Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en una red de distribución de agua potable

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(1)Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Carlos Andrés Zambrano Ovalle. Universidad de los Andes Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Bogotá D.C., Colombia Junio de 2012.

(2) Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) en una red de distribución de agua potable.. Carlos Andrés Zambrano Ovalle.. Proyecto de grado presentado para optar al título de Ingeniero Ambiental. Asesora del Proyecto Liliana Reyes Valderrama, Microbióloga M.Sc. Dirección Universitaria. Universidad de los Andes M.Sc. Evaluación en Educación. Universidad Santo Tomás de Aquino. Co-Asesor del Proyecto Manuel S. Rodríguez Susa, Ingeniero Químico M.Sc. Ingeniería Civil Universidad de los Andes PhD. Génie des Procédés Institut National Des Sciences Appliquées.

(3) Universidad de los Andes Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Bogotá D.C., Colombia Junio de 2012. Agradecimientos. A mis padres por su apoyo incondicional en todos y cada uno de los momentos de mi existencia, a los profesores del Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental de la Universidad de los Andes por su dedicación y compromiso con la educación del país, específicamente agradezco a los asesores de este proyecto de grado, a las personas que trabajan en el Centro de Investigaciones de Ingeniería Ambiental CIIA y a las personas del laboratorio de microscopía electrónica de la Universidad de los Andes por sus recomendaciones y sugerencias para que este trabajo fuese terminado satisfactoriamente. A María Fernanda Díaz por proporcionar las biopelículas utilizadas en este estudio y sus análisis microbiológicos previos..

(4) Tabla de contenido 1. Introducción .............................................................................................................. 1 2. Objetivos ................................................................................................................... 3 2.1. Objetivo General ................................................................................................ 3 2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 3 3. Marco teórico ............................................................................................................ 4 3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) ......................................................... 4 3.1.1. Historia ........................................................................................................................ 4 3.1.2. Fundamento ................................................................................................................ 7 3.1.3. Ventajas y limitaciones del MEB ................................................................................. 8 3.1.4. MEB en biopelículas ................................................................................................... 9 3.2. Analizador EDS ................................................................................................ 14 3.2.1. Análisis EDS en biopelículas ...................................................................................... 15 3.3. Biopelículas ...................................................................................................... 16 3.3.1. Definición de biopelícula ........................................................................................... 16 3.3.2. Formación de biopelículas en tuberías de distribución de agua potable ................. 16 3.3.3. Materiales de la tubería influyentes en la formación de biopelículas ...................... 19 3.3.4. Composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable.................... 21 4. Metodología ............................................................................................................ 28 4.1. Toma de muestras ........................................................................................... 28 4.1.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 28 4.1.2. Bogotá (Cundinamarca)............................................................................................. 30 4.1.3. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 31 4.2. Ensayos preliminares ....................................................................................... 32 4.2.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A ..................................... 32 4.2.2 Tinciones de Gram y láminas en fresco ...................................................................... 33 4.3. Preparación de las muestras para análisis MEB y EDS .................................... 34 4.3.1. Muestras de biopelícula ............................................................................................ 34 4.4. Microscopia electrónica de barrido y EDS ........................................................ 39 5. Resultados y análisis .............................................................................................. 43 5.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A.............................. 43.

(5) 5.1.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 43 5.1.2. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 44 5.1.3. Bogotá D.C. (Cundinamarca) ..................................................................................... 44 5.2. Laminas en fresco y tinciones de Gram de biopelículas ................................... 46 5.2.1. Tinciones de Gram..................................................................................................... 46 5.2.2. Láminas en fresco ...................................................................................................... 49 5.3 Imágenes de microscopia electrónica de barrido (MEB) en biopelículas ........... 52 5.3.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 53 5.3.2. Bogotá D.C. (Cundinamarca) ..................................................................................... 55 5.3.3. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 57 5.4. Análisis composicional EDS ............................................................................. 59 5.4.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 59 5.4.2. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 66 5.4.3. Bogotá (Cundinamarca)............................................................................................. 72 6. Conclusiones y Recomendaciones ......................................................................... 75 6.1. Conclusiones .................................................................................................... 75 6.2. Recomendaciones............................................................................................ 76 7. Referencias Bibliográficas....................................................................................... 76.

(6) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 1. Introducción. Los sistemas de distribución de agua potable tienen como objetivo transportar agua bebible a los consumidores, la cual ha sido tratada mediante procesos físicos y químicos en una planta de potabilización de agua. Este proceso permite que el agua tenga unas características físicas, químicas y biológicas que cumplan con condiciones mínimas de calidad para su consumo. Sin embargo, ésta es susceptible a contaminación microbiana en el proceso de transmisión y distribución. Los microorganismos presentes en el sistema de distribución son nutricionalmente deficientes (es decir que requieren nutrientes para su crecimiento) y pueden tomar ventaja de una gran variedad de sustratos para formar biopelículas oligotróficas que ponen en peligro la limpieza del agua potable y por lo tanto de los consumidores. (Yimei, Yan-wei, & Hui-na, 2010). Una biopelícula se define como una comunidad microbiana que crece adherida a un sustrato o a una interface, y que se encuentra embebida en una matriz de polímeros extracelulares que las bacterias producen. (Donlan & Costerton, 2002). Estos microorganismos se ven afectados principalmente por la temperatura, la disponibilidad de nutrientes, los materiales de la tubería, la presión hidráulica y el desinfectante. (Yimei, Yan-wei, & Hui-na, 2010). En diferentes investigaciones se ha encontrado que las biopelículas pueden causar problemas en la red de distribución de agua potable, tales como: corrosión en las tuberías, cambios en la presión de la red, obstrucción de los filtros de purificación de agua y el transporte de microorganismos patógenos que pueden ser perjudiciales para la salud humana (Vargas & Saldarriaga, 2005). Por esta razón las biopelículas en tuberías de agua potable han sido objeto de estudio a lo largo de los últimos años. El presente trabajo pretende estudiar biopelículas en redes de distribución de agua potable de distintos materiales, mediante microscopia electrónica de barrido y microanálisis químico por espectroscopia de energía dispersiva, además de métodos microbiológicos tradicionales, con el fin de encontrar y diferenciar morfotipos. 1.

(7) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. microbianos y la composición química de la biopelícula adherida a la tubería de la red de distribución de agua potable. Para ello, se tomaron 8 muestras de diferentes biopelículas de los municipios de Sogamoso (Boyacá), Duitama (Boyacá) y Bogotá D.C. (Cundinamarca) que fueron utilizadas para su visualización y análisis EDS en el microscopio electrónico de la Universidad de los Andes.. 2.

