 ml de hemolinfa de la

base del pleópodo del primer segmento abdominal cerca del poro genital. Para evitar la

coagulación de la muestra se utilizó una solución anticoagulante (SIC-EDTA), la cual fue

diseñada con base a los valores iónicos y osmóticos de la hemolinfa del camarón (450 mM

NaCl, 10 mM KCl, 10mM EDTA-Na

, 10mM HEPES, pH 7.3, 850 mOsm kg-1) de acuerdo a la técnica descrita por Vargas-Albores et al. (1996). Se centrifugó a 800 g por 10 min a 4°C para obtener el plasma, el cual se mantiene en congelación a -20 °C hasta su posterior utilización.

Determinación de la concentración de lectina

Se obtuvieron anticuerpos policlonales de la inmunización de un conejo Nueva Zelanda, hembra de 2 años con los agregados de lectina purificados. La inmunización se realizó cada 8 días por un mes, las dos primeras inmunizaciones de 0.5 ml se llevaron a cabo con adyuvante completo de Freund (0.25 ml) mezclado con 2 mg de agregado en 0.25 ml solución salina al 0.9% y las siguientes inmunizaciones se realizaron con adyuvante incompleto de Freund (0.25 ml) mezclado con 2 mg de agregado de lectina en 0.25 ml de solución salina al 0.9%. Después de una semana de la última inmunización se obtuvieron 50 ml de sangre del conejo, que fueron centrifugadas a 13,000 rpm por 10 min recuperando 25 ml de suero. Los anticuerpos fueron precipitados utilizando sulfato de amonio saturado, y fueron marcados con peroxidasa de rábano según el método de Avrameas y Ternynck (1971).

Los anticuerpos se titularon por tablero de ajedrez utilizando diluciones de 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800 de éste contra diluciones de 1/10, 1/20, 1/40 y 1/80 del suero de camarón, observándose una absorbancia de 0.300 cuando el anticuerpo estaba a 1/50 y el suero de camarón a 1/10, por lo que se decidió determinar la concentración de lectina utilizando anticuerpos monoclonales contra la lectina de Macrobrachium rosenbergii (MrL), los cuales mostraron una absorbancia de 0.686 a una dilución de 1/100 contra el suero de camarón disuelto 1/10.

Para confirmar que los anticuerpos monoclonales de MrL cruzaran con la lectina de L.

vannamei se realizó un Western blot utilizando agregados de la lectina purificada. La

estandarización de la curva se realizó utilizando lectina MrL. La lectina (1-10 µg en 50 µl

de buffer de carbonato a 0.1 M, pH 9.5) se fijó en el fondo de cada pozo incubándolo con

50 µl de buffer carbonato (0.1 M, pH 9.5) por una hora a 37°C y a 4°C por una noche. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS compuesto por 0.01% Tween 20 (PBS-T); los sitios de unión inespecíficos fueron bloqueados con 300 µl de PBS que contiene leche descremada incubándolos 90 minutos a 37°C y se lavaron con PBS-T varias veces.

Después se agregaron 50 µl de anticuerpos marcados con peroxidasa en una dilución de 1:400 y se incubaran por 90 minutos a 37°C, las placas se lavaron exhaustivamente con PBS-T y la reacción fue revelada al añadir 50 µl de O-fenilendiamina y H

O

en 100 mM de bufer de citrato (pH 5.6). La reacción se detuvo al agregar 50 µl de 3N HCl y las muestras se leyeron a 492 nm en un lector de ELISA. El plasma de L. vannamei fue diluida 1/10 en 0.1 M de buffer carbonato, pH 9.5 y se fijó al fondo de los pozos incubando con 100 µl de buffer carbonato pH 9.5 a 37°C una hora y a 4°C toda la noche, luego las placas se lavaron cuatro veces con PBS-T; los sitios de unión inespecíficos fueron bloqueados con 300 µl de PBS con leche descremada incubándolos 60 min a 37°C y se lavaron con PBS-T 4 veces. Después se agregaron 100 µl de anticuerpos marcados con peroxidasa en una dilución de 1:100 y se incubaron por 90 min a 37°C, las placas se lavaron exhaustivamente con PBS-T y la reacción fue revelada al añadir 100µl de O-fenilendiamina y H

O

en 100 mM de amortiguador de citratos (pH 5.6). La reacción se detuvo al agregar 100 µl de 3N HCl y las muestras se leyeron a 492 nm en un lector de ELISA.

