Diversidad de los genotipos vacA y cagA de helicobacter pylori y expresión de interferón gamma en pacientes con gastritis crónica y cáncer gástrico

REVISTA

DE

GASTROENTEROLOGIA

DE

MEXICO

´

´

www.elsevier.es/rgmx

ARTÍCULO

ORIGINAL

Diversidad

de

los

genotipos

vacA

y

cagA

de

Helicobacter

pylori

y

expresión

de

interferón

gamma

en

pacientes

con

gastritis

crónica

y

cáncer

gástrico

D.N.

Martínez-Carrillo

_,

_J.

_{Atrisco-Morales}

_,

_R.

_{Hernández-Pando}

_,

S.

Reyes-Navarrete

_,

_R.

_{Betancourt-Linares}

_,

_I.

_Cruz-del

_Carmen

_,

_B.

_Illades

_Aguiar

_,

A.

Román-Román

_y

_G.

_{Fernández-Tilapa}

a_{LaboratoriodeInvestigaciónClínica,UnidadAcadémicadeCienciasQuímicoBiológicas,UniversidadAutónomadeGuerrero,}

Chilpancingo,Guerrero,México

b_{SeccióndePatologíaExperimental,DepartamentodePatología,InstitutoNacionaldeCienciasMédicasyNutrición}

«Salvador Zubirán»,MéxicoD.F.,México

c_{ServiciodeEndoscopia,InstitutoEstataldeCancerología}

«Dr.ArturoBeltránOrtega»,Acapulco,Guerrero,México

d_{UnidadEspecializadaenGastroenterologíaEndoscopia,Chilpancingo,Guerrero,México}

e_{ServiciodeEndoscopia,HospitalGeneral}

«Dr.RaymundoAbarcaAlarcón»,Chilpancingo,Guerrero,México

f_{LaboratoriodeBiomedicina,UnidadAcadémicadeCienciasQuímicoBiológicas,UniversidadAutónomadeGuerrero,}

Chilpancingo,Guerrero,México

g_{LaboratoriodeInvestigaciónenBacteriología,UnidadAcadémicadeCienciasQuímicoBiológicas,UniversidadAutónomade}

Guerrero,Chilpancingo,Guerrero,México

Recibidoel25deenerode2014;aceptadoel23deoctubrede2014 DisponibleenInternetel26denoviembrede2014

PALABRASCLAVE

Helicobacterpylori; cagA;

vacA;

Interferóngamma; Cáncergástrico

Resumen

Antecedentes: ElH.pylorieselprincipalfactorderiesgoparaeldesarrollodegastritiscrónica, úlceragástricaycáncergástrico.Elresultadoclínicoeninfectadosporestabacteriadepende devariosfactores,entreellosloscomponentesbacterianos,larespuestainmune,ylainfluencia delmedioambiente.

ObjetivoComparar la expresiónde IFN-␥ con los genotiposvacA y cagAde H. pylori en pacientescongastritiscrónicaycáncergástrico.

Pacientesymétodos: Seincluyeron95pacientescondiagnósticodegastritiscrónicay20con

cáncergástrico.Setomaron3biopsiasgástricas,unaseutilizóparalaidentificaciónmoleculary genotipificacióndeH.pylori.Otrafuefijadaenalcoholabsolutoyrealizaroncorteshistológicos paradeterminarlaexpresióndeIFN-␥porinmunohistoquímica.

∗_{Autorparacorrespondencia:LaboratoriodeInvestigaciónClínica,UnidadAcadémicadeCienciasQuímicoBiológicas,Universidad} Autó-nomadeGuerrero,AvenidaLázaroCárdenasS/NCiudadUniversitariaCol.LaHaciendita39087,Chilpancingo,Guerrero,México.Tel.:éfono yfax:+52-747-4725503.

Correoelectrónico:[email protected](G.Fernández-Tilapa). http://dx.doi.org/10.1016/j.rgmx.2014.10.003

Resultados: NoseencontrarondiferenciasenlascélulasqueexpresaronIFN-␥entrepacientes congastritiscrónica(medianadelporcentajedecélulas positivas:82.6%enpacientessinH. pyloriy82%enpersonasinfectadas)ycáncergástrico(70.5%enpacientesH.pylori-negativosy 78.5%eninfectados).EnpacientescongastritiscrónicainfectadosporH.pylorivacAs2m2/cagA

-laexpresióndeIFN-␥fuedel69%,enpacientesconH.pylorivacAs1m2/cagA- fuede86.5%,

envacAs1m1/cagA- _{del86.5%,yenvacAs1m1/cagA}+_{del82%.Encáncerseencontrarondatos}

similares.

