Dr. Alberto Pacheco Castro
IVI-‐ Madrid
Congelación y banco de semen
ESTERILIDAD MASCULINA
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Contenido
Resumen ... 2
1. Congelación de muestras de semen ... 3
1.1. Congelación de la muestra ... 3
1.2. Mantenimiento de las muestras congeladas ... 4
Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos recipientes de congelación ... 5
1.3. Descongelación ... 6
1.4. Descongelación ... 7
2. Banco de semen de donantes ... 7
2.1. Criterios de selección... 7
Tabla 2. Pruebas de selección, con valores de aceptación, de donantes en el centro de Reproducción IVI-‐Madrid ... 8
2.2. Donaciones: mantenimiento y gestión del banco de semen ... 9
2.3. Utilidad del Banco de semen ... 10
3. Bibliografia ... 11
8. Lecturas recomendadas ... 12
Resumen
La congelación de semen es una técnica que permite conservar por un largo periodo de tiempo muestras de los distintos tipos celulares existentes en un eyaculado sin una pérdida significativa de la viabilidad celular, gracias a su mantenimiento a muy bajas temperaturas (criopreservación).
Existen distintos métodos de congelación, variando tanto el medio crioprotector utilizado, el protocolo de congelación empleado y el recipiente de congelación utilizado para su posterior mantenimiento. Las muestras congeladas se mantendrán almacenadas hasta su utilización en unos contenedores especiales denominados tanques de almacenamiento o bancos de semen. Las aplicaciones de esta técnica crecen progresivamente, siendo especialmente indicado para pacientes que se van a someter a tratamientos quirúrgicos o médicos que suponen una reducción de su fertilidad.
Una aplicación especial de esta técnica es la generación de un Banco de Semen de Donantes, que se encarga de la gestión, selección y distribución de semen congelado de donantes anónimos altruistas, cuyos gametos serán empleados en técnicas de reproducción asistida de parejas con un factor masculino grave.
1. Congelación de muestras de semen
Mediante la congelación de semen podemos conservar muestras de espermatozoides procedentes tanto de eyaculado como de testículo o epidídimo, manteniéndolas a temperatura de -‐196 ºC (criopreservación) hasta su descongelación y posterior utilización. El objetivo último de la congelación es recuperar el mayor número de espermatozoides viables tras la descongelación. Por tanto, es importante evitar durante todo el proceso de congelación cualquier cambio brusco en la fisiología de la célula espermática, como la formación de cristales en el interior celular o los cambios drásticos de temperatura y concentración de solutos, que pudieran provocar la lisis y muerte celular (Ref 1). Para ello, es crucial realizar correctamente todos los procesos que intervienen en la técnica de congelación:
Congelación.
Mantenimiento a bajas temperatura durante un periodo variable de tiempo. Descongelación de la muestra.
1.1. Congelación de la muestra
La calidad inicial de la muestra puede afectar en gran medida a la recuperación de espermatozoides viables tras la descongelación, por lo que, siempre que sea posible, es conveniente congelar muestras con una buena calidad seminal (3-‐5 días de abstinencia previa, ausencia de infecciones en la muestra, procesos febriles..). Antes de la congelación es recomendable realizar un seminograma sencillo (recuento, movilidad, morfología) con el fin de determinar, al final del proceso, la tasa de recuperación obtenida.
El primer paso de la congelación es la dilución de la muestra de semen con un medio de congelación, que sirve de protección celular frente a dicho proceso (2). Existen distintos medios de congelación, aunque todos ellos comparten 3 características:
a) Contienen nutrientes (básicamente azúcares), que aportan la energía necesaria para la célula,
b) Llevan compuestos que facilitan el mantenimiento de la concentración de solutos en las células (soluciones tampón como Tris, Hepes o Bes) y
c) Incorporan compuestos crioconservantes, que a su vez pueden dividirse en penetrantes, si entran en las células y desplazan paulatinamente el agua intracelular evitando la formación de cristales de hielo (como por ejemplo el metanol, el glicerol o el dimetilsulfóxido), o no penetrantes, si forman una película alrededor de la célula que sirve de protección (como los azúcares, o lipoproteínas de la yema de huevo).
