Influencia de la temperatura y la actividad acuosa en la producción de micotoxinas de Alternaria (Hyphomycetales) en girasol - Sociedad Argentina de Botánica

ISSN373

-

580X

Bol. Soc.Argent.Bot. 28 (1-4):175-181. 1992

INFLUENCIA

DE LA TEMPERATURA

Y

LA ACTIVIDAD

ACUOSA EN LA

PRODUCCION DE MICOTOXINAS DE ALTERNARIA (IIYPHOMYCETALES)

EN GIRASOL

PorADRIANA TORRES*, SOFIA CHUL2E,EDITH VARSAVSKY, ANADALCERO,MIRIAM ETCHEVERRYyCECILIA FARNOCHI'

Summary Influence of temperature and wateractivityonAlternaria(Hyphomycetales) mlcotoxinsproduc¬

tioninsunflowerseeds. The fungalsecondarymetabolitesbiosynthesisisregulated byphysical,chemical andbiologicalfactorssuch as temperature,wateractivity,chemicals and microbial interaction.Insunflower the optimal conditions of temperature and wateractivityforAlternaria sp.mycotoxinsproductionisunknown. Theaim of this work wastoinvestigatethe effect of temperatureand wateractivityonalternariol (AOH) and alternariolmono-methylether (AME)biosynthesis byAlternaría altérnalaITEM539andAlternarlaaltérnala ROYstrainsthelatter isolated fromsunflower.When temperature was evaluated (20,25and32°C) at 0.90 of wateractivity,it was observedthat25°C wasthe optimal temperature for toxin productionbyboth strains, while at20and32°Cthe toxinproductionwaslower,beingthis temperature effectremarkablyforAME.This could be explainedtakinginto consideration thebiosyntheticpathway ofAlternarla sp.metabolites.Under the

conditions ofconstant temperature (25 °C) and variable wateractivityvaluesit was observed that0.90was theoptimalvalue forAlternarlasp.mycotoxins.Insummary, insunflowerboth temperature and wateractivity

affect AOHandAMEproduction; particularly,thetemperaturedetermined theAMElevels produced.

combinadas (Logrieco et al. 1990; Visconti ct al. 1986).

INTRODUCCION

Se ha comprobado que los frutos de girasol,

tantoa campocomodespuésdela cosechaestán contaminados conAlternariaaltérnala (Dalceroet

ai,1981. 1989). Estaespecieproducevariosmeta¬

bolites tóxicos talescomo: alternariol, alternariol

La síntesisde los metabolitessecundariosfún¬ gicosestáregulada por factores físicos, químicos y biológicos(Lacey, 1989). En girasolno seconocen lascondiciones óptimas de temperaturay activi¬

dadacuosa 'que determinan laformaciónde

mico-monometil éteryácidotenuazónico,los cuales han _{toxinaspor Alternaria}

_aliei

_{nata.Elobjetivodelpre¬}

sidodetectadosnaturalmenteenproductosvegeta¬ les (Seitz et al., 1975;Schroedcr and Cole, 1977;

Saueretal.,1978).

Harvany Pero (1978) demostraronquelosme¬

tabolites de Alternaria sp. eran tóxicospara lascé¬ lulas demamíferos y bacterianas. Además se ha

observado que alternariol monometil éter posee

actividadmutagénicayquejuntamenteconalter- cepa aislada detomate,cedida por elInstituto de

nariol tendrían un efecto tóxico sinérgico (King Tossine eMicotossine da Parasiti Vegetali, Bari,

andSchade,1984). Peroaún, losefectostóxicosde Italia.

los metabolitesdeAlternariasp.noestánbiende-

.

Alternaria ulternata RCY, aislada degirasolen

terminados yse necesitanmayoresestudios para nuestrolaboratorio.

conocer los efectos de lastoxinasindividuales y

sentetrabajo fueestudiarel efecto de latemperatu¬

ra y la actividad acuosa sobre la formación de

alternariol y alternariol monometiléterengirasol.

MATERIALES YMETODOS

Microorganismos:Alternaria alternataITEM539,

Condiciones de cultivoeinoculación:secolocaron

25g.defrutos de girasolenfrascosErlenmeyerde

.

250miysellevaronalos porcentajes de humedad DepartamentodeMicrobiologíaeInmunología,Orientación Correspondientesa: 0,98;0,90; 0,87 y0,70de

aCtivi-36Km1o3ÿ

Cuart°' 8y _{dadacuosa dcacuerdoa isotermasde}

adsór-* Becario del Consejo deInvestigacionesCientíficas y Tecnoló¬ gicasde la Provincia de Córdoba (CONICOR).

ciónpara girasolenArgentina (Pollió,1985);luego

seesterilizaronenautoclave a 120°Cdurante 20'.

Bol.Soc.Argent.Bol.28 (1-4) (1992) 5.

