Las laminillas di son muy importantes sobre todo si se considera que los grupos. d) Nombre y adscripdn de br rc~ores:

4. Restmen del ServKi s.cW a) kmbm Hortencia Monks COI%&

M.MCd.: 94225520

Lieacbb

rn: Biología

b) Titnb

de¡

trabajo:

ELABORACIdN

DE

PREPARACIONES FUAS

DE

MATEERIAL BIOLÓGICO DE HELECHOS

Y

PLANTAS

AFINES.

c) Clave del registro del Serrkh Social y fecba de entrega: B01900,15 de diciembre del 2000

_J

d)

Nombre y adscripdn de br rc~ores:

Carmen

de

la Paz Pérez Olvaa

Profesor Titular C

Departamento de Biología

UAMI UAMI

e) Resumen de los objetivos, remitados y conclusiones

Jacqueline Ceja Romero Profesor Asociado D Departamento de Biologia

El objetivo de este Servicio

SOciJ

fue

elaborar preparaciones permanentes

de

los distintos jrganos de helechos y plantas afines

como

apoyo fundamental en el trabajo de laboratorio de

ilgunas

uu.ee.aa. de la Licenciatura

en

Biología y Biología Experimental, específicamente en

a parte botsnica.

El material biológico procesado fue tallo, hoja,

m'z y

_{estnicturas reproductoras (estróbilos)} ie Psilotum, Lycopodium,

Selaginella

Equisetum, Nephrolepis y Lonchitis, dándo un total de

$4

preparaciones. Aunque

no

se habían considerado denbo de los objetivos, también se

rabajaron el tallo y las estructuras reproductoras (conos) de

algunas

gimnospermas,

:laborbdose 21 preparaciones XI&, tmimdo en total 105 preparaciones.

Las

laminillas

d i

son muy importantes sobre todo si se considera que los grupos

lue se trabajaron son

escasos

o de difícil obtención dada su distribución y fenología. Algunos

le los órganos (raíz, hoja y estructuras reproductoras), son dificiles de procesar en el aboratorio, por lo que se obtuvieron pocas laminillas, pero todas ellas de buena calidad.

Contar con buenas preparaciones de las distintas estructuras de la plan* es imp&nfe )ara tener un mejor conocimiento de los diversos aspectos de su biología, estando los nás importantes la observacióp de su anatomía, que sirve como base en-la toma d&zckioaes axonómicas, en inferir el tipo de hábitat, auxiliar en el entendimiento de su fisiología, :ntender la evolución de

las

distintas estructuras etc., siendo por ello importante elmahejo de

as diferentes técnicas de tinción, que permitan la elaboración de preparaciones fijas.

Finalmente, se comprueba la bondad de la técnica de inciusión en parafma y el protocolo de tinción safranins-verde rápido en el procesamiento de la anatomia de los distintos órganos ie estos grupos vegetales.

5. Formato de Presentaci6n del Informe Final a. Introducción

Dentro del grupo de plantas vasculares que se originaron aproximadamente casi 400 millones de años (Bold et al., 1980). encontramos a las plantas afines a helechos. las cuales podrían ser

los

primeros representantes de los diferente taxa de las plantas terrestres existentes en la actualidad.

El primer grupo corresponde a la División Psilotophyta con dos géneros actuales: Psiloturn y Tmesipteris. Se caracterizan por carecer de hojas y raíces. presentar un tallo

subterráneo o rizoma y un tallo aereo que se dividen dicotómicamente. Sus estructuras asexuales o esporangios se encuentran sostenidos por ramas laterales muy cortas. Se

consideran

las

plantas más primitivas y sencillas. En México sólo se encuentra

Psilorim

(Bold et

al..

1980) (Lám. ₁ a).

El segundo grupo es el de l a División Microphyllophyta. representado por cuatro géneros: Lycopodiiirn.

Seluginrlla.

lsottes y /‘hyUog/os.siim. En México. únicamente vegetan

los tres primeros. distribuyéndose principalmente en bosques y selvas. El grupo se caracteriza

p r presentar un tallo subterráneo o rizoma. un tallo aéreo. hojas y raíces bien definidas. Sus estructuras asexuales o esporangios se encuentran sobre la. cara abasia1 de un conjunto de hojas modificadas. formando lo que _se c o n o ~ e conlo estróbilos. Lycoppotliirni presenta esporangios con un solo tipo de esporas (homosporia). mientras que SrlcigOirllu presenta esporangios con 2 tipos de esporas diferentes (heterosporia) (Bold

ef

d.. 1980) ( L h . 1 t,

>

C).

