CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE PATOGÉNESIS DE VIRUS DE PLANTAS Y
MECANISMOS DE RESISTENCIA EN PLANTAS
PATOGÉNESIS DEL VIRUS DEL MOTEADOS SUAVE DEL PIMIENTO EN
SOLANÁCEAS
TESIS DOCTORAL Fátima Tena Fernández
Madrid, 2012
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
PATOGÉNESIS DEL VIRUS DEL MOTEADOS SUAVE DEL PIMIENTO EN SOLANÁCEAS
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
F
ÁTIMA TENAF
ERNÁNDEZVº Bº DIRECTORA DE TESIS Vº Bº TUTORA DE TESIS
Fdo. Dra. M. Isabel García Luque Fdo.: Dra. Marta Martín Basanta
Fdo.: Fátima Tena Fernández
MADRID,2012
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
DÑA. ISABEL GARCÍA LUQUE, INVESTIGADORA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS EN EL CENTRO DE
INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS DE MADRID
CERTIFICA:
QUE LA TESIS DOCTORAL TITULADA “PATOGÉNESIS DEL VIRUS DEL MOTEADO SUAVE DEL PIMIENTO EN SOLANÁCEAS” REALIZADA POR LA LICENCIADA EN BIOLOGÍA FÁTIMA TENA FERNÁNDEZ, EN EL
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC) BAJO SU DIRECCIÓN, REÚNE LAS CONDICIONES EXIGIDAS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORENBIOLOGÍA.
EN MADRID,2012
FDO.DRA ISABEL GARCÍA LUQUE
Resistencia en Plantas del Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, financiado por el proyecto AGL2008-00450 del Ministerio de Ciencia y Tecnología.
Los resultados de esta Tesis Doctoral han sido presentados en los siguientes congresos y reuniones científicas:
- XIV International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Quebec, Canada, Julio de 2009).
- II Reunión de Virología Molecular de Plantas (Puerto de Santa María, Cádiz, España, Marzo de 2010).
- X Reunión de Biología Molecular de Plantas (Valencia, España, Julio de 2010).
- XV Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología (Vitoria, España, Septiembre de 2010).
Parte de los resultados de esta tesis ha dado lugar a la siguiente publicación:
- Tena, F., Molina-Galdeano, M., Serra, M.T. y García-Luque.2012. A single amino acid in the helicase domain of PMMoV-S is responsible for its enhanced accumulation in C. chinense (L3L3) plants at 32 °C. Virology 427: 34-43.
A mis padres,
A mi hermana,
Y a Ricardo.
me gustaría olvidarme de ninguna de ellas, pero si es así, pido disculpas de antemano y gracias a todos.
En primer lugar quiero agradecer a mi directora de Tesis, la Dra. Isabel García Luque, por todo lo que ha hecho por mí, tanto a nivel profesional como personal, por su inestimable ayuda, su confianza y por haberme transmitido sus inquietudes científicas.
A la Dra. Marta Martín Basanta, tutora de esta Tesis, por su interés y por la evaluación previa de este trabajo, y por ponerlo siempre todo tan fácil durante los trámites de presentación de la Tesis.
A la Dra. Mª Teresa Serra Yoldi, por la ayuda brindada a lo largo del desarrollo de esta tesis, siempre pendiente de mi trabajo, mi estado de ánimo y dispuesta a ayudarme.
A la Dra. Mª Rodriguez Serrano, por su ayuda y dedicación en la detección mediante microscopía confocal de ROS y RNS.
Quiero agradecer a la Dra. Pilar García Agustín de la Universidad Jaume I, por las medidas de las realizadas de hormonas de plantas en este trabajo y a las Dras. Carmen Merodio y María Escribano, por su generosidad al permitirnos utilizar su equipo de cromatografía para medir etileno.
Al Dr. Tomás Canto por todos sus consejos, su apoyo y por darme la oportunidad de continuar en la ciencia, y a la Dra. Shelly Praveen, por su interés en el proceso de escritura y la ayuda aportada.
A Mónica y Pablo del Servicio de Fotografía del CIB, por su impecable trabajo a lo largo de estos años con las fotos de mis plantas y los buenos
ayudado a hacer la mayor parte de las fotos de esta Memoria.
A mis compañeros de Laboratorio: Paula, por todas nuestras conversaciones científicas y no científicas, que puedo sacar tanto partido de ellas; Irene, por ser tan divertida, desde que llegaste se respiraba mas alegría en el ambiente y Kumar, por su ayuda aportada.
A los amigos de departamento de plantas: Livia, me faltan las palabras para expresar todo lo que me has ayudados, gracias por ser tan buena amiga;
Anita, eres pequeña pero valiente, estoy seguro que llegaras lejos; Gosia, mi amiga polaca, una suerte aprender Inglés contigo y tenerte a mi lado; Mayte Solís, por toda tu ayuda en el montaje de esta tesis y por estar siempre disponible; Lourdes y Virginia, por todas su enseñanzas y sus palabras de ánimo en todo momento. Fran, Alberto, Nacho, Héctor, Inma, Raúl y Miguel, gracias por vuestra ayuda y hacedme pasar tan buenos ratos en el CIB. Y como no, a Meme y a Miguel, mi familia madrileña, gracias por estar siempre conmigo y por esas maravillosas charlas nocturnas en vuestra casa.
Gracias al resto de personas que he conocido durante mi trayectoria en el CIB, todas me habéis marcado de alguna manera: Isa, Amor, por estar siempre ahí, Alfonso, Jose, Gema, Aitor, Bea, Ángel y Pachi.
A todos mis amigos malagueños por recibirme siempre con los brazos abiertos cada vez que voy. Especialmente a Emilio, por todas sus palabras de ánimo durante esta etapa de tesis doctoral.
Quiero dar la gracias a toda mi gran familia, en especial a mi tío Antonio, por apoyarme desde donde estés, a mi tía Mari por darme una lección de
No tengo palabras para expresar mi gratitud a mis padres. Muchas gracias por vuestra dedicación. Gracias porque siempre aceptáis todas mis decisiones y porque habéis dado y seguís dando lo mejor para mi y mi hermana, muchas gracias por todo. Muchas gracias también a mi hermana Celia, por todo su apoyo y porque es la mejor hermana que cualquiera podría desear.
Y para terminar, gracias a Ricardo, mi compañero, siempre apoyándome.
Esta tesis no habría salido adelante de no haber estado a mi lado en estos últimos meses, soportando como nadie mis cambios de humor, ansiedad y nervios. Gracias por ver la vida tan fácil, saber sacarme siempre una sonrisa, tu infinita paciencia, tu confianza y tu alegría.