(8) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 2. Objetivos. 2.1. Objetivo General . Estudiar mediante la técnica de microscopía electrónica de barrido y análisis de EDS, biopelículas de diferentes redes de distribución de agua potable, con el fin de detectar morfotipos microbianos presentes, además de su composición química.. 2.2. Objetivos Específicos . Realizar una revisión de la literatura referente a biopelículas presentes en los sistemas de distribución de agua potable incluyendo la aplicabilidad de la técnica de microscopia electrónica para su estudio.. . Aplicar la metodología de microscopia electrónica de barrido de muestras biológicas en biopelículas de agua potable.. . Realizar análisis composicionales de biopelículas de agua potable mediante espectroscopia de energía dispersiva.. 3.

(9) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3. Marco teórico. 3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB). 3.1.1. Historia. El microscopio electrónico de barrido fue introducido por Ernst Ruska en 1931, y de inmediato se constituyó en una herramienta fundamental en el trabajo científico, por lo que actualmente es utilizado en múltiples investigaciones alrededor del mundo. Sin embargo, transcurrieron dos décadas antes de lograr avances significativos en la obtención de preparaciones adecuadas, y de poder observar las primeras imágenes de ultraestructura celular. Hacia 1960 se había avanzado en la tecnología y en el procesamiento de los órganos y tejidos para su observación por microscopia electrónica de transmisión, superando grandes dificultades en los métodos de preservación, infiltración, corte y coloración de los tejidos, e iniciándose entonces una etapa de estudio de su ultraestructura. En los siguientes 15 años se desarrolló una gran actividad en laboratorios y centros de investigación, especialmente en Estados Unidos y Europa, aportando conocimientos valiosos sobre la organización celular y subcelular, así como la complejidad y participación en los procesos celulares de los organelos. En esta etapa descriptiva de la microscopía electrónica se generaron las bases de la biología celular. Su aplicabilidad se extendió a todas las áreas de la biomedicina y los resultados de esta profusa actividad fueron acogidos en diferentes revistas, al tiempo que surgieron nuevas publicaciones periódicas que se consolidaron como revistas especializadas en microscopía electrónica. Paralelamente, se continuó con el estudio de los factores físicos y químicos implicados en el procesamiento de los materiales biológicos, tendiente a dilucidar el efecto sobre éstos. Si bien la utilización de la microscopía electrónica ha sido asimilada por algunos al concepto de técnica, un seguimiento de las fuentes primarias sobre su desarrollo y aplicaciones en biología, la revelan como una ciencia y no como una simple técnica. La búsqueda de métodos confiables en la 4.

(10) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. preservación de los materiales biológicos hasta su observación al microscopio electrónico, ha significado el estudio minucioso del efecto de esos factores sobre las macromoléculas biológicas. Su utilización en todas las áreas del conocimiento ha derivado en un enorme conocimiento del funcionamiento de las células. Bozzola y Russell (1999) definen la microscopía electrónica como “un campo especializado de la ciencia que emplea el microscopio electrónico como herramienta”. La combinación de la microscopía electrónica con otros métodos (de autorradiografía, bioquímicos, inmunocitoquímicos, congelación – fractura, microscopía cuantitativa, entre otros) en especial desde la década de 1970, con la introducción del método de oro coloidal por Faulk y Taylor, abrió posibilidades insospechadas de interpretación y análisis de la función celular, enriquecida con el conocimiento sobre las macromoléculas, su génesis y tránsito por los distintos compartimientos celulares, dando paso a la biología molecular. (Romero, 2003) Fechas importantes en el desarrollo de la microscopía electrónica de barrido.. . 1931: Knoll y Ruska construyen el primer microscopio electrónico de barrido.. . 1939: Siemens en Alemania construye el primer microscopio electrónico comercial.. . 1939-1943: Investigadores de diferentes países realizan sin éxito esfuerzos para lograr la obtención de secciones menores de 1 µ.. . 1945: Porter, Claude y Fullman observan por primera vez al microscopio electrónico células en cultivo fijadas en tetróxido de osmio.. . 1946: Claude y Fullman logran las primeras electromicrografías.. . 1948: Pease y Beaker obtienen por primera vez secciones de tejido de 0.1-0.2 µ de espesor.. . 1949: Newman y colaboradores introducen el butil metacrilato como medio de imbibición.. . 1950: Gettner y Hillier demuestran la ventaja de hacer flotar las secciones en agua, idea desarrollada previamente por Claude en 1948.. 5.

(11) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. . 1949-1958: Durante este periodo se identificaron las limitaciones del metacrilato como medio de imbibición.. . 1950: Latta y Hartman introducen las cuchillas de vidrio.. . 1952: Palade, Porte y Sjöstrand desarrollan métodos de fijación y corte ultrafino, y realizan la primera observación de estructuras intracelulares al microscopio electrónico.. . 1953: Fernández Moran demuestra que los diamantes recientemente fracturados tienen un borde excepcional para el seccionamiento ultradelgado.. . 1953: Porte y Blum introducen el primer ultramicrótomo comercial (Sorvall MT2).. . 1956: Maale y Birch Andersen en su trabajo con resinas epoxi revelan las limitaciones del metacrilato.. . 1956: Glauert introduce la resina epoxi Araldita, posteriormente mejorada por Glauert en 1958.. . 1957: Brenner y Home introducen el método de “coloración negativa”.. . 1958: Watson introduce los colorantes electrónicos.. . 1960-1961: Fink y Luft exploran el uso de Epon.. . 1959: Singer utiliza anticuerpos marcados con ferritina para localización ultraestructural.. . 1963: Sabatini y colaboradores introducen aldehídos como fijadores primarios.. . 1971: Faulk y Taylor desarrollan el método de inmunolocalización con oro coloidal.1. 1. (Romero, 2003). 6.