LosfrascosErlenmeyersecolocaronendesecado¬

resqueconteníansoluciones saturadas de

_S04

K,;

CU

Ba;

Cr04K;

Cl,Cu;2 H,0 para permitir que los frutosseequilibraranalas actividadesacuosasde 0,98; 0,90;0,87 y 0,70 respectivamente. Losfrutos equilibradosse inocularon con106 esporas/ Erlen¬ meyer yse incubarondurante 7,14,21,28y35 días

a20, 25y32°C.

Finalizadocadaperíodo de incubaciónsedeter¬

minó la producción de alternariol y alternariol monometilétersiguiendola técnica propuestapor

Visconti et a!. (1986): apartirde 25g.desemillasse

extrajeron lastoxinascon 75 mldemetanol, por agitaciónenunagitadordevaivéndurante 1hora. Elhomogeneizadosefiltróy 30ml del filtradose

trataronconsulfatodeamonioacuosoal20%.Se

AOHyAME(ug/Kg ciégirasol) 5001

4601

4001

3601

3001

2501

2001

1501 y

y

1001

501

KÍ

±

20

8 22 38

1 15

Tlernpo(dias)

- Aai “4- AME

aW:0.90 Temp:25C

lig.1.— Producción de AGII yAME. sobregirasolporA. allcrnntu I TEM539.

AOHyAME(ug/Kg de girasol) 5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

"+

500

l-o

1 8 15 22 29 38

Tierrpo(dias)

AOH -+- AME aW;0.90Tempi 25C

Fig. 2.— Producción deAOIIyAME sobregirasolporA. iilternutuRCY.

A. Torresyoiros,Micotoxims de Alternaria

AONyAME(ug/Kgda girasol) 6000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-+

600

L

o

1 8 15 22 29 36

Tiempo(dias)

-+-

AME ACHI

oW:0.90Temp:20C

Fig.3.—Producciónde AGIIyAME sobregirasol porA. altérnalaITEM539.

AOFIy AME(ug/Kgda girasol) 5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

±3

-M-0

22

1 8 15 29 36

Tiempo)dias)

—

AOH -4- _AME

aW:0.-90 Temp:20C

Fig.4.- Producciónde AOHyAME sobregirasolporA. altérnalaRCY.

filtróelextractoysedesgrasóconhexano; lacapa Elsistema de solventes fue cloroformo- acetona

dehexanosedescartóy lastoxinas seextrajeron (88:12). concloroformoapartir de la faseacuosa.Los ex¬

tractosclorofórmicosseevaporaronasequedad y RESULTADOS YDISCUSION

seredisolvieronen200¡A decloroformo.Los ex¬

tractos se analizaron por cromatografía encapa

_Efecto

de la temperatura:cuando se analizó el delgada,utilizando placas de silicagel (G60) de efeptode la temperaturamanteniendo la actividad 0,25 mmde espesorsinindicadordefluorescencia, _{acuosaconstante}en0,90sepudo comprobar que

Bol. Soc. Argent.Bot. 28 (1-4) (1992)

AOHy AME(ug/Kgdo girasol) 5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

-

4-0

15 22 29 30

1 8

Tiernpo(dias)

—

*ÿ _AOH

—

t- _AME

aW:0.90Temp:32C

Fig.5.-Producciónde AOH y AME sobregirasolpor A. altérnala ITEM 539.

AOHyAME(ug/Kg de girasol) 6000

4500

4000

3500

3000

2600

2000

1600

1000

600

0

1 8 15 22 29 30

Tiempo(tjias)

AOH AME

aW:0.90Temp:32C

Fig.6.-Producción ele AOH y AME sobregirasolpor A. altérnala RCY.

para ambascepaslamáximaproduccióndetoxi- 539yde3.273/xg/kgconla cepa RCY. Sepuede

ñasseobtuvoa25°C(durantetodo elperíodode notarquelacepaRCYaislada degirasol,enestas

incubación).Elvalor máximo fueentrelos 21 y28 condiciones,producemásAOHquela cepa ITEM días, obteniéndose un total de toxina (AOH + 539, y que la producción deAMÉes mínima,

sien-AME) de6.068/xg/kgconla cepa ITEM 539 y de do23%del total y del 3%, respectivamente, y

re-3.945/xg/kgconlacepaRCY. En amboscasosel ciénaparecealos28díasde incubación (Fig.3y4).

35%del totalcorrespondíaaAME (Fig.1y2).A 20 A 32 °C y

_aw

0,90laproduccióntambién dismi

nu-°C y

_aw

0,90 laproducciónde ambas toxinasfue yócon respecto a25 °C,el valor máximo alcanzado

menor,el valor máximoalcanzadoalos28días fue alos 28 días fue de 2.930/xg/kgde AOH + AME de 3.615 /xg/kg de AOH + AMEconlacepaITEM conlacepaITEM539y de 2.587/xg/kgconla cepa

A. Torresyotros,Micotoxinas deAlternaria

AOH yAME(ug/Kg de girasol) 5001

4501

4001

3501

3001

2501

2001

1601

1001

601

'+

+

22 29 36

15

1 8

Tiempo(dias)

—t— AOH AME

aW:0.98 Temp:25C

Fig. 7.— Produccióndo AOl1yAME sobregirasolporA.altérnala ITEM539.