Conclusión: LaexpresióndeINF-␥varíadependiendodelgenotipovacAycagAdeH.pylori,

peronodeacuerdoalapresenciadegastritiscrónicaocáncergástrico.

©2014AsociaciónMexicanadeGastroenterología.Publicado porMassonDoymaMéxicoS.A. Todoslosderechosreservados.

KEYWORDS

Helicobacterpylori; cagA;

vacA;

Interferongamma; Gastriccancer

HelicobacterpylorivacAandcagAgenotypediversityandinterferongamma expressioninpatientswithchronicgastritisandpatientswithgastriccancer

Abstract

Background: Helicobacter pylori (H.pylori)is themain risk factor for the development of

chronicgastritis,gastriculcer,andgastriccancer.InH.pylori-infectedindividuals,theclinical resultisdependentonvarious factors,amongwhicharebacterialcomponents,theimmune response,andenvironmentalinfluence.

Aims: TocompareIFN-␥expressionwiththeH.pylorivacAandcagAgenotypesinpatientswith

chronicgastritisandpatientswithgastriccancer.

Methods:Ninety-fivepatientsdiagnosedwithchronicgastritisand20withgastriccancerwere

includedinthestudy.Threegastricbiopsiesweretaken;onewasusedforthemolecular detec-tionandgenotypingofH.pylori;anotherwasfixedinabsolutealcoholandhistologicsections weremadefordeterminingIFN-␥expressionthroughimmunohistochemistry.

Results:NodifferenceswerefoundinthecellsthatexpressedIFN-␥betweenthepatientswith

chronicgastritis(medianpercentageofpositivecells:82.6%inpatientswithoutH.pyloriand 82%ininfectedpersons)andthosewithgastriccancer(70.5%inH.pylori-negativepatientsand 78.5%ininfectedpersons).IFN-␥expressionwas69%inchronicgastritispatientsinfectedwith

H.pylori vacAs2m2/cagA-_{,itwas 86.5%inpatientsinfected withH.pylorivacAs1m2/cagA}-_,

86.5%invacAs1m1/cagA-_{,and82%invacAs1m1/cagA}+_{.Similardatawerefoundinthepatients}

withgastriccancer.

Conclusions: IFN-␥expressionvarieddependingontheH.pylorivacAandcagAgenotype,but

notinaccordancewiththepresenceofchronicgastritisorgastriccancer.

©2014AsociaciónMexicanadeGastroenterología.PublishedbyMassonDoymaMéxicoS.A.All rightsreserved.

Introducción

Helicobacterpylori(H.pylori)infectaacasilamitaddela población mundialyesla principalcausadegastritis cró-nica,úlceragástricaoduodenal,cáncergástricoylinfoma decélulasBdetejidolinfoideasociadoamucosas(MALT)1---3_. La citotoxina asociada al gen A (CagA) y la citoto-xina vacuolizante (VacA) son factores de virulencia de H.

pylori que tienen múltiples efectos sobre la célula

epi-telial humana4_{. Las cepas de H. pylori cagA positivas se} asocianainflamaciónmásseveraquelascepascagA nega-tivas.H.pyloritransfierelaproteínaCagAyotrosfactores solublesalcitoplasmadelacélulaepitelialatravésdesu sis-temadesecrecióntipoiv5.CagAactivavíasdese˜nalización intracelularesqueconducenalaactivacióndefactoresde transcripciónquemodulanlaexpresióndecitocinas proin-flamatorias, a la infiltración de células inmunes, al da˜no en las uniones célula-célula y al cambio en la polaridad

yla permeabilidadde lacélula epitelial3_{. Latoxina VacA} inducevacuolización, apoptosise inhibiciónde la prolife-racióncelular3,6_{.Todaslas cepasdeH.pyloricontienenel} genvacA,queespolimórficoenlaregiónse˜nal(aleloss1a, s1b,s1cys2)ylaregiónmedia(alelosm1ym2).Cadagen vacAcontiene unalelo s yunalelom,yla diversidaden lasecuenciaafectaalaactividadvacuolizantedela citoto-xina.LascepasvacAs1m1estánasociadasaunaenfermedad mássevera4,7_.