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INDICE
RESUMEN... 1
ABREVIATURAS... 7
ACRÓNIMOS DE VIRUS ... 9
1. INTRODUCCIÓN ... 11
1.1 Virus del moteado suave del pimiento...13
1.1.1 Características patogénicas y comportamiento en la naturaleza. ...13
1.1.2 Características estructurales...17
1.1.3 Ciclo de infección viral...21
1.2 Resitancia natural en plantas....28
1.2.1 Establecimiento de la reacción hipersensible. ...30
1.2.2 Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS)...31
1.2.3 Síntesis de las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). ...35
1.2.4 Compuestos claves en la ruta de defensa: etileno, SA, JA, y ácido abscísico (ABA)...37
1.2.5 Silenciamiento RNA...40
1.3 Tasa de respiración en plantas....43
1.4 Efecto de la temperatura sobre la defensa vegetal....44
1.5 Efecto de la temperatura sobre la infección viral....46
2. OBJETIVOS ... 49
3. MATERIALES Y MÉTODOS ...51
3.1 Material biológico, propagación y purificación viral...53
3.1.1 Plantas de ensayos ...53
3.1.2 Virus ...53
3.1.3 Purificación de los virus ...54
3.1.4 Estimación de la infectividad de los inóculos virales utilizados. ...54
3.1.5 Inoculación de virus en plantas de los géneros Capsicum y Nicotiana ...55
3.2 Preparación de ácidos nucleicos.... 55
3.2.1 Extracción del RNAs virales...55
3.2.2 Purificación del RNA total de plantas...56
3.2.3 Purificación del DNA plasmídico...56
3.3 Manipulación de ácidos nucleicos.... 57
3.3.1 Transcripción inversa...57
3.3.2 Amplificación de DNA mediante PCR...57
3.3.3 Digestión con enzimas de restricción...58
3.3.4 Electroforesis en geles de agarosa...58
3.3.5 Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa. ...59
3.3.6 Vectores de clonación y ligación de fragmentos de DNA59 3.3.7 RT-PCR cuantitativa. ...60
3.3.8 Marcajes de sonda con digoxigenina. ...62
3.3.9 Northern blot...63
3.4 Preparación de células competentes y transformación.... 64
3.5 Construcción de un transcrito infectivo de PMMoV-I y de transcritos quimeras.... 65
3.5.1 Plásmidos utilizados...65
3.5.2 Generación de un transcrito infectivo de PMMoV-I...66
3.5.3 Construcción de virus quimeras...67
3.5.4 Síntesis in vitro del genoma viral...72 3.6 Análisis de las CP virales....72 3.6.1 Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida. ...72 3.6.2 Detección de proteínas mediante ELISA-DAS. ...73 3.7 Obtención e infección de protoplastos....74 3.7.1 Obtención de protoplastos de C. chinense. ...74 3.7.2 Infección de protoplastos de C. chinense. ...75 3.7.3 Cuantificación de los protoplastos infectados...75 3.8 Visualización de la GFP....76 3.9 Visualización de H2O2, O2.- y NO....77 3.10 Determinación de hormonas y tasa de respiración en
plantas....78 3.10.1 Determinación de etileno y dióxido de carbono (CO2). ...78 3.10.2 Determinación de ácido salicílico (SA) y ácido abscísico
(ABA). ...79 3.11 Programas y técnicas de análisis estadístico....79 4. RESULTADOS...81 4.1 Obtención y análisis de la secuencia completa de PmmoV-
I....83 4.1.1 La secuencia del RNA genómico de PMMoV-I esta más
relacionada a la cepa PMMoV-Ia perteneciente al patotipo P1,2,3 que a ninguna otra...83 4.1.2 Análisis de la infectividad del transcrito de PMMoV-I en N.
benthamiana. ...85
4.2 Efecto de la temperatura sobre la patogénesis viral en plantas de C. chinense.... 87 4.2.1 Estimación de la infectividad de los inóculos virales utilizados.
...88 4.2.2 Análisis de la acumulación viral en plantas C. chinense
cultivadas a 32ºC ...89 4.2.3 Estudio de las funciones virales implicadas en las diferencias de acumulación viral observadas a 32ºC...96 4.3 estudio de la recuperación de plantas N. benthamiana
infectadas con PMMoV-I.... 104 4.3.1 Análisis de los síntomas producidos por PMMoV-S e I a partir de 21 d.p.i. ...104 4.3.2 Cinética de acumulación de RNAs virales. ...106 4.3.3 Expresión de proteínas de defensa. ...107 4.3.4 Niveles de Etileno (ET), Ácido Salicílico (SA) y Ácido
Abscísico (ABA)...108 4.3.5 Visualización de la producción de ROS y NO...111 4.3.6 Tasa de respiración...117 4.3.7 Análisis de la acumulación viral de PMMoV-S, PMMoV-I, PepMV y TMV en hojas recuperadas de plantas N. benthamiana infectadas previamente con PMMoV-I...118 5. DISCUSIÓN ... 121 5.1 Evolución de PMMoV... 123 5.2 Termorisestencia de PMMoV-S en plantas C. chinense.124 5.3 Análisis de la recuperación de plantas de N. benthamiana infectadas con PMMoV-I. ... 131
6. CONCLUSIONES ...139 7. BIBLIOGRAFÍA...145
2 1
RESUMEN
3 Las enfermedades causadas por virus vegetales son unos de los principales problemas en la agricultura de nuestro país. El virus del moteados suave del pimiento (PMMoV), el cual puede producir graves perdidas económicas, pertenece a las llamadas cepas de pimiento de los tobamovirus, las cuales han sido clasificadas en diferentes patotipos en función de su agresividad patogénica con respeto al gen L de resistencia del género Capsicum spp. La cepa italiana de PMMoV (PMMoV-I) pertenece al patotipo P1,2,3, sorteando la resistencia mediada por e gen L3, mientras que la cepa española (PMMoV-S) se engloba dentro del patotipo P1,2, susceptible a la resistencia mediada por el gen L3, sin embargo es la cepa española la que mas prevalece en los cultivos. La resistencia conferida por los genes L es de tipo hipersensible y se manifiesta por la inducción de lesiones locales necróticas (LLN) en las hojas infectadas.
Los cultivos españoles, en muchas ocasiones pueden alcanzar temperaturas superiores a 25 ºC, que en algunas especies virales se puede traducir en un incremento de la replicación y en el movimiento a través de la planta. Por ello, es importante conocer el efecto de la temperatura en el ciclo de infección viral, para así poder diseñar estrategias que inhiban su mecanismo de acción.
Datos previos de nuestro laboratorio demostraron que la resistencia conferida por el gen L3 es inactiva a temperaturas superiores a 28-30ºC, y que en esta misma temperatura la acumulación viral de la cepa española sufre un incremento con respecto a la cepa italiana. En este trabajo, hemos terminado de secuenciar 2 kb del extremo 5’ de PMMoV-I y llegando a la conclusión mediante análisis filogenético que la cepas pertenecientes al patotipo P1,2,3,4, se agrupan con aquellas pertenecientes al patotipo P1,2, lo que puede indicar que su evolución es desde este patotipo P1,2 y no desde el
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patotipo P1,2,3, como cabría esperar si hubieran tenido una coevolución con los genes L de resistencia.
Asimismo, realizando experimentos de acumulación viral a 32ºC en plantas de Capsicum chinense con virus quimeras obtenidos entre las dos cepas y con ambas cepas parentales, hemos podido establecer que el aminoácido 898 situado en el dominio helicasa de la proteína 126K es necesario para la mayor acumulación viral a 32ºC en la cepa española. Este fenómeno de termoresistencia ha sido analizado en los diferentes pasos del ciclo de infección viral (replicación y moviendo a corta y larga distancia), encontrando una mayor efectividad por parte de PMMoV-S desde el inicio de su replicación, pero no en el movimiento a larga distancia.
Los resultados obtenidos muestran por primera vez que el dominio helicasa está involucrado en la termoresistencia de PMMoV-S en regiones no conservadas de dicha helicasa, sino en una posición presuntamente expuesta, y que pudiera afectar a la interacción con elementos del huésped, por cuanto el cambio aminoacídico Pro-Gln en la posición 898 en el genoma de PMMoV-S no mantienen el comportamiento de caída de la acumulación viral en plantas de Nicotiana. benthamiana a 32ºC ; además muestran por primera vez que el dominio helicasa afecta a la síntesis de cadenas de ambas polaridades y que puede estar involucrada en el reconocimiento de las cadenas positivas para la síntesis de cadenas negativas.
