1 GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
2017
ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Área Bacteriología
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
2 TEMARIO
TP N° 1: Análisis microbiológico de agua potable para consumo humano.
Recuento de mesófilos por siembra en superficie y en profundidad. Recuento de coliformes totales por la técnica del número más probable (NMP). E. coli.
Pseudomonas aeruginosa.
TP N° 2: Análisis microbiológico de helados: determinación de la presencia de S. aureus
TP N° 3: Análisis microbiológico de productos cárnicos: determinación de la
presencia de E. coli O157:H7
TP N° 4: Análisis microbiológico de productos con huevo: determinación de la
presencia de Salmonella TP N° 5: Parasitología TP N° 6: Micología TP N° 7: Virología TP N° 8: Visita a Fábrica ANEXO I
I.1. Coloración: tinción de Gram- Nicolle I.2. Medios de cultivo
I.3. Pruebas bioquímicas para identificación bacteriana
ANEXO II. Tablas de identificación
II.1. Familia Enterobacteriaceae.
3 ACTUALIZACIÓN BIBLIOGRÁFICA
Manual de Microbiología Clínica, 7a edición, Murray et al. Diagnóstico Microbiológico, 11ª edición, Bailey& Scott.
COLABORADORES EN LA REALIZACIÓN DE LA GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Y ANEXOS.
Dra. Claudia Balagué Dra. Virginia Aquili Dra. Cecilia Casabonne Esp. Bioq. Agustina González Esp. Lic. Leonel Migliore
Horarios de comisiones
Días: 15 - 17 hs
Miércoles: 15.30 - 17 hs
4 Trabajo Práctico N° 1
Análisis microbiológico de agua potable para consumo humano. Recuento de mesófilos por siembra en superficie y en profundidad. Recuento de Coliformes totales por NMP (número más probable). Determinación de E. coli y
Pseudomonas aeruginosa.
Objetivo
Llevar a cabo el análisis microbiológico de las muestras de agua para consumo mediante los lineamientos propuestos por el Código Alimentario Argentino (CAA- Cap. VII).
5 Microorganismos aerobios mesófilos viables
En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de desarrollar en presencia de oxígeno a una temperatura comprendida entre 20°C y 45°C con una óptima entre 30ºC y 40ºC.
El recuento de microorganismos aerobios mesófilos, en condiciones
establecidas, estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de los productos analizados, indicando además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma como fueron
manipulados durante su elaboración.
Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar: - Contaminación de la materia prima.
- Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. - Posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. - Inmediata alteración del producto.
1. Técnica de Recuento en Placa. Siembra en superficie y en profundidad
El recuento en placa es el método más utilizado y recomendado por la Comisión Internacional sobre Especificaciones Microbiológicas en los Alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificación de la población microbiana presente en los alimentos sólidos o líquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayoría de los alimentos no son estériles, sino que contienen una población microbiana, que varía ampliamente en número, dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificación, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentarían un recuento tan alto que sería imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10 -4
), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilución, que es el inverso de la dilución. La
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dilución inicial siempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero lo importante es que se guarde la relación: 1+ 9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente.
DIA 1
1.1. Preparación de las diluciones
1-Homogeneizar la muestra de agua y tomar 1 ml y agregar en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada al 0,1%. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Rotular como dilución 10-1.
2- Tomar 1 ml de la dilución 10-1 y agregar en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada al 0,1%. Rotular como dilución 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta.
3-Tomar 1 ml de la dilución 10-2 y agregar en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada al 0,1%. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Rotular como dilución 10-3.
1.2. Siembra en profundidad
1. Sembrar 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 en placas de Petri estériles (sin medio).
2. En otra placa de Petri, sembrar 1 ml de agua peptonada 0,1% (Control del Diluyente) y dejar una 5ta placa de Petri sin sembrar (Control de Medio).
3. Agregar a todas las placas (12 – 15) ml de agar APC fundido y atemperado a 45ºC.
4. Mezclar, dejar solidificar, invertir las placas e incubar a 37ºC por 24 h.
5. Realizar el recuento de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
6. Informar UFC/ml de muestra.
1.3. Siembra en superficie
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2 y 10-3 en placas con APC.
2. Extender con espátula de Drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
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4. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar: UFC/ml de muestra.
2. Bacterias Coliformes
El grupo coliformes totales (CT) está integrado por 4 géneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella, los cuales son bacilos
Gram-negativos capaces de fermentar la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h de incubación a 35-37°C.
Los coliformes fecales (CF), un subgrupo dentro de los coliformes totales, son definidos como bacilos Gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44,5°C dentro de las 24 h. La especie predominante es E. coli. Los CF están presentes en el intestino de hombres y animales, por lo que su presencia en agua indica contaminación fecal reciente, indicando la posible presencia de microoganismos patógenos. El término “coliformes fecales”, al igual que coliformes, carece de validez taxonómica. La determinación de este grupo fue desarrollada como un método rápido y reproducible para detectar la presencia de E. coli.
Según artículo 982 del CAA para agua de consumo humano, la búsqueda de
coliformes totales se realiza por la técnica del NMP en 100 ml de muestra, utilizando medio McConkey a 37ºC- 48 h.
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La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP) se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C durante 48 h utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.
2.1 Número Más Probable (NMP) Introducción
Esta técnica sirve para estimar la población de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estándar en placa, el NMP es un método indirecto y solo brinda recuentos estimados de la población microbiana; es menos preciso cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero más eficaz en poblaciones bajas porque permite el análisis de muestras de tamaño más significativo. Se usa principalmente para la determinación de coliformes, pero variando el medio de cultivo también se puede utilizar para la cuantificación de S. aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodología de la técnica se basa en la siembra de volúmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 ml) de la muestra pura o 1 ml de las diluciones decimales. El número de diluciones dependerá del grado de contaminación del alimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos para ese producto: la relación muestra pura o diluida debe ser de 1 ml para 10 ml de medio de cultivo.
Existen diferentes métodos del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado:
1. Caldo Lauril Sulfato Triptosa, seguida de la confirmación de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estría en agar Levine (EMB).
2. Método Británico: caldo McConkey.
3. Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y confirmación con agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis Lactosa (AVRB-L).
2.1. Procedimiento
Sembrar 0,1 ml y 1 ml en tubos con caldo McConkey simple concentración y 10 ml de la muestra en caldo McConkey doble concentración, resultando 3 series
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Incubar a 37ºC durante 48 h.
Procesar las muestras de agua por triplicado.