H. pylori induce una fuerte respuesta inmunológica,

Enlamucosagástricadeadultoscongastritisoconúlcera pépticainfectadosporH.pylorihayunarespuesta inmuni-tariapredominantedetipoTh1,conunaelevadaexpresión deinterferón gamma(IFN-␥)einterleucina-2(IL-2)ybaja expresióndeIL-4eIL-109_.

El IFN-␥ es un mediador importante de la inmunidad innatayadaptativa;esproducidoprincipalmenteporcélulas TCD4+_,CD8+_{ycélulasasesinasnaturales(NK).Estacitocina} estásobreexpresadaenelestómagodehumanosyratones infectadosporHelicobacterspp.10_{.ElIFN-␥desempe˜naun} papeldualenrespuestaalainfecciónporH.pylori;porun lado,induceinflamacióngástrica ypromuevela aparición delesionespreneoplásicasdebidasalainfeccióny,porotra parte, el IFN-␥ disminuye la colonizaciónbacteriana yes fundamentalparalaeliminacióndelainfección11,12_.

Enestudiosprevios seencontróquelosnivelesde IFN-␥ fueron másaltos enpacientes infectados por H. pylori queenpacientessininfección9,13---15_{.Wangetal.,en2007,} encontraronqueenpacientesinfectadosporH.pyloricagA+

la respuesta inmunitaria celularmediada por células Th1 estuvoasociadaaetapasmástempranasdela carcinogéne-sisgástrica,mientrasquelainmunidadhumoralmediadapor célulasTh2predominóenlasetapasavanzadas16_.Apesarde quesehaobservadoquelaexpresióndeIFN-␥seencuentra incrementadaenlamucosagástricadepacientesH.pylori positivos,nosehaevaluadosilaexpresióndeestacitocina varíaconelgenotipovacAycagAdelabacteria.Ennuestro conocimiento,nosehanpublicadodatosque documenten laexpresióndeIFN-␥enpacientesmexicanoscon enferme-dades gástricas asociadas a la infección por H. pylori. El objetivodeesteestudiofuerelacionarlaexpresiónde IFN-␥conlainfecciónporH.pyloriyconlosgenotiposvacAy elestadodecagAdelabacteriaenpacientescongastritis crónicaycáncer.

Métodos

Pacientes

Seincluyóapacientesqueasistieronarealizarseuna endo-scopiadigestivaaltaalHospitalGeneral«RaymundoAbarca Alarcón», a la Unidad Especializada en Gastroenterología Endoscopiade la Ciudad de Chilpancingo yal Servicio de EndoscopiadelInstitutoEstataldeCancerología«Arturo Bel-tránOrtega»enAcapulco,Guerrero,México,deagostode del2011 a marzo del2013. Se seleccionóa pacientes sin tratamientodeerradicaciónparaH.pyloriduranteelmes previoalprocedimientoendoscópico.Seexcluyódelestudio alospacientescontratamientoinmunosupresoro antiinfla-matorionoesteroideo.Lospacientesosuspadresfirmaron unacartadeconsentimientoinformado.Alospacientesque aceptaronparticiparenelestudioselesaplicóunaencuesta para registrar datos generales e información relacionada conlaenfermedad.ElproyectoseaprobóporelComitéde BioéticadelaUniversidadAutónomadeGuerreroyporlos hospitalesparticipantes.

Endoscopiayobtencióndebiopsias

Laendoscopiasellevóacabodespuésdeunanochedeayuno con un videoprocesador y un videogastroscopio (Fujinon,

Wayne,EE.UU.).Decadapaciente,setomaron3biopsias gástricasdeantro,cuerpoodeltumor;unafuecolocadaen soluciónamortiguadora(Tris10mMpH8.0,EDTA20mMpH 8.0,SDS 0.5%)paraeldiagnóstico moleculardeH.pylori. Otrafuefijadaenalcoholabsolutoparaverificarla expre-sióndeIFN-␥porinmunohistoquímica.Laúltimabiopsiafue fijada enformol amortiguadopara el estudio histopatoló-gico.Loscorteshistológicosfueronte˜nidosconhematoxilina yeosina,yevaluadosporunpatólogo usandoloscriterios del sistema de Sydney actualizado17 _{o la clasificación de} Lauren18_.

