Diagnóstico de leptospira pomona por el método inmunofluorescencia directa

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(1)'LIOTEC4 AG*CPECUAR,j LcM9já. '2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y DE ZOOTECNIA. DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIRA POMONA POR EL. METODO DE INRtJNOFLUQRESCENCXR DIRECTA. Por :. MAMIJEL GUILLERMO LEZZACA CASCA JORGE MRRTidEZ ZANA8RIA. Trabajo dirigido presentado como requisito parcial para optar el titulo de Doctor en Medicina Veterinaria. BOGOTA O. E. COLOMBIA 1978.

(2) Rector de la Universidad Nacional Dr. Ramada Hakim Murad Vicerector de la Universidad Nacional Dr. Ziaime ttodtig.uez Lara. Secretario da la Universidad Nacional Dr ... Vranct*co Varela Aniel Decana da la Facultad Dr. Pedro Lazará Bustos Secretario de la facultad Dr. Enrique Nsj La Cuartas Presidente Honorario. Dr. Rl%Iaro•Gutierrez ~tallo Director del Trabajo Dr. Luis Carlos Villnil Jimonsa Codirector. Dra, Olga Mz'iflo Profesor de la t4aterla Dr. Victor Cotrino Badila 3u?adoa Dr. Rafael Sendíno Alfaro Dr. Manuel loae Torres. Anjel. ji.

(3) ( Articulo. 104 dei Regiemento do la Facultad ). £1 presidente do Tesis el Consejo de 3ueas de Tesis y el Jurado examinador, no serán responsables de les ideas emitidas poi' el candidato.. 111.

(4) ¡nstju. Coíombjai Ccntr3 de CEI S. DEDICATORIA. A lo memoria del doctor. ALtMRÜ GUT1ERREZ. MQNTiO, quien fué el gestor del preee. te trabajo.. A la memoria da Mercedes. A mis Padree. A mi Madre. A mis Hermanos. A mis Hermanos. A mis Sobrinos. A Ana Eles. A Ligia. Manuel Guillermo. ]orge. iv.

(5) r. AGRADECIMIENTOS. £1 presenta trabajo.. dirigido no hubiera podido llevaras. a cabo sin ¿e desinteresada colaboración de las doctoras Olga Mariflo y $ teila Ücampo, del doctor Isaac Callego t -le eaara LLgia de De León y del personal de . microbiólogas del Oepartemento de Inmunologie del Laboratorio de -. Investigaciones Médico Veterinarias del Instituto Colombanio Agropecuario lCR.

(6) INDICE GMERAL. 1.. INTRODUCC ION. U,. 1EV.ISi'Dí DE LITERATURA 2.1 Recuento histérico 2.2 Literatura nacional 2.3 Definición 2.31.. Morfologla. 2.3.2. Reproducción 2.3.3. Resistencia. 16. 2.3.4. Necanidades de crecimiento. 17. 2 9 3.5.. Propiedades antgnces. 18. 2.346. inmunidad. 21. 2.3.?. C1aejf.cacidn. 2. 2,4 Leptospirosis en bovinos. 23. 2.5. 25. Leptospirosis. en cerdos. 26 Leptospirosis en equinos. 25. 2..7 Patognasis. 26. 2.8 Diegn4stico. 29.

(7) 29. 2.9 Métodos da damoet*acidn. 2.9.1. £xdrnenesde campo oscuro. 29. 2.9.2. Tinción ar4n.tica. 29. 2.9.3. Tlnsj.dn con ?1uosscena. 30. 2.10 Procedimiento de aislamiento. 31 31. 2.10.1.. Cultivo 2.11 Procedimientos esro3.ógicoe. 31. 2.11.1. Aglutinación macroscópica:. 31. 2.11.2. Aglutinación microecdpca con antígeno inactivado (?orc1ab). 31. 2.11.3. Método de aiutinacidn-1L&is. 31. Métodos. 32. 2.11.4. Otras. 2.12 Leptoapirceis corno zoonosis. 32. 2.12.1. Descripción. 32. 2.12.2. Trateiento especifico. .33. 2.12.3.. Medidas en caso de epIdemia. 33. 2.12.4. Medidas internacionales. 34 36. III. MATERIALES Y METODOS 3.1 Preparación de antígenos. 36. .2 Obtención de anticuerpoS. 37. 33. 3.2.1. Pian da inoculación. 38. Preparación del conjugado. 40. 3.3.1. f raccionmviento. del suero. 3.3.2. Cromato rafia 3.3.3. Determinación del. contenido prot4ico. 40 4,.

(8) 3.3.4. Conju9acidrt de inTTiunoglobulinas 3.4 £vaivacjón del conjugado. 44 46. 3.41.. Eveivacidn in ultra. 46. 3.442.. Eva1uaión In vivo. 4?. IV. RESULTADOS. 51. 4.1 Determinación de proteína. 54. 4.2 DeterinLnacidn de pureza por Inmunoeiectroforeeis 4,3 Conjugación de inmunoglobulinee 444 EvaluaciÓn del conjugado 4.4.1.. £va1uai6n in vitro. 4.4.2. Evaluación in Vivo U.. DISCUSION .i EvaluacIón del conjugada 5. 1 • 1. • Ev1uaci6n in vitro 5.1.2. Evaluación iii vivo. 'Ji. RECOMENDACIONES. 17. RESUMEN. 74. tIIII •SUMMARY. 76. 'JU.. BISLIOCRRFI A. 78.

(9) INDICE DE FIGURAS. 1.. Pureza de igC equjna anti L pomona. 57. fracción No. 28 2.. Pureza de ¡gG equina anti. ponina pool No. 3. 3.. F.rotie da 1. pomona viauaiizada con. conjugado especifico, dilución 124 4.. .57 62. Fotis de L. pomona uieualizada con. conjugado específico dilución 1*8. 63. .. Innuinoflucresceacia. de L. p omona en. cortes de tifón de hamater ID días pø8tinoculacii5n 6. Irununofluoreacencja de pomona cepa días de campo, 7 poatinaculación. 65 66.

(10) INDICE DE TABLAS 1aÇ. 1 • Readmon del sietema de inOculación. 39. 2. Titulaciones. 53. 3 • TitUos de Aglutinación-lieja concentraciones prot4icas 4... OUución prueba in. y. y. 55. especificidad del conjugado. uitro9. '54 Evaluación del conjugado. Prueba in vivo. 61 64.

(11) INDICE DE CRFICAS. Pag.. 1.. Cromatografíe de intercambio idnivo. 56. 2.. CrcmatøgrafXa da tamiz molecular, eeparacidn de colorante- ro adherido a proteina. 59. INDICE DE tUADROS. L. Principales enférnied dOe producidas por Lepto9pirea. 35.