(12) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3.1.2. Fundamento. La microscopía electrónica de barrido (MEB) es una técnica de análisis superficial, que consiste en enfocar sobre una muestra electrodensa (opaca a los electrones) un fino haz de electrones acelerado con energías de excitación desde 0.1kV hasta 50kV. El haz de electrones se desplaza sobre la superficie de la muestra realizando un barrido que obedece a una trayectoria de líneas paralelas. La variación morfológica de la. muestra. entrega. diversas. señales. (electrones. secundarios,. electrones. retrodispersados, emisión de rayos X, etc.) que son recogidas por distintos detectores; los cuales permiten la observación, caracterización y microanálisis superficial de materiales tanto orgánicos como inorgánicos (Langebaek & Gutierrez, 2012). La técnica de microscopía electrónica de barrido (MEB) es novedosa en caracterización de biopelículas en una red de distribución de agua potable. Esta técnica permite hacer una caracterización morfológica, topográfica y composicional de la biopelícula de la red de agua potable. Además, usando MEB es posible observar microorganismos que por métodos tradicionales de cultivo no serían detectados. Para esto el MEB utiliza un haz de electrones que es emitido desde un cañón termoiónico o un “Field Emission Gun” (FEG). Al cañón se le aplica un potencial eléctrico que acelera el haz de electrones hacia la columna, siendo éste focalizado por medio de lentes electromagnéticas sobre la muestra (toda la trayectoria de los electrones debe estar en vacío, de lo contrario, los electrones colisionarían con las moléculas de aire y serán absorbidos). Los electrones chocan e interactúan con la muestra produciendo varias señales que podrán ser recogidas de acuerdo a los detectores presentes. La amplificación de la imagen se produce por un conjunto de lentes electromagnéticas que mediante un tratamiento adecuado de las señales electrónicas son proyectadas en un tubo de rayos catódicos (CRT) (Langebaek & Gutierrez, 2012). Usando la interacción de los electrones con la superficie y la muestra, y los fenómenos que se producen, la MEB suministra la información necesaria para una mejor. 7.

(13) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. caracterización de la biopelícula. Esta técnica permite capturar el detalle de la biopelícula con ampliaciones hasta de 300.000X e imágenes de alta resolución, hasta los 3nm, y con apariencia tridimensional (Langebaek & Gutierrez, 2012). El MEB está compuesto por tres detectores que se clasifican en imágenes de electrones secundarios, imágenes de electrones de retrodispersión y analizador EDS de rayos X, los cuales están instalados dentro de la cámara de vacío. La muestra se coloca en el portamuestras de la cámara de vacío del microscopio, en donde es escaneada, convirtiendo las señales eléctricas en una imagen tridimensional que se observa en el monitor de las computadoras (Adabache, Silva, & Galvan). 3.1.3. Ventajas y limitaciones del MEB. Ventajas del MEB (Langebaek & Gutierrez, 2012): . Gran profundidad de campo, que le da apariencia tridimensional a las imágenes permitiendo enfocar y observar amplias zonas de la muestra al mismo tiempo.. . Imágenes de alta resolución (de hasta 3 nm). Detalles muy cercanos en la muestra pueden ser observados separadamente a alta magnificación.. . Preparación relativamente sencilla de las muestras.. . Observación de muestras de tamaños desde centímetros hasta muestras del orden de nanómetros.. Limitaciones del MEB (Langebaek & Gutierrez, 2012): . Las muestras deben ser conductoras.. . Las muestras deben estar libres de humedad.. . No es posible observar la estructura interna y detalles ultraestructurales de las muestras (para esto se requiere un Microscopio Electrónico de Transmisión MET).. 8.

(14) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3.1.4. MEB en biopelículas. Debido a la gran versatilidad de muestras que pueden analizarse mediante la técnica de microscopia electrónica de barrido ha sido posible estudiar biopelículas. Estudios recientes muestran imágenes de biopelículas adheridas a tuberías de agua potable y han permitido estudiar una gran cantidad de variables. Entre éstas últimas se encuentran la corrosión de las tuberías, los efectos de los desinfectantes usados en la red de distribución de agua potable, la diversidad microbiológica presente y fenómenos de colonización. Así por ejemplo, el estudio realizado por Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012 consistió en el estudio de biopelículas con diversas técnicas, entre ellas microscopía electrónica de barrido para evaluar el efecto de los desinfectantes en la corrosión de tuberías.. 9.

(15) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 3.1.4.A. Imágenes de biopelículas en redes de distribución de agua potable mediante MEB evaluando desinfectantes.. 2. La Figura 3.1.4.A., muestra el resultado del análisis mediante MEB donde se encontraron principalmente bacterias de los phyla Proteobacteria, Bacteroidetes y bacterias no cultivables. El estudio de Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009, consistió en hacer crecer biopelículas en un montaje de distribución de agua potable e identificar las bacterias presentes.. Figura 3.1.4.B. Imágenes de biopelículas mediante MEB en identificación de bacterias.. 3. La Figura 3.1.4.B., muestra las imágenes obtenidas mediante MEB. Los géneros bacterianos identificados en este estudio incluyen: Pseudomonas, Chryseobacterium, Stenotrophomonas, Vibrio, Chromobacterium, Stomatococcus y Burkholderia. Estos resultados muestran que muchos de los géneros identificados son patógenos potenciales, lo cual indica que podría existir riesgo bacteriano en los sistemas de distribución de agua potable. Un estudio de análisis de biopelículas mediante MEB realizado por Pei-Ying, Chiachi, Fangqiong, Gary L., Mark W., & Wen-Tso en 2010, mostró la caracterización de comunidades bacterianas en biopelículas en un caso de estudio en Estados Unidos. La Figura 3.1.4.C., muestra los resultados de las bacterias encontradas. Mediante análisis posteriores de secuenciación se identificaron principalmente los siguientes. 2 3. (Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012) (Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009). 10.

(16) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. phyla de bacterias: Firmicutes, Deinococcus-Thermus, Bacteroidetes, Actinobacteria, y Proteobacteria.. Figura 3.1.4.C. Imágenes de biopelículas obtenidas por MEB. A) Matriz extracelular de la biopelícula. B) 4. Bacterias en la tubería .. Otros estudios como el presentado por Yi-mei, Yan-wei, & Hui-na en 2010, confirman la necesidad de complementar el análisis de microscopia electrónica de barrido con técnicas microbiológicas tradicionales, además de estudios moleculares, para poder identificar los microorganismos presentes en la biopelícula. Esto ocurre por la dificultad de visualizar morfotipos en este tipo de muestras y a que la matriz de polímeros extracelulares que las bacterias producen para su estabilización impide observar claramente sus comunidades. La Figura 3.1.4.D. muestra una imagen de biopelículas en tuberías de polietileno donde los autores del estudio cultivaron en cajas de Petri para poder ampliar la información. de. la. imagen,. donde. no. pueden. observarse. claramente. los. microorganismos presentes. Se observan precipitados y los materiales constituyentes de la matriz de exopolímeros que producen las bacterias.. 4. (Pei-Ying, Chiachi, Fangqiong, Gary L., Mark W., & Wen-Tso, 2010). 11.

(17) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 5. Figura 3.1.4.D. Biopelícula en tubería de Polietileno.. Para una mejor visualización de los microorganismos, Yu, Kim, & Lee en 2010 tomaron muestras de biopelícula de distintos materiales de tubería e incubaron los microorganismos comparando las imágenes de MEB obtenidas antes y después de dicha incubación.. 5. (Yi-mei, Yan-wei, & Hui-na, 2010). 12.