DetecciónygenotipificacióndeHelicobacterpylori

SeextrajoelADNtotaldelasbiopsiasgástricasporlatécnica defenol-cloroformo-alcoholisoamílico,previadigestióncon proteinasaK19_{.LadeteccióndeH.pyloriserealizóporPCR,} amplificandounfragmentodelgen16SdelRNAr,siguiendo la metodologíadescritapreviamente porMartínez-Carrillo etal.20_{.LasmuestrasH.pyloripositivasfueronsometidasa} unasegundaPCRconiniciadoresparaamplificarlasregiones symdelgenvacA21,22_,elgencagA23_ybabA224_.Enun volu-menfinalde25␮Lsemezclaron500ngdeADN,1.5mMde MgCl2,0.15mMdedNTPs(Invitrogen,Carlsbad,EE.UU.),1.3 UdeTaqDNApolimerasaPlatinum® _{(Invitrogen,Carlsbad,} EE. UU.) ylas concentracionesrequeridas de oligonucleó-tidos: 2.5 pM para vacA, 5 pM para cagA y 12.5 pM para babA2.Elprogramadeamplificaciónincluyóunpasode des-naturalizacióniniciala94◦_{Cpor10min,35ciclosa94}◦_Cpor

1min,57◦_Cpor1min,72◦_{Cpor1minyunpasode}

exten-sión final a72◦_{C por10min (fig. 1).Encada PCR, se usó}

ADNdelacepaJ99,congenotipovacAs1m1/cagA+_/babA2+

comocontrolpositivo.Paraelcontrolnegativo,elADNfue sustituidoporaguadesionizadaestéril.Todaslasreacciones

850 pb (babA2)

pb

1650

1000 850

650

500

400

300

200

100

2

1 3 4 5 6 7 8 9

645pb (vacA m2)

570pb (vacA m1)

349pb (cagA)

286pb (vacA s2)

259pb (vacA s1)

Figura 1 Genotipificación de H. pylori. Carril 1: marcador

de peso molecular de 1kb plus; carril 2: control negativo; carril 3: control positivo, ADN de la cepa J99 de H. pylori, genotipo vacAs1m1/cagA+_/babA2+_{;carril 4, 7y 9: muestras} clínicas genotipo vacAs2m2/cagA---_/babA2---_{; carril 5: muestra}

clínica genotipo vacAs1m1/cagA+_/babA2---_{; carril 6: muestra}

clínicagenotipovacAs1m1/cagA---_/babA2---_{;carril8:muestra}

Tabla1 PrevalenciadeinfecciónporH.pyloriygenotiposvacA/cagA

Gastritiscrónica(n=95) Cáncergástrico(n=20) Valordep

Edad(media±DE;a˜nos) 47.4±16 60.9±16.2 <0.001a

Género,n(%)

Femenino 59(62.1) 11(55) 0.554b

Masculino 36(37.9) 9(45)

H.pylori,n(%)

Negativo 41(43.2) 8(40) 0.795b

Positivo 54(56.8) 12(60)

GenotipovacA/cagA,n(%)

vacAs2m2/cagA--- _{3(5.5) 2(16.7) 0.587}c

vacAs2m2/cagA+ _{1(1.9) 0}

vacAs1m2/cagA--- _{1(1.9) 0}

vacAs1m2/cagA+ _{2(3.7) 0}

vacAs1m1/cagA--- _{8(14.8) 3(25)}

vacAs1m1/cagA+ _{39(72.2) 7(58.3)}

Total 54(100) 12(100)

a _{PruebadelatdeStudent.} b _Pruebadela

␹2. c _{PruebaexactadeFisher.}

fueronhechasenuntermocicladorMastercyclerEpgradient (Eppendorf,Hamburg,Alemania).

Deteccióndelaexpresióndeinterferóngamma porinmunohistoquímica

Las muestras fijadas en alcohol absoluto fueron incluidas enparafina. Se hicieroncortes de 3␮m. Cada sección de tejido fuedesparafinadocon xilolyrehidratadocon alco-holengradosdescendentes.Laslaminillassehirvieroncon buffer de citratos (Declere1X, Cell marque,Rocklin, EE. UU.) por 20min en autoclave, para recuperación antigé-nica. Después de la permeabilización y el bloqueo de la peroxidasa endógena,loscortes fueron incubados toda la noche con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN-␥ humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE. UU.) dilución 1:50. Launión del anticuerpo fuedetectada con el Kit Mouse/Rabbit ImmunoDetector HRP/DAB Detection System(BioSB,SantaBarbara,EE.UU.).Loscortesfueron contrate˜nidosconhematoxilina(BiocareMedical,Concord, EE. UU.). En5 camposseleccionados al azar,se contóun totalde100célulasmononuclearesyseconsideraron posi-tivasaquellascontinciónnuclearocitoplasmáticamarrón. Los datos fueron expresados como porcentaje de células positivas.Paravalidarlosresultadosdelconteomanualde célulasIFN-␥+,se seleccionóal azarunnúmerode mues-trasequivalenteal10%yseverificóelporcentajedecélulas IFN-␥+medianteelsoftwareLeicaMicrosystemsCMSGmbH versión4.3.0.