(12) 1. XNTRODIJCC!ON. La leptospiroeis es una enfermedad eeptjcdinica, infecciosa y e la vez una zoonosis do gran importancia, causada por microorganismos del género Leptospira. Me de 125 earogrupoa han sido IdantífIcados en todo el mundo por aplicación de rndtocloe apropiados de laboratorio. Los más importantes serorupoa reconocidos en el país incluyen : ona,. ha14p,j. canicola4... L. grIPj2oty0o. yJ hebdorna.die . Son afectados más frecuentemente animales domés ticos como bovinos, cuinos, fÓlInos, caninos, equinos y at2n el hombre. Otros animales que son afectedo0 por esta enfermedad son loe roedores. La naturaleza da la enfermedad varía de acuerdo con el serogrupo infectante Yo que algunos serogrupos es presenten en un estado CubclXni. co haciendo que esta enfermedad se confunda con otras entidades de nLa. nifestacio es similares y ceso Consecuencia no. SB. ha valorado al ver-. dadero impacto económico en el palo.. Las pérdidas económicas caueadae por la enfermedad en la especie bovina hacen referencia a que es una de las etiologíaS de abortos, cijaminución e incluso case total da la producción l4ctea, mastitis atLp, ces, retraso en el estado de Carnes, mortalidad en terneros de i 3.

(13) meses en éreas altamente infeotadea y si los animales se recuperan con tini3an eliminando leptospiras en la orine por cetca de 3 meses. Sico, etdernmos que el índice de natalidad en la especie bouina de nuestro * país está entre un 40 50% y que muchas de 150. causas de este bajo !. dice con totalmente desconocidas o atribuidas a estos factores, probable que la. leptospirosis. GB. muy. juegue un papel importante en estos re -. 8u1tad8. Loe mtodoe de diagnóstiço comdnrnente utilizados en el paxc paseen algunas caractarieticaa adtsereas que hacen que sus resultados requieren cierto tiempo para el normal desarrollo de BU tica.. El objetivo del presente trabajo es probar la bondad de la tica deanticuerpos fluorescentes como método de diagnóstico para lept.oapizo 5j5 en nuestro medio, ya que algunos estudios indiOan que el mtodo di. i recto pueda apl carse con buen resultado (16). Este. tic3 es uno de. loe procesos inunol4gicoc me modernas y ha sido ampliamente uttiiz-. da debido a su rapidez y eBnSibilidad para detectar e Identificar anta gofoS o anticuerpos..

(14) II.. REVISION DE LITERATURA. 2 .1 Recuentojit4rico. LerrSy en 1800 observó una enfermedad en el hombre carecterLzada por una fiebre Ictericia y hemorragias potequialee. Una fiebrohepática "esocíodo con trabaja en coladores, reportada en 1883 por Landcuzy, fud indudablemente la Leptospirosis (45).. Weil d1?erenci6 en 1886 asta enfermedad de otras similares y de. di recibe el nombre (40). Desde entonces, el término ' Enferme dad de Wei]. ", introducido por Goldechmidt en 1887, fuá usado en todos partes del mundo para describir una enfermedad febril con Ictericia (45). En 1914, H. Bouchet en Çruai•ellera (Francia) llamó le atención sobre una enfermedad febril con mani?eetciones digestivas y meninge» que enfermaban a personas que trabajaban en contacto Can. porcinos, pero recién en el ato de 1935 meningitis de los porquerizos 11 (11).. la denominó " eeudof ito. La causa do la enfermedad de Well cagón comprobaron en 1916 Inda y colaboradores, ea un microorganismo el que llamaron Spirmchaeta.

(15) .4.. icterohaemorrhiae. 14de tarde, el agente fuø hallado en loe rif nos de ratones y ratas de campo considerados como loa principales reservotioe de la infecidn. (49). Weil y Çie lar dieron a conocer un singular padeciniienta infeccL. 00. agudo, que evolucionaba con fiebre jcterjcjs y que hasta 1-. fecha C89. se habla confundido con otros tipos de. enfermedades ictrj. inoluyendo la fiebre amarilla (51).. Inada e ido en 1915 aislaron el agente etioldgico Le p tospira cte rohaemozrhaji (49. Estos mismos autores vieron por primera vez espiroquetas en el tejido da hígado de un conejillo de indias inyectado, con la sangre de un paciente con esta forma Japonesa de la enfermedad de Weti (45). Noguchi en 1917 eetudid varias lesiones sialadas de ceses de enfermedad do Wail y do ratas silvestres en loe Catados Unidos y consideró la morfo1ogLa 3.ø suficientemente Caracterietica para Justificar un nuevo género,, la cual llam6 i. ptoepire, en el or. d5n de las Lepiroquetalee (45). En la Argentina Uriarte en 1917 par métodos biológicos, observó en ratas grises lo infección a Leptospiras (10). El agente causal do la Leptospirosis Ci cerdo en Eetdo* Unidos.

(16) .5'. se la Leptopir pomona . Esta especie fué aislado primeramente por Cla yton y col. (.1937) de Una persona que padø.c!a lo que se le did en llamar "fiebre de loe siete días" (22) Sinjuehina., en 1929 0 estudia ratas de la ciudad de Mosci; de. 60 r adoras examinados, encontró el ii% de positivos por ax6rnene.a sorológicos. richer en 1930, estudiando fl . rattus en Banka (indonesia) halle un 6% de in0cci6n y un 20% en Ratus noeicue. En este mismo ario Forayth y Gohor encuentren inés del 30% de Ratus &ØXafldrinMs. del Cairo positivos a Leptospiras por exémenes al ultrami crO8capio (10).. Savirio y Renalle en 1944 propusiecon el nombre , de. para lee. •loptospirae aísladeadel cerdo en Argentina que, més tarde, 50 Co probó erenL. p nene. La enfermedad de los porqueros, conocida en Suiza desde 1914 9 se comprobó era causada por . •pornoa, trae investigaciones de teell en 1944 (40). En loe Estados corno COU&a. Unidos, Gochersour y Col 1950 idntUicaron,.pornona. da una Optzootia de Leptospirosis bovina, denunciado -. por Saker y Little en 1948, poco después, se dieron a conocer Ln?eccionsø en cerdos y otros animales domésticos, producidas por . pomona (40). En la Unión Soviética, eedn los trabajes de Awrorow y Semskaow -.

(17) .6.. 1937., 1941 y otros, se considera como agente Causante lee Lepto-. iteoaeoo1obinurie o j. ictetoanemia, de le cual se dL tinquen dos tipos (Tipo .1 y Tipo ti) conforme e las iflvetigacionos de Kemenes 1956 y Kelien. 1956 al Tipo ¡ seria el tipo do isp-. toepiras ye descrito en 1928 por Terasou como L ptoep ra orippot a, mientras que el Tipo it serie idéntico al denominado en la ibliografie Svitidø leptospira cepa DWØ a cepa MOnkow, O tem-. bien deade el punto de vista de le nomenclatura bnominal, •. L. Pomo. (31).. £n 1956, Rorg-Peteraon y Feenestad ae ocupan de investigar roedo-. roe de Dinamarca y llegan a notificar que ellos son una do los cu sentee de le enfermedad de los bovinos de ese país,, obtenindossel aislamiento de trescopas de_ pomp a sobra 14 animales exarni nadóe(iO) ,Ferguson y Powere en 1956 9 infectando experimentalmente cerdas con j. pomona vía conjuntival g nasal, domoatrron mayar auceptibilidad al segundo mee de embarazo, ya que observaciones al prim, ro y tercer mee indicaron poco efecto en a reproduccidn (23).. G:erlech en 1957 en Turquía describid una meningitis en un toro cu ya Causa etioldgica fuá. ppmong (27... Kemenes efect2a. en 1956 en Hungría un estudio epdamiol4gico de la enfermedad, logrando aislar entre atrae especies, una cepa de.