Nº de tubos Volumen de muestra Volumen de medio Concentración del medio 3 10 ml 10 ml Doble 3 1 ml 10 ml Simple 3 0,1 ml 10 ml Simple
A las 24 h a partir de la incubación, realizar la lectura de los tubos y confirmar los tubos positivos (+). Los tubos negativos (-) se reincuban otras 24 h a 37ºC.
Tubo (+): tubos en los que simultáneamente se observa viraje del indicador al amarillo y producción de gas.
Tubo (-): tubos sin viraje del medio de cultivo y sin la presencia de gas.
2.2. Confirmación de los tubos (+)
Para confirmar la presencia de coliformes totales, a partir de los tubos (+), tomar 0,1 ml del caldo y trasvasar a tubos conteniendo 9 ml de caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. Incubar 48 h a 37ºC.
2.3. Lectura del NMP – Tabla de Hoskins
Realizar la lectura del NMP, en la tabla de Hoskins, computando todos los tubos (+) a las 48 h de incubación. Ver tabla del NMP para la serie de 9 tubos Por ejemplo: si solo se obtuvo crecimiento en 3 tubos de 10 ml y en uno de 1 ml, el resultado será 3-1-0 y el NMP 43 coliformes cada 100 ml.
10 Tabla de Hoskins para serie de 9 tubos
3. Coliformes fecales – E. coli
Las cepas de E. coli representan un elevado porcentaje del grupo coliformes fecales. En los alimentos, E. coli, es el indicador mas utilizado para significar una contaminación de origen fecal relativamente reciente.
3.1. Procedimiento
En el caso de que se observen tubos (+) en el ensayo de coliformes totales, proceder a investigar si la muestra también contiene coliformes fecales.
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Para confirmar la presencia de coliformes fecales, a partir de los tubos (+) en el ensayo de NMP, tomar 0,1 ml del caldo y trasvasar a tubos conteniendo 9 ml de caldo EC. Incubar 24 h a 44ºC.
Evaluar la presencia de turbidez y producción de gas.
3.2. Confirmación de E. coli
Para confirmar la presencia de E. coli estriar los tubos (+) en agar LEVINE en incubar 24 h a 37ºC.
A aquellas colonias que presenten un crecimiento típico (colonias de color negro azulado con brillo metálico) realizarles las pruebas bioquímicas urea, citrato, SIM y TSI.
Evaluar los resultados e informar
4. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es capaz de sobrevivir y multiplicarse en aguas
tratadas, debido a una densa capa polisacárida la que establece una barrera no física y química capaz de proteger a la bacteria de las moléculas e iones de cloro libre residual (REILLY, 2000). La presencia de este microorganismo es un indicador de la calidad del agua ya que su resistencia al cloro es superior a la de otros microorganismos aislados en el agua (APHA, 1995).
Como otras Pseudomonas, P. aeruginosa produce una variedad de pigmentos como la piocianina (azul verdoso), la piorrubina (rojo pardo) y la pioverdina (amarillo verdoso fluorescente).
12 4.1. Procedimiento
Proceder paralelamente:
a- Filtrar por membrana 100 ml de agua y colocar el filtro en 25 ml de caldo Verde de Malaquita.
b- Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de caldo Verde de Malaquita doble concentración.
Incubar 48 h a 37ºC.
4.2. Aislamiento y confirmación
Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento, sembrar por estría en placas de agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42ºC.
Las colonias de P. aeruginosa forman en el medio agar cetrimida, un pigmento verde azulado (piocianina)
Para confirmar la presencia de P. aeruginosa, a partir de las colonias con crecimiento típico en agar cetrimida, realizar los siguientes ensayos:
- Sembrar en Agar F: formación de fluoresceína
- Sembrar en Agar P: formación de piocianinas y/o piorrubina - Realizar prueba de la oxidasa y TSI
Evaluar los resultados e informar.
5. Informe de resultados
ENSAYO ESPECIFICACION (CAA) RESULTADO
Bacterias Mesófilas Viables
Bacterias Coliformes
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
En base a los resultados obtenidos concluir e informar la aptitud de la muestra de agua según CAA.
13 Trabajo Práctico Nº 2
Análisis microbiológico de helados: Determinación de Staphylococcus aureus (S. aureus).
Objetivo: Realizar el análisis microbiológico de las muestras de helado
mediante los lineamientos propuestos por el CAA.
Definición y clasificación de los helados (CAA)
Cap VII, Art. 1074.- Con la denominación genérica de "Helados" se entiende
los productos obtenidos por mezclado congelado de mezclas líquidas constituidas, fundamentalmente, por leche, derivados lácteos, agua y otros ingredientes consignados en este artículo, con el agregado de los aditivos autorizados por el artículo 1075.
Criterios microbiológicos
*Art. 1078.- Los distintos tipos de helados, deberán responder a las siguientes
exigencias microbiológicas.
La calidad microbiológica de la muestra de helado se dará por no cumplida si el producto presenta:
- Recuento de bacterias mesófilas aerobias, PCA, 30ºC, 72 h: mayor de 1x105/g
- Bacterias coliformes: más de 1 X 10 2/g. - Bacterias coliformes fecales: más de 1/g.
- Staphylococcus aureus coagulasa positiva: más de 1 x 10 2/g
- Salmonella: presencia en 50 g.
En los helados los riegos de contaminación microbiana siempre están presentes, por depender de la carga microbiana de los ingredientes y de las condiciones operativas en las diferentes fases de su elaboración. A pesar de que los microorganismos no son capaces de crecer en el helado que es almacenado en adecuadas condiciones de congelación, pueden sobrevivir durante mucho tiempo en este producto. Los principales problemas de descomposición están relacionados con materias primas como leche y huevos.
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La presencia de S. aureus se interpreta como indicativo de contaminación por piel, boca y fosas nasales de los manipuladores de los alimentos, material, equipos sucios y materia prima de origen animal contaminado. Las intoxicaciones estafilocóccicas son causadas por la ingestión de alimentos que contienen una de las enterotoxinas producidas por el S. aureus en el alimento.
1. Procedimiento
1. Pesar 10 g de muestra y agregar a un frasco conteniendo 90 ml de agua peptonada 0,1% (dilución 10-1).
2. Homogeneizar la muestra, tomar 1 ml y realizar diluciones decimales seriadas (10-2, 10-3, 10-4) en tubos conteniendo 9 ml de agua peptonada 0,1%.
1.1. Recuento de bacterias mesófilas aerobias
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 en placas con APC.
2. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
3. Invertir las placas e incubar a 30ºC por 72 h.
4. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar UFC/g de muestra.