El Tercer grupo, corresponde a la División Arthrophyta. l a cual tiene un solo género.

Equisetum. de distribución cosmopolita que se caracteriza por presentar un rizoma o tallo subterráneo del cual parten tallos aéreos ramificados y articulados. debido a la presencia de nudos y entrenudos. Presenta hojas que al madurar se hacen escamosas. Sus estructuras reproductoras o estróbilos se localizan en l a porciOn apical de las ramas y tiene un solo tipo de esporas (homosporia). Una característica es que los tejidos poseen sílice el cual se va acentuando a medida que l a planta madura, esta característica hace que sea anatómicamente difícil de procesar (Bold et

al..

1980) (Lám. I d).

El último grupo es el de los iieicchos. que cvrresponde

a

l a división Pieridoph>ta con cerca de 10,000 sp. L a mayoría se caracteriza por poseer un tallo subterráneo

o

rizoma. aunque algunos presentan un tallo aéreo. Todos presentan raíces y hojas bien definidas. Este ultimo órgano es el mas dominante. Su talla es muy variada, desde unos cuantos centímetros como en los helechos acuáticos hasta más de 14 m en los arborescentes. Sobre l a cara adaxial de l a hoja se forman las estructuras reproductoras asexuales o esporangios, que en conjunto forman los soros (Strasburger et d., 1985) (Lám. 1 e).

Para tener un mejor conocimiento de estos grupos de plantas vasculares. es básico estudiar los diversos aspectos de su biología estando entre los más importantes la observación

de su anatomía. Por lo que es necesario contar con buenas preparaciones de los distintos

órganos de los diversos grupos, ya que este conocimiento sirve como base en l a toma de decisiones taxonómicas, puede ayudar a inferir el tipo de hábitat. auxiliar en el entendimiento de su fisiología y entender l a evolución de las distintas estructuras, siendo importante por ello

el manejo de las diferentes técnicas anatómicas que permitan

la

elaboración de preparaciones fijas.

Existe

una

gran variedad de literatura relacionada con técnicas anatómicas. Entre los trabajos más tradicionales se encuentran el de Johansen (1940). el de Sass (1958) y el de Gaviño et al. (i972), donde se reportan diversas técnicas para los distintos grupos de plantas. en particular se encuentran la técnica de parafina y la tinción safranina-verde rápido que es la que se uso en el presente Servicio Social.

b.

Objetivos

El

objetivo de este Servicio Social fue elaborar laminillas fijas de alta calidad como apoyo principal en el trabajo de laboratorio de algunas uu. ee. aa. de las licenciaturas de Biologia (Anatomía Vegetal) y Biología Experimental (Histologia Vegetal y Organografía Vegetal), básicamente en la parte botánica. El material procesado fue tallo. raiz. hoja ! estructuras reproductoras de

Psilotirm.

L>~copocliinn.

Seltrginrlh. Eyiti.srtitni y helechos. seleccionados con base en su variacion anatómica.

c. Metodología

Recolección y preparación de las muestras

El material procesado se obtuvo de dos salidas de campo. una al Instituto de Ecologia A.

C.

en Xalapa. Veracruz y otra de la u.e.a Fitogeografia de México. de l a Licenciatura de Biologia. El material procesado fue: tallo. hoja. raíz. y estructuras reproductoras de: Pdorirm.

Lycopodiiim. Selaginella. Equisetitrn y 2 género de helechos. La técnica utilizada fue la de

inclusión en parafina.

El material fresco. se cortó en trozos de aproximadamente 5 mm de largo (Fig. 1 ). los

cuales se colocaron en frascos con tijador (FAA). durante 48 horas. procurando que el material quedara cubierto completamente (Fig. 2). Transcumdo este tiempo. se lavó el material con agua corriente hasta eliminar el fijador.

Deshidratación

En los mismos frascos. una vez Ejado y lavado el material. se inició la deshidratacion de las muestras, usando para ello alcohol terbutílico a distintos grados de concentración: 30. 50, 70, 85, 95 y 100%. haciendo cambios cada 24 horas en cada uno, a excepción del de 100%. del cual se hicieron tres cambios.