PMMoV-I y PMMoV-S también poseen un comportamiento diferente cuando la infección tiene lugar en plantas de N. benthamiana. En trabajos anteriores, se había observado que estas plantas inoculadas con PMMoV-I presentan una recuperación a los 28 días post inoculación (d.p.i.) que no se observa en plantas inoculadas con PMMoV-S. Por este motivo, para
5 dilucidar las razones de este comportamiento diferencial llevamos a cabo estudios de acumulación viral, del patrón de expresión de diferentes genes de proteínas relacionadas con la patogénesis (PRS) y de los niveles de las principales fitohormonas relacionadas con la respuesta de defensa en plantas, así como, la capacidad de las plantas de responder a una reinfección cuando habían sido previamente inoculadas con PMMoV-I.
El conjunto de los resultados nos lleva a proponer que la planta modelo N.
benthamiana es capaz de activar un mecanismo de defensa frente a PMMoV-I con mas eficiencia que frente a PMMoV-S, desarrollándose incluso unas repuesta de defensa inducida para futuras infecciones virales.
Por lo tanto, estas capacidades de termoresistencia y de evadir las repuestas de defensas de las plantas pueden ser una de las razones de la mayor prevalencia en los cultivos de la cepa española.
7 ABREVIATURAS
aa Aminoácidos AOX Oxidasa alternativa ABA Ácido abscísico BrE Bromuro de etidio CP Proteína de cubierta ca-siRNAs Cis-acting siRNAs dNTPs Desoxiribonucleótidos d.p.i. Días post inoculación dsRNA RNA de doble cadena DCL Dicer-like
nt nucleótidos
gRNA RNA genómico
HEN1 Hua enhancer methyltransferase 1 h. i. Hoja inoculada
H2O2 Peróxido de hidrógeno h.p.i. Horas post inoculación HR Respuesta hipersensible h. s. Hoja sistémica
JA Ácido jasmónico
Kb Kilobase
kDA kilodalton
LAR Resistencia local adquirida LLN Lesiones locales necróticas MP proteína de movimiento mRNA RNA mensajero
nat-siRNAs Natural antisense transcript siRNAs
8
NO Óxido nítrico
nt Nucleótido O2.- Anión su peróxido ORF Marco abierto de lectura
pb Pares de base
PRs Proteínas relacionadas con la patogénesis PTGS Silenciamiento génico post-transcripcional RISC Complejo inductor del silenciamiento por RNA RNA Ácido ribonucleico
ROS Especies reactivas de oxígeno
RdRP RNA polimerasa dependiente de RNA RE Retículo endoplasmático
r.p.m. Revoluciones por minuto SA Ácido salicílico
SAR Resistencia sistémica adquirida
miRNA microRNA
sgRNA RNA subgenómico
siRNA pequeños RNA interferentes ta-siRNA Trans-acting small interfering RNA tRNAt RNA de transferencia truncado Tyr Tirosina
UV Ultravioleta
VRC Complejos replicativos virales vsRNA Pequeño RNAs derivados de virus VMC complejos del movimiento viral
9 ACRÓNIMOS DE VIRUS
AMV Virus del mosaico de la alfalfa BMV Virus del mosaico del bromo CarMV Carmovirus del moteado del clavel CGMV Virus del mosaico moteado del pepino CMV Virus del mosaico del pepino
CymRSV virus de las manchas en anillo de Cymbidium MNSV Virus de las manchas necróticas del melón PepMV Virus del mosaico del pepino
PMMoV Virus del moteado suave del pimiento SFV Virus del bosque de Semliki
TCV Virus del arrugamiento del nabo TMV Virus del mosaico del tabaco TNV Virus de la necrosis del tabaco TomRSV Virus de la mancha anular del tomate TRSV Virus de la mancha anular del tabaco TYMV Virus del mosaico amarillo TURNIP
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INTRODUCCIÓN
13 1.1 VIRUS DEL MOTEADO SUAVE DEL PIMIENTO
1.1.1 Características patogénicas y comportamiento en la naturaleza.
España es el segundo estado comunitario en cuanto a extensión agrícola, con cerca de 24 millones de hectáreas de superficie agrícola utilizada según el censo agrario del año 2009, por lo que la sanidad vegetal es un tema de preocupación en nuestro país.
Entre las enfermedades que pueden tener lugar en plantas, las producidas por virus son responsables de graves pérdidas económicas en todo tipo de cultivos, debido en última instancia a las profundas alteraciones morfológicas y fisiológicas que sufre la planta como consecuencia de la infección viral (rev. en Hull, 2002;
rev. en Kang et al., 2005).
En el caso de los cultivos de pimiento, del que nuestro país es uno de los principales productores europeos, poseen un interés especial las enfermedades producidas por las denominadas cepas de pimiento de los tobamovirus. Entre ellas nos encontramos con la enfermedad producida por PMMoV, la cual produce una reducción del tamaño del fruto, manchas, abultamientos e incluso áreas necróticas, agravándose el problema debido a que los síntomas evidentes no se manifiestan en la parte vegetativa de la planta, por lo que provoca pérdidas económicas aún mayores (Figura 1.1).
Hasta un 100% de las plantas cultivadas en la misma área pueden verse afectadas por la infección, debido a la facilidad con que se transmite el virus
FIGURA 1.1
Sintomatología de los frutos de C.
annuum infectados con PMMoV.
14
por contacto entre plantas, por inoculación mecánica o por semillas, sobreviviendo durante meses en los restos de cosechas y en el suelo (Ikegashira et al., 2004). Con anterioridad, la fumigación del suelo con bromuro de metilo era uno de los tratamientos químico que prevenían efectivamente de la enfermedad, pero este producto fue prohibido por el protocolo de Montreal en países desarrollados a partir del año 2005.
Consecuentemente, se requiere una estrategia alternativa para el control de la enfermedad (Goldbach et al., 2003).
PMMoV afecta prácticamente a todas las especies del género Capsicum que no son portadoras de los genes L de resistencia superiores a L2, es decir L3 o L4 (rev. en Andrés Yebes et al., 2010), y produce una infección sistémica en plantas de N. benthamiana (Berzal-Herranz et al., 1995; Pineda et al., 2010) y por lo tanto, al pertenecer también a la familia de las solanáceas es usada como sistema modelo de la interacción compatible planta-virus en esta tesis.
Para intentar encontrar una solución a los problemas producidos por virus vegetales, un considerable esfuerzo de la investigación agronómica se ha dirigido hacia el control de estas enfermedades (Goldbach et al., 2003; Kang et al., 2005), si bien los resultados son a todas luces ineficientes, como lo prueba las pérdidas provocadas por las virosis y los riesgos medioambientales inherentes a las prácticas de control actualmente en uso.
Por tanto, es necesario el desarrollo de otras estrategias que reúnan las características de amplio espectro, persistencia y bajo coste medioambiental.
De esta forma, se podrían evitar los efectos devastadores de enfermedades producidas por patógenos, incluidos los emergentes, que representan hoy en día uno de los principales problemas para la agricultura moderna. Para ello, es un paso previo e imprescindible la profundización en el conocimiento de los procesos que conducen al establecimiento de las infecciones virales y
15 que conllevan a una invasión generalizada de la planta o por el contrario, a la limitación de la enfermedad y consiguiente recuperación del huésped, o la termoresistencia dado el problema del calentamiento global del planeta.
Las cepas pimiento de los tobamovirus han sido agrupadas en cinco patotipos P0, P1, P1,2, P1,2,3 y P1,2,3,4 según su agresividad patogénica con respecto a los cuatros genes de resistencia del genero Capsicum (L1-L4).
Plantas homocigotas para el alelo L+ son susceptibles a todos los patotipos descritos, con un genotipo L1L1 son resistentes al patotipos P0, pero susceptibles a los patotipos P1, P1,2, P1,2,3 y P1,2,3,4; con un genotipo L2L2 son resistentes al patotipos P0 y P1 pero susceptibles a los patotipos P1,2, P1,2,3 y
P1,2,3,4 y así sucesivamente (Tabla 1.1). Frente a los tobamovirus
pertenecientes al patotipo P1,2,3,4, aún no se han encontrado genes de resistencia (Genda et al., 2007; Antignus et al., 2008).