1.2. Bacterias Coliformes
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 en placas AVRB-L.
2. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
3. Invertir las placas e incubar a 37ºC por 24 h.
4. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar UFC/g de muestra.
1.3. Coliformes fecales
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 en placas LEVINE.
2. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
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3. Invertir las placas e incubar a 44ºC por 24 h.
4. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar UFC/g de muestra.
1.4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 en placas de agar Baird-Parker (BP).
2. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
3. Invertir las placas e incubar a 37ºC por 48 h.
4. Realizar el recuento de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) típicas en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar UFC/g de muestra.
Luego del conteo de colonias se deben hacer pruebas confirmatorias, en particular la prueba de la coagulasa. Si las colonias contadas son coagulasa positivas entonces expresaremos el recuento como UFC/g de S. aureus coagulasa positivo.
1.4.1. Confirmacion de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
Para confirmar la presencia de S. aureus coagulasa positiva, a partir de las colonias con crecimiento típico en agar BP, realizar los siguientes ensayos:
- Coloración de Gram: cocos Gram positivos
- Estriar en placa de agar manitol salado (Chapman)
- Realizar las pruebas bioquímicas: coagulasa (positiva), catalasa (positiva), DNAsa, manitol.
Evaluar los resultados e informar.
El aspecto de las colonias típicas de S. aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente: redondas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.
16 1.5. Informe de resultados
ENSAYO ESPECIFICACION
(CAA) RESULTADO
Bacterias mesófilas viables
Bacterias coliformes
Coliformes fecales
S. aureus coagulasa positiva
En base a los resultados obtenidos concluir e informar la aptitud de la muestra de agua según CAA.
17 Trabajo Práctico Nº 3
Análisis microbiológico de productos cárnicos: determinación de la presencia de E. coli O157:H7.
Objetivo
Llevar a cabo el análisis microbiológico de las muestras de carne picada mediante los lineamientos propuestos por el Código Alimentario Argentino.
CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
Capítulo VI, Artículo 255 (Resolución Conjunta SPReI y SAV N° 4 - E/2017) [Se otorga a las empresas, a partir del 10 de enero de 2017, un plazo de ciento ochenta (180) días hábiles para su adecuación].
Con la designación de Carne triturada o picada, se entiende la carne apta para el consumo dividida finamente por procedimientos mecánicos y sin aditivo alguno.
La carne picada fresca deberá responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:
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En el presente trabajo práctico se realizará el recuento de bacterias mesófilas aerobias, recuento de E. coli y de Staphylococcus aureus y determinación de
Escherichia coli O157:H7/NM.
1. Procedimiento
Pesar 10 g de muestra y agregar a un frasco conteniendo 90 ml de agua peptonada 0,1% (dilución 10-1).
Homogeneizar la muestra, tomar 1 ml y realizar diluciones decimales seriadas (10-2, 10-3, 10-4) en tubos conteniendo 9 ml de agua peptonada 0,1%.
1.1. Recuento de bacterias mesófilas aerobias
2. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2, 10-3 en placas con APC.
3. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
4. Invertir las placas e incubar a 30ºC por 72 h.
5. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
19 6.1. Escherichia coli
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2 y 10-3 en placas LEVINE.
2. Extender con espátula de drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
3. Invertir las placas e incubar a 44ºC por 24 h.
4. Realizar el recuento de las UFC en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC. Realizar PB para E. coli: TSI, urea, citrato, LIA, SIM.
5. Informar UFC/g de muestra.
6.2. Staphylococcus aureus coagulasa positiva
1. Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-2 y 10-3 en placas de agar Baird-Parker (BP).
2. Extender con espátula de Drigalsky la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.
3. Invertir las placas e incubar a 37ºC por 48 h.
4. Realizar el recuento de las UFC típicas en aquellas placas de Petri que tengan entre 30 - 300 UFC.
5. Informar UFC/g de muestra.
6.2.1. Confirmacion de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
Para confirmar la presencia de S. aureus coagulasa positiva, a partir de las colonias con crecimiento típico en agar BP, realizar los siguientes ensayos:
- Coloración de Gram: se observan cocos Gram positivos. - Estriar en placa de agar manitol salado (agar Chapman)
- Realizar las pruebas bioquímicas: coagulasa (positiva), catalasa (positiva), DNAsa (positiva), manitol (positiva).
Evaluar los resultados e informar
6.3. Escherichia coli O157:H7/NM
Escherichia coli (E. coli) pertenece a la familia Enterobacteriaceae y es parte de
la flora anaerobia facultativa del tracto intestinal del hombre y de los animales.
E. coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente asociado a
enfermedades transmitidas por alimentos, cuyo prototipo es STEC O157:H7. Los rumiantes son los principales reservorios de STEC (Caprioli y col., 2005).
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Otras formas de transmisión incluyen, la contaminación cruzada durante la preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los animales, y persona a persona por la ruta fecal-oral.
Se han realizado numerosos trabajos referidos a la detección y aislamiento de STEC en distintos alimentos. Sin embargo, en el CAA se recomienda la metodología validada por United States Department of Agriculture/Food Safety
and Inspection Service, Office of Public Health and Science (USDA/FSIS) para
la detección de E. coli O157:H7 en productos cárnicos. El método USDA está basado en 5 etapas:
1. Enriquecimiento en medio selectivo 2. Tamizaje rápido (test de screening) 3. Concentración inmunomagnética
4. Aislamiento en medios selectivos y diferenciales 5. Identificación y caracterización de los aislamientos
En nuestro caso, omitiremos las etapas de tamizaje rápido y de concentración inmunomagnética
1.4.1. Enriquecimiento
1. Pesar 25 g de la muestra de carne picada y transferirla a un frasco conteniendo caldo EC modificado con novobiocina (ECm+n).
2. Homogeneizar la muestra agitando por rotación durante 2 min. 3. Incubar a 42°C durante 15 a 22 h
4. Incluir un control positivo, un control negativo y un control de sistema (medio sin inocular) para cada grupo de muestras analizadas.
1.4.2. Aislamiento en medio selectivo
1. Tomar una alícuota de 1 ml de caldo enriquecido en un tubo eppendorf. 2. Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm. Descartar el sobrenadante.
3. Sembrar el pellet por agotamiento en las placas de SMAC y de CHROMagar O157.
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El aislamiento de E. coli O157:H7/NM se basa en algunas propiedades bioquímicas que lo diferencian de otras cepas de E. coli. Una de ellas es que no fermentan el sorbitol dentro de las 24 h y no poseen actividad de ß-glucuronidasa.