Una vez diluida la muestra con el crioprotector y mantenida así durante 5-‐10 minutos, se puede realizar el proceso de congelación propiamente dicho. Existen diversos métodos de congelación de semen, aunque los 2 más utilizados en la actualidad son:
Congelación en píldoras (Figura 1)
Se basa en el empleo de una pastilla de hielo seco comprimido en la que se practica sobre su superficie unos pequeños hoyos donde se irá depositando gota a gota el
semen. Al congelarse por el contacto con el hielo seco se producen pequeñas píldoras individuales, que son posteriormente recogidas e introducidas en un recipiente de congelación debidamente identificado (3).
Figura 1. Protocolo de congelación de muestras en píldoras.
Congelación en pajuelas
En este caso, la muestra de semen diluida con el medio de congelación es introducida previamente en pajuelas de diferentes volúmenes. Tras sellar e identificar las pajuelas, se sitúan sobre un soporte a cierta altura sobre un contenedor con nitrógeno líquido. La congelación de la muestra, en este caso, se produce gracias a los vapores emanados por el nitrógeno líquido.
En ambos casos se produce un descenso progresivo de la temperatura, aunque, debido a la tolerancia de la célula espermática al descenso de temperatura, la rampa de congelación puede ser muy variable (desde 0,5 a 50ºC/minuto).
1.2. Mantenimiento de las muestras congeladas
Una vez congelada la muestra, ésta debe guardarse en un recipiente especializado. Existen distintos tipos de recipientes de congelación, utilizándose aquel que mejor se adapte al sistema de congelación y almacenamiento de cada centro. Un buen recipiente de congelación sería aquel que proporcione de manera homogénea los cambios de temperatura producidos
en el proceso de congelación y descongelación, que sea fácil de identificar la muestra, ocupe el menor espacio posible y sea lo más estanco con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los recipientes de congelación más utilizados son las pajuelas, los criotubos y las ampollas (Tabla 1).
Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos recipientes de congelación
Tipo de
recipiente Ventajas Inconvenientes
Pajuela Velocidad de congelación mayor
Congelación más uniforme
Posibilidad de descongelación parcial
Dificultad de identificación de muestra Mayor tiempo de congelación
Sensibilidad a cambios de temperatura
Criotubo Posibilidad congelación píldoras
Poco tiempo de congelación
Posibilidad de descongelación parcial Facilidad de identificación muestra
Congelación no siempre uniforme Cerrado no hermético
Ampolla Cerrado hermético
Facilidad de identificación muestra
Imposibilidad descongelación parcial Gran espacio almacenamiento Congelación no homogénea
Por último, las muestras congeladas y guardadas en un recipiente de congelación, quedan almacenadas hasta su utilización en unos contenedores especiales denominados tanques de almacenamiento o también llamados bancos de semen. Estos recipientes mantienen la temperatura apropiada en su interior gracias a una cámara aislante, existente entre la envoltura interna y externa (4). En el interior del tanque, quedan alojados unos accesorios que permiten clasificar las muestras congeladas. Los más utilizados son a) las canastillas de acero inoxidable, en las cuales a su vez, y dependiendo de los recipientes de congelación utilizados, pueden depositarse varias varillas con muestras, y b) los racks, columnas de plástico o metal ĚŽŶĚĞƐĞƐƵĞůĞŶĂůŽũĂƌǀĂƌŝŽƐ͞ĐĂũŽŶĞƐ͟ĚŽŶĚĞƐĞƐŝƚƷĂŶůĂƐŵƵĞƐƚƌĂƐ;ĞƐƉĞĐŝĂůŵĞŶƚĞŝŶĚŝĐĂĚŽ para la congelación en criotubos). Por último, y con el fin de mantener el nitrógeno líquido durante el mayor tiempo posible en su interior, los banco disponen de una tapa aislante, con posibilidad de cierre con llave.