En todos los casos, la resistencia es de dominancia incompleta, a excepción del gen L2 que es dominante, y de tipo hipersensible manifestándose con la inducción de LLNs (Holmes, 1934; Boukema, 1980, 1982; Sekine et al., 2012). La cepa tipo del patotipo P1,2,3 es la cepa italiana de PMMoV (PMMoV-I) (Wetter et al., 1984; Garcia-Luque et al., 1993).
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Tabla 1.1 Patotipos en los que han sido agrupados los tobamovirus que infectan plantas del genero Capsicum, según su agresividad patogénica con respecto a los genes L de resistencia. LLN, lesiones locales necróticas; MS, mosaico sistémico.
A pesar de que los patotipos P1,2,3 y P1,2,3,4 poseen mayor virulencia respecto a estos genes de resistencia, el patotipo P1,2, menos agresivo, es el que más prevalece en los cultivos. Ha sido propuesto que este hecho es debido a una mayor eficacia biológica de aquellos virus que pertenecen al patotipo P1,2, debido a que la teoría predice que mayores niveles de patogenicidad están asociados con pérdidas en la eficacia biológica (Sakamoto et al., 2008; Fraile et al., 2011).
Previamente, en nuestro laboratorio había sido establecido que PMMoV-S es termoresistente, por cuanto que su acumulación se incrementa a 32C respecto a 25C. Asimismo, en estudios anteriores fue comprobado que en plantas de N. benthamiana PMMoV-S era más virulenta que PMMoV-I, debido a que aquellas plantas infectada con la cepa italiana mostraban una recuperación de los síntomas inducidos por el virus (Perez-Bueno et al., 2004). Por lo tanto, estas pueden ser unas de las razones de la mayor prevalencia del patotipo P1,2 en los cultivos.
PATOTIPOS
PLANTA GENOTIPO P0 P1 P1,2 P1,2,3 P1,2,3,4
C. annuum cv. Early
Calwonder L+L+ MS MS MS MS MS
C. annuum cv. Bruinsma
Wonder L1L1 LLN MS MS MS MS
C. frutescens cv. Tabasco L2L2 LLN LLN MS MS MS C. chinense PI159236 L3L3 LLN LLN LLN MS MS C. chacoense cv. SA/85 L4L4 LLN LLN LLN LLN MS
17 PMMoV ha sido identificado como el principal virus de RNA encontrado en heces humanas (Zhang et al., 2006), comprobándose que los viriones de PMMoV recuperados de las heces eran altamente infecciosos en plantas (Zhang et al., 2006; Colson et al., 2010). Este hecho ha conducido a su propuesta como un indicador efectivo de la polución fecal en las aguas superficiales (Rosario et al., 2009; Hamza et al., 2011). Además, Colson et al.
(2010) han mostrado una asociación entre la presencia del RNA viral de PMMoV en heces humanas y síntomas clínicos explicando una respuesta inmune específica, sugiriendo un papel patogénico directo o indirecto de PMMoV en humanos.
1.1.2 Características estructurales.
PMMoV pertenece al género Tobamovirus, cuyo miembro tipo es TMV. Todos los representantes de los tobamovirus tienen forma de varilla cilíndrica rígida y alargada de unos 300 nm de longitud y 18 nm de diámetro (Figura 1.2) que están constituidas por unas 2130 unidades de una única
molécula polipeptídica de 17 a 18 kDa denominada CP. Estas unidades se distribuyen de forma helicoidal alrededor de una molécula de RNA lineal de cadena sencilla y polaridad positiva que constituye el genoma viral (rev. en Hull, 2002).
FIGURA 1.2
Fotografía de una observación al microscopio electrónico de partículas de PMMoV-S. La barra representa 0, 1µm.
18
El gRNA de PMMoV-S está constituido por 6357 nt (Alonso et al., 1991).
En el extremo 5’ del RNA posee una estructura CAP (7mGpppG) unida a una secuencia líder de 69 nt denominada fragmento Ω. Se ha demostrado que esta estructura es activadora de la traducción tanto en eucariotas como en procariotas (Gallie y Walbot, 1992). Asimismo, en el extremo 3’ PMMoV posee una secuencia no codificante de 199 nt que adopta una estructura de tRNAt (Avila-Rincon et al., 1989) cuya función en TMV también consiste en incrementar la traducción del RNA viral (Gallie y Walbot, 1992; Gallie, 1996). El RNA está organizado en 4 ORFs, que codifica al menos 4 proteínas diferentes (Figura 1.3). La primera ORF (nt 70-3423) codifica una proteína de 1117 aa denominada 126K. La supresión del codón de terminación ámbar (UAG) de la secuencia que codifica la proteína 126K posibilita la lectura hasta el nt 4908, de tal forma que se traduce una proteína de 1612 aa denominada 183K. La tercera ORF (nt 4909-5682) codifica una proteína de 257 aa, la proteína 30K. Por último, la cuarta ORF (nt 5685-6158) codifica la CP o 17,5K de 156 aa (Alonso et al., 1991).
Las proteínas 126 y 183 K se traducen directamente del gRNA del virus,
FIGURA 1.3
Organización genómica y estrategia de replicación de PMMoV-S por analogía a TMV por cuanto que en PMMoV-S no han sido mapeados los orígenes de transcripción de los sgRNAs. Se muestran el gRNA de polaridad positiva y los sgRNAs a partir de los cuales se sintetizan las proteínas de las ORF que se encuentran próximas al extremo 5’ del mRNA, representadas por encima de la línea que representa el RNA.
19 mientras que la 30 K y la CP lo hacen a partir de sgRNAs 3’ coterminales que se sintetizan utilizando como molde las cadenas negativas originadas a partir del gRNA en el transcurso de la replicación viral (rev. en Hull, 2002).
La proteína 126 K tiene en su extremo amino un dominio con actividad metiltransferasa (aa 1 al 494), necesario para la formación de la estructura CAP en los gRNAs y sgRNAs (Ahlquist et al., 1985; Dunigan y Zaitlin, 1990; Schuman y Schwer, 1995). En su extremo carboxilo (aa 833 al 1086) presentan un dominio con actividad helicasa necesario para desenrollar los RNAs bicatenarios producidos durante la replicación viral (Gorbalenya y Koonin, 1989; Goregaoker y Culver, 2003). Estas proteínas helicasas han sido clasificadas en tres superfamilias (SF1, SF2, SF3) (Hodgman, 1988;
Gorbalenya y Koonin, 1989), perteneciendo las helicasas virales de los tobamovirus a SF1, que poseen cinco dominios conservados (I, II, III, IV, V) (Kadare y Haenni, 1997). Mediante el estudio de la similitud de secuencia de los dominios helicasas estudiados, se ha postulado que todos ellos tienen un dominio de unión común a NTPs, que en el caso de los tobamovirus es ATP (Culver, 2002), los cuales son hidrolizados para obtener la energía necesaria para llevar a cabo la función de desenrollar los RNAs bicatenarios, ocurriendo estas reacciones en los dominios designados como I y II (aa 833 al 850 y 902 al 913 respectivamente en PMMoV-S) (Alonso et al., 1991;
Kadare y Haenni, 1997; Xiang et al., 2012). Sin embargo, existen otras funciones asignadas al dominio helicasa, por ejemplo, en TMV es capaz de desencadenar la HR en plantas de tabaco que contienen el gen N (Erickson et al., 1999).