AOHyAME(ug/Kgdogirasol) 6000

4500

4000

3600

3000

2600

2000

1500

1000

500

0

1 0 15 22 29 36

Tiempo(dias)

AOH -+- AME

aW:0.98Temp: 25 C

Fig.8.—Producciónde AOHy AME sobregirasolporA.altérnalaRCY.

RCY. Laproducción de AME,enestaácondiciones, 0,87,dondeno seobservó diferenciaentrelasce¬ esmuy baja, el5%del totalenelcasodela primera pas. Esto demuestra la importancia de las condi-cepa y del8%para la cepa RCY (Fig.5y6). donesde desarrollo para la producción detoxinas, Esimportantenotarque,mantenidas enlasmis- especialmente durante elalmacenamiento,ya que

mascondiciones de temperatura y

aw,

cadacepase pequeñas variaciones endichos parámetros pue-comporta diferenteencuantoalaproducciónde den modificarlos niveles detoxinasproducidos.

Comosepuede observarseproducemayorcan¬

eadauno de los metabolitos,aexcepciónde las

condiciones de 32°C y

_aw

0,90y25°Ccon un

_aw

tidaddeAME,enrelaciónconel total detoxinas a

Bol.Soc.Argent.Bot. 28 (1-4) (1992)

AOHyAME(ug/Kg degirasol) 5000

4500

4000

3600

3000

2500

2000

1500

1000

500

4—4

-M-0

1 6 15 22 29 38

Tiempo(dias)

AOH -+- AME

aW:0.87 Temp: 26 C

Fig.9.—Producciónde AOH y AME sobre girasolporA. altérnala ITEM539.

AOH y AME(ug/Kg de girasol) 5000

4500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

4

4-4 0

1 8 15 22 29 38

Tiempo(dias)

AOH —F— _AME

aW:0.87 Temp: 26C

Fig.10.— Producciónde AOl 1 yAMEsobregirasol porA. altérnala KCY.

25 °C,con respecto a lasotras temperaturas.La

mejorproducciónde'AMEa25°C podría explicar¬

seconsiderando lavíabiosintética,dadoque AME

deriva de AOHa través de una transformación llevadaacabo por laenzimaO-hietiltransferasa cuya actividadóptimaes a 28°C (Stinson,1985).

Efecto

delaactividadacuosa:cuando se mantiene

constantelatemperatura a 25°C ysevaríala activi¬

dad acuosalos resultados

_fueron

los siguientes:

con una

_aw

de 0,98,lpsvaloresmáximotambiénse

obtuvieronalos28días,enelcasodela cepa ITEM

539 fueronde 2.823/xg/kgde AOH4AMEyde

3.404 /xg/kg parala cepa RCY. El porcentaje de

AME fue del 30% y 19%, respectivamente. Conesta

aw

senotaunamarcada disminuciónenla produc¬

ciónde toxinas de la cepa ITEM 539con respecto a

A.Torres yotros,Micoloxinas de Alternaria

loobtenidoa0,90,mientrasquepara lacepa RCY

la disminuciónesmínimapara AOH,peroesevi¬

dente para AME (Fig.7y8).A

_avv

0,87elcrecimien¬

todelhongofuemínimo (detectadovisualmente)y

el valormáximo detoxinasalcanzadoalos28 días fue de 842p-g/kgde AOH+ AME conla cepa ITEM539yconla cepa RCY elmismovalor, peroa

los 21 díasdeincubación. Enambos casosla pro¬

duccióndeAMEesel25%del total detoxinas(Fig.

9y10).

Cuandolos frutos fueron mantenidosa unaa(V

de0,70 no se observó crecimientofúngico sobre ellosy tampoco huboproduccióndetoxinas.

Podemosconcluir que la actividadacuosaópti¬

ma para la producción de los metabolitos de Alta nariasobre girasolesde0,90.Comparando los

datosobtenidos sobre girasolconaquellos de

Ma-gan y Lacey(1984)sobre trigo, podemos poneren evidenciala importancia delsustratoenlaproduc¬

cióndetoxinas,cuando las demás condicionesson

iguales; Dichosautores encuentranqueentrigola máximaproduccióndetoxinas seobtuvoa25?C peroa una_alv de0,98, mientrasquea la misma

temperatura ya 0,90 de

_avv

detectaron mínimas concentraciones de toxina, datosqueestarían con¬ trapuestosconlo obtenidoengirasol.A

_aw

de 0;98 ellos detectaroncantidadestrazasde AOH y AME

a20-25°C,losautoresencuentranunamayor pro¬ duccióndeAME quedeAOH,estopuede depen¬ der de la cepaodelsustratoutilizado.

St/mp. Mycoloxinsp. 434-441,ElCairo,Egipto. DÀLCERO,A., S.CHULZE; M. ETECHEVERRY,C.

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Agradecemos al ConsejodeInvestigaciones Científicas yTecnológicasdelaProvincia deCórdoba(CONICOR)ya laIFS,quienes han apoyado económicamenea travésde lossubsidiosN°1539/90y E/1896-1,la realizacióndel presentetrabajo.

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