(18) .. 7. L.. pomona da rata, otra del serotipo L. eojraa y una tercera de. k. .. -axkoebifl9 (113).. Lanç y Morse en 1958 hicieron pruebas seroldgicee en cardoo ma. culedoc con L. Oomongy encontraron reaccionas positivas con en tiganas dé. En 1960 Morter,. y. .nica (33).. , demoatró que cerdos y cardas preedas ex-. puestas a L. Pomona, ninguno de estos • inclusiva las cerdee que. hartaron, mostraron otro .sntoma de 1a enfermedad (41). En 1961 Clark y Colá estudiando una epizootia en ganado bovino da una granja de Pensylvania, aíslen de animaleo silvestres U copas entre ellas 1. Áctgrot,pmorrhaiae,b. be jlusn y. RED e. En ese-. mismo aflo y en el mismo Fari.e y Col analizan sIervos, hallandoun indica de positividad por reaccioneo oeroldgicaa del 6.94% p, te L. Pomona y 6.09% paraj g ripj,otyphoeg y 1.38% a. be11i y. monos indica a otros varios serotipos (10).. £n1961 Bload y Col., aíslen por primate vez en Argentina una CEpa de. pomona de cutís (Cavia pamparuin) como çonsewenci da un estudio realizado en una epizootia da ganada bovino (3)•.. En Rumania, Sturdza y Nia1eco aislan en 1963, 11 copas da 223 r tan (Raitue noruonicus) : de ellas 9 fueron j4 pmona. de 146 C ro1dicamenta Positivas 85 fuererLLZ, pomona, 21 e L. hebdomadio,. 1.

(19) o 8,. sólo 3 a L..icterohaemorrheiae, 6 a j autornnalis y el resto a trae variedades (52), En Argentina se analizaron 1298 sueros de aves domEsticaS en 197 investigándose en especial Isa zonas donde se realizan explote clones avícolas racionalizadas El serotipa. .mB. com*3n resultó ser. hebdompdie con 34.61%, de j1,. ¿.cterohaemorrhaiae con finalmente L.. pyroqenes y. 15.38%. y. pomona con 13,84% en cada uno (12).. En 1910, en Italia y Ar6entina ce realizaron estudioS eimuit&ieo& sobro eficacia de una bacterina antileptoapire y la respuesta de anticuerpos sEricos eglutinince inducida en bovinos (.15). $e observa una rápida aparición de. eglutininee para loe serotipoe contenidos en la vacune aunque no ea obtuvieron titule cuperio res a 1:1000. Esta vacune puede ser útil pera proteger animales que cohabitan en ambientes. infectados expuestos a fácil cofltamin. cidn (,15) En 1911, D.H.V. Stailheim, en Estados Unidos realizó un procedimL ento mejorado para la preparación de antígenos pata el diagnóstico de Leptospirosis utilizando el método de inmunofl.uoreecencia indirecta, siendo sedimentada L pomona de su ~dio por centrifugacióh y aplicada en una lámina deslizable pata ser usado como aj tigeno (50)..

(20) 0. En 1912 el. Departamento de Patologie del Colegio de Medicine Vete rinaria de Kansas compard la eficacia del método indirecto da anticuerpos fluoreecéntec (Af) y da la técnica convencional de tinción ccn plata, para detectar leptc.apirso en los tejidos infecta dos de Hamater, fijados en fozmalina Le pruebe (Ar) fue generoso, pecifica y efectiva, pudiendo ademe aá realizada por la mayoría del personal de laboratorio (le). En 1972 el Departamento de Zoología del. Royal. Hollaway •Couege exmin6 el suero de 801 vacea 1echere para la presencia de cn cuerpos eepecficoo y encontró evidencia de la infección previa. en 116 animales. En un rabaifo la tase de infección as reflejo de • Varios COipOPefltea embi.entalea, siendo el principal leo especies de mamiferos silvestres con leo cuales entta en cOntacto. LI papel de lee especies de roedores comensales - la rata Rettus nprY el retan dometico j. ea particularmente i. portante; 91 de las 133 reactores positivas o sea el. 68.4 fueron a satotipos loo cuales esas des aspecto* son portadoras () De 1966 a 1972 ea efectuó en la región de la salve peruana un estudio sobre ieptoapiroeio., en la cual ea aislaron por primera vez leptospÍras de loe serogrupoe Ratavine y Pyrogenea, de vacunos; hebdomdje de cerdos y pomona de cobayos silveetros. Las resultados indican que la Leptospirosis ea endómica y anzootica en el -. 9.

(21) . 10 .. Os partanento de San M4rtín y que probablementedich animales son algunos de loe reservorioe naturales de La enfermedad (34). Rodi, P. st. demostraron las actividades aglutinantes e. inmun2. fluorescentes de loe antcuerpoe antileptoepiras de sueros humanos e inmunoglobulinas uy C, para lo cual Fueron examinadas lee-. actividades microaglutinantee e inmunofluoreecentas de sueros de 9 pacientes con la leptospira demostrada clinicamente. Se trató. de L. ioty26 en 7 enfermos y de. sajroe de le. itero. frrhaiaa por un caso (48).. Se hallé La actividad inmuno?liioreecente IgC en 8 pacientes dentro de des hasta 5 semanas desde el principio de la enfermedad; seí loe autores han demostrado la posibilidad de diferencir. el. estado temprano de la in?ecció4 desde la reconveleecencia (48).. Donaid M. Piyera et al en un grupo de 89 armadiUce (haetohracviUous)de argentina en 1977 realizó. un axman serológico,. bacteric.lógico e hiatopatológico para determinar la presencia de Leptopirae. El 47% de les muestras de suero did resultados poaj tivos a la prueba de aglutinación microscópica (43). 2.2 Liteiaturnacjjpaj Villa en 1928 al mencionar la llamada "fiebre de co.cordis des-.

(22) • u. •. cribié la Leptospirosis como la posible. enfermedad de Usil (6). Rastrepo en 1932 presentó la einteeia de aran n*3mero de casos C1 nicos de eXndrome icterohemorrgico observados en diferentes re gaones do Antíoquia y sr, los cuales-el dagnstio probable pudil re ser Fiebre Amarilla, L!ptasJ,jrosie o .Hepatitis Vital. (1). Muñoz Rivas en 197 examinando sueros humanos y porcinos entr4 positividad aj 1ct9rohaemorrhaLae y la L. 1onona (42) Rivera sri 1961 con sueros bovinos procedentes de varios lugares del peLe obtuvo resultados negativos, no sólo pare le . oiia CiflO. tambien para otros tipos de Leptospirosis (47).. Híncapíd ectudid 2060 sueros bovinos por medio de aglutinación m, o5pica con 12 eercgrvpoe de Leptospira, de loe cuales el 36% fueron reactores a dos o más tipos de Leptospiras, correspondiendo al porcentaje ms elto L. aní<aj con l7, .5% (30). García en 1963, examiné 224 muestres de bovinos por el método da aglutir,aci6n-liels encontrando 5.?% pera £.. k. autmneiis,. 450% para. iDp0tYhgea, 3.6% de L. poiiuna, 3.2% e L. £2n!r.*12, 2.8% aeJroo, 2.4% a. Lsustaliey. Py r9g eneffiq 1.6% a. ictarohaeinorrhpojpe.. bdomadie (25).. Manrique, $iver, Sierre, Casarso por la tcnice de esroaglutina-.