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Entre los dominios helicasa y metiltransferasa de las proteínas 126/183 K existe una región interdominio la cual no tiene ninguna función específica (Koonin, 1991; Koonin y Dolja, 1993) pero si es conocida su participación en diferentes procesos virales, como por ejemplo, en la interacción necesaria para llevar a cabo la replicación entre las proteínas 126/183K (Goregaoker et al., 2001).
Liu et al. (2005) demostraron que la proteína 126 K está implicada en el movimiento intracelular del VRC a lo largo de los microfilamentos, y es también necesaria tanto para el movimiento a corta (Hirashima y Watanabe, 2001, 2003) como a larga distancia del virus (Nelson y van Bel, 1998).
Por otro lado, las proteína 126 K de TMV y su equivalente la 130 K de ToMV han sido identificados como supresores del silenciamiento génico (Kubota et al., 2003; Ding et al., 2004; Wang et al., 2010).
La proteína 183 K tiene además de los dominios metiltransferasa y helicasa (que son compartidos con la 126 K) un domino en la región C terminal con secuencias características de las RNA polimerasas dependientes de RNA (Poch et al., 1989), común a todas las polimerasas dependientes de RNA o DNA involucradas en la elongación de cadenas preexistentes (Quadt y Jaspars, 1989). Estas dos proteínas forman parte del VRC (Osman y Buck, 1996), los cuales son necesarios para una eficiente replicación (Ishikawa et al., 1986; Lewandowski y Dawson, 2000).
La proteína 126 K/183 K cumplen funciones independientes al ciclo de infección viral, siendo responsables por ejemplo de la sintomatología diferencial producida por distintas cepas virales en plantas de pimiento (Hagiwara et al., 2002; Ichiki et al., 2005; Ichiki et al., 2009).
21 La proteína 30 K o MP es necesaria para el movimiento célula a célula del virus (Deom et al., 1987; Meshi et al., 1987) a través de los plasmodesmos, incrementando el tamaño de exclusión de los mismos (Wolf et al., 1989). El paso del RNA viral por los plasmodesmos se lleva a cabo tras su interacción con la MP a través de un dominio de unión con ácidos nucleicos facilitando así su desplegamiento (Wolf et al., 1989; Oparka et al., 1997).
La CP cumple una función estructural como proteína de cubierta del virus, siendo necesaria para el movimiento a larga distancia (Holt y Beachy, 1991;
Simon-Buela y Garcia-Arenal, 1999), debido a que es imprescindible una CP funcional para la encapsidación viral (Nelson y van Bel, 1998). Entre otras funciones, la CP de tobamovirus está implicada en el desarrollo de síntomas en ciertas especies vegetales (Culver, 2002) y se ha identificado como el inductor de la resistencia conferida por el gen N’ de Nicotiana sylvestris (Culver y Dawson, 1989) y por los genes L1-L4 de Capsicum spp. (Berzal- Herranz et al., 1995; de la Cruz et al., 1997; Gilardi et al., 1998; Gilardi et al., 2004).
1.1.3 Ciclo de infección viral.
El ciclo de infección de PMMoV concretamente no se ha estudiado, pero sí se han estudiado muchos aspectos del ciclo de infección del miembro tipo de tobamovirus, TMV. Por lo tanto, se asume que los conocimientos sobre este virus son extensibles a los demás tobamovirus.
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FIGURA 1.4
Ciclo de infección de virus vegetales de RNA de cadena positiva (Roossinck, 2005)
El establecimiento de una interacción compatible depende de la habilidad de un virus para invadir una célula huésped, que a su vez depende de la formación de complejos funcionales entre las proteínas del huésped y del virus. Los procesos necesarios para el establecimiento de la infección viral se agrupan en desnudamiento, replicación, traducción y movimiento (rev. en Hull, 2002) (Figura 1.4).
1. Desnudamiento.
La partícula viral debe entrar en la célula mediante daño mecánico de la cutícula y de la pared celular. En el momento de la entrada o poco después, se produce el desnudamiento viral, que es bidireccional en el caso de TMV (Wu y Shaw, 1996). Este proceso es cotraduccional debido a que participan los ribosomas, que se unen al RNA viral y traducen las ORF 5’ dando lugar
23 a las proteínas 126/183K (replicasas) y desplazan las subunidades de CP hasta que alcanzan el codón de terminación de la ORF 126/183K.
Posteriormente, la replicasa interacciona con las subunidades de la CP localizadas en el extremo 3’ de la partícula y posibilita la desencapsidación del RNA en dirección 3’-5’ completando así la liberación del RNA viral en un proceso acoplado a la replicación de cadenas negativas del RNA viral (rev. en Hull, 2002).
2. Replicación.
La replicación se inicia copiando las cadenas positivas a cadenas complementarias negativas, moléculas intermedias que sirven de molde para la síntesis de nuevos RNAs virales y de los sgRNA. Estos sgRNA son una de las estrategias utilizadas por los virus de RNA policistrónicos, y que no pueden ser traducidas todas las ORFs en células eucariotas a excepción de la localizada en el extremo 5’. Para ello son necesarias las cadenas negativas debido a que las RdRP reconocen una región de estas cadenas denominadas promotores subgenómicos que dan lugar a fragmentos de RNA a partir de los cuales pueden ser traducidas las diferentes proteínas. En el género Tobamovirus estos sgRNA se traducen para dar lugar a las proteínas MP y CP. Las subunidades de la CP se unen al gRNA de nueva síntesis, constituyéndose los viriones (rev. en Hull, 2002).
Los intermediarios de la replicación viral que se han aislado de células infectadas incluyen las llamadas formas replicativas o RF (RNA de doble cadena de igual longitud al gRNA y totalmente apareada) y los llamados intermediarios replicativos o RI (RNA de doble cadena parcialmente apareada que contiene varias colas monocatenarias de polaridad positiva) (Jackson et al., 1971; Aoki y Takebe, 1975). En el caso de plantas infectadas
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con TMV se han aislado RNAs de doble cadena de la longitud correspondiente a los sgRNA (Palukaitis et al., 1983).
Para una eficiente replicación del RNA de TMV, son necesarias las proteínas 126K y 183K (Ishikawa et al., 1986), formando parte en los VRC, aislados de plantas infectadas con TMV en una relación 1:1 (Osman y Buck, 1996; Watanabe et al., 1999). Estudios de microscopia de fluorescencia sugieren que estas proteínas se localizan en membranas del RE (Heinlein et al., 1998; Mas y Beachy, 1999), mientras que otros estudios de microscopía electrónica sugieren que estas proteínas se acumulan en inclusiones citoplasmáticas (Hills et al., 1987; Saito et al., 1987), si bien se postula que estas inclusiones son posteriores a la replicación.
Ha sido demostrado que existe una interacción entre los dominios helicasas y entre las regiones interdominio de las proteínas 126K y 183K, dando lugar a homo o heterooligómeros necesarios para la replicación viral (Goregaoker et al., 2001; Goregaoker y Culver, 2003). El dominio helicasa es esencial en el ciclo de infección viral debido a que además de desenrollar los RNAs bicatenarios producidos durante la replicación, interacciona con mas de 10 proteínas hospedadoras de diferentes especies de plantas las cuales algunas tienen importantes funciones en el ciclo de infección viral (Ishibashi et al., 2010).
En algunos estudios se ha sugerido la implicación de proteínas de membrana TOM1 (TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION) y TOM2A de Arabidopsis thaliana y TOM1 y TOM3 de Nicotiana tabacum en la replicación de los tobamovirus (Ishibashi et al., 2010). Mediante las técnicas de interacción de doble híbrido en levaduras y copurificación de proteínas ha sido demostrado la interacción de TOM1 con el dominio helicasa de las
25 proteínas de replicación de ToMV (Yamanaka et al., 2000; Yamanaka et al., 2002; Nishikiori et al., 2006).