Infiltración e inclusión en parafina

Para l a infiltración en parafina. se fueron agregando poco a poco, pequeñas escamas de parafina histológica con punto de fusión de 56 a 58 "C cada dos o tres horas durante 2 dias (Fig. 3). Para la infiltración los frascos se colocaron en un horno a temperatura de 58" a 60

"C

durante un tiempo variable dependiendo de la consistencia del material (F~ig. 4).

Una vez que el material quedó infiltrado, se procedió a incluir en pequeños moldes con parafina. en donde se orientaba dependiendo del tipo de corte deseado y se dejo solidificar (Fig. 5).

Cortes

Los cubos de parafina fueron colocados en soportes de madera (Fig. 6). para hacer los cortes en un micr6tomo de rotación de las diferentes estructuras, de un _{grosor de entre 15 y} 25 rnicras (Fig. 7).

Se obtuvieron listones de parafina con cuatro o cinco cortes, que se colocaron en agua a una temperatura de 55-60 "C. AI agua se le agregó un poco de grenetina con el fin de que la parafina se estire. Después con la ayuda de una aguja o pinzas con punta fina. el listón se

coloc6 sobre un portaobjetos (Fig. 8).

Cada portaobjetos, se marcó con un plumón indeleble anotando el nombre vulgar

o

científico de la planta, el Órgano y el tipo de corte. Posteriormente. con un lápiz de punta de diamante se remarcó la misma información. para evitar confusiones en el manejo del material.

Desparafinado y tinción con safranina

Para desparafinar, se colocaron 1 O portaobjetos en una canastilla. pasándola por silo1 (30 min). xilol-alcohol (20 min). alcohol del 100% (20 min). alcohol del 96% (20 min). alcohol del 70% (20 minl alcohol del jOY0 (20 mini y alcohol del 30% (20 min) (Fig. 9).

Una vez desparafinados los cortes, se inició el protocolo de tinción. colocando los portaobjetos en safranina durante 24 horas. pasando este tiempo. se sacaron del colorante ! se

lavaron con agua destilada hasta quitarles el excedente. Tinción con verde rápido y montaje

Después de la safranina. se agregaron de cinco a diez gotas de alcohol del 30%. 50%. 70% y 96%. dejándolas por espacio de un minuto en cada alcohol. Inmediatamente. se agregó

el verde rápido, el cual se dejó de 10 a 25 segundos dependiendo del tipo de órgano. Enseguida se agregaron 2 cambios de un minuto cada uno de alcohol absoluto. a continuación

se dejaron en aceite de clavo por cinco minutos. Una vez transcurrido este tiempo. se hicieron dos a tres cambios en xilol de lminuto cada uno (Fig. 10). En esta fase se hizo la observación al microscopio para corroborar la calidad de los cortes (Fig. 1 I). Si éste era de buena calidad se procedía a l montaje agregando algunas gotas de resina y se colocaba un cubreobjetos con el cuidado de no formar burbujas.

.

Limpieza y etiquetado

Una vez seca l a resina, se limpiaron las laminillas con xilol y se etiquetaron con el nombre científico, el órgano correspondiente, el tipo de corte y el protocolo de tinción. Finalmente se colocaron en cajas de preparaciones (Fig. _12).

En cuadros se resume las laminillas obtenidas y el nombre del género yio especie de las plantas procesadas.

b

d

;$.

3

METODOLOG~A

29

El'

F

'is.

I . C :one del materi al

1

Fig. 7. Fijación

. .

I ig. 5. Orientacion de las muestras dentro de los moldes

Fig. 4. Colocación de los frascos en el homo

Fig. 1. Corte

Fig. 8. Obtencion del liston en el portaobjetos

a Fig. iüs&iw IO. 1 _____ Iy 'inción

Fig. I I í 3bsei rvac :ión

,

de inuesti ra

_.

d. Actividades realizadas

Cuadro I . Calendario de las actividades realizadas

Actividades Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Selecci6n del material X

I Tincion I I I I X X I I

e. Objetivos y metas alcanzados

El objetivo de este Servicio Social fue l a elahoracion de laminillas fijas de helechos !

plantas afines de alta calidad. En total se obtuvieron 17 laniinillas de helechos y 67 laminillas de planta afines. Aunque no se habían considerado dentro de los objetivos. también se elaboraron 21 laminillas de tallo y estructuras reproductoras de gimnospermas. dando un total de 105 laminillas de las 90 programadas todas ellas de buena calidad. cumpliendo en su totalidad el objetivo programado (Cuadro 2).