Análisisestadístico

Se determinaron las frecuencias de las variables cuali-tativas, la media ± desviación estándar de las variables

cuantitativas paramétricasy mediana yrango intercuartí-licoparavariablesnoparamétricas.Elvalordepseobtuvo

con la prueba de la ␹2 o exacta de Fisher para variables cualitativasy pruebat deStudent,ANOVA, Mann-Whitney o Kruskal-Wallis paravariables cuantitativas. Un valor de p<0.05seconsideróestadísticamentesignificativo.

Resultados

PrevalenciadeinfecciónporHelicobacterpyloriy genotiposvacA/cagA

Seestudióa95pacientesquerecibierondiagnóstico histo-lógicoconfirmatoriodegastritiscrónicay20conresultados histopatológicosdeadenocarcinomagástrico. Lamediade edadparaelgrupodegastritiscrónicafuede47.4a˜nosyde 60.9a˜nosencáncergástrico(p<0.001,tabla1).Delos115 pacientesincluidosenelestudio,66(57.4%)fueronH.pylori positivosyelgenotipomásfrecuentefuevacAs1m1/cagA+_,

el69.7%(46/66).LaprevalenciadeinfecciónporH.pyloriy delosgenotiposvacA/cagAvarióentrelosgrupos(tabla1).

Expresióndeinterferóngammaengastritiscrónica ycáncergástrico

LaexpresióndeIFN-␥selocalizópredominanteenel cito-plasmadelascélulasmononuclearesinfiltrantes.Sedetectó expresióndeIFN-␥enlamayoríadelospacientesH.pylori positivosyH.pylorinegativos(99/115,datosnomostrados). Noseencontraron diferenciasenlas célulasque expresa-ron IFN-␥ entre pacientes con gastritis crónica (mediana delporcentajedecélulaspositivas:82.6%enpacientessin

H.pylori y82% en personasinfectadas) y cáncer gástrico

H. pylori negativo H. pylori positivo

Gastritis crónica

40

60

80

*p = 0,237

*p = 0,322

78,5% 82%

70,5% 82,6%

P

orcentaje de células positiv

as a

IFN-γ

100

Cáncer gástrico

Figura2 ExpresióndeIFN-genpacientescongastritiscrónicaycáncergástricoconysininfecciónporH.pylori.

*PruebadeMann-Whitney.

en cáncer gástrico, la mediana fue del 64 al 90% (rango intercuartílicodel55al94%)ynoseobservarondiferencias estadísticamentesignificativasenel porcentajedecélulas IFN-␥positivasnientrelosgruposdeedaddelospacientes con gastritis crónica (p=0.1601) ni entre los grupos eta-rios con cáncer gástrico (p=0.1514) (fig. 3). Tampoco se encontraron diferencias en el porcentaje de células con expresióndeIFN-␥entregastritiscrónicaycáncergástrico (p=0.8781),datosnomostrados.

Enpacientescongastritiscrónicayconcáncergástrico, la expresión de IFN-␥ varía con el genotipo de H. pylori (fig. 4). En el grupo de gastritis crónica, los infectados

por H. pylori vacAs2m2/cagA--- _{presentaron un porcentaje}

menor de células con expresión de IFN-␥ (69%), en com-paración con lospacientes con H.pylori vacAs1m2/cagA

---(86.5%),vacAs1m1/cagA− _{(86.5%)yvacAs1m1/cagA}+ _(82%)

(fig. 5). De forma interesante, de 5 pacientes con

geno-tipo vacAs1m1/cagA+ _{de H. pylori, en 4 se encontró el}

< 20 años

*p = 0,1601

82%

78%

83% 84%

91%

78%

64% *p = 0,1514

40

60

80

100

De 20 a 39 años

Gastritis crónica

P

orcentaje de células positiv

as a

IFN-γ

Cáncer gástrico De 40 a 59

años

≥ 60 años < 20 años De 20 a 39 años

De 40 a 59 años

≥ 60 a años

Figura3 PorcentajedecélulaspositivasaIFN-genpacientescongastritiscrónicaoconcáncergástricodistribuidosengrupos

deedad.