3. Traducción.
La traducción del genoma de TMV es llevada a cabo por la maquinaria de traducción del huésped a partir de los gRNA y sgRNA virales (rev. en Hull, 2002). Al igual que los mRNAs de la célula huésped (Welch et al., 2000) existe evidencia de que los RNAs virales se circularizan, incrementándose así la eficiencia de traducción (Thivierge et al., 2005).En el caso de TMV, se sabe que la estructura similar a tRNAt, situada en el extremo 3’ de su genoma, es cargada con una histidina ocurriendo esto mismo en PMMoV-S (Garcia-Arenal, 1988). Esta estructura está precedida por un dominio de pseudolazo que interacciona con un factor de la traducción de la célula huésped (eIF1A). Se ha demostrado que ésta interacción es importante, ya que mutaciones que la reducen también reducen la síntesis de RNA y la acumulación viral. El mecanismo exacto está aún por esclarecer, aunque se ha sugerido que eIF1A podría estimular la replicación en asociación con otros factores del huésped (Zeenko et al., 2002). eIF1A también se encuentra de forma abundante en los cuerpos replicativos de células infectadas, junto con ribosomas, hecho que apoya la hipótesis de que se trata de un factor necesario para la traducción y replicación eficaz de TMV (Thivierge et al., 2005).
4. Movimiento.
Después de una ronda de replicación inicial en las células de infección primaria, para que la infección se propague a las células adyacentes, TMV al igual que otros virus, ha de moverse a través de la pared celular. Este tipo de movimiento se denomina de célula a célula o a corta distancia y se realiza a través de los plasmodesmos. El movimiento a través del sistema vascular
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permite alcanzar zonas más distantes de la planta y se denomina movimiento sistémico o a larga distancia. El movimiento célula a célula de TMV ha sido ampliamente estudiado ( rev. en Heinlein et al., 1998;
Citovsky, 1999) en comparación con el movimiento a larga distancia, del que se dispone de menor cantidad de información.
El movimiento célula a célula es un proceso activo que requiere la interacción específica entre el virus y los plasmodesmos. Esta interacción es mediada por la MP de TMV, que actúa incrementando el límite de exclusión de los plasmodesmos y transportando el RNA viral a través de estos canales ensanchados (Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997; Heinlein et al., 1998; Citovsky, 1999). Recientemente se han encontrado resultados que indican que el aumento de este límite de exclusión es debido a que la MP de TMV se asocia a microfilamentos (Su et al., 2010). Se sabe que esta proteína interacciona con el RNA viral, formando un complejo ribonucleoproteíco desplegado que puede penetrar en el canal de los plasmodesmos (Citovsky et al., 1990; Citovsky et al., 1992); que interacciona con elementos del citoesqueleto que facilitan el transporte de estos complejos del citoplasma celular hasta los plasmodesmos (McLean et al., 1995; Heinlein et al., 1998) y que se asocia al RE (Heinlein et al., 1998; Reichel y Beachy, 1998; Mas y Beachy, 1999; Asurmendi et al., 2004).
El modelo actual propone que la MP de TMV forma complejos con el RNA viral y la proteína 126K. Hirashima y Watanabe (2001, 2003) demostraron que un virus quimera de TMV con un aa intercambiado en el dominio helicasa de la proteína 126K era defectivo en el movimiento célula a célula, pero sin embargo replicaba normalmente. Se ha podido observar que la proteína 126K, tanto formando parte de los VRCs como sóla, se alinea con los microfilamentos y se mueve sobre ellos dentro de la célula
27 (Liu et al., 2005). Se ha postulado que mediante una interacción directa o indirecta de la proteína 126K con los microfilamentos se puede producir el transporte del VRC desde los lugares de síntesis asociados al RE, hacia los plasmodesmos en la pared celular. Ahí, la MP de TMV se asociaría a las pectinmetilesterasa de la pared celular e incrementaría la permeabilidad de los plasmodesmos. El complejo RNA viral MP sería transportado a través de los canales de los plasmodesmos ensachados a las células adyacentes (Lazarowitz y Beachy, 1999; Tzfira et al., 2000; Heinlein, 2002; Heinlein y Epel, 2004). Asimismo, también ha sido demostrado que la MP de TMV interactúa en el plasmodesmo con un receptor del hospedador, una proteína que contiene repeticiones de anquirina (ANK), resultando en una disminución de callosa que facilita el movimiento intercelular (Ueki et al., 2010).
Kawakami et al. (2004) observaron que a través de los plasmodesmos se transfieren unos complejos de estructura similar a los VRCs. Estos complejos unidos a MP que se mueven célula a célula se han llamado complejos de movimiento viral (VMC), pero se desconoce si existen o no diferencias en la composición y estructura de estos respecto de los VRCs (Asurmendi et al., 2004; Kawakami et al., 2004).
El movimiento a larga distancia permite la diseminación de los virus por toda la planta. Este movimiento se lleva a cabo a través del floema en un proceso pasivo, siguiendo el flujo del fotosintato, desde los tejidos fuente a los sumideros (Leisner y Howell, 1993; Leisner y Turgeon, 1993; Roberts et al., 1997; Simon-Buela y Garcia-Arenal, 1999). Este proceso consta de varias etapas: la entrada o “carga” del virus en el floema en los tejidos fuentes, su circulación en el floema y su salida o “descarga” desde el floema hacia los tejidos sumideros. En plantas de N. benthamiana se ha visualizado que TMV
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infecta las venas menores de la hoja moviéndose desde las células del mesófilo hasta el floema abaxial, para penetrar en el floema externo a nivel del tallo y desplazarse por él hasta la raíz. En la raíz, el virus se trasloca al floema interno e inicia el transporte hacia la parte superior de la planta (Cheng et al., 2000); posteriormente se produce la descarga del virus desde las venas menores a las células del mesófilo y se lleva a cabo la invasión del resto de la hoja mediante el movimiento de célula a célula. La CP de TMV es esencial para un movimiento sistémico rápido del virus, y además esta CP debe ser funcional en su habilidad para ensamblarse para formar viriones (Dawson et al., 1988).
1.2 RESISTENCIA NATURAL EN PLANTAS.
Cuando una planta detecta el ataque de un patógeno, se activan rápidamente mecanismos de defensa local y sistémica. En la actualidad se sabe que el sistema inmune de las plantas está constituido por una inmunidad innata que actúa de dos formas fundamentales: la primera denominada PTI (del inglés: PAMP-triggered immunity) la cual está basada en un reconocimiento de PAMP (del inglés: pathogen-associated molecular pattern), mediante receptores que reconocen estos patrones (PRR del inglés: pattern recognition receptors) que se encuentran en la superficie de las células vegetales. Sin embargo, hay patógenos exitosos que producen efectores que inhiben la PTI, los cuales son reconocidos por las plantas mediante receptores adicionales, proteínas NB-LRR (del inglés: nucleotidebinding leucine-rich repeat), desencadenando respuestas efectoras contra los patógenos que constituyen la segunda forma de actuación de la inmunidad innata y se denomina ETI (del inglés: effector- triggered immunity) (Jones y Dangl, 2006; He et al., 2007; Boller y He, 2009).
En las respuestas de defensas de la plantas son desencadenados multitud de mecanismos como pueden ser reforzamiento de la pared celular por
29 deposición de callosa y lignina, producción de enzimas líticas como quitinasas y glucanasas, biosíntesis de hormonas y fitoalexinas, síntesis de PRs, muerte celular programada, etc... Estas reacciones se desarrollan desde unas pocas horas hasta días después de la inducción, desencadenando cambios en el potencial de membrana, en el flujo de iones, en la producción de ROS, en la peroxidación de lípidos, en la fosforilación de proteínas, etc… Todos estos cambios pueden alterar la fisiología celular y generar mensajeros químicos involucrados en la activación de la defensa local y sistémica (Dixon y Lamb, 1990) (Figura 1.5).