(18) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 3.1.4.E. Imágenes de biopelícula en distintos materiales de tubería realizando comparación en 6. incubaciones.. En la Figura 3.1.4.E., se observa cómo puede potenciarse la visualización de microorganismos mediante la técnica de MEB por incubación de las muestras. Antes de la incubación no pueden apreciarse los microorganismos en la biopelícula, debido principalmente a la baja diversidad, pero después de una incubación de 90 días la diversidad aumenta y la visualización de las imágenes mejora sustancialmente. Posteriores análisis moleculares permitieron identificar los phyla: Proteobacteria, Bacteroidetes y Actinobacteria.. 6. (Yu, Kim, & Lee, 2010). 13.

(19) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3.2. Analizador EDS. El analizador EDS es una herramienta muy útil porque además de la visualización de las imágenes en la biopelícula, permite conocer su composición química y obtener información sobre posibles cambios generados por microorganismos presentes en ella. El funcionamiento del analizador EDS consiste en identificar la distribución cuantitativa y cualitativa de elementos químicos que se encuentran presentes en la muestra, mostrando gráficas e imágenes relacionadas con esa distribución. El analizador EDS de rayos X identifica y evalúa el contenido de elementos químicos desde el carbono al uranio, en superficies planas o secciones finas de las muestras en todo tipo de material biológico e inerte (Adabache, Silva, & Galvan). En el analizador EDS de rayos X del MEB se realizan diversos análisis representados con histogramas e imágenes de distribución de los elementos químicos presentes en la muestra. La formación de un espectro EDS de rayos X se obtiene mediante un software (INCA) que recoge durante un determinado tiempo (minutos) los fotones emitidos por la muestra, clasificándolos según su energía. El espectro se presenta como un histograma en donde el eje de las X tiene unidades de energía (Kiloelectrovolts) y el eje de las Y el número de cuentas o intensidad. En el espectro se realiza de forma automática la identificación, el análisis cualitativo y cuantitativo de los diferentes elementos a través de picos en la campana de Gauss observados en el histograma. Una vez obtenido el espectro, se identifican los elementos en los picos de un histograma espectral de un punto elegido de la muestra. El gran poder de resolución (3 nm) y la profundidad de campo (1000 nm) permiten la aplicación del microscopio electrónico de barrido en diversas disciplinas del ámbito científico (ciencias biológicas, médicas, geológicas, metalúrgicas, biotecnología y ciencia de los materiales) (Adabache, Silva, & Galvan).. 14.

(20) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3.2.1. Análisis EDS en biopelículas. El análisis mediante EDS se realiza en conjunto de la técnica MEB como un complemento de información que se puede obtener en muestras biológicas. Estudios de composición química se han realizado en redes de distribución de agua potable con el fin de cuantificar la corrosión de las tuberías en el sistema, debido a la acción del desinfectante y a la acción metabólica de las biopelículas. Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012 encontraron en su estudio, que principalmente las biopelículas en tuberías de hierro contenían elementos químicos como: carbono, oxígeno y fósforo (inherentes al metabolismo de las biopelículas) y calcio y hierro (sedimentos producto de procesos corrosivos). (Ver Tabla 3.2.1.). Tabla 3.2.1. Composición química de biopelículas mediante SEM/EDS en comparación con la aplicación del 7. desinfectante.. 7. (Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012). 15.

(21) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 3.3. Biopelículas. 3.3.1. Definición de biopelícula. Las biopelículas son agrupaciones de microorganismos que se forman y persisten en los límites de fase de un sustrato, causadas por el crecimiento heterogéneo de bacterias, hongos, algas y otros organismos superiores (Wang, Xu, Sun, & Kong, 2010). Este tipo de asociaciones puede presentarse en cualquier lugar en el que una superficie esté en contacto permanente con el agua. En el caso específico de las tuberías de agua potable, la formación y estabilidad de las biopelículas depende de la interacción entre la calidad del agua, tipo de material de la red, condiciones hidráulicas y operativas. Dentro del sistema de distribución, las áreas de corrosión y el flujo lento proporcionan los sitios más atractivos para el desarrollo de estos agregados. De igual manera, los reservorios y las paredes laterales de tubos verticales son sitios atrayentes (Rodriguez, Lemus, & Moreno, 2011). Las biopelículas se adhieren a algún tipo de superficie, formando una película gracias a la excreción de exopolímeros o sustancias poliméricas extracelulares (EPS). La película formada por los EPS les confiere propiedades a los conglomerados celulares, como la obtención de nutrientes de la tubería y del agua, además de resistencia a los desinfectantes (Diaz, 2011).. 3.3.2. Formación de biopelículas en tuberías de distribución de agua potable. El proceso de formación de biopelículas en tuberías de agua potable puede observarse en la Figura 3.3.2.A. En un principio, con el paso del agua por la tubería se da lugar a la formación de una capa de depósitos orgánicos e inorgánicos en la superficie causados por partículas y sedimentos, los cuales sirve de nutrientes para las bacterias. Posteriormente, la adhesión de los primeros microorganismos colonizadores ocurre en las paredes de la tubería, donde la velocidad del flujo del agua tiende a cero, debido a la subcapa laminar viscosa. Allí son adsorbidos por la tubería, quedándose 16.

(22) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. algunas veces ahí por tiempo ilimitado y en otros casos saliendo al flujo normal de agua; este proceso recibe el nombre de adsorción reversible (Vargas & Saldarriaga, 2005).. Figura 3.3.2.A. Etapas de formación de biopelículas.. 8. Esta primera etapa está gobernada por la atracción electrostática y por las fuerzas físicas. Las reacciones químicas aún no tienen efecto en el desarrollo de la biopelícula. En este momento aparecen las primeras microcolonias como puede observarse en la imagen Figura 3.3.2.A. Según Vargas & Saldarriaga, 2005, las bacterias de las biopelículas secretan una serie de sustancias poliméricas que la sostienen y evitan que ésta se disuelva, la mantienen unida entre sí y la adhieren a la pared de la tubería dándole estabilidad mecánica. La. 8. (Vargas & Saldarriaga, 2005). 17.

