Aislamiento, caracterización y determinación del potencial probiótico de bacterias lácticas de pollos

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Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

Aislamiento, caracterización y determinación del

potencial probiótico de bacterias lácticas de

pollos

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Aislamiento, caracterización y determinación del potencial

probiótico de bacterias lácticas de pollos

Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante: Antonela Garcia Franco.

Director: Dra., García Cecilia M.

Codirector: Dra., Alonso Mónica

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Agradecimientos

A mis padres, por apoyarme y alentarme en mis estudios; y brindarme incondicionalmente todo su amor. Especialmente a mi madre por ser ejemplo de esfuerzo y lucha.

A mis hermanos por todo el cariño y alegría que me han dado. A mi novio, por no dejar que me rinda y ser mi fuerza y templanza.

A la familia Aguirre-Menéndez, por acompañarme en los momentos difíciles y brindarme su cariño.

A mis amigos, por haber compartido conmigo todo tipo de experiencias, por acompañarme en los momentos de felicidad y apoyarme en instantes de desesperación.

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Resumen

Argentina registra un crecimiento sostenido, tanto en la producción como en el consumo de la carne aviar, durante los últimos 20 años. Ocupa el 8º lugar como productor a nivel mundial y registra un consumo de 42,94 kg/persona/año. Las enfermedades entéricas son muy importantes en este tipo de producción ya que producen pérdida de productividad, aumento de mortandad, aumento del costo de los tratamientos y contaminación asociada a los productos de consumo humano. Una alternativa para generar producción “limpia” es el empleo de probióticos que se podrían utilizar en forma alternativa sobre los antibióticos promotores del crecimiento, ya que tienen la ventaja de no dejar residuos en los animales destinados a consumo. Por lo tanto, este trabajo de Tesis tiene como objetivo general aislar y caracterizar bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus provenientes de intestino de pollos parrilleros de nuestra región y evaluar su posible potencial probiótico. Se tomaron hisopados de íleon de treinta y seis pollos sanos. Posteriormente, se realizó el aislamiento y la caracterización fenotípica de cepas del género

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Índice General

1. Introducción ... 1

2. Antecedentes ... 2

3. Materiales y métodos ... 4

3.1. Aislamiento de BAL del TGI de pollos parrilleros ... 4

3.2. Identificación fenotípica de las cepas ... 4

3.3. Evaluación de las capacidades probióticas in vitro ... 6

4. Resultados y discusión... 8

4.1. Aislamiento de BAL del TGI de pollos parrilleros ... 8

4.2. Identificación fenotípica de las cepas ... 8

4.3. Evaluación de las capacidades probióticas in vitro ... 9

5. Conclusiones ... 13

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Índice de Tablas

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Índice de figuras

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1. Introducción

En 2014 la producción mundial de carne aviar estimada alcanzó un total de 980 mil toneladas, lo que representa un incremento de 6% en relación con el año anterior. Argentina registra un crecimiento sostenido tanto en la producción como en el consumo durante los últimos 20 años. Nuestro país ocupa el 8º lugar como productor a nivel mundial y registra un consumo de 42,94 kg/persona/año. Sin embargo, existen algunos problemas que generan déficit en la producción como la conversión ajustada y la mortandad temprana y masiva (MINAGRI, 2015).

Las enfermedades entéricas son muy importantes en este tipo de producción ya que producen pérdida de productividad, aumento de mortandad, aumento del costo de los tratamientos y contaminación asociada a los productos de consumo humano. Una alternativa para generar producción “limpia” es el empleo de probióticos que se podrían utilizar en forma alternativa sobre los antibióticos promotores del crecimiento, ya que tienen la ventaja de no dejar residuos en los animales destinados a consumo. En la avicultura los microorganismos que más se han empleado con fines probióticos han sido las bacterias ácido lácticas (BAL), especialmente las del género Lactobacillus, las cuales se encuentran entre los componentes bióticos más destacados de la microflora benéfica (Rondón et al., 2008)

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2. Antecedentes

La producción mundial en carne aviar alcanzó un total de 980 mil toneladas en el año 2014 lo que significó un incremento del 6% en relación con el año anterior. Argentina es el octavo productor a nivel mundial, con un consumo de 42,94 Kg/persona/año. Sin embargo, existen algunos problemas que generan déficit en la producción como la conversión ajustada y la mortandad temprana y masiva (MINAGRI, 2015).