Análisis Estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa STATISTICS V9, se hizo la

prueba de Kolmogórov-Smirnov para verificar la normalidad de la distribución de los datos

y se efectúo la prueba ANOVA para determinar si hubo diferencias significativas entre la

concentración de lectina en la hemolinfa de los camarones expuestos a diferentes

inmunoestimulantes y el control.

RESULTADOS Aislamiento de lectina por cromatografía de afinidad

Se purificó una lectina de la hemolinfa del camarón blanco (L. vannamei) mediante cromatografía de afinidad, en una columna de estroma de eritrocitos de rata (Figura 1). La fracción no retenida no mostró aglutinación de eritrocitos de conejo ni de rata al 2% en solución salina-calcio. Las fracciones retenidas eluídas con ácido acético concentradas y dializadas presentaron aglutinación (Tabla II). Aproximadamente el 90% de la proteína corresponde a la fracción no retenida.

Figura 1. Perfil de elusión de la lectina de Litopenaeus vannamei del suero de los camarones por cromatografía de afinidad utilizando una columna con estroma de eritrocitos de rata. Densidad óptica a 280 nm (línea sólida) y actividad hemaglutinante (línea punteada) en la presencia de eritrocitos de conejo al 2%.

Tabla II.

Actividad hemaglutinante de las fracciones retenidas. *UHA: Unidades hemaglutinantes por 1 ml de muestra.

Muestra UHA* eritrocitos conejo 2% en TBS

UHA* eritrocitos rata 2% en TBS

1 (300 µl) 640 320

Determinación de proteínas

Se determinaron proteínas por el método de Bradford del suero del camarón y de las fracciones no retenidas y retenidas obtenidas de la aplicación de 300 µL de suero.

Obteniéndose la concentración de proteínas en mg de todas las anteriores excepto de la fracción retenida, ya que la mayoría de la proteína se agregó al momento de concentrar y dializar (Tabla III).

Tabla III. Concentración de proteínas en las diferentes etapas de la purificación de lectina de L. vannamei contenidas en 300 µL de suero.

Fracción Proteínas mg

Suero 60.47

No retenida 54.33

Retenida No detectada

Determinación del peso molecular de la lectina.

El peso molecular de la lectina se evaluó por electroforesis en gel de poliacrilamida con urea de acuerdo al método descrito por Bollag DM et al. (1996) y se tiñó con plata obteniéndose 4 fracciones de 83.14 kDa, 64.01 kDa 46.16 kDa y 33.29. (Figura 2).

Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con urea de la lectina purificada. Carril (a): Marcadores moleculares. Carril (b): lectina purificada de camarón L.vannamei.

205 kDa   116 kDa    97 kDa  80 kDa  66 kDa  55 kDa  45 kDa  30 kDa  21 kDa  14 kDa   

a b

83.14  64.01  46.16    33.29   

Se realizó una electroforesis en gel SDS-PAGE, según el método descrito por Laemli (1970) y se tiñó con plata observándose las mismas bandas en el suero y fracción no retenida y 4 bandas en la fracción retenida de 83.28 kDa, 63.66 kDa, 57.07 kDa y 49. 25 kDa. (Figura 3).

Figura 3. Electroforesis SDS-PAGE. Carril (a): Marcadores moleculares. Carril (b): Suero de camarón L.vannamei. Carril (c) Fracción no retenida. Carril (d) Lectina de L.vannamei purificada.

Actividad hemaglutinante

El suero del camarón Litopenaeus vannamei aglutinó eritrocitos de diferentes especies, el título más alto de hemaglutinación se observó en los eritrocitos de ratón, siendo 8 veces mayor que los demás eritrocitos probados en PBS. La actividad aglutinante aumentó en presencia de CaCl

, de eritrocitos tratados con tripsina y en algunos eritrocitos tratados con sialidasa (Tabla IV).

205 kDa   

116 kDa  97 kDa  80 kDa  66 kDa  45 kDa  30 kDa 

 a   b   c   d 

83.28  63.66  57.07  49.25 

Tabla IV. Actividad hemaglutinante del suero de camarón. Unidades hemaglutinantes (UHA) indican el inverso de la última dilución con actividad hemaglutinante ND: no determinado.