(23) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. estructura química de estas sustancias depende del tipo de microorganismo que las secrete y de las condiciones ambientales en las que sean producidas. El material polimérico, está formado por polisacáridos con carga eléctrica neutra, que no sólo facilitan la unión de las bacterias con la pared de la tubería, sino que adicionalmente actúan como un sistema de intercambio iónico en el que se atrapan nutrientes del agua que pasa por la superficie. Por otro lado, se ha podido establecer en diversos estudios que el limo mitiga los efectos de los antibióticos y desinfectantes que se encuentran en la columna de agua, actuando como protección para los microorganismos. La matriz de limo no sólo sirve para atrapar moléculas de nutrientes, sino que atrae diferentes tipos de células microbianas. Estas nuevas integrantes de la población están encargadas de metabolizar los residuos de las colonizadoras primarias. Se crea así sucesivamente una cadena de microorganismos que se relacionan en una comunidad (Donoso & Saldarriaga, 2009).. Figura 3.3.2.B. Biopelícula madura en tuberías de agua potable.. 9. Finalmente una biopelícula madura se forma (ver Figura 3.3.2.B.), ésta consiste en una comunidad compleja, metabólicamente cooperativa, formada por diversas especies que viven en un micronicho. Las microcolonias se relacionan de diferentes formas estableciendo una gran estructura que cubre la mayoría del sustrato, la cual es. 9. (Donoso & Saldarriaga, 2009). 18.

(24) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. atravesada por una serie de canales por los cuales pasan agua, residuos bacteriales, nutrientes, enzimas y oxígeno. Adicionalmente, la biopelícula posee componentes tanto orgánicos como inorgánicos que obtiene de fuentes externas. Las partículas inorgánicas pueden ser el resultado de la absorción de minerales, la sedimentación y la precipitación de sales o productos de la corrosión (Vargas & Saldarriaga, 2005).. 3.3.3. Materiales de la tubería influyentes en la formación de biopelículas. Entre los factores que en mayor medida afectan la aparición y formación de biopelículas en redes de distribución de agua potable, el material de la tubería es uno de los aspectos a tener en cuenta debido a que dependiendo del tipo de material del cual este constituida la red los microorganismos en la biopelícula pueden obtener sus nutrientes. Existen estudios que comprueban diferencias en la composición de biopelículas para distintos materiales de tubería, según Rogers, Dowsett, Dennos, Lee, & Keevil, 1994 en un estudio donde se evaluó la formación de biopelículas para diferentes tipos de materiales. Las bacterias pioneras, que son las encargadas de la colonización, fueron diferentes en cada caso por lo que las biopelículas fueron diferentes en diversidad, abundancia y morfología. Los principales materiales en la fabricación de tuberías se muestran a continuación: Metales:. Hierro: Se ha demostrado que las tuberías de hierro estimulan el crecimiento de biopelículas. Factores como la corrosión, la formación de tubérculos y de huecos, ayudan a crear una atmósfera favorable para el crecimiento de las biopelículas, especialmente en aguas pobres de nutrientes. El hierro también interfiere en la acción del cloro haciendo aún más favorable el ambiente para los microorganismos. Por otro lado, se ha observado un crecimiento más rápido y una mayor densidad en las biopelículas que se forman en este material (Vargas Gamarra, 2004).. 19.

(25) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Comparando las tuberías de hierro con las de PVC se ha encontrado que en las primeras, el número de bacterias, la velocidad de formación y la diversidad de las biopelículas es mucho mayor en todos los casos (EPA, 1992). Cementos:. En diferentes estudios se ha comprobado que los materiales de cemento tienen menor capacidad de albergar biopelículas que los materiales metálicos (Vargas Gamarra, 2004). Concreto: Durante varios años se han relacionado los microorganismos con el deterioro del concreto. Se cree que es un proceso complejo en el que se ven involucrados diferentes tipos de microorganismos tales como las bacterias reductoras de azufre (Vargas Gamarra, 2004). Materiales plásticos:. (PVCu, PVCc, MDPE): Se han hecho algunas comparaciones en las que se han encontrado que la cantidad de biopelícula que se forma en estos nuevos materiales es considerablemente menor que la que se forma, por ejemplo, en tuberías de hierro. En el estudio realizado por Rogers, Dowsett, Dennos, Lee, & Keevil, 1994, se encontró un número reducido de colonizadores de crecimiento rápido, pero una gran cantidad de colonizadores de crecimiento lento. Así, la biopelícula que se forma es de crecimiento lento, pero de una gran diversidad y una gran densidad. Se ha planteado que los plastificantes y demás componentes del material, pueden llegar a ser directamente utilizados por algunas comunidades de microorganismos, creando una relación directa entre el material y la biopelícula (Vargas Gamarra, 2004). Los materiales plásticos son capaces de proveer ciertos nutrientes a los microorganismos; sin embargo, se cree que es más relevante la contribución de nutrientes debido al flujo del agua. Por otro lado, se ha encontrado que en la superficie de estos materiales pueden existir ciertos huecos e imperfectos causados en el. 20.

(26) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. proceso de manufactura, los cuales se convierten en los principales nichos y los lugares que son colonizados en primer lugar por los microorganismos. Este fenómeno colabora con la formación de las biopelículas en los materiales plásticos, ya que estos lugares protegen a los microorganismos de las fuerzas cortantes, porque actúan como barreras protectoras permitiendo el libre desarrollo de los colonizadores (Donoso & Saldarriaga, 2009).. 3.3.4. Composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable. La composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable es muy diversa, entre los microorganismos más comunes se encuentran: diatomeas, algas, bacterias heterotróficas, coliformes, bacterias oportunistas, arqueobacterias y hongos. Dicha composición varía en biopelículas y aún no se conocen todos los tipos de microorganismos que existen en las tuberías, ni la distribución de los mismos por varias razones entre ellas se incluyen la imposibilidad de recuperación de muchos microorganismos (Diaz, 2011). Salud humana. Los microorganismos que comprometen la salud humana han captado la mayor atención e interés en investigación, ya que bacterias patógenas responsables de enfermedades gastrointestinales han sido identificadas en biopelículas de tuberías de distribución de agua potable. La disentería, gastroenteritis y fiebre tifoidea son producidas por las siguientes especies que se han encontrado presentes en los sistemas de distribución de agua potable: Shigella spp, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Salmonella spp, Escherichia coli y Helicobacter pylori. Esto implica un riesgo importante para los consumidores que debe minimizarse. Los organismos predominantes en las biopelículas de redes de distribución de agua potable son en su mayoría patógenos potenciales de los géneros Pseudomonas y Flavobacterium. También pueden estar presentes otros organismos patógenos como. 21.