Mediante este mecanismo, cuando la defensa es eficiente, el patógeno es restringido al sitio inicial de la infección y no se multiplica (interacción incompatible), sin embargo, cuando la defensa es ineficiente, la planta puede llegar a ser rápidamente infectada (interacción compatible) (Desender et al., 2007).
La mayoría de los estudios tratan de interacciones incompatibles y sólo unos pocos han sido centrados en respuesta de defensa de interacciones compatibles, siendo esta última la que tiene lugar en la interacción PMMoV- N. benthamiana objeto de estudio en este trabajo. La comprensión de la similitudes y diferencias de ambas interacciones no está actualmente muy estudiada, pero sí está claro que existen algunos procesos comunes en ambas. Ha sido demostrado por varios estudios que la capacidad de un patógeno virulento para desarrollar una interacción compatible puede ser debido a un retraso o a una más débil modelo de defensa, más que a un efecto cualitativo en los modelos de defensa (Desender et al., 2007).
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1.2.1 Establecimiento de la reacción hipersensible.
Este mecanismo ha sido ampliamente descrito en plantas, debido a que carecen de un sistema inmune adaptativo, y por tanto han adaptado estrategias para reconocer y eliminar de forma específica ciertos patógenos microbianos, montando una respuesta de defensa localizada conocida como la HR. Se presenta de una forma similar a la muerte celular programada, presentando puntos comunes con el proceso de apoptosis descrito en células animales (rev. en Greenberg y Yao, 2004) consiguiendo una necrosis local y dando lugar a las LLN , la cual restringe severamente la diseminación sistémica del patógeno en el organismo vegetal (Bonas y Van den Ackervaken, 1997; Van den Ackerveken y Bonas, 1997).
Esta HR es acompañado por otros mecanismo de defensa en la planta, entre los que se incluyen estallido oxidativo, acumulación de moléculas señalizadoras, como el SA, y la activación transcripcional de genes que codifican PRs etc. (Parker y Coleman, 1997). Durante su establecimiento, dos grupos de genes son sobreexpresados. El primer grupo corresponde a genes específicos de la inducción de la HR, sobreexpresados sólo en interacciones incompatibles, mientras que el segundo grupo es expresado en niveles similares en interacciones compatibles e incompatibles (Marco et al., 1990; Desender et al., 2007).
Esta respuesta va asociada a un estado de defensa de la planta tanto a nivel local como sistémico. Las zonas de alrededor de las lesiones pasan a ser resistentes a una segunda infección por otros patógenos debido a que se ha producido por un lado, una activación de la resistencia local adquirida (LAR), y por otro lado una resistencia sistémica adquirida (SAR) en tejidos distales. Se ha comprobado en varias ocasiones que estos tipos de resistencias no son específicas para un patógeno concreto, por ejemplo,
31 plantas de tabaco con genotipo NN desarrollan un HR frente a TMV, pero también se produce una resistencia a la infección cuando las plantas son inoculadas posteriormente con TNV, TRSV y TomRSV (rev. en Loebenstein, 2009).
A nivel macroscópico, la HR es el primer síntoma que testifica que la planta ha reaccionado al ataque de un patógeno. Generalmente está asociada a una interacción incompatible, aunque característica microscópica en tejido necrótico de algunas interacciones compatibles son idénticos a una HR (Vleeshouwers et al., 2000).
1.2.2 Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS).
Las ROS son intermediarias de la reducción de oxígeno molecular y se genera tanto por actividades fisiológicas normales como la respiración, como por otras situaciones, tales como la respuesta frente a estrés abiótico y biótico (Rodriguez-Serrano et al., 2006; Torres, 2010). Aunque el O2.- es la forma de ROS más generada, el H2O2 es la forma más estable en la célula.
Sin embargo, otras especies reactivas pueden ser generadas como el oxígeno singlete o el radical hidroxilo (Foyer y Noctor, 2005). Por lo tanto las plantas, para asegurarse de que los niveles de ROS no alcanzan niveles tóxicos, necesitan un balance entre producción y destoxificación que mantengan la homeostasis celular (Noctor y Foyer, 1998; Dutilleul et al., 2003).
La producción de ROS es un fenómeno característico de un exitoso reconocimiento de la infección y por lo tanto de la activación del sistema de defensa en la planta, mediante interacción con otras señales y fitohormonas (Torres, 2010). Generalmente están asociadas a la HR, contribuyendo a la
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muerte celular programada para limitar al patógeno al sitio inicial de la infección (Mur et al., 2008). Pero sin embargo, existen evidencias que sugieren su implicación en mecanismos adicionales a la HR, mediante control redox de factores de transcripción o por interacción con otros componentes como puede ser la cascada de fosforilación (Kovtun et al., 2000; Mou et al., 2003). Aunque la producción inicial de ROS en un proceso de reconocimiento de un patógeno ocurre principalmente en el apoplasto, la producción en el interior celular también funciona como mecanismo de defensa. Por ejemplo, altos niveles de ROS pueden ser producidos cuando existen problemas de desacople o inhibición en los procesos de fotosíntesis o respiración asociados a los cloroplastos, peroxisomas y mitocondrias (Karpinski et al., 2003; Vidal et al., 2007).
La producción de ROS en una reacción de defensa en células de tabaco es desencadenada por un amplio número de moléculas, lo que sugiere que estas reacciones no son específicas de ningún grupo de inductores (Desender et al., 2007). Asimismo, su producción tiene lugar en dos fases:
una temprana, no específica, seguida de una segunda específica y concomitante con el desarrollo de la HR (Baker et al., 1993). Ambos picos, desarrollan un papel central en la iniciación de la muerte celular en interacciones incompatibles (Rusterucci et al., 1996). Sin embargo, en interacciones compatibles, también existe producción de ROS, permaneciendo incluso durante largos periodos de tiempo (Mur et al., 2005).
ROS tienen varias funciones en el desarrollo de la HR, pero desde el punto de vista de la señalización, dos de ellas son consideradas las más importantes. En primer lugar la activación del flujo de iones de calcio que conduce a la muerte celular, y en segundo lugar la activación de MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos). Otra ruta de señalización de
33 ROS es vía mitocondrial, donde juega un papel importante en la defensa frente a virus a través de la inducción de SA (Singh et al., 2004), donde se ha propuesto que la AOX es uno de los factores que influye en esta ruta de defensa (Carr et al., 2010). AOX es la enzima responsable de llevar a cabo la respiración alternativa, resistente al cianuro y activada cuando la cadena de transporte electrónico mitocondrial esta afectada, por la ruta del coenzima Q, donde no ocurre una liberación de energía en forma de ATP (rev. en Goodman et al., 1986)
Sin embargo, en el caso de las infecciones virales en nuestro conocimiento no se han analizado en la acumulación de ROS en estadios tardíos de la infección sino tan sólo asociadas a la HR (Carr et al., 2010).
El NO es una pequeña molécula señal gaseosa con diversas funciones en las plantas. Sin embargo, las RNS abarcan no sólo al radical NO y sus iones nitroxilo (NO-) y nitrosonio (NO+), sino que también al peroxinitrito (ONOO-), S-nitrosotioles, etc.; es decir, a todos los derivados del NO que puedan producir modificaciones (Nathan, 2004). En plantas, existen tres rutas principales de producción de NO: la conversión no enzimática de nitrito a NO en el apoplasto, la formación de NO dependiente de la enzima nitrato reductasa, y por último, la formación de NO dependiente de arginina por una actividad semejante a la NO sintasa. Al igual que ocurre con las ROS, las células vegetales poseen mecanismos de destoxificación del NO para mantener la homeostasis y que no llegue a niveles perjudiciales (Leitner et al., 2009).