Eritrocitos Unidades hemaglutinantes (UHA) Nativos

(PBS)

Con 5 mM CaCl

Tratados con sialidasa

Tratados con tripsina

Conejo 32 1024

16384

Rata 32 128

1024 

Cuyo ND 128

256 

Hámster ND 16

512 

Ratón 256 2048

16384

Humano B 32 32

2048 

Humano O 32 32

1024 

Humano A 32 32

1024 

Especificidad

La especificidad se determinó comparando la actividad inhibitoria de varios carbohidratos

en la hemaglutinación de los eritrocitos de conejo al 2%. De los 9 monosacáridos

evaluados, glucosamina fue el mayor inhibidor al inhibir la aglutinación un 96.8% a 200

mM, mientras que la fucosa tuvo un porcentaje de inhibición de 87.5% y la galactosa y

glucosa inhibieron la aglutinación en un 75%. La N-acetil-glucosamina, galactosamina, N-

acetil-galactosamina, manosa y manosamina no lograron inhibir la aglutinación a 200 mM

(Tabla V).

Tabla V. Especificidad de lectina.

Carbohidrato Porcentaje de inhibición

D-Glucosamina 96.8%

L-Fucosa 87.5%

D-Galactosa 75%

D-Glucosa 75 %

Determinación de la concentración de lectina

Se estandarizó la curva utilizando lectina de Machrobrachium rosenbergii (1-10 µg en 50 µL de buffer de carbonato a 0.1 M, pH 9.5), obteniéndose una R

de 0.99 y una pendiente de 0.4128 (Figura 4).

Figura 4. Curva estándar de lectina de Macrobrachium rosembergii.

Se realizó un Western blot utilizando agregados de la lectina purificada y anticuerpos

contra la lectina de Macrobrachium rosembergtii a una dilución de 1/40, observándose que

reconoce 3 (83, 64 y 46 kDa) de las 4 fracciones purificadas. (Figura 5).

Figura 5. Western blot de lectina de camarón L.vannamei y anticuerpos contra MrL

La concentración de lectina de los camarones tratados se determinó por ELISA utilizando anticuerpos monoclonales contra MrL y el plasma de camarón. El análisis de ANOVA no mostró diferencias significativas entre la concentración de lectina en la hemolinfa de los camarones L. vannamei expuestos a diferentes tratamientos y el control. La concentración de lectina se mantuvo entre 18.2 y 32.4 µg ml

(Figura 6, 7 y 8).

Figura 5. Muestreo realizado 24 h después de la quinta aplicación del tratamiento. Las barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p< 0.05 indica diferencias significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal.

205 kDa   116 kDa  97 kDa  80 kDa  66 kDa  55 kDa    45 kDa  30 kDa  21 kDa  14 kDa  6.5 kDa 

80.40 kDa 61. 38kDa  48.29 kDa   

Figura 6. Muestreo realizado 48 h después de la tercera aplicación del tratamiento. Las barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p<0.05 indica diferencias significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal.

Figura 7. Muestreo realizado 72 h después de la cuarta aplicación del tratamiento. Las

barras verticales indican el error estándar.

Prueba de ANOVA p<0.05 indica diferencias

significativas.

Prueba de Kolmogórov-Smirnov, p>0.20 indica una distribución normal.

DISCUSIÓN

Los invertebrados no presentan una respuesta inmune adaptativa para combatir a los agentes extraños, por lo que aparentemente carecen de una especificidad y memoria inmunológica. Sin embargo, poseen lectinas que son proteínas ampliamente distribuidas en la naturaleza y tienen la capacidad de reconocer de manera específica carbohidratos en la superficie celular, desencadenando diferentes mecanismos de defensa como son: activación del estallido respiratorio, inducción del sistema profenoloxidasa, aglutinación, fagocitosis mediada por opsonización y encapsulación de virus, bacterias y hongos, además algunas lectinas pueden presentar actividad antimicrobiana (Xian-Wei et al., 2012). Así mismo, se ha sugerido que las lectinas podrían ser los precursores funcionales de los anticuerpos en vertebrados, ya que muestran una gran especificidad por ciertos carbohidratos y porque están involucradas en el reconocimiento y eliminación de patógenos (Vázquez-Moreno et al., 1998).