(27) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. es el caso de Legionella pneumophila, que es causante de neumonía y se ha aislado de tuberías de látex, etileno, polipropileno, polietileno, PVC y acero. Las micobacterias también pueden estar presentes, puesto que tienen gran importancia en la salud humana porque las especies Mycobacterium avium y P. aeruginosa son causantes de enfermedades pulmonares, y afectan en mayor medida a pacientes con diabetes (Donoso & Saldarriaga, 2009). Las. bacterias. oportunistas,. organismos. que. pueden. causar. enfermedades. comprometiendo el sistema inmune, también se han encontrado en tuberías de agua potable. Entre ellas se encuentran: Legionella spp, Pseudomonas aeruginosa, y algunas especies del género Klebsiella, entre otras. Entre los coliformes (totales y fecales), se encuentran unos de los microorganismos importantes a nivel de salud pública por su causalidad en enfermedades gastrointestinales, tal como Escherichia coli (EPA, 1992). Algunos estudios han podido identificar también otros organismos presentes en biopelículas tales como hongos y protozoos, entre otros. A continuación se realizara una revisión bibliográfica de los microorganismos encontrados en biopelículas. Bacterias. En las biopelículas que se forman en las redes de distribución, la mayoría de las bacterias son Gram negativas, mientras que la mayoría de las bacterias que se encuentran libres en el agua son Gram positivas. Esta diferencia de distribución posiblemente se debe a la protección extra que tienen las bacterias al vivir en la biopelícula. Debido a las condiciones ambientales y a la acción de los desinfectantes una bacteria Gram negativa tiene mayores dificultades para vivir libre en el agua de la tubería y por esta razón se encuentran en comunidades microbianas incrustadas en las paredes del material de la tubería realizando relaciones simbióticas. La Aeromonas hydrophila es una bacteria gram negativa y patógena oportunista para los humanos. Normalmente se encuentra en aguas superficiales y en los sistemas de. 22.

(28) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. distribución de agua potable. Tiene capacidad de adherirse y formar biopelículas en tuberías de acero inoxidable, cobre y polibutileno (Donoso & Saldarriaga, 2009). La Figura 3.3.4.A. muestra bacterias en biopelículas identificadas en el estudio de Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009. Fueron identificados los géneros Pseudomonas, Chryseobacterium, Stomatococcus y Escherichia.. Figura 3.3.4.A. Bacterias en biopelículas mediante microscopía óptica.. 10. Bacterias anaerobias, que utilizan el sulfato o sulfuro como aceptor de electrones para metabolizar compuestos orgánicos, han sido encontradas comúnmente en la parte interna de biopelículas y son causantes de corrosión en las tuberías metálicas; existen aproximadamente dieciocho géneros de estos organismos y están divididos en dos grandes grupos: las que utilizan acetato como fuente de energía (Desulfovibrio, Desulfomonas, Desulfomaculum, Desulfobulbus), y las que utilizan otros compuestos (Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfosarcina y Desulfonema) (Diaz, 2011). Hongos. Para que los hongos puedan desarrollarse en los sistemas de distribución de agua potable, se requiere la presencia de otros microorganismos. En biopelículas se han. 10. (Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009). 23.

(29) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. encontrado hongos que se relacionan con bacterias y conforman relaciones mutualistas que los ayudan a sobrevivir. Estas biopelículas tienen una gran diversidad y características especiales en la flora microbiana. La gran mayoría de los hongos se encuentran incrustados en la biopelícula y en forma de esporas. El estudio realizado por Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M. en 2011, encontró hongos filamentosos en biopelículas de redes de distribución de agua potable en un caso de estudio en Brasil. Principalmente se encontraron los hongos de géneros: Aspergillus,. Cladosporium,. Epicoccum,. Penicillium,. Trichoderma,. Acremonium,. Exophiala y Phialophora. Dicho estudio utilizó técnicas moleculares para la identificación de los hongos como FISH, en conjunto con técnicas tradicionales de cultivo y microscopia óptica. Las Figuras 3.3.4.B. y 3.3.4.C. muestran hongos encontrados en el sistema de distribución de agua potable mediante microscopía óptica y crecimiento en cajas de Petri en medios selectivos para hongos, respectivamente.. Figura 3.3.4.B. Penicillium brevicompacum y Trichoderma spp. identificados en agua potable mediante microscopía óptica en azul de lactofenol.. 11. 11. (Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M., 2011). 24.

(30) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 3.3.4.C. Penicillium brevicompacum y Penicillium aurantiogriseum en cajas de Petri de medio MEA.. 12. La Figura 3.3.4.D. muestra el crecimiento de hongos en una tubería de hierro en una red de distribución de agua potable.. Figura 3.3.4.D. Crecimiento de hongos en cajas de Petri en medio NGRBA.. 12 y 13. 13. (Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M., 2011). 25.

(31) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Protozoos. Gracias a su diversidad, es muy probable encontrar microorganismos de este tipo presentes en las biopelículas de las redes de distribución de agua potable; algunos de estos podrían ser patógenos, por lo que es importante conocer su funcionamiento y sus características para poder controlarlos. Los principales protozoos patógenos encontrados en las redes de distribución pertenecen a los géneros: Cryptosporidium, Giardia, Acanthamoeba, Toxoplasma y Cyclospora (Donoso & Saldarriaga, 2009). A pesar de que los protozoos se encuentren en las biopelículas, en muchos casos no se pueden desarrollar en estas, ya que necesitan un huésped para desarrollarse, por ejemplo la Acanthamoeba es común en los sistemas de distribución y es la causante de diferentes infecciones de ojos y de encefalitis crónica. Por otro lado, los protozoos pueden servir de huéspedes a bacterias y virus que se encuentran en el agua, aumentando la posibilidad de contaminación y de transmisión de enfermedades. También los protozoos son consumidores de bacterias, por lo que juegan un papel importante en el equilibrio de la biopelícula. Se han encontrado protozoos por momentos cortos sobre la superficie, lo que sugiere que llegan a la superficie de la biopelícula, se alimentan y luego se desprenden, pero también se han encontrado diferentes protozoos completamente adheridos e inmersos en la biopelícula. Es importante tener en cuenta esta dinámica para entender el comportamiento de la biopelícula, ya que afecta el equilibrio de los nutrientes y la cantidad de microorganismos, la cual está directamente relacionada con la densidad de bacterias que haya en el sistema (Donoso & Saldarriaga, 2009). La presencia de protozoos en las biopelículas puede servir como indicador de la presencia de otros microorganismos, por ejemplo se conoce que varios protozoos están asociados con bacterias patógenas como Legionella spp.. 26.