(23) • 12. cidn en caninos, encontraron positividad para L. , Pyrooenes en un 80 y. pata. del matadero. ____ en. otro. neetividad en sueros de loe empleados, --. de Bogotá (37).. ManrLqe en 1964 investigo muestras de LOO cerdos pata cultivo (ori no), serologia (sangre). No es hizo ningGn aislamiento El 80% de las orinas estaban contaminadas. Soreldgicamente predominaron los cer9rupos .. p. TOrree en 19. 64. oig y k. canícolg (35).. utiliza por. primera vez en el pafe al método de ag1. tinacidn- lista pera el dieqndeti•ca de leptoapirosie canina. Se encontró una positividad muy aprecab1e. a. J canicie con titu. loe nxirnoe dB positividad baste l 12000; a la vez que doe casos que presentaron site positividad se aLelaran dos. capas de. an.iq. (4).. En 194 se logró por primera vez el aislamiento da j, cenic la en — dos perros al estudiar por punción vosical la orine de 74 perroa i vos de BOggtd (36).. García en 1966 publica la comprobación' serológica de infección por leptospiras en equinós y bovinos en el Departamento de Celdas, sien, do los serotipos mds frecuentes J . automrta jts. y L . pona (26).. Nuevamente Manrique y Sierra en 1966 iiformaron un aislamiento de.

(24) . 13 .. 2201co1e de orine de 55 bovinos examinados. Rde, hallaron en loe mismos animales un porcentaje alto de Beroaglutinacidn positivas p re 1;' *nO. (38). Posteriormente ea informe ,0-1 hallazgo de los primeros casos de j. pomona aislada de cerdos en Colombia el estudiar 113 cerdos eacrjf! •cadoe para el consumo pi3bj..tco en el Municipio de Concordia (Antio. qui). se rec4la importancia epiden4oidgica da este hallazgo por la facilidad de trenssnisidn de la leptospira de animales a animales y de estos al hombre. (6). En 1969 se presenta el primer caso d9 leptospirosis humana dagnostiadr cUnica y serológicarnsnte en Colombia; tio trataba de un joven da II afee de edad quien preeentd un cuadro clIníco Upico, con .c. promiso eimultneo de hig•do, rlfonee y meninges. La aglutinación microscópica mostró ttu1as crectentos de L.pQnicola (4) En 1970 se presentan loe primeros resultados de laS investigaciones sobre leptospiras en trae grupos de animales del dapartamBrto de A tioquia. Se 09tudieron los sueros da 43 cexdo9 por el mtodo de e 1utinaciÓn macroacptca. Se observaron 12 (2?,9) reacciona» positivas (L. 1). ona 9j . py. en. 1, )ba1lL2 1 y j 4ipotyphoe.e. (5).. Torres, Gemez, en 1971 por el método de aglutinación haLe tvabajd.

(25) instituto r&rbíRno p!oor. • 14 .. Centro de Oirflflt3C13fl ÇEIS en 169 sueros aançu1naos !y 20_t ra ovinOs perteneciente a bras 'bovinas da le aabne de Ejogoté y loa vahee da Ubaté y Sppó, encontrando que el serotipo L. b&.1uri. era. el nde frecuente. Ente. resultado çiiferS.a de las investigaciones nacjonales y aQn mundiales en las cualea l. atiºoptyphosa. y pna tenin la mayor inc. dencia (53). La 1975. ea aíslé la L, jnterrooane serotipo kennewicki de fetos por. cinas abortados. Este constituye al primer alelamiento en Colombia y posblemante el primer reporte escrito del alelamiento de este S rotipo de fetos porcinos en América Latina (17) Villa,míl y Alvarez en 1975 encontraron un alto Índice de prevalencia de leptospirosis (41.42%), en un estudio realizado en. 44. oxp1. tacionee lechares (5e)e tetas. autores, eael mismo oa investigaron 97 au g ros da equinos de. paso provenientes de varios municipios del país, encontraron un -56.57. de reactores. positivos. Loe títulos finales más altos fueran. los obtenidos ocn los serotipos 1. jpoJwphosp y j. pocona (57). De las 41timas inveatigaciones realizadas en el pele en el cam po de la leptospirosis fueron las de Almanza y Rincón en 1917, al estudiar 186 sueros bovinas encontrando que el porcentaje de reactores positivos era notoriamente superior (52.60%) que e]. reportado.

(26) 4. por Villamil en a llos. anteriores (41.42%) (2).. 2.3. etiriición Se deeiQnan con el nombre de leptospirosis a las enfermedades de los animales y del hombre que en. su ferina tpice, se manifiestan. /. después de una septicemia inicial por ictericia y nefritis, ee.t como hemog1otinuria y encefalitis (31) Las leptospirosj.s son esencialmente enfermedades de 103 animaleS., le infetcidn humana es edio accidental y resulta del contacto con a1mentos, agua u otros materiales contaminados Con las exeredio.. nes de huéspedes animales (32).. 2.3.1. Los mtr4órÇaflismoe son formaciones extreordinaríamente filias, do vueltas muy poco curva* y juntas. de 7 a 15 micras de largo y de a 1.12 micras de grosor. Su poriin media es casi recta y m1)oS. extremos están encorvados en forma da gancho. Moviendo estos. extremos,, las Leptospirao cambian da lugar o efectian sólo moví mientas de rotacidn (31) Las espírales Lndividua].monte se coponen:de 12 e 18 espires prima. tiaS pøquefae regulares (49)... 15 ..

(27) , 16 .. Las futomictogrefleo electrónicas muestran un fino filamento axial y una membrana delicada. La espiroqueta es. tan delicada que eb el. campo oscuro puede aparecer solamente como una cadena de cocos diminutos (32... Segn Swain el filamento axial esté contenida dentro de la membrana celular que envuelve el cilindre (protoplasmdticó). El organismo consiste en un cilindro da protoplasma homogéneo enrollado alrA dador de un filamento axial:. tanto el uno como el otro encerrado en una delgada membrana (33) 2.3.2. eropi. Le reproducción es usualmente por fisión transversal, pero algunos. organismos desarrollan en un extremo estructuras esudoquisticas 4, go grandes, que hacen suponer un mtodó de reproducción me compl. cada 49) 2.3.3.. eeiatoncia. Las leptospirsa con sensibles tanto a la acción 4e1. C510r. (sucumban. en una hora a 50 - 55 C ) como a les bajas temperaturas. Por esta. razón pierden taabien BU capacidad patógena en me carnes corieledas. Son sensibles a 51 miSmo, frente a loe ácidos, por lo cual mueren rpidamante en orinas acidificadas. En al agua pet'inañecen -.