En este estudio se purificó lectina de la hemolinfa del camarón blanco (L. vannamei)

mediante la cromatografía de afinidad en una columna de estroma de eritrocitos de rata,

donde la fracción no retenida comprendió el 90% de las proteínas presentes en el suero del

camarón. Probablemente la mayor parte de la fracción no retenida corresponde a la

hemocianina ya que en el camarón L. vannamei la hemocianina representa del 80 al 95% de

las proteínas totales de su hemolinfa (Vázquez-Moreno et al., 1997). Sin embargo al

momento de concentrar y dializar la lectina obtenida se agregó, por lo que no fue posible

evaluar su peso molecular en condiciones nativas, por lo tanto es difícil saber si se trata de

una o de varias lectinas purificadas. En condiciones desnaturalizantes (gel urea) se

obtuvieron cuatro fracciones de 83, 64, 46 y 33 kDa. Sun et al. (2007) purificaron un

lectina del plasma de L. vannamei, que presentó un peso molecular de 172 kDa y está

compuesta por subunidades de 32 y de 38 kDa. También se han caracterizado diversas

lectinas del camarón L. vannamei mediante métodos moleculares, como las lectinas

recombinantes LvLec (Zhang et al., 2009), LvLec1 (Luo et al., 2011) y LvCTL1 (Zhi-Ying

et al., 2009); que al correrlas en un gel SDS-PAGE al 15% presentaron un peso molecular

de 25, 18.8, 15.86 kDa respectivamente. Así mismo, se han purificado lectinas de varias especies de camarones peneidos que difieren en su peso molecular, número y tamaño de sus subunidades. La lectina de la hemolinfa de P.californiensis (BSH-1) tiene un peso molecular de 175 kDa, constituida por subunidades de 41 kDa; la lectina del suero de P.

monodon (monodina) es una proteína de 420 kDa, compuesta por subunidades de 27 kDa, en P. paulensis se purificó una lectina de la hemolinfa de un peso molecular de 153 kDa, formada por subunidades de 31 kDa; P. japonicus tiene una lectina de 330 kDa, compuesta por subunidades de 33 kDa, en P. stylirostris se encontró una lectina de 30 kDa (Freire Marques y Barracco, 2000) mientras que en P. shmitti (Freire-Marques y Barracco, 2000) y L. setiferus (Alpuche et al., 2005),

presentan lectinas heterooligoméricas, ya que la primera es una proteína de 153 kDa, con subunidades de 31 y 34 kDa y la última tiene un peso molecular de 291 kDa formada por cuatro subunidades, dos de 80 y dos de 52 kDa. Con lo anterior podemos ver que las lectinas de L. vannamei al igual que la de otras especies de camarón presentan variabilidad en el peso molecular de sus subunidades y que puede presentar una o varias subunidades, por lo que según los pesos moleculares obtenidos en el gel no podemos saber si es una lectina con varias subunidades o son varias lectinas de diferente peso molecular.

La hemolinfa de L. vannamei tiene mayor actividad aglutinante en presencia de eritrocitos

de ratón. La superficie de los eritrocitos de ratón presenta una gran cantidad de residuos O-

acetilados (60% del total de sus residuos de ácido siálico) provenientes principalmente del

ácido siálico 9-O-acetil neuramínico (Neu5,9Ac); mientras que los eritrocitos de rata y

conejo tienen un menor porcentaje de derivados O-acetilados (40% y 20% del total de

residuos de ácido siálico) (Shukla et al., 1982) y los eritrocitos de los humanos presentan

ácido neruamínico y no cuentan con Neu5,9Ac (Krotkiewski et al., 1988), por lo tanto se

puede decir que los derivados O-acetilados tienen un papel importante en el reconocimiento

de la lectina presente en la hemolinfa. En general varias lectinas de diferentes camarones

presentan una alta especificidad para los carbohidratos N-acetilados, principalmente para el

ácido neuramínico como es en el caso de las lectinas LVL (L. vannamei) (Sun et al., 2007)

y FC-L (Fenneropenaus chinensis) (Sun et al., 2008), las cuales son inhibidas con muy

bajas concentraciones de este monosácarido (0.125 y .25 mM, respectivamente). Sin embargo, también hay lectinas que tienen una mayor especificidad para los residuos O- acetilados como en caso de la lectina de Cancer antennarius que es específica para los ácidos siálicos 9-O y 4-O acetilados (Ravindranath MH et al., 1985),

o la lectina de Macrobrachium rosembergii (Vázquez-Moreno et al., 1993)

y Liocarcinus depurator (Fragkiadakis et al., 1997) que reconocen el Neu5,9Ac. No obstante, podemos observar que al tratar los eritrocitos con sialidasa la aglutinación permanece igual o aumenta, probablemente debido a que al hidrolizar los enlaces de ácido siálico se exponen más residuos de galactosa en los eritrocitos de las diferentes especies (Krotkiewski , 1998), demostrándose especificidad de la lectina hacia este monosacárido. Esta especificidad hacia la galactosa se ha visto en otras lectinas de camarones como la lectina PmLec de P.