(32) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Otros microorganismos presentes en biopelículas. Los virus necesitan un huésped específico para poder desarrollarse, y por lo tanto estos se pueden acumular en las biopelículas, pero no crecer directamente en ellas. Las biopelículas pueden protegerlos de la acción de los desinfectantes y así ayudar a que estos sobrevivan por más tiempo. Algunos virus importantes relacionados con la fuente de agua potable son: Poliovirus (poliomelitis), el virus de la hepatitis A y el virus de la hepatitis B (Donoso & Saldarriaga, 2009). Diferentes macroinvertebrados pueden colonizar los sistemas de distribución: nematodos, gusanos, larvas de insectos, rotíferos y pequeños crustáceos. Estos organismos tienen necesidades nutricionales bastante específicas, por lo que su supervivencia en los sistemas de distribución no es fácil. Algunos se alimentan de bacterias que encuentran en la red. Al entrar en los sistemas de distribución y alimentarse de las bacterias que habitan en este lugar, los invertebrados sirven de protectores para las bacterias y pueden servir como transporte para que las bacterias puedan ir de una zona de la tubería a otra. Algunas algas también pueden ser encontradas en los sistemas de distribución de agua potable. Las cianobacterias pueden desarrollarse en agua potable y producir toxinas supremamente peligrosas. En diferentes estudios se han encontrado diferentes algas o restos de ellas con las biopelículas (Donoso & Saldarriaga, 2009).. 27.

(33) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 4. Metodología 4.1. Toma de muestras Las muestras de biopelícula fueron suministradas por el laboratorio del Centro de Investigaciones en Ingeniería Ambiental de la Universidad de los Andes (CIIA). La estudiante de posgrado María Fernanda Díaz tomó las muestras de biopelículas de tuberías de distribución de agua potable de los municipios de Sogamoso (Boyacá), Duitama (Boyacá) y Bogotá D.C. (Cundinamarca). Para la toma de muestras se siguió un procedimiento que garantizó el manejo óptimo de la biopelícula. El protocolo de muestreo a seguir es el propuesto por (Pérez, 2010):. 1. Programación para toma de muestras 2. En campo, se tomó el material de la tubería o accesorio, diámetro, planta que abastece el sector, dirección de flujo, dirección del lugar y apariencia física de la muestra a tomar. 3. Se realizó el raspado directo sobre la tubería y accesorios en la parte de abajo, en los lados y arriba, para obtener una muestra compuesta. 4. Las muestras se tomaron con espátulas y bajalenguas que fueron esterilizados previamente con el fin de evitar cualquier interferencia en los ensayos. De igual manera, se almacenaron en bolsas Ziploc® y botellas ámbar completamente estériles que, posteriormente fueron guardadas en nevera de laboratorio.14 4.1.1. Sogamoso (Boyacá). El municipio de Sogamoso cuenta con un sistema de acueducto, que se abastece de tres fuentes naturales de captación de agua, el río Tejar y el pozo profundo La Esperanza que surten la planta de tratamiento El Mode, y el lago de Tota que surte las. 14. (Diaz, 2011). 28.

(34) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. plantas de tratamiento del Sur y Chacón, siendo esta última la más importante del municipio. La red de distribución está conformada por diferentes tipos de materiales tales como PVC, Asbesto-Cemento, ACCP (Tubos de concreto tipo cilindro de acero con refuerzo de varilla), Hierro Galvanizado y Acero, con diámetros que varían de 2 a 16 pulgadas (Rodriguez, Lemus, & Moreno, 2011). La biopelícula utilizada en este estudio fue obtenida de tubería de hierro galvanizado de 2.5 pulgadas, el 26 de Septiembre de 2011. Esta tubería tiene una edad aproximada de 25 a 30 años. La Figura 4.1.1. muestra la tubería de la cual se extrajo la biopelícula y un acercamiento donde se observa la biopelícula adherida al tubo de Hierro Galvanizado.. Figura 4.1.1. Biopelícula en tubería de Hierro Galvanizado. Sogamoso (Boyacá). 15. 15. Fotografías de María Fernanda Díaz.. 29.

(35) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 4.1.2. Bogotá (Cundinamarca). El Acueducto de Bogotá realiza la gestión integral del recurso hídrico, la cual inicia desde la captación de las fuentes de agua superficial utilizadas en los diferentes sistemas de abastecimiento, pasando luego, por los sistemas matrices de acueducto y de distribución, garantizando el suministro de agua en las viviendas, industrias e instituciones existentes en el entorno urbano de la capital, para ser posteriormente recogida, después de ser utilizada, y ser transportada hasta la planta de tratamiento de aguas residuales PTAR Salitre para su posterior vertimiento al Río Bogotá (Acueducto de Bogotá ). La zona 1 del sistema matriz de distribución comprende la parte norte de la ciudad, en las localidades de Suba y Usaquén. De esta zona fue obtenida la biopelícula para este estudio en una tubería de asbesto cemento de 4 pulgadas el 5 de Diciembre de 2011 en la Cra 6 # 127 B – 23. La Figura 4.1.2. muestra la biopelícula adherida a la tubería.. Figura 4.1.2. Biopelícula en tubería de asbesto cemento. Bogotá (Cundinamarca). 16. 16. Fotografías de María Fernanda Díaz. 30.

(36) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 4.1.3. Duitama (Boyacá). Las tres plantas de tratamiento de agua potable que abastecen la zona urbana son: Planta del Surba, La Milagrosa y Boyacogua, cuentan con tuberías de asbesto cemento en la red matriz de 6 a 8 pulgadas de diámetro. El sistema de abastecimiento utiliza un sistema de bombeo desde el Río Chicamocha con cota 2485 msnm hasta la Planta de La Milagrosa, ubicada en el Cerro del mismo nombre, desde cuatro pozos profundos a este mismo cerro, y desde el pozo profundo Rafael Reyes ubicado en el Colegio Rafael Reyes hasta el Cerro La Alacranera, donde se efectúa un tratamiento de aireación. Existe una línea de 8” de diámetro para bombeo desde el pozo El Mirto ubicado en el Barrio Simón Bolívar hasta la Planta de Tratamiento del Surba para reforzar el sistema en época de verano, con un caudal de 30 lps (Empoduitama, 2009). La biopelícula obtenida en esta red se encontraba adherida a una tubería de asbesto cemento de 2 pulgadas de diámetro y fue recuperada el 3 de Noviembre de 2012. La Figura 4.1.3. muestra la excavación para obtener la biopelícula y el interior de la tubería con la biopelícula adherida.. Figura 4.1.3. Biopelícula en tubería de Asbesto Cemento. Duitama (Boyacá). 17. 17. Fotografías tomadas por María Fernanda Díaz. 31.