vacAs2m2/cagA–

A1

A2

A3

A4

B1

B2

B3

B4

vacAs1m1/cagA– vacAs1m1/cagA+ H. pylori –_/

IFN-γnegativo

Figura4 InmunohistoquímicadelaexpresióndeIFN-genbiopsiasgástricasdepacientescongastritiscrónicaycáncergástrico,

contrate˜nidas conhematoxilina (10´). A1-A4)Biopsias gástricas de pacientescon gastritiscrónica. B1-B3) Biopsias gástricasde pacientesconcáncergástrico.B4)Biopsiadeamígdala,controlnegativodelareacción(seomitióelanticuerpoprimario).

93% de células con expresión de IFN-␥ y en un paciente el 96%. En los pacientes con cáncer gástrico infecta-dos por el genotipovacAs2m2/cagA--- _{se detectóun70.5%}

de células con expresión de IFN-␥; en quienes tenían el genotipo vacAs1m1/cagA--- _{el porcentaje de célula}

IFN-␥-positivasalcanzóel79%yenlosinfectadosconelgenotipo

vacAs1m1/cagA+_{deH.pyloriel porcentajedecélulascon}

expresióndeIFN-␥fuedel78%;unodelos7pacientescon este mismogenotipotuvo unaexpresióndeIFN-␥ del94% (fig.5).

EntreelporcentajedecélulasIFN-␥+contadaspor obser-vación microscópica y verificadas mediante el software LeicaMicrosystems,seencontróunavariaciónde±4.4

célu-las.

Discusión

Laincidenciay/oseveridaddelas patologíasrelacionadas conH.pyloripuedevariarentrelasáreasgeográficas25_,la

*p = 0,495 *p = 0,854

40

60

80

100

Gastritis crónica

69%

66,5% 86,5%

82%

70,5%

79% _78%

P

orcentaje de células positiv

as a

IFN-γ

Cáncer gástrico

vacAs2m2/cagA

–

vacAs1m2/cagA

+

vacAs1m1/cagA

–

vacAs1m1/cagA

+

vacAs2m2/cagA

–

vacAs1m1/cagA

–

vacAs1m1/cagA

+

Figura5 ExpresióndeIFN-gporgenotipodeH.pylorienmuestrasdepacientescongastritiscrónicaycáncergástrico.

prevalenciadelainfecciónyladistribucióndelos genoti-posvaríaentrepaíses,entreregionesygruposétnicos.En México,sehareportadounavariaciónenlaprevalecíade H.pyloriquevade86.1%enelsurestea47.1%enni˜nosdel norestedelpaísyun66%enunapoblacióndeTepehuanos (grupoétnico)delnortedeMéxico26,27,28_{.Torresetal.,en} 2005,notificaronque,enMéxico,laprevalenciadeH.pylori cagA+_{varíade47.6%a63.4%}29_.

Sinembargo,sonpocoslosreportesacercadela preva-lenciadeinfecciónporH.pyloriysusgenotiposenpoblación mexicana. En esta investigación, el 60% de los casos de cáncergástricofueronpositivosaH.pylori,siendoel

geno-tipo vacAs1m1/cagA+ el más frecuente, el 58.3% (7/12).

Lafrecuencia deH. pylori encontrada eneste estudioes iguala lareportada por Morales-Espinosaet al.,ysupera lareportada porLópez-Vidaletal.,en2008,enpoblación mexicana,quienesdetectaronlapresenciadeH.pylorien el38%delasmuestrasdelospacientesconcáncergástrico. LaprevalenciadeH.pyloricagA+_{informadaporLópez-Vidal}

etal.essuperior(72%)alaqueencontramosenpacientes guerrerenses con cáncer gástrico(58%). Estas diferencias pueden deberse a las distintas regiones de procedencia de los pacientes. Se ha documentado que los genotipos deH.pyloricirculandiferencialmenteentrepoblacionesy zonas geográficas. En población del noreste de Brasil, de Figueiredo-Cavalcanteetal.,en2012,encontraronqueen pacientesconcáncer gástricoel 83.3%delas cepasde H. pylorieranvacAs1,el53.3%vacAm1yel96.7%cagA+25---28_.