Cuadro

2.

Laminillas obtenidas

Helechos Plantas

I

Gimnospermas

I

j

atines

I I

I

17 I _{67 21}

f. Resultados y conclusiones

El

material biológico procesado fue de: tallo. hoja, raíz y estructuras reproductoras de

Psilofum, Lycopodium. Selaginella, Eqrrisetirm. Nephrolepis

y

Lonchitis. En

total se realizaron 20 laminillas de

Psilofum,

17 de

Lycopodium,

19 de

Selaginella.

1 1 de

Eqitise/um

y 17 de helechos, dando un total de 84 preparaciones. De las gimnospermas se obtuvieron 11 laminillas de tallo y 10 de estructuras reproductoras (conos masculinos)

de

Tmodirim

mucronatum

y

Pinus.

es decir

2

1 preparaciones más

Los resultados se resumen en el cuadro 3. El material de algunas de las laminillas obtenidas se ilustra en las figuras de la 13 a la 22.

*helechos

**gimnospermas

Conclusiones

I . El órgano del que mayor numere de lmini!!s se obtuvieron fue el tal!o y que su anatomía permite se procese más fácilmente.

7. Los órganos. hoja, raíz y estructuras reproductoras fueron más dificiles de procesar debido a su forma. tamaño y anatomia. sin embargo. aunque pocas. se obtuyieron buenas preparaciones de los mismos.

3. Debido a la,distribución y a la fenologia que presentan cada uno de los grupos que integran a las plantas afines as¡. como el número de especies con que cuentan. es dificil conseguir el material para procesar. sobre todo fértil. siendo ello una de las causas por las que se obtuvo un número reducido de preparaciones fijas de estructuras reproductoras. Sin embargo, aunque pocas. estas son de buena calidad y apoyarán considerablemente la impartición de los cursos correspondientes.

4.

El material con gran cantidad de silice como en el caso de

Equiretirrn,

se sugiere que se someta a un proceso de desilificación antes de hacerse la técnica de inclusión a fin de evitar se desgarre al cortar. Otra opción es trabajar con estructuras provenientes de individuos jóvenes, en los cuales la depositación de sílice es mínima.

5. Contar con buenas preparaciones de las distintas estructuras de la planta. es importante para tener un mejor conocimiento de los diversos aspectos de su biología. estando entre

los más importantes la observación de su anatomía, que sirve como base en la toma de decisiones taxonómicas, en inferir el tipo de hábitat, auxiliar en el entendimiento de su fisiologia, entender la evolución de las distintas estructuras etc., siendo por ello importante el manejo de las diferentes técnicas de tinción que permitan la elaboración de preparaciones fijas.

6 . Finalmente se comprueba la bondad de la técnica de inclusión en parafina y el protocolo de tinción safranins-verde rápido en el procesamiento de las estructuras de los distintos órganos de estos grupos vegetales.

~~

u,

c

Id

b

L

'

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a"

g. Criterios de evaluación

-

-

-

Entrega del informe final Agradecimientos

fotográfico.

h.

Bibliografia

Bold, H. C.; C. J. Alexopoulos. y

T.

Delevoryas. 1980. Morphology o f the plants and fungi. Gaviño, G., J. C. Juárez y H. H. Figueroa. 1972. Ténicas biológicas selectas de laboratorio Johansen.

D.

A. 1940. Plant microtechnique. McCraw-Hill Book. Nueva York. 573 p. Sass. J. E. 1958. Botanical microtecnique. 3a ed. College Press. Iowa. 328 p.

Strasburger E.. F. Noll. H. Schenck. y

F.

W. Schimper, 1985. Tratado de Botánica. 7" Cumplimiento de los objetivos en los tiempos señalados

Obtención de laminilllas de alta calidad

La alumna agradece al Sr. Jorge Lodigiani la toma y procesado del material

4a ed. Harper International, EUA. 8 19 p.

y de campo. Limusa-Wiley. S. A. México. 25 1 p. 523 p.

fotografías

de

los Órganos

de algunas

de

las

Helechos y plantas afines

Fig. 14. Hoja de Lycopodiirm (licopodio)

Fie.

de S, 16. Corte elagirirlln ongitudinal doradilla) de estróbilo

c

a

P

'

Gimnosperrnas

a

~