LA DUPLICACIÓ DEL DNA i LA
BIOSÍNTESI DE PROTEÏNES
La duplicació del DNA
i la biosíntesi de les proteïnes
●
La duplicació del DNA. Investigacions
i propietats.
●
Mecanismes de la duplicació.
●
La transcripció del DNA.
Introducció
● L’ADN durant la vida de la cèl·lula té dues funcions:
– Transmetre la informació que conté a la descendència.
(Replicació o duplicació)
– Expressar la informació que conté en forma de proteïnes.
La duplicació o replicació del DNA
Procés mitjançant el qual a partir d'una molècula de DNA de doble hèlix se'n sintetitzen dues de idèntiques.
La molècula “progenitora” serveix de “motlle” per a la síntesi de la seva còpia.
La replicació té lloc necessàriament cada cop que es divideix una cèl·lula i constitueix una etapa del seu cicle de vida.
Hipòtesis sobre la duplicació del DNA
● Hipòtesi conservadora.
● Hipòtesi semiconservadora
(Watson i Crick)
●
Molècula DNA
progenitora
Hipòtesi replicació conservadora
●
Molècules DNA
filles
Molècula amb els dos filaments
Hipòtesi replicació semiconservadora
●
Molècula DNA
progenitora
●
Molècules DNA
●
Molècula DNA
progenitora
Hipòtesi replicació dispersiva
●
Molècules de DNA
després d'un cicle de
replicació
Les molècules filles estan formades per dos filaments cadascun dels quals conté segments parentals i segments de nova síntesi.
DNA parental Molècules filles després d'un cicle de replicació Hipòtesi conservadora Hipòtesi semiconservadora Hipòtesi dispersiva
Experiments que van portar a coneixer
el mecanisme de replicació del DNA
●
1957 Meselson i Stahl
●1956 Kornerg
●
1963 Cairns
●1968 Okazaki
●
Experiment que demostra la hipòtesi correcta
sobre la duplicació del DNA:
1957 Meselson i Stahl.
Clica damunt la foto per veure una animació de l'experiment i de les
● Cultiven bacteris d'Escherichia coli en un medi amb N15 (isòtop del nitrogen N14 amb un neutró més i per tant de
major pes). Els bacteris incorporen el nitrogen pesat N15 en
el seu DNA.
● Després passen aquests bacteris a un medi amb N14,
(isòtop comú del nitrogen i més lleuger). Qualsevol DNA nou que sintetitzin els bacteris a partir d'ara serà més lleuger que el parental.
● Cada 20 minuts, extreuen bacteris del medi que
conté N14, i procedeixen a la separació del DNA per
Meselson i Sthal van utilitzar la centrifugació en gradient de densitat per distingir entre el DNA pesat carregat amb N15 del DNA lleuger carregat amb N14.
Centrifugació per gradient de densitat
Meselson i Stahl arriben a la conclusió que la replicació del DNA
segueix el model semiconservador al comparar el que els hi va sortir amb el que hauria d'haver sortit si les hipòtesis correctes fossin la conservadora o la dispersiva.
Clica damunt l'esquema per veure una
explicació de l'experiment !!
1956, Kornberg
:
– Comença l’estudi sobre els
mecanismes pels quals es
produeix la duplicació del DNA.
– Aïlla l'enzim DNA-polimerasa de
l’Escherichia coli.
● Aquest enzim és capaç de
sintetitzar DNA in vitro.
DNA patró
DNA encebador
Com pot la DNA-polimerasa sintetitzar DNA?
● La DNA polimerasa és incapaç de sintetitzar una cadena de
DNA de novo.
● L'enzim l'únic que pot fer és afegir nucleòtids a l'extrem 3'
lliure d'una cadena preexistent (anomenada DNA encebador).
● A més l'enzim necessita una cadena patró (motlle) a la que
La DNA-polimerasa necessita:
● Desoxiribonucleòtids 5'-trifosfat lliures en el medi
(dATP, dGTP, dCTP i dTTP)
● Un DNA encebador (”primer”).
Nucleòtids lliures
DNA polimerasa
DNA patró DNA encebador Mg2+
Extrem 5' Extrem 3' Extrem 5' Extrem 3' DNA polimerasa Extrem 3' Desoxinucleòtid trifosfat Desoxiribosa Fosfat Extrem 3'
Experiment de Cairns (1963)
Objectiu:
observar la duplicació del DNA in vivo
● Cairns deixa creixer, durant dues generacions, bacteris
de Escherichia coli en un medi amb nucleòtids
radiactius (timina tritiada, TH3), els quals emeten
partícules β capaces d'impressionar una placa fotogràfica.