Una alternativa para generar producción limpia y desarrollo competitivo a gran escala sin efectos colaterales y de forma natural, es el empleo de probióticos para remplazar el uso de antibióticos promotores de crecimiento (APC) (Kalavathy et al., 2003, Gutierrez et al., 2013). Se ha demostrado que la aplicación de estos antibióticos producen efectos indeseados tales como la presencia de residuos en el alimento, riesgos de reacciones alérgicas en el consumidor e incremento de la resistencia bacteriana frente a distintos productos antimicrobianos (Castello Llobet et al.,2002, Velasco et al., 2010). Un probiótico se define como “un organismo vivo que ingerido en las cantidades adecuadas confiere un beneficio al huésped” (FAO/OMS, 2002). Entre los beneficios se destacan la estimulación de la inmunidad y la optimización del balance nutricional y microbiano en el tracto gastrointestinal (TGI) (Mantilla y Burgos Portacio, 2012). Para que un microorganismo sea considerado probiótico debe tener la capacidad de sobrevivir a las condiciones gástricas, ser estable y mantenerse viable, entre otras (Gutierrez Ramirez et al., 2013). Son numerosos los géneros que se incluyen como posibles probióticos: Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacillus, Streptococcus y algunas levaduras como Saccharomyces, siendo las bacterias ácido lácticas (BAL) del género Lactobacillus una de las especies típicas del ecosistema gastrointestinal de las aves (Fennema Owen et al., 1998, Rondón

et al., 2008, Gutiérrez Ramírez et al., 2013).

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enteros, opacas y sin pigmentación (Bergey, 1975). Sus requerimientos nutricionales son complejos incluyendo: carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y nucleótidos, los cuales se encuentran en el medio Man Rogosa y Sharpe (MRS) utilizado para su crecimiento en laboratorio (Fennema Owen et al., 1998).

Al igual que el resto de las BAL, las bacterias del género Lactobacillus

transforman la glucosa y otras hexosas en ácido láctico por homofermentación; o en ácido láctico y otros productos finales adicionales (ácido acético, dióxido de carbono) por heterofermentación (Kandler, 1983). Estas bacterias crecen bajo condiciones microaerofílicas o anaeróbicas con una temperatura que oscila entre los 5 y 53ºC y pueden multiplicarse en medios ligeramente ácidos, encontrándose en la flora normal del TGI de animales (Bergey, 1975, Frizzo et al., 2006).

La especificidad por parte de los microorganismos es un importante factor para determinar la colonización y la adhesión in vivo. Esto se debe a que una determinada especie no coloniza necesariamente el mismo sitio de otra especie animal (Frizzo et al., 2006). Por este motivo, el uso no selectivo de probióticos elaborados y distribuidos por firmas comerciales, ha dado como resultado una baja eficiencia en el aumento de los indicadores de la producción aviar (Rosmini et al., 2004).

Teniendo en cuenta el objetivo general definirán los siguientes objetivos específicos:

 Aislar BAL del TGI de pollos parrilleros de la región.

 Identificar fenotípicamente las cepas obtenidas.

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3. Materiales y métodos

El trabajo de tesis fue realizado en el Laboratorio de Fisiología Celular del Departamento de Fisiopatología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA).