1.4.3. Confirmación de E. coli O157:H7
Para confirmar la presencia de E. coli O157:H7, a partir de las colonias con crecimiento típico en los medios específicos de aislamiento, realizar los siguientes ensayos:
- Coloración de Gram.
- Siembra en placa de Enterohemolisina. - Confirmación serológica: antígeno O157 - Pruebas bioquímicas: urea, citrato, SIM y TSI - Opcionales: MUG y sorbitol.
Tabla: Pruebas bioquímicas
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23 Trabajo Práctico Nº 4
Análisis microbiológico de fideos al huevo: determinación de la presencia de
Salmonella spp.
Objetivo
El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada a cabo por el laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos a base de huevo.
Legislación argentina
CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
CAPÍTULO IV ALIMENTOS FARINÁCEOS – CEREALES, HARINAS Y DERIVADOS
Artículo 720 – (Res 305, 26.03.93)
Exigencias microbiológicas:
Salmonella: ausencia en 25g.
1. Procedimiento (según manual de Bacteriología analítica – FDA:2007)
El método para detectar Salmonella spp. en productos con huevo está basado en las siguientes etapas:
1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo 2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo
3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial
4. Confirmación de colonias presuntivas aisladas: Las colonias sospechosas de
Salmonella spp. son reaisladas y su confirmación se realiza por propiedades
24 Procedimiento
1.1. Pre-enriquecimiento
1. Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un recipiente estéril de boca ancha y agregar 225 ml de caldo lactosado.
2. Dejar 60 min a temperatura ambiente, mezclar bien por agitación y determinar el pH con papel indicador. Si es necesario ajustar el pH a 6,8 ± 0,2 con NaOH 1N o HCl 1N.
3. Incubar 24 h a 35°C.
1.2. Enriquecimiento selectivo
1. Homogeneizar las muestras incubadas por agitación.
2. Transferir 0,1 ml del caldo de enriquecimiento a 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) y 1 ml del caldo de enriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato (TT).
3. Incubar los caldos RV y TT 24 h a 42°C.
1.3. Aislamiento en medio selectivo y diferencial
A partir de los caldos TT y RV estriar un ansa llena (10 l) en agar Verde Brillante (VB), en agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) y en agar Salmonella Shigella (SS).
Incubar las placas a 24 h a 35°C.
Examinar las placas luego de la incubación a fin de determinar de la presencia de colonias típicas de Salmonella.
Las colonias sospechosas se evidencian de la siguiente manera:
Agar Verde Brillante: colonias de color rosa a blanco, opacas, rodeadas por el rojo brillante del medio.
25 Nota: muchas cepas de Salmonella pueden dar colonias con centros negros
grandes y brillantes o pueden dar colonias completamente negras.
Agar Salmonella Shigella: Salmonella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen adecuadamente en el medio de cultivo y producen colonias transparentes. La producción de H2S se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.
1.4. Identificación
1.4.1. Identificación bioquímica
Para confirmar la presencia de Salmonella spp., a partir de las colonias con crecimiento típico en los medios específicos de aislamiento, realizar los siguientes ensayos:
- Pruebas bioquímicas: TSI, urea, SIM, lisina descarboxilasa y VP.
1.4.2. Identificación serológica
La detección de la presencia de los antígenos O, Vi y H de Salmonella se realiza por aglutinación en placa con los sueros apropiados a partir de colonias puras y después de eliminar las cepas autoaglutinables.
1.4.2.1. Eliminación de cepas autoaglutinables
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Con un ansa dispersar una colonia hasta obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en círculos por 30 - 60 s.
Observar el resultado contra un fondo oscuro.
Si la cepa aglutina es considerada autoaglutinable y no debería someterse a la determinación serológica ya que los resultados no son confiables.
1.4.2.2. Determinación del antígeno O
Colocar una gota del suero anti O en un portaobjeto.
Con un ansa dispersar una colonia hasta obtener una suspensión turbia y homogénea. Mover la placa de vidrio en círculos por 30 - 60 s.
Observar el resultado contra un fondo oscuro.
Si se observa aglutinación la reacción es considerada positiva. Evaluar los resultados e informar.
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ANEXO I
I.1. COLORACIONES: Tinción de Gram Nicolle
1. Primer colorante: Violeta de Genciana. 2. Mordiente: solución de Lugol
3. Decolorante: alcohol acetona
4. Segundo colorante (de contraste): Safranina
Método
1) Extender y fijar el material sobre el portaobjetos limpio, desengrasado y seco.
2) Cubrir el preparado con el primer colorante durante 1 min, volcar el colorante y lavar con agua corriente.
3) Cubrir el preparado con el mordiente, dejar actuar por 1 min y volcar el exceso.
4) Decolorar con alcohol-acetona durante 10 s y lavar con agua.
5) Colorear durante 1 min con el segundo colorante, lavar con agua y secar. 6) Examinar al microscopio utilizando el objetivo de inmersión.
28 I.2. MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es la observación de su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, éste debe reunir una serie de condiciones tales como: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
I.2.1. Clasificación de medios de cultivo
- Según su estado físico
Líquidos: usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. caldo nutritivo.
Sólidos: se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les
añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. agar nutritivo.
- Según sus propósitos de uso
a- Medios de enriquecimiento
Favorecen el desarrollo de una o más especies bacterianas con agregado de sustancias nutritivas como sangre, albúmina, yema de huevo, suplementos vitamínicos, extracto de levaduras.
Ej: agar Plate Count, caldo Tioglicolato, agar sangre.
b- Medios selectivos
Permiten el desarrollo de determinados microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Los agentes inhibidores pueden ser: sales biliares, colorantes como verde brillante, eosina, metales pesados como bismuto, sustancias químicas como citrato, selenito, alcohol feniletílico, agentes antimicrobianos como colistina, vancomicina. Ej: el caldo selenito que es un
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caldo de enriquecimiento que permite la recuperación de Salmonella spp. y utiliza selenito como inhibidor de bacterias coliformes.
c- Medios diferenciales
No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos pero sí contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificación presuntiva de microorganismos. Ej: el agar Levine utiliza la combinación de eosina y azul de metileno como indicador lo que permite una marcada diferenciación entre microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa.
d- Medios selectivos diferenciales
Combinan en un mismo medio las características de ser selectivo y diferencial. Ej: el agar Mac Conkey contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas. Además contiene lactosa y un indicador de pH que permiten distinguir bacterias fermentadoras y no fermetadoras de lactosa.
A continuación se describen los medios de cultivo que se utilizarán en los trabajos prácticos.