NO es una importante molécula señal en la defensa en plantas. Por ejemplo, los niveles relativos de NO y H2O2 parecen regular la muerte celular programada durante la HR (Delledonne et al., 2001) y la expresión de genes de defensa tanto en el punto de la infección como en tejidos dístales,
34
participando en este punto también la inducción de SA (Song y Goodman, 2001). NO puede ejercer algunos de sus efectos bien por la modulación de la señalización basada en nucleótidos cíclicos, o bien por la S-nitrosilación de proteínas dianas (Wendehenne et al., 2004; Hong et al., 2008). NO también puede estimular cambios en la expresión de genes nucleares y señales de defensa a través de la inhibición de la citocromo oxidasa (Huang et al., 2002), conduciendo este proceso a cambios en el redox mitocondrial y a la inducción de genes relacionados con las proteínas de defensa (Maxwell et al., 2002). En definitiva, en la actualidad existe múltiples datos de la producción de NO y su mecanismo de defensa en plantas sin llegar a tener una ruta de señalización clara (Carr et al., 2010), sin embargo en el caso de infecciones virales se han efectuado muy pocos estudios. Actividad relacionada con el NO ha sido detectada en varios tejidos, incluyendo organelas tales como mitocondria, núcleo y peroxisomas, y la mayoría de los estudios se han centrado en bacterias, habiendo muy poca documentación en el caso de virus. Se ha demostrado que esta molécula esta implicado tanto en respuestas a estreses abióticos y bióticos, como en procesos de germinación o senescencia (Baudouin, 2011).
Recientes estudios, han mostrado que en plantas de tomate infectadas con TMV se produce una rápida síntesis de NO y AOX a las 12 h.p.i. en las hojas sistémicas, y que ambos procesos van asociados, de forma que la aplicación de inhibidores de la ruta del citocromo y de donadores de NO en las hojas superiores conlleva a una fuerte acumulación de transcritos de AOX, una reducción de la acumulación de RNA viral y un incremento del photochemical quantum yield del fotosistema II, y el pretratamiento con inhibidores de NO anularon casi completamente la inducción de AOX e incrementaron la susceptibilidad a la infección. El tratamiento con SHAM (acído salicilhidroxámico) un inhibidor de AOX redujo la respiración
35 inducida por DEA/NO y parcialmente inhibió la resistencia inducida a TMV, y estos inhibidores tuvieron muy poco efecto en la generación de NO, sugiriendo que la generación de NO inducida por TMV actúa antes y facilita la inducción de AOX, que a su vez induce el transporte electrónico mitocondrial alternativo y desencadena la defensa basal contra los virus (Fu et al., 2010).
De igual forma Sarkar et al. (2010) mostraron que en plantas de Hibiscus cannabinus infectadas por un begomovirus se produce elevadas cantidades de NO y ROS en estadios iniciales de la infección, no solamente en las hojas infectadas sino también en la raiz y en brotes. Asimismo, han confirmado la existencia de nitración de Tyr en proteínas, lo que demuestra que el NO no sólo se produce durante la infección viral sino que produce un estrés nitrosativo, y lo detectan especialmente en el colénquima del tallo incluyendo la túnica y en la región cambial también en estadios tardíos de la infección. Sin embargo, no aportan datos sobre su presencia en hojas en estos estadios, ni lo detectan en las plantas control.
Por otro lado, las funciones de ROS se han relacionado con las de NO, aunque una regulación disminuida de la producción de ROS y NO no confiere efectos sinérgicos en las resistencia frente a diferentes hongos patógenos, indicando que los requerimiento de ROS y NO son diferentes en función de cada patógeno (Asai et al., 2002).
1.2.3 Síntesis de las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR).
Las PRs son un grupo heterogéneo de proteínas inducidas en plantas por la infección de un patógeno. El término “proteína relacionadas con la patogénesis” es referido para indicar que las actividades enzimáticas llevadas a cabo por estas proteínas no son detectadas normalmente en tejidos sanos,
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atribuyéndose su inducción a la infección de uno o más patógenos (van Loon et al., 2006).
Las PRs pueden ser reguladas por ácido JA, etileno, o SA (rev. en van Loon et al., 2006) a través de la ruta dependiente de NPR-1 o de otras rutas. Estas PRs son comúnmente detectadas en interacciones incompatibles pero también se pueden detectar en interacciones compatibles, si bien lo que varía es el tiempo de aparición que en el caso de las interacciones incompatibles es anterior y la intensidad, que es mayor también en las interacciones incompatibles (Whitham et al., 2003; Pruss et al., 2004; Shams- Bakhsh et al., 2007).
La activación de estas PRs y otros mecanismos de defensa también pueden ser activados durante los procesos de senescencia, aunque el tiempo y el nivel de expresión puede variar de un proceso a otro (Obregón et al., 2001).
Las PRs de tabaco inducidas durante la HR frente a TMV fueron agrupadas en cinco familias, pero trabajos posteriores con otras especies y otros patógenos ha conducido a la descripción de 17 familias diferentes. La mayoría de ellas tienen actividad conocida, por ejemplo, PR-2 es una β-1,3- glucanasa; PR-3,-4,-8 y -11 son diferentes tipos de quitinasas; PR-5 es una proteína semejante a taumatina; PR-6 es un inhibidor de proteinasa; PR-7 es una endoproteinasa; PR-9 es una peroxidasa; PR-10 es una ribonucleasa;
PR-12 es una defensina; PR-13 es una tionina; PR-14 es una proteína transferente de lípidos y PR-15 y 16 son oxalato oxidasas y PR-4 tiene actividad RNasa y DNasa (rev. en van Loon et al., 2006).
Como podemos ver algunas proteínas PRs tienen claramente una actividad antifúngica y antibacteriana (Bowles, 1990). Sin embargo, aún no está muy claro una actividad unida a la inhibición de la infección viral, a pesar de ser
37 encontradas en numerosas interacciones planta-virus (Carr et al., 2010;
Guevara-Morato et al., 2010).
1.2.4 Compuestos claves en la ruta de defensa: etileno, SA, JA, y ABA.
La resistencia establecida en la planta completa es llevada a cabo por señales sistémicas mediadas por hormonas de plantas. Se ha descrito que en los sistemas vegetales existen tres principales fitohormonas responsables de las respuestas de defensa frente a patógenos o estrés abiótico: SA, JA y ET (rev. en Robert-Seilaniantz et al., 2011). Clásicamente, el SA desencadena resistencia frente a patógenos biotróficos o hemibiotróficos, y sin embargo, la combinación de JA y ET desencadena la resistencia frente a patógenos necrotróficos (Glazebrook, 2005). Estas dos rutas son mayormente antagonistas: una elevada resistencia en patógenos biotróficos a menudo correlaciona con un incremento a la susceptibilidad necrotrófica, ocurriendo lo mismo en sentido inverso para patógenos necrotróficos (rev. en Robert- Seilaniantz et al., 2011).
El etileno además de ser una de las fitohormonas responsables de los procesos de estrés en las plantas, participa en procesos como la maduración de los frutos, la senescencia de las hojas y las flores y la abscisión del fruto.
La alteración en las condiciones normales del desarrollo, bien por agentes químicos (metales pesados, lluvia ácida, ozono), físicos (heridas, deficiencia hídrica, encharcamiento, radiaciones, altas o bajas temperaturas) o biológicos (insectos, hongos, bacterias o virus) ocasionan en la mayoría de los casos, un incremento en la producción de etileno, que puede actuar como una señal común controlando las diferentes respuestas de las plantas frente a dichas situaciones (rev. en Azcón-Bieto y Talón, 2001).