De un total de 360 pollos línea Cobb 500 que se utilizaron en un ensayo previo, se muestrearon 36 animales de diferentes edades (24 de 6 días y 12 de 53 días). Luego del sacrificio se extrajo el íleon en condiciones asépticas y se ligó en los extremos. A continuación se realizaron hisopados de íleon y se colocaron en 5 ml de caldo MRS. Se incubaron a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente se tomó una alícuota (1 ml) de cada uno de dichos cultivos y se almacenó en un freezer a -76ºC con glicerol al 30%.

3.1. Aislamiento de BAL del TGI de pollos parrilleros

Las muestras congeladas fueron transportadas en condiciones de refrigeración hasta el laboratorio.

Se tomó una anzada de cada uno de los cultivos congelados y se sembró por estría en una placa Petri con agar MRS. Las mismas se incubaron a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia.

3.2. Identificación fenotípica de las cepas

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3.2.1. Morfología de colonias

Se observó la forma, el color, la opacidad y la consistencia de las colonias que crecieron en agar MRS luego de 48 hs de incubación a 37ºC en condiciones de microaerofilia.

3.2.2. Prueba de catalasa

Se colocó una gota de agua oxigenada sobre el centro de un portaobjetos de vidrio, se le adicionó una colonia con ansa y se mezcló hasta formar una suspensión microbiana homogénea. Luego se observó la producción o no de burbujas. Si la enzima catalasa está presente, descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno, indicando un resultado positivo, de lo contrario el resultado es negativo (Mac Faddin, 1980).

3.2.3. Tinción de Gram y morfología al microscopio

La colonia se extendió en el centro de un portaobjeto de vidrio y se fijó con calor. Se tiño con la solución cristal-violeta (por un minuto), se cubrió con Lugol (se dejó reaccionar 1 minuto) y se enjuagó con agua. Posteriormente se realizó una decoloración con alcohol/acetona (durante 18 segundos), se enjuagó nuevamente con agua y se dejó secar a temperatura ambiente. La tinción de Gram dependerá del espesor, la estructura física y la permeabilidad de la pared bacteriana. Las bacterias Gram (+) se tiñen de color púrpura en cambio las bacterias Gram (-) se tiñen de rosado (Basualdo et al., 2006).

La morfología y coloración se observaron en un microscopio óptico con un objetivo de inmersión 100X.

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sulfanílico) y se observó si varió la coloración de los mismos. La desnitrificación es un proceso metabólico que usa el nitrato como aceptor terminal de electrones. Si el microorganismo reduce el nitrato a nitrito los reactivos adquieren una coloración rojo intenso, de lo contrario no se observa cambio de color (Mac Faddin, 1980).

3.2.5. Capacidad fermentativa

Cada colonia se colocó en un tubo con caldo MRS modificado (sin citrato) con campana de Durham e incubó a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia. Si el microorganismo es homofermentativo, no se observa burbuja en la campana, ya que solo produce ácido láctico. Si es heterofermentativo produce burbuja, ya que genera además dióxido de carbono y ácido acético (Mac Faddin, 1980).

3.3. Evaluación de las capacidades probióticas

in vitro

Se seleccionaron aquellas cepas que presentaron características fenotípicas correspondientes al género Lactobacillus. Cada una se reactivó en 5 ml de caldo MRS a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia.

3.3.1. Crecimiento a distintos pH

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3.3.2. Crecimiento a distintas temperaturas

Una anzada de cada colonia se sembró en tubos con 3 ml de caldo MRS y se incubó a tres temperaturas diferentes (20, 37 y 45ºC) durante 24 hs en condiciones de microaerofilia (Reque et al., 2000, Rondón et al., 2008, Mantilla y Burgos Portacio, 2012). Posteriormente se determinó la turbidez del medio por DO. Se demostró la viabilidad de las colonias sembrando el contenido de cada tubo en agar MRS que se incubó durante 48 hs a 37ºC en condiciones de microaerofilia.