MEDIOS LÍQUIDOS
Agua peptonada
Medio usado como diluyente y enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario.
Agua Peptonada para dilución:
Peptona 1 g
Agua destilada 1 l
Disolver la peptona en 1 litro de agua destilada ajustando el pH a 6,8 0,1 y esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 a 20 min.
30 Caldo Escherichia coli (E.C)
Este medio se utiliza para la demostración selectiva de coliformes y E. coli en aguas, alimentos y otros materiales. La lactosa favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, especialmente coliformes y E. coli, las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. Los germenes lactosa positiva consumen lactosa con produción de gas.
Composición Peptona de caseina 20,0 g Sales biliares 1,5 g Lactosa 5,0 g K2HPO4 4,0 g KH2PO4 NaCl Agua destilada 1,5 g 5,0 g 1,0 l
Distribuir en tubos provistos de campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C.
Caldo Lactosado
Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del creimiento bacteriano. Permite recuperar células injuriadas, diluye sustancias tóxicas o inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias. El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas.
Composición
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Lactosa 5,0 g
31 Caldo McConkey
Medio de cultivo selectivo utilizado para la investigación presuntiva de microorganismos coliformes en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de aminoácidos y de otros factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con producción de ácido y gas. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color púrpura al amarillo.
Composición
Bilis de buey 5 g Peptona 20 g Lactosa 10 g Purpura de Bromocresol 0,01 g
Suspender 35 g de polvo por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.pH final: 7,3 ± 0,2.
Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis
Este medio está recomendado para recuento de coliformes totales y fecales mediante la técnica del NMP. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.
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Composición
Bilis de buey deshidratada 20,0 g
Peptona 10,0 g
Lactosa 10,0 g
Verde Brillante 0,0133 g
Suspender 40 g del polvo deshidratado por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Preparar además, el medio a doble concentración. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. pH final: 7,2 ± 0,2.
Interpretación
- Positivo: turbidez y presencia de gas. - Negativo: ausencia de gas.
Peptona de Carne N°1
Es un hidrolisado péptico de carne bovina, recomendado como nutriente para medios de cultivo, fermentaciones industriales y produción de vacunas.
Caldo Rappaport Vassiliadis con soja
Es un medio de enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. (excepto
Salmonella typhi y paratyphi A) a partir de alimentos, medicamentos y otros
materiales de importancia sanitaria. El enriquecimiento selectivo de especies de Salmonella se debe a la capacidad de estos microorganismos de sobrevivir y multiplicarse a presiones osmóticas relativamente altas (debido a la alta concentración de cloruro de magnesio en el medio), a pH relativamente bajos.
Composición Peptona de soja 4,5 g MgCl2.6 H2O 29,0 g NaCl 8,0 g K2HPO4 0,4 g KH2PO4 Verde de malaquita 0,6 g 0,036 g
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Disolver los ingredientes en agua y hervir. Poner en tubos o frascos. Autoclavar por 15 min a 121ºC. El pH final debe ser 5,2 0,1.
Caldo Selenito cistina
Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. En este medio la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 h de incubación.
Composición Peptona 5,0 g Lactosa 4,0 g Fosfato de sodio 10,0 g Selenito de sodio 4,0 g L-Cistina 0,01 g
Disolver los ingredientes en agua, calentar ligeramente hasta disolución total. Evitar calentamiento excesivo. No esterilizar en autoclave. Distribuir en tubos un volumen no menor a 5ml.
Caldo Tetrationato
Contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada.
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Composición del medio tetrationato base
Peptona 5,0 g
Sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Tiosulfato de sodio 30,0 g
Agua destilada 1,0 l
Composición de la solución yodo-ioduro de potasio
Ioduro de potacio. 5,0 g
Yodo resublimado 1,0 g
Agua destilada 10,0 g
Disolver el polvo en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullición mezclando vigorosamente, enfriar a 45°C y agregar 20 ml de solución iodada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada.
No autoclavar. El medio base debe mantenerse a 4°C y una vez agregada la
solución iodada debe utilizarse en el mismo día.
Caldo University of Vermont modificado (UVM)
La triptosa, el extracto de carne y el extracto de levadura proporcionan un elevado contenido de sustancias nutritivas que permiten un buen crecimiento de Listeria. El ácido nalidixico y la acriflavina dan selectividad al medio inhibiendo el crecimiento de germenes acompañantes. Por acción de la B-D-glucosidasa se transforma el glucósido esculina en esculetina y glucosa.
Composición
Proteasa peptona 5,0 g
Triptona 5,0 g
Extracto de carne 5,0 g
35 NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Esculina Acido nalidixico Acriflavina Agua destilada 20,0 g 1,35 g 12,0 g 1,0 g 1,0 ml 12,0 mg 1,0 l
Disolver los componentes en agua destilada, ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7,2 0,2 luego de la esterilización. Esterilizar a 121°C durante 15 min. NO SOBRECALENTAR.
Caldo Verde de Malaquita
El verde de malaquita inhibe ampliamente a la flora acompañante, mientras que
P. aeruginosa crece prácticamente sin impedimento alguno. Se incuba
aproximadamente 20 a 44 h a 37ºC. Los cultivos que muestran turbidez se seguirán analizando para P. aeruginosa.
Composición
Peptona de carne 15,0 g
Extracto de carne 9,0 g
Verde de Malaquita oxalato 0,03 g
K2HPO4
Agua destilada
1,1 g 1,0 l
Disolver los componentes en agua destilada. Esterilizar en autoclave. pH final: 7,0 0,1.
Agar Baird Parker
Medio de alta especificidad diagnostica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococo coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Es un medio altamente nutritivo en el cual la peptona de caseína y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levaduras aporta vitaminas del complejo B, la glicina y
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el piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos. El agar es el agente solidificante.
Permite el crecimiento selectivo de estafilococos ya que el telurito de potasio y el cloruro de litio inhiben el desarrollo de la flora acompañante en la muestra. La yema de huevo permite demostrar la actividad lecitinasica de los microorganismos.
Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisáceo-negro y tienen actividad lecitinásica por eso actúan sobre la yema del huevo produciendo un halo claro alrededor de la colonia.
Composición Peptona de Caseina 10,0 g Extracto de Carne 5,0 g Extracto de Levadura 1,0 g Cloruro de Litio 5,0 g Glicina Piruvato de sodio Agar 12,0 g 10,0 g 17,0 g
Disolver los ingredientes en agua y hervir. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición durante 1 min para disolución total. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Enfriar a 45°C y agregar 45ml de emulsión de yema de huevo y 10 ml de solución de telurito. Homogeneizar y distribuir en placas de Petri. El pH final debe ser 6,8 0,2.