(37) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. 4.2. Ensayos preliminares Con el fin de complementar la información obtenida mediante las imágenes de microscopia electrónica de barrido, se decidió realizar ensayos microbiológicos preliminares. Por un lado, se utilizaron los resultados del crecimiento de biopelículas en cajas de Petri con medio R2A de la estudiante de maestría en ingeniería ambiental de la Universidad de los Andes, María Fernanda Díaz, y adicionalmente se realizaron láminas en fresco y tinciones de Gram de muestras de las biopelículas utilizadas en este estudio, que posteriormente se analizaron mediante microscopia óptica. 4.2.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A. El agar R2A es un medio de cultivo desarrollado para cultivar bacterias que normalmente habitan en agua potable, estas bacterias tienden a ser de crecimiento lento y por esta razón se desarrolló este medio de cultivo, que es nutritivamente pobre para que especies de crecimiento más rápido no supriman o desplacen el crecimiento de estas bacterias. Su composición principal consta de agar, piruvato de sodio, sulfato de magnesio, fosfato dipotásico, almidón soluble, dextrosa, extracto de levadura, ácido de casamino y proteosa peptona (Acumedia , 2009). Se realizaron siembras de las diferentes biopelículas en cajas de Petri con medio R2A para verificar la existencia de microorganismos en la biopelícula. La Figura 4.2.1. muestra las diluciones que se realizaron a las biopelículas para su posterior cultivo.. 32.

(38) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 4.2.1. Biopelículas en tubos de ensayo para sembrar en cajas de Petri.. 18. Estas siembras se incubaron a una temperatura de 30-35°C durante 72 horas y en condiciones anaerobias y aerobias para observar el crecimiento.. 4.2.2 Tinciones de Gram y láminas en fresco Tinciones de Gram. Las tinciones de Gram se realizaron conforme el protocolo formulado por Alfaro, 2009 que consiste en los siguientes pasos:. 1. Preparar el frotis de biopelícula y fijar a la lámina por medio de calor. 2. Colocar la preparación de biopelícula con la solución de cristal violeta sumergirla durante 1 minuto. 3. Cubrir el frotis durante el lavado con solución lugol durante 1 minuto. 4. Escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta. 5. Lavar con agua destilada. 6. Contrastar con la solución safranina. 7. Lavar con agua destilada y secar a temperatura ambiente. 8. Observar con el microscopio óptico a una magnificación de 40x y posteriormente, con una gota de aceite de inmersión en objetivo 100x.. 18. Fotografías tomadas por María Fernanda Díaz. 33.

(39) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Láminas en fresco. Para realizar la visualización de las láminas de biopelícula en fresco, se siguieron los siguientes pasos:. 1. Preparar el frotis de biopelícula adicionar una gota de agua destilada. 2. Observar con el microscopio óptico a una magnificación de 40x y posteriormente, con una gota de aceite de inmersión en objetivo 100x. 4.3. Preparación de las muestras para análisis MEB y EDS El protocolo de preparación de las muestras fue el presentado por Romero, 2003 que consiste en los siguientes pasos: 4.3.1. Muestras de biopelícula. Fijación: El proceso de fijación busca estabilizar y mantener las estructuras y el contenido químico de las células, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho tejido estaba vivo. Para evitar la acción ácida de los fijadores, se introduce la solución amortiguadora que equilibró la presencia de sustancias ácidas o básicas para que mantuviese el pH dentro de los límites fisiológicos. Deshidratación: Las muestras de tejidos o estructuras blandas que se analizaron mediante MEB, debieron ser deshidratadas antes de su introducción al microscopio para evitar cambios morfológicos causados por una deshidratación repentina, razón por la cual, se realizaron lavados progresivos, con una serie de alcohol etílico de graduación creciente (50%, 70%...100%), dejando actuar el alcohol por períodos de 15 minutos y lavando entre las aplicaciones de alcohol con agua destilada para evitar la formación de sales que impedirían la visualización en el microscopio electrónico.. 34.

(40) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Secado de punto crítico: La baja presión en la cámara se utilizó para que cualquier líquido volátil se evaporara y emigrara súbitamente; esto unido a las fuerzas de tensión superficial asociadas a la salida del agua de la muestra pudieron alterar, deformar y/o destruir su estructura. Una solución a este inconveniente es que durante el proceso de secado se pasó el límite entre la fase "líquido-gas". Esto se logró mediante el secado de punto crítico, en el cual el líquido pasó directamente a la fase gaseosa. De este modo las fuerzas de deformación se obviaron, ya que el proceso de secado tiene lugar por encima del punto crítico del líquido, donde el límite entre la fase líquida y la fase gas no existe. Pero, según los valores de presión y temperatura crítica del agua (228.5 bar y 373.95 ºC) una muestra que contiene agua no puede ser secada por el método de punto crítico ya que valores tan altos de presión y temperatura la destruirán; por lo tanto, la muestra fue tratada con un fluido transicional (dióxido de carbono) cuyos valores de punto crítico son más favorables durante el proceso de extracción de humedad, 73.8 bar y 31 ºC. Montaje de la muestra sobre los portamuestras: Se realizó el montaje sobre monedas para mejorar la conducción de la muestra.. Recubrimiento con oro: Consistió en el depósito de una película fina de material conductor (oro) sobre un substrato (muestra de biopelícula) en condiciones de baja presión (10-4 Torr). Gracias a la baja presión, las moléculas de metal se mueven desde la fuente de evaporación (blanco de oro) hasta la superficie a revestir, sin encontrar resistencia del aire u otras partículas gaseosas. Esta técnica se empleó para la obtención de imágenes de electrones secundarios, ya que el oro es uno de los materiales que origina mayor emisión, conduciendo a mejores resultados. Luego de esta preparación se pudo llevar las muestras de biopelícula al microscopio de barrido electrónico para la producción de imágenes y análisis composicionales. La Figura 4.3.1.A. Muestra el proceso anteriormente descrito mediante un diagrama de flujo.. 35.

(41) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 4.3.1.A. Diagrama de flujo empleado para el análisis de biopelículas en MEB.. La Figura 4.3.1.B. muestra las biopelículas del laboratorio del Centro de Investigaciones en Ingeniería Ambiental (CIIA) luego de ser extraídas de la tubería de agua potable y almacenadas en bolsas Ziploc® en un refrigerador a 4°C. Para cada muestra llevada al microscopio electrónico de barrido fue requerido 1 gr de biopelícula. 36.

(42) Universidad de los Andes IAMB 201210 34 Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua potable.. Figura 4.3.1.B. Biopelículas almacenadas en el laboratorio del CIIA. Almacenamiento de biopelículas en bolsas Ziploc® (izq.) y acercamiento al interior de la bolsa Ziploc® (der.) Biopelícula de Sogamoso, Bogotá D.C. y Duitama respectivamente.. Posteriormente se realizó la preparación de la solución amortiguadora y la solución fijadora mediante los reactivos mostrados en la Figura 4.3.1.C.. 37.