Porotrolado,encontramosqueenloscasosdegastritis crónica el 56.8% fueron H. pylori positivos y los genoti-pos más frecuentes fueron el vacAs1m1 con un87% y un 77.8%fueron cagA+_{.La frecuenciadelgenotipovacAs1m1}

fuemayoralareportadaporRomán-Románetal.,en2013, en población guerrerense con gastritis crónica (43.4%) y superatambiénlaencontradaporPaniaguaetal.,en2009, enpacientesdelEstadodeMéxicocongastritis crónicaH. pylori-positivos(60.1%),enquienesel40%delosinfectados tuvieron el genotipovacAs1m1 yel 52% fueron cagA+_{. De}

Figueiredo-Cavalcanteetal.,en2012,encontraronqueen pacientescongastritiscrónicalosalelotiposs1ym1fueron losmásfrecuentes,el72.4yel51.3%,respectivamente,y el73.7%fueron H.pyloricagA+;Torresetal.,en2009,en pacientescubanoscondispepsiafuncional,encontraronuna frecuenciadel54.9%paraelgenotipovacAs1m1ydel70.6% paraelgenotipocagA+_{.Enestetrabajo,ladeteccióndelos}

genotiposvacA y cagA se hizocon los mismos iniciadores usadosporTorresetal.,yenambosestudioselADNdeH. pyloriydesus genotipossehizoa partirdeADNtotalde biopsiagástrica,porloqueesprobablequelas discrepan-ciasenlasfrecuenciaspuedanexplicarsepordiferenciasen elorigendelapoblación,enelnúmerodepacientesylos criteriosdiagnósticosempleados,yquizápordiferenciasen lametodologíaparaobteneryprocesarlasbiopsias28---31_.La probabilidaddedetectarel ADNdeH.pylori estáinfluido por el número de bacterias en el tejido empleado como fuentede ADNgenómico. Los oligonucleótidos empleados enlaPCR usadaeneste estudiopara revelarelgen RNAr 16SdeH.pyloripermitendetectar2.5ngdeADNdela bac-teriaen50o150ngdeADNhumanoydiscriminanentreel genRNAr16SdeH.pyloriconeldeCampylobacterspp.yel deotrasbacteriasaisladasdelamucosagástrica29_.Elusode laPCRmúltiplepermitióobtenerelgenotipobacterianoen

unmenortiempo,disminuirelgastodereactivosyagilizar laentregaderesultadosalospacientes.

Eneste estudio comparamos la expresión de IFN-␥ en pacientescongastritiscrónicaycáncergástricoinfectadosy noinfectadosporH.pylori,asícomoentregruposdeedady gruposdeinfectadospordiferentesgenotiposbacterianos. Encontramosqueel86.1%delasmuestrasexpresaron IFN-␥yque,apesardenohaberencontradodiferenciasentre laexpresióndeIFN-␥ylainfecciónporH.pylorienambos grupos deestudio,esteanálisisrevelóque enel grupode cáncergástricolaexpresióndeIFN-␥fuemenorqueenel grupodegastritiscrónicaindependientementedela infec-ción.Por el contrario,Lopes etal.,en2005,enmuestras deni˜nosyadolescentesdePortugal,yLindholmetal.,en 1998,enpacientesdeSuecia,reportaronquelaexpresión de IFN-␥ fue mayor en las muestras de los pacientes H. pylori-positivos9,13_{.Considerandoquelagastritiscrónicaes} elprocesoinflamatoriodemagnitudvariablequepuededar origenaladenocarcinomagástrico, enunperiodode10 a 15 a˜nosdeevolución, yque laintensidaddela respuesta inmunitariapresentacambiosconlaedaddelaspersonas, seanalizóelnúmerodecélulascontinciónpositivaaIFN-␥ conrespectoalgrupodeedaddelospacientes.Lafaltade diferenciasestadísticamentesignificativasconrespectoala edadpuedenestarrelacionadaconladiversidadyla intensi-daddelosestímulosinflamatoriosprovenientesdeH.pylori, conotrosfactoresrelacionadosconelestilodevidadelos pacientesyconla presenciadeotros agentesinfecciosos, comoelvirusdeEpstein-Barr.