● Quan els bacteris es divideixen incorporen la timina
marcada en el seu nou DNA, fet que permet localitzar les noves molècules de DNA sintetitzat.
Formes observades en les fotografies després d'un cicle de replicació:
● Cada 3 minuts es realitza una autoradiografia del DNA
bacterià fins obtenir la seqüencia completa, primer d'una replicació del DNA, que dura aproximadament uns 30 minuts, i després d'una segona replicació.
• Les autoradiografies obtingudes després de la 1a generació presenten imatges de punts formant un cercle.
• En les autoradiografies corresponents a la 2a generació s'observen imatges de punts en forma de lletra θ (theta) que mostraven una zona interior amb doble quantitat de punts.
Cairns interpreta que el DNA de Escherichia coli és circular, que es
• Posteriorment als experiments de Cairns es confirma que la replicació en E. coli té un unic origen de replicació i que a més és bidireccional: a partir de l'origen de replicació (OriC) avança en els dos sentits.
• En eucariotes la replicació del DNA també és bidireccional però a
diferencia dels bacteris té lloc a partir de molts orígens de
Recapitulem!!!
Propietats de la replicació
● És semiconservadora: les dues cadenes de DNA
inicials se separen i cadascuna serveix de motlle per a la síntesi, segons la complementarietat de bases, d'una
nova cadena antiparal·lela.
● Comença en uns llocs concrets anomenats orígens de
replicació:
– En bacteris, hi ha un únic origen de replicació: es diu
Dilema 1:
Si la DNA-polimerasa necessita un “primer”
o “DNA encebador”, de quina manera es
sintetitza aquest “primer”?
Tots aquests descobriments fets van plantejar en el seu moment dos dilemes...
Dilema 2:
Si la DNA polimerasa només pot unir nucleòtids a
l'extrem 3' del “DNA primer”, de quina manera és
pot sintetitzar la cadena 3’→5’ a partir de la cadena
patró 5’→3’ ?
1968 Okazaki.
Descobreix uns fragments
(anomenats fragments
d'Okazaki) constituïts per uns 50
nucleòtids de RNA i entre 1000 i
2000 nucleòtids de DNA que van
donar solució als dilemes
plantejats.
Els fragments d'Okazaki
RNA DNA
●
Els fragments d'Okazaki són sintetitzats per una
RNA-polimerasa
(també anomenada primasa),
que no necessita encebador, i per una
DNA-polimerasa
, en direcció 5’→3’ sobre diferents
regions d'una cadena patró 3’→5’.
3' 5' DNA patró
Fragment d'Okazaki
DNA patró Inici síntesi RNA Síntesi RNA «primer»
Allargament del RNA «primer» per una DNA polimerasa
Bombolla de replicació
Bombolla de replicació
(2 forquetes de replicació)
La síntesi de DNA es produeix en les dues cadenes simultàniament, però en direccions oposades. La replicació del DNA en una forqueta de replicació comença quan
la molecula de DNA de cadena doble es desenrotlla per proporcionar dos motlles de cadena simple.
●
Solució al dilema 1.
“
Primer” o encebador de RNA:
és sintetitzat
per la RNA-polimerasa (primasa) la qual no
necessita cap encebador per poder sintetitzar
fragments de RNA. Després el RNA serà
eliminat i substituït per DNA.
●
Solució al dilema 2.
●
Nou dilema:
Si el DNA d’una cèl·lula no té fragments de
RNA en la seva estructura, què passa amb el
RNA dels fragments d'Okazaki?
Enllaç
Activitat exonucleasa 5’→3’ de la DNA polimerasa.
La DNA polimerasa elimina el «primer» en direcció 5’→3’ i omple el buit deixat amb nucleòtids nous complementaris mitjançant la seva activitat polimerasa 5’→3’
Activitat de la DNA lligasa.
L'enzim estableix un enllaç covalent entre el 3'-OH de l'últim nucleòtid afegit per la DNA polimerasa i el 5'-P del fragment d'Okazaki següent. L'ATP aporta l'energia necessària per aquesta unió.
A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C A C U A G C T T G G C A A C G T G
Síntesis continua de la cadena 5’→ 3’
Síntesis continua de la cadena en dirección 5'3'. La síntesis de esta cadena no plantea ningún problema.
Así, una vez separadas ambas cadenas, se sintetiza el primer y la ADN pol. III (una de las enzimas que unen los nucleótidos) va a elongar la cadena en dirección 5'3'.
A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C T A G C T U G G C A A C G T G
Síntesis discontinua de la cadena 3’ → 5’
A A C C C G G T