Agar Hektoen entérico
Contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de la flora acompañante y dos sistemas indicadores: (i) azul de bromotimol y fucsina ácida como indicadores de la fermentación de carbohidratos, y (ii) el citrato de hierro como un indicador de la formación de SH2 a partir del tiosulfato. El desarrollo de Shigella spp. es adecuado debido a que la inhibición de estos microorganismos por las sales biliares está disminuida por la adición de cantidades relativamente elevadas de peptona y carbohidratos. Este medio permite una buena diferenciación de las colonias e inhibe el desarrollo de algunos coliformes y otras bacterias no
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fermentadoras de lactosa, facilitando así la identificación de Salmonella y
Shigella a partir de la muestra.
Composición Peptona 12,0 g Extracto de levadura 3,0 g Sales biliares 9,0 g Lactosa 12,0 g Sucrosa Salicina NaCl Tiosulfato de sodio Citrato ferrico amonico Azul de bromotimol Fucsina acida Agar Agua destilada 12,0 g 2,0 g 5,0 g 5,0 g 1,5 g 0,065 g 0,1 g 14,0 g 1,0 l
Calentar agitando con frecuencia hasta disolver, no calentar más de 1 min. No sobrecalentar. Ajustar el pH final 7,5 0,2
Agar Levine
Medio de cultivo utilizado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos. Puede ser usado para examen microbiológico de materiales clínicos y para el control sanitario de aguas servidas, productos lácteos y otros. Este medio sirve de orientación y no de confirmación. La combinación de eosina y azul de metileno usado como indicador permite una marcada diferenciación entre fermentadores o no de lactosa e inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y negativas fastidiosas.
Los microorganismos fermentadores de lactosa originan colonias de color negro azulado con brillo metálico. Las colonias de microorganismos no fementadoras de lactosa son incoloras. Algunas bacterias Gram positivas y levaduras pueden crecer como colonias incoloras y puntiformes.
38 Composición Peptona 10,0 g Lactosa 10,0 g K2PO4 2,0 g Agar 15,0 g Eosina Azul de Metileno 0,4 g 0,065 g
Disolver en agua y hervir hasta disolución total. Distribuir y autoclavar por 15 min a 121ºC. El pH final debe ser 7,1 0,2.
Agar Plate Count (APC)
Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas.
Composición Triptona 5,0 g Extracto de Levadura 2,5 g Glucosa 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1 l
Disolver los ingredientes en agua y hervir. Colocar en tubos o frascos y autoclavar por 15 min a 121ºC. El pH final debe ser 7,0 0,1.
Agar Verde Brillante (VB)
Es un medio de enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. (excepto
Salmonella typhi y paratyphi A) a partir de alimentos, medicamentos y otros
materiales de importancia sanitaria. La peptona y el extracto de levadura constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y minerales. La lactosa y sacarosa son los hidratos de carbono fementables, el rojo fenol es el indicador de pH que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azucares. El VB inhibe el desarrollo de la flora Gram positiva y algunos microorganismos Gram negativos.
39 Composición Pluripeptona 10,0 g Extracto de levadura 3,0 g NaCl 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa Rojo fenol Verde Brillante Agar 10,0 g 0,08 g 0,0125 g 20 g
Agar Violeta Rojo Bilis Lactosa (AVRB-L)
Es un medio selectivo utilizado para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos, productos lacteos y otros materiales de importancia sanitaria. La peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el Cristal Violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el Rojo Neutro es el indicador de pH. El agar es el agente solidificante.
Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen el viraje del indicador de pH al color rojo intenso, debido a esto se observan colonias de color rojo purpura, de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas generalmente de una zona rojiza de bilis precipitada.
Composición Extracto de levadura. 3,0 g Peptona. 7,0 g Sales Biliares 1,5 g Lactosa 10,0 g NaCl Rojo Neutro Cristal Violeta Agar 5,0 g 0,03 g 0,002 g 15 g
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Disolver los ingredientes en agua y hervir. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición durante un minuto para disolución total, no esterilizar en
autoclave. Enfriar y distribuir en placas de Petri. El pH final debe ser 7,4 0,2.
Agar de Xilosa- Lisina- Desoxicolato (XLD)
Es un medio moderadamente selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de enterobacterias patógenas, especialmente Salmonella spp. y
Shigella spp. Contiene extracto de levadura como fuente de nutrientes y
vitaminas. Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y por consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos. La xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prácticamente todos los entéricos, excepto
Shigella, y esta propiedad hace posible la diferenciación de dicha especie. La
lisina se incluye para permitir la diferenciación del grupo Salmonella de los organismos no patógenos, dado que, sin lisina, Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa y no se distinguiría de las especies no patógenas. Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH alcalino que imita la reacción de Shigella.
Incluye un sistema indicador de H2S, formado por tiosulfato sódico y citrato férrico amónico, para la visualización del H2S producido, lo que origina la formación de colonias con centros de color negro.
Composición
Xilosa 3,5 g
Lisina 5,0 g
Lactosa 7,5 g
41 Nacl Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Tiosulfato sódico
Citrato férrico de amonio Agar 5,0 g 3,0 g 0,08 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g 13,0 g
Disolver los componentes en agua destilada por calentamiento con frecuente agitación hasta ebullición. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor de 7,4 0,2 a 25°C.
Interpretación
Shigella spp. Colonias rojas
42 I.3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
I.3.1. Pruebas bioqímicas para la identificación de E. coli
HIDRÓLISIS DE LA UREA (agar urea de Christensen)
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea según la siguiente reacción química:
UREA NH3 + CO2
El amoníaco recciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que da como resultado alcalinización y aumento de pH del medio, lo que se manifiesta por el viraje del indicador rojo fenol.
Modo de realización:
Se siembra la superficie del pico de flauta del agar con ansa desde un cultivo puro del microorganismo. Se incuba a 37°C durante 18-24 h hasta 7 días. Interpretación:
Hidrolizadores rápidos de urea: color rojo en todo el medio.
Hidrolizadores lentos de urea: color rojo en principio sólo en el pico de flauta, que de forma gradual se extiende a todo el tubo.
No hidrólisis de urea: el medio conserva el color amarillo original.