3.3.3. Tolerancia a sales biliares

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4. Resultados y discusión

4.1. Aislamiento de BAL del TGI de pollos parrilleros

Todas las muestras provenientes del hisopado de íleon de pollos, crecieron en el caldo MRS observando turbidez en los tubos. En cuanto al crecimiento en placa, la mayoría presentó colonias de similar morfología y solo en 2 muestras se observaron colonias diferentes. En base al crecimiento en placa se seleccionaron 12 muestras que presentaron poca contaminación y colonias aisladas.

Los valores de DO permitieron cuantificar la turbidez, siendo un dato complementario y a profundizar en futuros trabajos.

4.2. Identificación fenotípica de las cepas

Se observaron diferentes morfologías de colonias. Presentaron distintos tamaños, color y forma. La mayoría fueron medianas y chicas, de coloración blanca, lechosa o mucosa aunque hubo transparentes y solo una colonia presentó bordes estrellados. En las placas que presentaron diferente morfología de colonia, se tomó una de cada tipo para la realización de las pruebas bioquímicas básicas. Todas las colonias menos la 4.1 fueron catalasa (-) y Gram (+). Se observaron al microscopio tres morfologías diferentes: bacilos, cocos y cocobacilos. Las colonias en general fueron nitrato (-) con excepción de la 4 y homofermentativas. Estos datos se encuentran detallados en la tabla 1.

De acuerdo con los resultados obtenidos se seleccionaron 5 cepas que presentaron características fenotípicas propias del género Lactobacillus

establecidas en la bibliografía citada (Kandler, 1983, Bergey, 1975).

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Tabla 1: Características fenotípicas y pruebas bioquímicas básicas.

4.3. Evaluación de las capacidades probióticas

in vitro

Se evaluó el potencial probiótico de las 5 cepas que presentaron características fenotípicas correspondientes al género Lactobacillus.

4.3.1. Crecimiento a distintos pH

A pH 1 y pH 2 no se observó crecimiento en caldo ni en placa; excepto la muestra 6 que presentó una colonia a pH 2 demostrando la viabilidad de la

Colonia Morfología de colonias Catalasa Gram Morfología a microscopio Nitrato Fermentación

1 Colonias chicas, opacas - + Bacilos pequeños - Homofermentativa

1.1 Colonias transparentes - + Bacilos pequeños

-2 Colonias chicas, blancas, lechosas - + Bacilos cortos - Homofermentativa

3 Colonias medianas, lechosas - + Bacilos cortos - Homofermentativa

4 Colonias medianas, blancas, traslúcidas - + Cocos con halo + Homofermentativa

4.1 Colonias medianas, blancas, mucosas, bordes estrellados + + Cocos

-5 Colonias chicas, traslúcidas - + Bacilos largos/ Bacilos cortos - Homofermentativa

5.1 Colonias chicas, opacas - + Bacilos / Cocos en cadena

-6 Colonias chicas, lechosas - + Bacilos cortos - Homofermentativa

7 Colonias grandes, mucosas - + Bacilos cortos - Homofermentativa

8 Colonias chicas, bien traslúcidas - + Bacilos cortos unidos/ Cocos - Homofermentativa

9 Colonias medianas, mucosas - + Bacilos - Homofermentativa

10 Colonias medianas, más mucosas que la 9 - + Cocos - Homofermentativa

11 Colonias grandes, mucosas - + Cocobacilos - Homofermentativa

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La mayoría de las colonias estudiadas en este trabajo presentaron tolerancia a pH ácidos coincidiendo con lo descripto por Gutiérrez Ramírez et al., 2013. Los resultados obtenidos presentan similitudes con los trabajos de Rondón et al., 2008 y Mantilla y Burgos Portacio, 2012, donde un número reducido de cepas creció a pH 2 y 3. La importancia del crecimiento de las colonias bajo condiciones extremas, se debe a que los microorganismos poseen una mayor capacidad para sobrevivir y llegar en mayor número a los sitios de colonización (Frizzo et al., 2006).