(28) I1jfr COjflr-bt., CPfltr. de t ':. n. C. vivas durante eemanaa aunque SU vitalidad queda reducido ante loe me leves Indicios de eust flcis dcidae (31). 2.3.4.. .N. oid ee d r&c$*ietflq.. Las laptoepiraa son esrabise y Be desarrollan mejor art pH 9.2 a. temperaturas entre 25 y 30 C.. -L.as leptospiraS se desarrollan enun medio simple compuesto .de 5o1ø 9 tiamina, aspatagina y esroal.. búmina de conejo; pero esta albúmina de conejo no puede ser sust tuina por una mezcla de amnodcidOs que se Saben se encuentran en 1a albúmina (49).. El cultivo se logra con facilidad• en el medí* nutritivo da Siu ffner y Wolf (agua potable con 1:1000 peptona •y 2:1000 de cal comdn) mezclando con 2 cc de dote eolucidn 0,51,0 de sangre con laptoe.. piras, en tubitos que se mantienen luego a la temperatura de 18 C El crecimiento puede verso y a a los 5 o 6 dla.u. Bajas con centrac iones de ealøe de Zn y Co en el medio estimularon el crecjmiento de varias cepas de dos especies de Lepfosiraa, p. ro antidadO$ altas lo inhibieron. El cobre en bajas concentraci nos aumenta la taza de crecimiento de lept*piraa eaprófitas pero no afecta las cepas parasitarias; en altas concentraciones inhi bid la rnu1tip1icacin de todas las cepas. £n un medio contenido -. 1.

(29) • 18. .Zn la adición de cantidadeS crecientes de Cd produjo un erecto Inhibitorio pregrasIvo sobre ambas espacies. Se recomienda el agreedo de 0,2 x ID6 gr de Zn (NO 3 )2 61420 y JJ gr da Co SO4 70201m1 de media kortho?. Lee k-eD_ to!pí.,rAs eapr4fitae crece n mejor en presencie degr de Cu $O . 514201m1 de medio (9). 23 .. Pdadea Desde el punto de viste morfológico., lee ieDtospir&s no ea pueden diferenciar; biaquimicamante sólo se diferencian las pató genaS . .Inter£Mna de las saprofItas J.L hjJf Por esto eu identificA ci4n as hacen en, base a sus característicos erstgdncee. Se debe tener en cuenta que un sarotipo se la unidad taxonómica bsice por l.e propiedades sglutinógenee y que un serogrupo está formado por dos o m earotpoe que tienen reaccionas esrológicae cruzadas (24) ppjngni. exhibe cióite e].utinacidn cruzada c0nj. autqmiaIie.. Y ligeree reacciones con ciertas j..e ptspira8. La ~renta parad, gica reacción. cruzada cm L. !jros que dan 108 sueros da bovinos infectados con . r pornong pueda explicares con al aislamiento de L.hardio ( del mismo grupo eerolt5gico que le .eiroa) realizado Por Roth e partir de ganado 'acuno aparentemente normL (40)..

(30) . 19 .. Lee propiedades, antigdnicas de, las leptospiras, tanto pat4ena$ Comø feq fueron motivo de interesantes: estudios, bebiéndose encontrado propiedades eerolgicas propias y: comunes entre 1e Pffl tógenas y no en la misma magnitud dentro del gran grupo de las j flexas • Todos estos mio anismc$ son de similar canetitución morfológica pero genotipicamente diferentes. En base e lea propia dedos antjgdnicae pudo clasi?Lcer en grupos e LaS' diferentes uere dadee de Iept!spiras patógenas (__trrQqsna) en cambio en no es. posible agrupar al infinitp ncméro de ..aptqspirae btflgxg, debido e la baje tss o a la falta de relaciones entignicae entre ellas (14). Roik y Col, examinaran 1,s propiedades microaglutinsntss a Ínmun, fluorescentes de sueros en pacientes con la leptospira demostrada clinicemente. Las actividades aglutinantes do la 'XgM ea acercaban a la de loe sueros enteros. Fueron halleda en la igG le activi. dadas aglutinantes en 5 pacientes de los cuales 4 casos hasta tres meses desde el principio de la enfermedad. Sdio en uno da -. los pacientes la actividad de la IgG alcanzó la LgM de*pus de 6 mases (45). Ctiang y ramo demostraron por microscopia electrt5nlce ls reccjo nez entra los filamentos axiales da las leptospiras y los anticuar.

(31) pos 1g e igM,. Li empleo de antisueros f reccionadoe revela que ten tu la 1914 tomo la igG teccianen con el filamento axial. Loe anti cuerpos IgM en forma de ganchos, se adhieren al filamento por nume rasos elementos da fijacLón. La molécula da IgM tiene una longitud dedin da 33 nm . y :cda 813'nsnta taide. 3. .m. Las anticuarp 19S ea -. presentan en forma de bastoncillos adheridos el filamento axia1 por una o ambas axteetaidadea portadoras de los sitios reacionantee. Las dimensiones medias de astas anticuerpos Iivalshtes son de 24 por 3 nín. El filarnonta axial es el primer elemento estructural de las leptospiras a sor identificado por serologia. LI estudio astemtico de la reactivided antigdnica czada del fj lamento axial de los diferentes eerotipae podrá contribuir al dos rollo de un nuevo. sistema. de clasificacidn basado en la eepecific. dad antigÓni,a (20). Un trabajo exprlrneñtel realizado por Graves y Vaina para estudiar las :aglutiflinaø antileptospiras en conejos hacienda inoculación Ui travenosa en conejos adultos de leptospiras vivas especie biflexa, cepa, provocó el desarrollo de anticuerpos eglutinantes compue tos de una frecotón 19$ (detectabi.e el cuarto die después de le inoculación) y une fracción 75 que apareció a los 6 dias después do la inoculación. Ambas aglutininas persistieron en el euaro hasta -.

(32) s 21. el final de lee observaciones (día 216)0 Las. proteinae edrtcas presentes en ambos componentes fueron determj nadas por inmunoelectroforeaja y e1ectrofoje8js sobre acetato de ca lulocaé La elucidn de les fracciones 11.11053 confirmó. en. membranas de aCetatO de ce-.. que en loe anticuerpos 19$ le actividad aglutinante. reside en los IG que migran. Sfl:. la Zona Beta, mientras que 1 fraccj,. dn 7S debía ser atríbu£da a las ig nigrantea en la zona gama (29). 2.3.6. Los .anjmalea curados da leptoapirosis ea consideren inmunes de porvide ente el eerotlpi, homólogo, pero pueden ser receptivos a otros serotlpos no relacionados antigónlcametite. La presencia de anticuar Poe, reSponsables de la aglutinacidn-. lieie (Ii L) indica que el en¡ mal resiste la in?ecci6n con el serotipo homólogo. No 'obtanto, algunos anima1ee pueden estar inmunes aunque no puedan demostrarse en los .auroe. anticuerpos ( A L). York. y. Col, 1955 9 consiguió una bac-. terine eficaz en le prevención de 'la leptospirosis bovina le cual protegió al ganado vacuno aproximadamentó por 12 meses. Reinhard 1954.. indicó que lee vacas inoculadas con una vacune a bea de copee pasadas por embrión de pollo * eran inmunes par lo menos durante 17 meses..