Dependiendo de las necesidades de cada laboratorio se suelen emplear distintos tipos de tanques:
x tanques para pacientes y para donantes (de mayor o menor capacidad). En estos recipientes, y dependiendo de su capacidad y de la utilización diaria, el nitrógeno líquido puede mantenerse durante 15-‐30 días.
x tanques de transporte de muestras (generalmente son de pequeño tamaño); en estos recipientes, las muestras se mantienen congeladas en fase gaseosa durante un periodo máximo de 3-‐5 días.
x Tanque de almacenamiento de muestras infecciosas/de reserva. Son útiles para evitar contaminaciones.
1.3. Descongelación
Al igual que ocurre con el proceso de congelación, existen diversos protocolos de descongelación (5), aunque la mayoría de los Centros realizan este proceso pasando las muestras bien directamente del nitrógeno líquido a 37ºC (en un baño o un incubador), o bien con un paso previo de incubación de la muestra a temperatura ambiente. Cabe resaltar de nuevo que la tasa de supervivencia puede depender de otros factores como es la calidad inicial de la muestra (muestras oligo o astenozoospérmicas tienden a descongelar peor), el proceso de congelación realizado o incluso el tiempo de mantenimiento de la muestra en los tanques de almacenamiento (periodos largos de conservación pueden afectar a la viabilidad posterior). Figura 2. Protocolo de descongelación de muestras de semen.
1.4. Descongelación
En la actualidad, existen múltiples indicaciones para la congelación de semen. Las más importantes son:
x Pacientes que se van a someter a tratamientos médicos que suponen una pérdida o disminución de la fertilidad, como tratamientos de quimioterapia o radioterapia. x Conservación de muestras valiosas, como las biopsias de testículos o aspiraciones de
epidídimo.
x Personas que se van a someter a intervenciones quirúrgicas por vasectomía.
x Pacientes seropositivos que desean realizar técnicas de eliminación de agentes infecciosos de la muestra de semen (lavados de semen).
x Pacientes que residen lejos del Centro de Reproducción o que por motivos laborales no pueden estar presente el día que se someten al tratamiento.
x Casos en los que existe dificultad para la obtención del eyaculado (impotencia, eyaculación retrógrada).
2. Banco de semen de donantes
El Banco de Semen de Donantes es un servicio existente en Centros de Reproducción Asistida en el que se obtienen, conservan y gestionan muestras de semen de donantes sanos para su posterior utilización en tratamientos de reproducción asistida en casos de factor masculino grave, falta de pareja u otras indicaciones.
La organización del Banco de Semen es bastante compleja e implica la conexión de distintos procesos, como son la selección y obtención de donantes, el seguimiento de las donaciones periódicas, el mantenimiento de las dosis en el banco y la gestión de la utilización de las dosis en las diferentes técnicas de reproducción asistida.
2.1. Criterios de selección.
El proceso de selección de donantes es de vital importancia para el correcto funcionamiento del banco. Su objetivo es asegurar el buen estado de salud de los candidatos y comprobar la ausencia de enfermedades de los mismos. Para ello, se debe realizar una valoración de los posibles candidatos previa a su aceptación como donantes, que se puede dividir a su vez en 3 procesos:
Captación. Existen diversos métodos para captar donantes, los cuales proceden en su gran
mayoría de la población universitaria. En los primeros momentos de generación del banco, o bien cuando no se disponen de muchos donantes, los métodos más habituales son los anuncios en prensa universitaria, anuncios/octavillas en las Facultades y Escuelas Universitarias (sobre todo en los meses de inicio del curso académico), así como en Colegios Mayores e instalaciones deportivas. Cuando el Banco se encuentra ya en funcionamiento, los mismos donantes son los que lo comentan a conocidos y compañeros universitarios, siendo ellos mismos los primeros en motivarlos.