T.S.I. (TRIPLE AZÚCAR HIERRO) - K.I.A. (AGAR HIERRO DE KLIEGER)
Los medios KIA y TSI pueden detectar tres características: la capacidad de producir gas en su proceso de fermentación de azúcares, la producción de grandes cantidades de SH2 (que se visualiza por la formación de un precipitado negro con el hierro ya que el medio contiene sulfato ferroso) y la capacidad de utilizar lactosa en KIA o lactosa y sacarosa en TSI. La formación de gas se visualiza usualmente como burbujas o fractura del medio provocado por la presión del gas formado dentro del agar. Los dos medios, TSI y KIA contienen una cantidad limitante de glucosa y una concentración diez veces mayor de lactosa (y de sacarosa en el TSI).
Las enterobacterias y otros fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes como constituyentes de éstas bacterias, las que pueden obtener la mayor energía por utilización del azúcar más simple. La utilización de la
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glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis; luego el piruvato, formado por la degradación de la glucosa es metabolizado a productos ácidos. El ácido en el medio hace virar al amarillo el indicador de pH rojo fenol. Entonces luego de seis horas de incubación la zona de la estría y el fondo del tubo de TSI o KIA inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa el fondo permanecerá naranja (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (rojo). Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, un microorganismo con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene diez veces más lactosa (o sacarosa en el TSI) que glucosa el microorganismo (si es capaz de utilizar éstos azúcares) encontrará sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos, luego de 18 a 24 h de incubación todo el medio TSI o KIA permanecerá de color amarillo. Si el organismo en estudio no es capaz de utilizar la lactosa y/o la sacarosa del medio, debe producir energía en forma menos eficiente al utilizar las proteínas y aminoácidos del medio como fuente nutritiva. El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. Los productos de la degradación de la peptona (como el amoníaco) son alcalinos y provocan el viraje del indicador rojo fenol a su color rojo original. Un TSI o un KIA, inoculados con una bacteria que no utiliza la lactosa (ni la sacarosa en el caso del TSI) al cabo de 18 a 24 h de incubación presentará la zona inclinada roja y el fondo del agar permanecerá amarillo debido al metabolismo anaerobio de la glucosa durante la primera etapa.
Modo de realización:
Se toma con un ansa recta una colonia perfectamente aislada se inocula el medio marcando una estría sobre la superficie del agar inclinado y perforando la parte inferior de la columna de agar hasta el fondo del tubo. Se incuba a 35°C durante 18 a 24 h.
Interpretación:
Pico:
1- amarillo: utilizador de lactosa y/o sacarosa (segúnTSI o KIA) 2- rojo o naranja: no utilizador de lactosa ni de sacarosa (TSI)
44 Fondo:
1-amarillo: fermentador de glucosa
2- naranja(s/c): no fermentador de glucosa 3-Precipitado negro: producción de SH2
4- burbujas o fractura de la columna: producción de gas.
L.I.A. (AGAR HIERRO LISINA)
La lisina puede ser decarboxilada a la amina cadaverina, esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol. Puesto que la decarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH < 6), es necesaria la acidificación previa del medio de cultivo por fermentación de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo sólo puede utilizarse para diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos lisina decarboxilasa negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje alamarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia se produce un viraje al violeta. La formación de SH2 produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido. Las cepas del grupo
Proteus-Providencia desaminan a la lisina a ácido a-cetocarbónico. Este último
forma un complejo pardo-rojizo en la región superficial del medio con el hierro y bajo la influencia del oxígeno.
Modo de realización:
Se toma con un hilo una colonia perfectamente aislada y se inocula por punción en la región central de la columna vertical y luego por estría en la superficie del pico de flauta. El tubo se incuba a 37°C durante 18 a 24 h.
Interpretación:
Pico:
1- violeta: entonces ver fondo
2- pardo-rojizo: entonces sospechar que se trata de Proteus-Providencia
Fondo:
1- amarillo: prueba negativa 2- violeta: prueba positiva
45 S.I.M. (SULFHÍDRICO - INDOL - MOVILIDAD)
Debido a que es un medio semisólido puede ponerse en evidencia la movilidad de un germen, o sea la existencia de flagelos, por el enturbiamiento o no del medio. La producción de sulfuros se detecta por la formación con el catión férrico de un precipitado negro de Fe2S3. La enzima triptofanasa degrada el triptofano (proveniente de las peptonas) en indol, el cual se pone de manifiesto porque reacciona con el p-dimetil-amino benzaldehído formando un complejo color rojo.
Modo de realización:
Se toma con un hilo una colonia perfectamente aislada y se inocula por punción en la parte central de la colmna sin llegar al fondo del medio de cultivo. El tubo se incuba a 35°C durante 18 a 24 h.
Interpretación:
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. La producción de SH2 se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento. La formación de indol da lugar, luego del agregado del reactivo de Erlich, a una coloración roja purpúrea
ROJO DE METILO - VOGES PROSKAUER (CLARK Y LUBS)
Los microorganismos que utilizan la glucosa pueden producir abundantes compuestos acídicos como formato y acetato a partir de piruvato (vía ácido mixta) o pueden metabolizar los compuestos carbonados dando acetoína y butanediol que tienen un pH más neutro (vía butilen glicólica). Los productos de estas vías son detectados en el primer caso por la variación del pH con un indicador: rojo de metilo. Conviene leerlo a las 48-72 h (hasta 5 días) ya que lo importante es la capacidad de que se mantenga un pH bajo (4,2 o menos) superando el sistema de amortiguación de pH. En el segundo caso en presencia del oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoína es oxidada a diacetilo y siendo el α-naftol un catalizador de la reacción se produce un compuesto de color rojo amarronado en la superficie del medio.
Modo de realización:Se inocula el caldo de Clark y Lubs y se incuba a 35°C durante 48 h. A las 48 h a una fracción se le agregan unas gotas del indicador
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rojo de metilo, y a la otra fracción 6 gotas de α-naftol y 2 gotas de KOH al 40%. Agitar suavemente el tubo y dejar reposar 15 min a temperatura ambiente Interpretación:
Rojo: prueba Positiva
RM Amarillo-anaranjado: prueba Negativa
Rojo amarronado: prueba Positiva
VP Anillo marrón o sin cambio: prueba Negativa
MUG
Alrededor del 94% de las cepas de E. coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima -glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4 metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar E. coli.
Modo de realización:
Se toma una colonia de la cepa en estudio y se siembra en un tubo con caldo suplementado con MUG a la par se larga un control positivo con la cepa patrón de E. coli ATCC 25922. Se incuba durante 24 h a 36°C.
Interpretación: un ensayo positivo se evidencia por la aparición de fluorescencia a la luz U.V.