(33) ! 22. r4áe tarde. kenzy y Col-. empleando una vacune procedente de un cultivo. pasado por embti4n. de pollo 543 veces observaron la persistencia de 1Ø inmunidad aproximadamente du te. 4 ellos. Corno era de espar . r la 2. vacuna viva estimule una respuesta de anUcuerpos 1% L más temprana,. pues aparece al cuarto día mientras que se requieran 10-14 díaspara lograr Su aparición con una bacterina. Las cepas utilizadas fueron preparadas con cultivos vvs de L. pØona (40). En Italia y en Argentina 1971, ea realizaron estudios Simultáneas s bre la eficacIa de Una vaculia antilaptoepire y la respuesta de enti cuerpos s,ricos (eQlutinineó) inducida en bovinos. La vacune contenta 1.000.000 de leptoSpiras do cada sarotipo por dosis y ea administró. a terneros de 3-5 meses do edad en dosis sucesivas, con un intervalo de 10-11 días entro cada una Se obeervd una rápida aparición de agiutininee pare loe eerottpos con-tenidos-en la vacune aunque no se obtuvieron titules superiores a. 1: 1000.1, atando en la mayoría de los COSOS, da apenas 1:100. Estos -. titulas bajou y poco persistentes dificilmente, provocarán errores da interpretación derivados de. co fundtr. excretqres de leptospira como. reSultado de una infección superada y animales vacunados, Esta vacune.

(34) • 23.. Puede ser i3tLl para proteger animales que cohabitan en ambientes j! fe.ctados (13).. El empleo de suero iparimune puede sr dtii pero da este tratamien tu eSlo so puede obtener buen resultado, en el møjor de loe casos cuando se instituye lo más tatde, de 4 e 6 dXaw deapués de presentar ea los primeros sintomes de la. .enf':ex'meded. Se presenta tambien le dificultad de que date suero es difícil de conseguir (31). 2.•7• tlaaiflccjdn (8) Reino $ Proceryotae División ji La Bacteria Parte 5 t Spirichetee Orden 1: $pr1rocbaatalee Familia 1: Spri•rochaataceee Género V ; Leptospira. 2.4 Leptoppira enbovi.noa, La Leptoepiroeis en bovinos puede variar en eevericia8 desde una infacción inaparente hasta una ínfeccién aguda que puede terminar -.

(35) .. con la muerte. La forma aguda COLr9 m .a frecuentemente en animales jdvenee, peto t ce las edadeS puedan ser afectadas. Loe btvinoe pueden desarrollar una leptopirarnia, alta temperatura hasta 40 C, depresi,3n, anorexia y baja en la producción láctea. Los signos para el aparato digestivo incluyen diarrea, constipecidn. Y algunos animales desarrollan diarrea después de la sana ipacidn, nemia hemo1itca, hemoglobinuria, a nemja, ictericia y ere en la leche tambien pueden ser vistos (21). En y ace en lactancia es presente f1aidez asmeria y la producción de leche puede c5Or. La leche eS g eneralmente anormal y 4ontiene -griSnui.us rojos o amarila.. Loa. obortoø Son el signo clinjco mds frecuentemente reportdo dependiendo de la .apoca de infección, ueulmente ocurre -5 ean e dos puse de la infección inicial. Algunos abortes pueden ocurrir me ta, de, preeentndr3ee tanbien .caeoa de abortos en el último trimestre.. Ciir4camente la enfermedad puede manifestares con eignoe poco visibles G SOPE COARI4. 24 ..

(36) • 25 .. Y ocurrir. una infecci4n ineparenta. Algunee bovinos pueden desarrollar. titulas ser14gicos sin presentar signos c1Lnia (21). 2.5 LØptep i gai en cerdo. La Infección: se caracteriza por aborto y muerte neonatales. Tarnbien pue de observaras fiebre, rigidez artiuiar e inapetencia. Perece sor queleo cerdas contagiadas durante el segundo mee de la gaataci4n experimen tafl lag prdidaa mde graves, por aborto y partes a termina con la cría muerta (23). 2.6 kepto#pirojeneqjno En esta especie la faSe aguda de in •enferrneciad es la cGneDCuenci inmediata de la exposición que frecuentemente es eubclinia y el animal a fectada puede arnantar $u tSmperatura y disminuir su apetito. La ].epto .pLieeie causada por el serotipo j. pomoria es lo mde frecuente en equl nos uScGptibles. Deepue de le. .inf8ccidn I. niciall. les hombres profladee. pueden abortar, pero le leptospirosis no .es le cause conun de abortos. HXpOtet:icarflente despuda del 12 o 14 mes de la infeccidn inicial las. o-.

(37) • 26 .. JoB do loe cabellos evidencln uvaitie y la enfeiedad es le causa co. mr de la oftarnf o periódico, ir±dociclitie recurrente o ceguera lunar tvetuamentø hay opacidad en el cristalino o catarata. Las oftaimias pueden regresar a Su entado norrn1 praentdndose posteriorente un* . o doe ataques eudoa que pueden conllevar a la ceguera total (21).. 2.7. .Zénasís 100: animales se ínfOtten al beber aguas contaminadas con orines viru-. lentas o al caminar par charcas inteçtade, circunstancia en lee cueles las leptosjirae penetran en loe tejidos con facilidad o a través de heridas o de erosiones de las nucoeae de la pial.,Com fuente de infección desempe?tan un papel importante no e40 los animales enfer mos sino tembien otros sanos, ya que, tras su curación, e1imjnn las 1eptoepres durante trae o cuatro meses. Loe bóvinos. pueden Contaminares aei mino con orino virulenta de otros animales. £n este sentido el popel m$ importante lo deaompeíian los cerdos cono Principales reservonas de la L. pomona, aunque en la or..

(38) .2?.. na de los 4uidoe, ovidóo y caprinos, aei coma en diferentes roedoree salvajes, se encuentran acaeionalmente Leptospiras que pueden Set Oantes de le Leptospirosis bovina. Las leptospiras ingeridas Con al agua de bebida pasen a le sangre y destruyen. cierto núrnerp de glóbulos rojos. Muofise veces la infcción. Pasa Inadvertida o en vacas goetentee origina sola la muerte del feto, mientras que en otros casos la enfermedad se manifieste por sintamos muy d:bilee aunque en otros casos produce un cuadro clZnco da notorj a gravedad (31). El. aborto puede set debido a Leptosp±roeio, e suete poisa tdxcae pro ducd3e cuando Zas lepto8p1rae son lied por los antcuerpoe o por djeturbjo.s en la nutrícitlb 41 feto inducidS por cambios patolØgicos en los plecentomue. Sinembsrgo se oree que el feto muere durante la Leptospirosis y expulsado fuera del cuerpo.. Durante le Leptoemia. algunos de las Leptoepirs penentran la barrera placentarla y pueden ocasionar anticuerpos materniea., ello co tindan la multiplicación durante largos Perlados en el feto. La regularidad con que la infecq dn dSZ feto ocurre no ha sido bien determinada pero algunos de loe fetos infectadossobreviven a la enfermedad y llegan a término. ti a.'.