AlanalizarlaexpresióndeIFN-␥deacuerdoconel

geno-tipo vacA/cagA de H. pylori, encontramos que en ambos

grupos el porcentajede células con expresiónde la cito-cinafuemenorcuandolossujetosestabaninfectadosconel genotipomenosvirulento(vacAs2m2/cagA+_),69%en

gastri-tisy70.5%encáncergástrico;enelgrupodegastritishubo unamayor expresióndeIFN-␥ (86.5%)enaquellos pacien-tesH.pyloripositivosvacAs1m2/cagA+_{yvacAs1m1/cagA}---_. En cáncer gástrico la expresión disminuyó a un 79 y 78% en pacientes H. pylori positivos vacAs1m1/cagA--- _y vacAs1m1/cagA+,respectivamente.Hallazgossimilares fue-ronreportadosporWangetal.,en2007,enpoblaciónChina, queencontraronquelaexpresióndeIFN-␥enpacientescon gastritiscrónicaycáncergástricoinfectadosporH.pylori cagA+_{fuedisminuyendoconformelalesióngástricasehizo}

mássevera16_{.Enpacientescongastritiscrónica,losniveles} incrementadosdeIFN-␥podríancontribuiralainflamación gástricaporactivacióndefagocitosmononuclearesyporla sobrerregulacióndelaexpresióndemoléculasMHC-claseiy ii13.Ademásdedesempe˜narunpapelimportanteenla res-puestaantitumoral,seha reportadoqueelIFN-␥también puede tenerefectos tumorigénicos32_{.En2009, Sayi etal.} reportaronque, enunmodelo murino,el IFN-␥ producido porlascélulasTCD4+desempe˜naunpapelimportanteen el control de la infección por H. pylori y, por otro lado, inducecambiospreneoplásicosdelamucosagástrica11_.La altaexpresióndeIFN-␥enelgrupodepacientesconcáncer gástricopuedetenerdiversossignificados:a)podríaserde buenpronóstico, debidoa que seha reportadoque IFN-␥ puedepromoverlaeliminacióndelascélulasneoplásicasa travésdesuacciónangiostática,lacualrestringeel creci-mientotumoralporinterferirconelsuministrodesangre15_;

dese˜nalesproliferativasyantiapoptóticas,yfacilitandoel escape delas célulastumorales dela accióncitolítica de las célulasNKyloslinfocitosTcitotóxicos32_.Se necesita-ríarealizarunseguimientodelospacientesparaverificarel significadodenuestroshallazgos.

Enconclusión,laexpresióndeINF-␥varíadependiendo delgenotipovacAycagAdeH.pylori,peronodeacuerdoa lapresenciadegastritiscrónicaocáncergástrico.Es nece-sario que se realicen más estudios para determinar si la expresión de IFN-␥ podría ser un biomarcador útil en el pronósticodelcáncergástrico.

Responsabilidades

éticas

Protección de personas y animales.Los autores decla-ranque losprocedimientosseguidosse conformaronalas normaséticasdelcomitédeexperimentaciónhumana res-ponsableydeacuerdoconlaAsociación MédicaMundialy laDeclaracióndeHelsinki.

Confidencialidad de los datos.Los autores declaran que hanseguidolosprotocolosdesucentrodetrabajosobrela publicacióndedatosdepacientesyquetodoslospacientes incluidosenelestudiohanrecibidoinformaciónsuficiente yhan dado suconsentimiento informadopor escrito para participarendichoestudio.

Derechoalaprivacidadyconsentimientoinformado.Los autores han obtenido el consentimiento informadode los pacientes y/osujetos referidos enel artículo.Este docu-mentoobraenpoderdelautordecorrespondencia.

Financiamiento

Lainvestigaciónserealizóconfinanciamientodela Univer-sidadAutónomadeGuerrero,convocatoria2013;delaSEPa travésdelPIFI-2011ydelProgramadeFortalecimiento Aca-démicodelPosgradodeAltaCalidad,claveI010/455/2013 C-677/2013.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclaranquenotienenningúnconflictode inte-reses.

Agradecimientos

AgradecemosalLaboratoriodeBiologíaCelulardelCáncer de la Universidad Autónoma de Guerrero por permitirnos tomarlasfotografíasdelainmunohistoquímica.AlDr.Miguel ÁngelMendozaCatalán,porelapoyobrindadoenlacaptura delasimágenes.AlpersonaldelServiciodeEndoscopiadel HospitalGeneral«RaymundoAbarcaAlarcón»,delaUnidad EspecializadaenGastroenterología Endoscopiaydel Insti-tutoEstataldeCancerología«ArturoBeltránOrtega».

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