ENTEROHEMOLISINA
En E. coli O157, existe una estrecha relación (90%) entre la producción de Stx y de enterohemolisina (EHEC-Hly), por lo cual se considera que la detección de EHEC-Hly puede ser un marcador epidemiológico útil para seleccionar rápidamente probables cepas STEC O157. Sin embargo, en cepas STEC no-O157 la relación entre estos marcadores de virulencia es menor.
Para la caracterización de cepas productoras de enterohemolisina, se emplean placas con agar base triptosa suplementado con 10 mM de Cl2Ca y 5% de sangre desfibrinada de oveja, lavada tres veces con solución salina buferada
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(PBS) estéril pH 7,2. Como control se emplean placas de agar base triptosa con 5% de sangre desfibrinada de oveja, sin lavar y sin el agregado de Cl2Ca. Las cepas se siembran en paralelo placas de agar sangre lavada y sin el agregado ce Cl2Ca.
A las 18 h de incubación se realiza la lectura para la detección de hemólisis típica por EHEC-Hly. El único requisito de emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída.
La cepa es productora de EHEC-Hly si después de 18 h de incubación aparece una fina hemólisis alrededor de la zona de siembra sólo en la placa de ensayo (con Cl2Ca).
Si después de 18 h de incubación también se observa hemólisis en ambas placas (con Cl2Ca y sin Cl2Ca), la cepa es productora de α-Hly y no de EHEC-Hly.
Se puede visualizar mejor la hemólisis levantando suavemente el desarrollo bacteriano con un ansa.
A B
Figura: A: placas lavadas con Cl2Ca, B: placas sin lavar y sin Cl2Ca, 1: Aislamiento de E. coli O157:H7 EHEC-Hly positivo, 2: Cepa de referencia E.
coli ATCC 32511 EHEC-Hly positiva, 3: cepa de referencia E. coli ATCC 25922
EHEC-Hly negativa.
Preparación:
Estos medios se utilizan para la detección de la enterohemolisina de EHEC. Se emplean placas con agar base triptosa suplementado con 10 mM de Cl2Ca y 5% de sangre desfibrinada de cabra u oveja, previamente lavada tres veces con solución salina buferada esteril pH 7,2. (AGRL) y como control se emplean
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placas de agar con 5% de sangre desfibrinada de oveja, sin lavar y sin el agregado de Cl2Ca (AGRSL).
Placa de AGRL (para 20 ml de agar)
Recomendación: se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída.
Preparación de la placa AGRL
1. Dispensar el medio de TSA en cada placa de Petri y dejar solidificar. 2. Mantener el medio de TBA a 50ºC.
3. Agregar el Cl2Ca al TBA y homogeneizar.
4. Incorporar el volumen necesario de GRL al TBA. Mezclar suavemente con movimientos circulares.
5. Agregar el agar TBA con los GRL en las placas de Petri con TSA.
6. Conservar a 4ºC. Utilizar dentro de los 15 días posteriores a su preparación.
Agar base triptosa (TBA) 10 ml
Agar TSA 10 ml
Cl2Ca 1M 0,1 ml
Glóbulos rojos lavados (GRL) de
sangre desfibrinada de cabra u oveja 0,5 ml
Placa de AGRSL (para 15 ml de agar: una placa)
Recomendación: Se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída.
Preparación de la placa AGRSL
1. Mantener el medio de TBA a 50ºC.
2. Incorporar el volumen necesario de GRSL al TBA. 3. Mezclar suavemente con movimientos circulares.
4. Dispensar el agar TBA con los GRSL en las placas de Petri. 5. Identificar a las placas como placas controles.
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Agar Base triptosa (TBA) 15 ml
Glóbulos rojos sin lavar (GRSL) de sangre desfibrinada de cabra u oveja
0,75 ml
Preparación de los componentes de las placas de AGRL y AGRSL TBA (Agar Base triptosa)
Preparación
1. Disolver los componentes en un litro de agua destilada 2. Calentar a ebullición hasta disolución completa
3. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. Dejar enfriar
4. Mantener en baño de agua termoestatizado a 50ºC para la preparación de las placas de AGRL y AGRSL
Nota: el TBA puede ser reemplazado por agar base sangre (Difco)
Cloruro de calcio 1M (para 10 ml)
Cloruro de calcio: 1,11 g Preparación
1. Disolver el Cl2Ca en 10 ml de agua destilada. 2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 μm.
3. Conservar el Cl2Ca 1M a temperatura ambiente para la preparación de la placa de AGRL.
Obtención de GRL de sangre desfibrinada de cabra u oveja
Preparación
1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 min.
2. Desechar el plasma
3. Resuspender suavemente con micropipeta, 1 vol de glóbulos rojos en 2 vol de solución salina bufferada estéril pH 7,2. Se debe obtener una suspensión homogénea sin romper los glóbulos rojos.
4. Centrifugar a 2500 rpm por 10 min. 5. Repetir 2 veces los pasos 2, 3 y 4. 6. Desechar el sobrenadante.
50 Obtención de GRSL de sangre desfibrinada de cabra u oveja
Preparación
1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 min.
2. Desechar el plasma.
51 I.3.2. Pruebas bioquímicas para la identificación de Staphylococcus aureus
CATALASA
La catalasa es una hemoproteína similar en estructura a la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno es uno de los productos oxidativos finales en el metabolismo aerobio de los carbohidratos. Si se acumula, el H2O2 es letal para las células bacterianas. La catalasa convierte el H2O2 en H2O y O2.
H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)
Modo de realización:
A partir de una colonia fresca de 18 a 24 h transferir células a la superficie de un portaobjetos. Agregar 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.
Interpretación:
La rápida aparición y sostenida producción de burbujas de gas o efervescencia constituyen un resultado positivo.
Falsos positivos:
* Si se toma la colonia a partir de una placa de agar sangre, evitar arrastrar medio, ya que los eritrocitos tienen actividad catalasa.
* Siempre se debe agregar el H2O2 al microorganismo y no a la inversa, en especial si se utilizan ansas con contenido de hierro, porque puede dar resultados falsos positivos.
* Como algunas bacterias pueden tener otras enzimas que descomponen el H2O2, la producción de unas pocas burbujas pequeñas formadas después de 20 a 30 s no se considera resultado positivo.
Falsos negativos:
* El H2O2 debe conservarse en frascos color caramelo y refrigerada. Podemos tener un falso negativo por descomposición del H2O2.
COAGULASA
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, produciendo un coagulo visible en un sistema de prueba apropiado. Se cree que la coagulasa actúa in vivo formando una barrera de fibrina en el sitio