Selección. Cuando un candidato está interesado, bien por vía telefónica o bien personalmente,
periodo de donación (abstinencia sexual previa a los días de donación, asiduidad periódica durante el tiempo de donaciones y aceptación de los controles serológicos periódicos), la aceptación por ambas partes del anonimato de las donaciones, así como la compensación económica que percibirán en concepto de gastos de desplazamiento (las donaciones en España es siempre un acto altruista y desinteresado). En el caso de que sigan interesados en participar como donantes, se les cita para la realización de las pruebas de selección.
Pruebas. Las pruebas que se realizan a los donantes sirven para determinar la aceptación final
de los mismos y, por lo tanto, el tipo de pruebas, así como los valores que marcan la aceptación de los donantes, puede variar en cada centro de reproducción, aunque siempre respetando los criterios establecidos por la Ley Española de Reproducción Asistida. Así, las pruebas más habituales se pueden dividir en 3 grupos:
x Formulario de aceptación: el candidato tiene que rellenar un formulario en el que se pregunta acerca de sus datos personales, hábitos de vida (tabaco, alcohol, drogas,etc), historia particular (enfermedades padecidas, promiscuidad sexual,..) e historia familiar (antecedentes de enfermedades genéticas en la familia) (6).
x Seminograma y test de congelación/descongelación: son quizá los análisis más importantes (y en el que se producen un mayor número de descartes de candidatos), ya que determinarán la calidad seminal del candidato. Las determinaciones más habituales son la realización de 1-‐2 seminogramas completos (recuento, movilidad, morfología, vitalidad y capacitación espermática) y la congelación y descongelación de una muestra de semen.
x Analítica: el objetivo de la analítica es la comprobación del estado de salud del candidato así como la ausencia de enfermedades de transmisión sexual (7). Las analíticas realizadas constan de un hemograma, determinación del grupo sanguíneo y factor Rh, pruebas de coagulación, bioquímica, análisis serológico, cultivo de semen y cariotipo (Tabla 2).
Tabla 2. Pruebas de selección, con valores de aceptación, de donantes en el centro de Reproducción IVI-‐Madrid
PRUEBAS VALORES ACEPTACION
Seminograma
Recuento > 70 Millones/ml
Movilidad progresiva > 50% móviles progresivos
Morfología > 14% formas normales
Congelación/descongelación
Movilidad tras descongelación > 15 millones/ml
Analítica
Hemograma, coagulación Valores normales
Cariotipo Normal
Serología
(HIV, VDRL, VHB, VHC)
Ausencia de anticuerpos
Cultivo de semen
(Neisseria, micoplasma, ureaplasma, y Chlamydia)
Ausencia de infección
Después de la realización de estas pruebas, una gran parte de los candidatos quedan rechazados (Tabla 3). Aquellos que las han superado, deben firmar antes de comenzar las donaciones los consentimientos de utilización de dosis con fines reproductivos, el contrato de confidencialidad mutuo entre el Centro y el donante (Real Decreto 412/96), así como la aceptación para la realización por parte del Centro del seguimiento serológico periódico del donante.
2.2. Donaciones: mantenimiento y gestión del banco de semen
Una vez que el donante es aceptado en el Banco, se establece de mutuo acuerdo un calendario de donaciones, generalmente constituido por una donación semanal y con una duración aproximada de 6-‐8 meses; estos periodos se pueden prolongar o modificar por diversos motivos (vacaciones, periodos de exámenes, procesos gripales u otras enfermedades..). Es importante que durante el periodo de donaciones se mantenga el periodo de abstinencia de 3 días previos a cada donación con el fin de obtener muestras de buena calidad espermática. De cada dosis donada, se realizará en primer lugar un seminograma simple (volumen, recuento, movilidad); posteriormente, se procederá a la congelación de la muestra, guardándose en un recipiente de almacenamiento perfectamente identificado y finalmente se almacenará y registrará en el banco hasta su utilización. Una vez que la dosis se encuentra en el banco, se realizará una prueba de descongelación.