(39) • 28 .. borto pude ocurrir de 2-5 sen3arec después de la Lnfecidn y ea expuL sedo en algunos d.as (21). Aparte de sato se originan 1eaones en lee paredes veacuiarea debidas a *uetantea catab61Lcee tóxca$. La consecuencia de esto es le duccidn de hemorragias, edemas y necrosis cit*5neaa y mucosas. Lee l, tosptraa a$jen.tan tmbien en los r4JIDneZ y producen inflanaoiÓn inte! Gt.iCiel ($l).. 2.8 pij En todos IDa Casos de erferneciedea febriles de iniiaci*n aguda y de origen desconocida deben ~doraras la posibilidad de Leptospirosis y debe efectuaras al diagnóstica de laboretorLo, Sobre todo si le hi tone, del paLente Indica una posib1e expoeicidn a la Leptospira. Manifeetecionee clínicas que eugieran meningitis aeptice o infciones de. tipo :p4IiornOIitis nc peraUtica, eón tembien caus adas por Leptoepj. res. £vldenteaente, 108 protodimientoe de laboratorio que den la u rpida confirmación de diagnóstiCo de Leptospirosis son loe rns deseables deadó el punto de viste del paciente, del veterinario y del eidemi6-.

(40) .29.. loso. Latos p ro.cedimjentca, como en otras in?ecpiones bacterianas., e tdn basados en pruebas de cultivas e .inoculaci4n anirnal pare at3lat Leptospiras de los tejidos o liquidas orgnicos y pruebas eeroldgics para descubrir articuerpoa epecXfica.. 2.9 todaS Z9-1-. maetraci6n manØo4. oecurg. Durante la leptospiremi, las leptospiras puedan encontrarse por exdman de sangre en el campo oscuro o pueden ser descubiertas en la Ori-. na después de la primera Semana de la enfermedad. Ej ex&ien directa de la Sangre u arana falla o lleva a errores de . d.tagndstico con tanta fracuøncia que nunca debería Ser utilizado coma .Ónica pruebe de diagndatico. Generalmente hay tan paces leptospiras en un gota de sangre que nc, pueden veras coma tambien coexistir formaciones protoplasmétícae. oiulae que pueden ciar lugar o ~vocaciones (16).. .94. Tincion arnntca £n. casos fatales lee laptospiree pueden encontrares en secciones de. hígado y da Vifi&% talUdes por le tecnica de irnpregnacin da tevaditi..

(41) Otra tcniea de tinci&t ergdntica ha sido descrita por aridges y Lun (7) la que parece me oatisfactorie espe$o1menta si el paciente. ha sido tratado con antibióticos. Debe recalcarse que no puede hacerse ninguna dUerenoiacidn con respecto al eertipo infectante por ninguna de lea técnica* de daaetacitSn (16). 2..3 Lee tnicae de anticuerpos. fluoreecentes. pueden aplicaras con buen -. resultado para denoetrsr la presencie de leptospiras en orine y .propeticiones de tejidos (16). Cuando se c0parsron los resultedoe de la pruebo. inmunpfluoresce. cia con la de e itinación-lieia y prueba maroecdpica de aglutine cl4n en placa se enesntró que le irununofluorescencie ea tan sensible COMO. la ag1utinaci4n . 11e1e y eignif•icantementa rnde sensible como la. aglutimcldb en P1,aco Para 1Q detecci6n de anticuerpos en la orine. La d terminación. toepira On tu. para. de la presencia de anticuerpos especifico; anti-le. la orina. el.. da bviroe ha demostrado ser un procedimiento 4-. dascutrirnianto .da Infecciones previaa y actuales (16).

(42) • 31 .. 2. ID. ProSOWIeieii,ento 2.1.1. Cu1tig El a alaiento de 1eptosire por cultivo direito de la sangre de p cientos durante el t,erLodo febril de la enfex'rnedad ea un rndtodo con. parativanente eencjllc ysi está, bien hecho ea ns confiable (16).. 2.11 PL pedinientg s Øarolóoicoo 2,11.1raid. bec4pic,a. Lotee pruebas son sdIo parcialmente especificas pare eerogrtipos lo gua significa que debe uaaree una bacteria de antigenos o varios pool de antigenoa (16). 2.11. .2. uidn mcroscápjca en ' 8atXer nct yg {op1g).. Le menoe rnpiicado y. los antX9encs generalmente permanecen eotables:. durante dos $anlana6 p o r lo menee. RUnqUB lOE: Utulos son algo iMa jos. con antiBnos Inactivado, los resultados son comparables (28).. 2.11.3.. 0d* d. Esta, corno otras reacciones eeroldgicae tiene el problema que de reacci.

(43) . ones tadLes, t'eacçionee cruzades y ea ro co*ario el uso de sntigenos vivos .ue impliog peligro de contemineción para el laboratorista, además largos pIados de ptparaci4n de antigenos (54). 2.11.4 ptoS tod Xtciuye la prueba de fijacidn de cnplensnto con antigenw desjnteg radas por vjbracjdn uj.traanica(46) la ptuebe de e4•trociton sensiiZLzadOs y la prueba hUtica.. £Staø. prueba* Son en cierta medida genero- oapac?iee y requieren. mucho menos ant gano para descubrir anticuerpos leptaepirsicoe Sine barga, son más dificilee de realizar y no son prócticos para mucijoslaboratorios (16). 2.12. p to pirp sM Oø.ZOQnveis 2.12.1 Deecrio.ón La une enfermeda0 infecciosa aguda que ea presenta con fiebre,, ceft. gis, eea1o'rio, el molestar intenso, vómitos, dolores muS cuieree, •rritatión msnLngea, ccnjuntivjtie, con poca frecuencia. Se. observa:. ictericia, lneuficjercia renal, anemia hemolÍtica, hemorragias cut4-. J$LJOTECA M GOFECUARj4 !. L9IA. 32 ..

(44) e 33 neae y de lee CE branas. mucosas. A verso hay erupción pretibiel, e. cuadro . clínico dura 1-3 semanas y puedo haber t'ecaidaa. La letalidad. as baja pero autiente conforme avanza le edad del pacientes puede 11 qar a ser del 2 o nd* en enfermos con ictericia y lesiones renales (44)1 Lee princ$palas capee de leptospiras aisladas del hombre .y de loe anirnalee ea Øi?erentas .patee del mundo y Omirad como especies — diførentae (ver cuadro 1) están relacionadas øerlóicaiente y musetren notable reativLdad cruzada en la reacción saro14ica(32). 2.12.2.re19gjscXfico La estreptomicina y loe .n tibitico: del grupo de lee tetrecicUnae son iapto9pirioids, pero atP no se ha comprobado . su utilidad en lainfección htna (44). 2.12.3. ei3 1 en case deepidamia Se debe buecar la fuente de infección (Cuadro l) eliminar10 coataminacit5n O prohibir. su uso. ABi mismo se debe buscar la fuente de in. fección en la industria u otras ocupaciones en la que haya contacto ditecto con animales..