Tabla 2: Crecimiento a distintos pH en caldo y agar MRS.

Figura 1: crecimiento de colonias a pH 4, 5 y 6,5 en agar MRS.

4.3.2. Crecimiento a distintas temperaturas

Todas las colonias crecieron a 20 y 37ºC en caldo y en placa, demostrando la viabilidad de las mismas, con la excepción de la colonia 12 que no creció a 20ºC en placa. A 45ºC hubo crecimiento en caldo en todas las cepas menos en la 2, sin embargo solo la cepa 6 presento viabilidad. Estos datos se encuentran

pH 1 pH 2 pH 4 pH 5 pH 6,5 pH 1 pH 2 pH 4 pH 5 pH 6,5 pH 1 pH 2 pH 4 pH 5 pH 6,5

2 S/ turbidez S/ turbidez Turbidez S/ turbidez S/ turbidez S/ crecim S/ crecim Crecim S/ crecim Crecim 0,957 0,116 1,470 0,153 0,166

3 S/ turbidez S/ turbidez Turbidez Turbidez ++ turbidez S/ crecim S/ crecim Crecim Crecim Crecim 1,170 0,278 0,970 1,990 1,910

6 S/ turbidez S/ turbidez Turbidez leve S/ turbidez Turbidez S/ crecim 1 colonia Crecim Crecim Crecim 1,024 0,129 0,355 0,183 1,420

9 S/ turbidez S/ turbidez S/ turbidez ++ turbidez S/ turbidez S/ crecim S/ crecim S/ crecim Crecim S/ crecim 0,503 0,110 0,138 1,750 0,154

12 S/ turbidez S/ turbidez Turbidez ++ turbidez ++ turbidez S/ crecim S/ crecim Crecim Crecim Crecim 1,120 0,148 2,110 2,240 2,260

DO Placa MRS

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detallados en la tabla 3 y se puede observar el crecimiento de las colonias a 20 y 45ºC en la figura 2.

La temperatura es un factor importante que afecta el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos, variando entre los diferentes géneros y reflejando el rango de temperatura optima de su hábitat natural. Solo la colonia 6 demostró ser estable y su crecimiento no se vio afectado por las distintas temperaturas, siendo este un requisito de los probióticos según Gutiérrez Ramírez et al., 2013.

Este trabajo de Tesis demostró que el crecimiento en la mayoría de las cepas fue a 20 y 37ºC mientras que a 45ºC solo una pudo desarrollarse. Estos resultados difieren con los trabajos de Rondón et al., 2008, que no obtuvieron crecimiento a bajas temperaturas (15ºC) y con los de Mantilla y Burgos Portacio, 2012, que observaron crecimiento a altas temperaturas (43ºC).

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4.3.3. Tolerancia a sales biliares

Todas las muestras en el caldo MRS con sal Britania presentaron turbidez, mientras que en el caldo MRS con sal Stanton solo se evidenció en la muestra 3. Se observaron diferencias en el crecimiento en placa, según la marca de la sal utilizada. Estos datos se encuentran detallados en la tabla 4 y se presenta el crecimiento de las colonias en la figura 3.

Los resultados de este trabajo de Tesis concuerdan con los obtenidos por Zamudio y Zavaleta, 2003, Ávila et al., 2010 y Mantilla y Burgos Portacio, 2012, quienes obtuvieron crecimiento de colonias a la misma concentración de sales biliares (0,15%).

Tabla 4: Tolerancia a sales biliares (0,15%).

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5. Conclusiones

 Se aisló bacterias ácido lácticas del tracto gastrointestinal de pollos parrilleros de la zona.

 Se caracterizó fenotípicamente bacterias ácido lácticas del género

Lactobacillus, mediante pruebas bioquímicas básicas.

 Se aisló una cepa con características fenotípicas del género

Lactobacillus con posible potencial probiótico.

Estudios posteriores serán necesarios para identificar la especie de

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6. Bibliografía

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