monodon (Luo et al., 2006) y la lectina recombinante LvLec1 de L.vannamei (Luo et al., 2011), que reconocen galactosa y glucosa pero no sus derivados acetilados. Todo lo anterior sugiere que la hemolinfa presenta una lectina con diversos mecanismos de regulación en base a organización estructural o la hemolinfa podría tener diferentes lectinas o isoformas de lectinas con diversas especificidades y posiblemente distintas funciones, como se ha visto en las lectina LvCTLbr1 y LvCTLbr2 de L.vannamei, las cuales difieren en 5 residuos en las posiciones 29, 91, 109, 150 y 330, dónde la sustitución de treonina por alanina (posición 150) en el CRD1 de LvCTL-br1 y el aspartato por glicina (posición 109), ocasiona un menor número de puentes de hidrógeno en el CRD1 de LvCTL-br2, provocando una interacción química más débil entre los residuos del sitio de unión LvCTL- br2, CRD1 y el azúcar correspondiente, afectando la afinidad de las proteínas por los carbohidratos (Costa et al., 2011) En juveniles de Macrobrachium rosenbergii, se encontraron 4 isoformas de lectina, de las cuales las lectinas formadas por subunidades en un pI de 5.6 mostraron una menor actividad hemaglutinante (Zenteno et al., 2000).

Al tratar los eritrocitos de las diferentes especies con tripsina, aumenta el título de

aglutinación, probablemente debido a que la tripsina hidroliza los enlaces peptídicos de las

proteínas dejando más expuestos a los glicolípidos de la superficie de los eritrocitos que en

su mayoría tienen como carbohidrato terminal a la galactosa. Los eritrocitos de conejo

tienen una gran cantidad de macro glicolípidos en su membrana, que pueden representar 1/3 de la fracción glicoproteíca y el carbohidrato terminal de la mayoría de las cadenas de carbohidratos de los glicolípidos es la galactosa (Krotkiewski et al., 1988; Galili et al., 2010). En los eritrocitos de los humanos, aproximadamente el 26% de las cadenas de carbohidratos de los glicolipidos terminan en galactosa y otras en menor proporción cuentan con fucosa (Greer et al., 2009). Un fenómeno similar sucede con la lectina LVL de L. vannamei (Sun et al., 2007) y la lectina de M. rosembergii (Vázquez-Moreno et al., 1993) donde aumenta la actividad aglutinante de los eritrocitos tratados con tripsina o proteasa.

En la inhibición de la hemaglutinación con diferentes carbohidratos observamos que existe una mayor especificidad por la glucosamina, lo que indica que la lectina presente en el suero podría estar participando mayormente en el transporte de glucosamina para la formación de la quitina de la cutícula (Cuzon et al., 2000). Igualmente hay una especificidad por la fucosa, galactosa y glucosa. La especificidad por la fucosa también se ha observado en la lectina tachylectin-4 de Tachypleus tridentatus, que presenta una alta afinidad por la cepa lisa de Escherichia coli O111:B4, debido a que en el extremo de su antígeno O tiene a la colitosa (3-deoxi-L-fucosa), la cual muestra una estructura similar a la L-fucosa (Saito et al., 1997). Como se mencionó anteriormente, el reconocimiento de la lectina hacia la galactosa y glucosa es compartido por las lectinas LvLec1 (Luo et al., 2011) y por la lectina PmLec de P. monodon (Luo et al., 2006). La galactosa se encuentra principalmente en los lipopolisacáridos de las bacterias Gram- como Listonella anguillarum y en la envoltura de algunos virus (Wei et al., 2012). Los lipopolisacáridos de las bacterias Gram- varían en su grado de acilación y glicosilación (Raetz et al., 2002), por lo que la especificidad de la lectina por los diferentes monosacáridos (glucosa, galactosa y fucosa) sugiere que ésta podría tener una función importante en el reconocimiento de bacterias Gram-.

También podemos observar que la aglutinación de la hemolinfa aumenta al agregar 5 mM

de CaCl

, lo que sugiere que las lectinas presentes en la hemolinfa son lectinas tipo C, que