Gestión informática del Banco. Para una adecuada gestión del Banco, es importante tener un
registro informatizado, así como un archivo en papel en los que exista constancia escrita de los registros complementarios al programa informático. El acceso al registro del Banco debe quedar restringido, mediante una clave secreta, al personal autorizado con el fin de garantizar en la mayor medida posible la confidencialidad de los datos de los donantes.
En el programa informático debe constar todas las fichas de los donantes, presentes y pasados, de forma individualizada. Cada ficha de donante incluirá el nombre y apellidos, teléfono y dirección de contacto, la clave de identificación o número de historia, las características físicas, grupo sanguíneo y las analíticas realizadas, tanto en la fase de aceptación como durante las donaciones. A su vez, dentro de cada ficha de donante, debe aparecer de forma clara el registro de las donaciones realizadas de forma individualizada, en la que conste la fecha de la donación, los valores seminales obtenidos, su posición en el tanque de almacenamiento y la disponibilidad o no para su utilización. En el caso de utilización, debe quedar reflejado el paciente que ha recibido la muestra, siguiéndose el control de embarazo y de recién nacidos vivos con el fin de no sobrepasar el límite de embarazos por donante recomendado por la Ley de Reproducción Asistida.
Antes de comenzar a utilizar las dosis almacenadas, se deben realizar a los donantes controles serológicos y microbiológicos periódicos (8). Estos controles se realizarán al mes, a los 3 meses y a los 6 meses de la finalización de las donaciones e incluirán las mismas pruebas analíticas que las realizadas en el momento de la selección del donante (ver Tabla 2).
2.3. Utilidad del Banco de semen
La utilización de semen de donante en las técnicas de reproducción asistida está indicada en los siguientes casos:
x Parejas heterosexuales con varón azoospérmico, tanto en el eyaculado como en el testículo, el epidídimo, o en ambos.
x Riesgo de transmisión de trastornos genéticos o enfermedades contagiosas por la utilización de semen de la pareja.
x Enfermedades inmunitarias (anticuerpos anti-‐espermatozoides) x Mujeres monoparentales
3. Bibliografia
James PS, Wolfe CA, Mackie A. Hum Reprod 1999, vol 14: 1827-‐1832. Prins GS, Weidel L. Fertil Steril 1986, vol 46: 147-‐149.
Meseguer M, Ruiz A, Garrido N. En: Reproducción Humana 2ª Ed. Remohi J, Pellicer A, Simón C Eds. McGrawHill Interamericana 2002: 363-‐371.
Tomlinson M, Sakkas D. Hum Reprod 2000, vol 15: 2460-‐2463
Wolf DP. En: Gametes. The spermatozoon. Grudzinskas JG, Yorich JL. Cambridge University Press 1995: 192-‐205
Linden JV, Centola G. Fértil Steril 1997, vol 68: 597-‐600.
British Andrology Society. Hum Reprod 1999, vol 14: 1823-‐1826
American Society for Reproductive Medicine. Fertil Steril 2002, vol 77 (6), suppl 5: S1-‐S5
8. Lecturas recomendadas
Meseguer M, Ruiz A, Garrido N. Congelación y banco de semen: Métodos, organización e indicaciones. En: Reproducción Humana 2ª Ed. Remohi J, Pellicer A, Simón C Eds. McGrawHill Interamericana (2002): 363-‐371.
American Society for Reproductive Medicine. 2002 Guidelines for gamete and embryo donation: a practice comité report. Guidelines and minimum standards. Fertility and Sterility 2002, vol 77 (6), suppl 5: S1-‐S5:
Wolf DP. Sperm Storage. En Gametes. The spermatozoon. Grudzinskas JG, Yorich JL. Cambridge University Press (1995): 192-‐205
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