(45) .342. 2.4. Mecidae Lntero1øs Bajo loe uBíicio e ~Junto de La Organización f4uridjal de la Salud. (MS) y la oranizacidn para le Alimentación y lo Agricultura (ttAfl), ea han establecido en todo el mundo asia laboratórjoe encargados de la idOnt?icaci4n de las iepto.epLreB, aisladas y do la dfución de información entre los inveatigadoree que trabajan en Laptoepiroeis..

(46) )flOk d3. Lt. ntnL4 £bnoz4 rob o. R1. tkdvw- oca r.1vo. 4ngUi. Un~, A?do. mosiÁL1 Uflito,. r.to, iCt,G. tcU. LI!i' ( t * t1taL. Tt7e. cobm. jwttt$a. fj8bX*t 01. ley Ubi-n. ¡tttrUa ULO.

(47) • 36 •. UI. t4MtRZRLS y METODOS. atJçenp. 3.1 .. Se inicia si trebejo a partir de copec de ptoepir eMone cedidas por el laboratorio de inveatigecionea Mdicae ieterinexiae (LIMtI) del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), ie cuales son utilizadas r t4nariarnente para diagnetico d9 Leptospirosis por si método de eglutinacin- lizIG. Rdeme, se uCton cepaS del mima seóti.pc enviadas por el. Centro Panjnsricano de Zoonosis al Dspartarnento da Enfermada -. des de le Reprodicoin del LIMV- ICA Para le pruebe in vivo del conjugado se utlllzd adoniás una capa de campo aislada de porcinoe de la sabane de Bogotá. Dichas cepas fueran cultivadas en rnedioe fl.stcher y Stuart a una temperatuta de 28 C Pa-. re su co nservación ea hicieron repiques ceda 8 dfas. Antes de ger inoculada al ontigerrn deberla llenar los siguienteo requ. II.

(48) • 3•?.. a. SØr inocuo y libre de sustancies extrfae, pare lo cual. 85. rsiii.. ZaDon pruebas en medios tioglicolato y agar aengrs. b Concentración *+ 200 leptoOpiras por campo 40X C. Motilidad de]. 00%. E] antijeno preparado en condicíonez ideales so tomó del anillo formado, ea pacd a un tubo con tepa rosca, Luego se procedió a Inactivar lea leptospiras por medio del calor (belio de maria) e 56 C. durante -. 15 iinutoe; pasada este tiempo os observó la preparación al microscopio de campo oScuDo pare saber si las leptospiras estaban vives o En rato de Persistencia de leo vivas se , re1izebn una nueva inactiva. cin. A la euepensión obtenida es adió posteriormente el adyuvante Incompleto da frsund en proporción de 25 e 50% adicionado lentamente hasta le obtención d9 una emulsión.. 3.2 pbtencLón. entlWmmgo2 En :5, obtención del suero hiperirmwne se utiliz6 un grupo de tres equinos cuyas Odadea fluctuaban antro dos y cuatro aPios, los cuales fueron sometidos a un riguroso cxmen clinica y de laboratorio, Se ealecciani5 esta espacie debido el gran va1meri de suero que auminta-.

(49) • 38 . tra y tambien a la comodidad de su manejo. Previamente a la inoculación es re1izó a Coda uno de los animales un angr1a, 10 cual se practicó Put venopunción en la yugular boato obtener una cantidad de. IGcc da sangre. Obtenido 01 suero. :50. procedid a la determInación del título final ag. tiflenta.antileptoapire, comprobando ev,euogncia total. 3.2 - 1 Plan d. j22.c lacn La &noculacir se hizo por v.a aubcutnea. Loe sitios de elección para las aplicaciones fueran leo rgionaa cervicales derecha e izquierda Inoculando igual cantidad de antígeno en cada. UfltO. Las Inoculacionsa fueron periónicas y ccn los intervalos que se expreSan. en. la Tabla No • 1 • Lea cantidad de nócula deberían ser prograsi -. V00 pero en algunos casos la cantidad fué igual a la inoculación ente-. rior debida o que en ocasiones no 5obtenf. sufIcIente. y rápido cree¡. miento de lee cepae A partir de la tercera inoculación y con la eecuenia que muestra la tabla No .2, ea realizaron pruebas. serológicee Para la deteruiinacLdn: del. título final aglutinante en cada caso y a cada uno de loe tres anima -.

(50) TABLA 1.. No. de inoculoci&i 1. 2. 3 4 5 6 7 8. No. del día 1 7 15 24 33. 40 47 55. Resumen del. aiaterna de inocule cidn. Ttal cc antigeno VIO s.c.. total c.c adyuvante. 1 2 2 2 2* 2* 2*. 3 2 2 2 2 2 2. 2*. 3. Total de animales inoculados. * R partir de la quinta inoculecidr se tjtiliz6 entigeno Vivo. 3. 3 3 3 3. 3 3.

(51) r • 413 .. les proviamente identificedoc corno EL, £2 9 £3. lina vez obtenido el t tule óptimo requerido para los procesos de conjugación de sueros hipl rinrnunea se procedió e eang er al equino. El que mostró el nóximo titulo do anticuerpos.. Los demós equinos se descartaron • A dicho equino ?uØ colectada por venopuncidn sn le yugular un litro de sangre en tres ocasiones,, cada tres diaS. Dicha sangre por procesw de docontación y centri?uç ación i.a fud extraido SI suero, que fué conserveda e -25 C. 33 .Parecón 1 conj,uqo 3.3.1.. 3i19. del ' suero. Para obtener inmunoglabulina purificada y epeeL?ica que •cornprende: - Precipitación : el m4todo que es utilizó fué el de pracÍpitación con sulfato de amonio caL: Eliminación de impurezas del suero .por centrifu.aci4n e 1.400 x g. drnte 30 minutos. Adición, al suero clarificado de un volórnen igual de solución na 0.85% Adición gota a gota da solución saturada de sulfato, do enwi*io (NH4) 2 904 el 70%, hasta lograr que le concentración final fuese del 5% 1 se.

(52) . 41 trabajó a una temperatura de 4 C durante 15 minutos en continua egit. citn eritr1fuectdn a 1.084% x g en : frío (4 C) durante 30 minutas Disolución del precipitado en Lo mitad. del volumen inicial en solución. salino 0.85% peticiÓn de le precipitación con Sulfato de amonio, en lo forme. en-. teriinte enunciada, por dos veces consecutivas. Dis lución del tercer precipitado de solución e1ina en la cuarta P4. t del volumen inicial del suero Eliminacidn del exceso d&: sulfato en suspensión dializando contra 82, luciÓn salina 0.85% durante 18. hora* con cambies psi4dicos. Comprobación dø lo ausencia de aulfato aliadiendo a un volumen dializ do un volumen de cloruro. de bario al IQ% aa en el cual se ~robó. lo no formación de precipitado del sulfato de bario. Centrfugecidn a 1.084 x g (3.000 fprn) durante 20 minutas . paro remoc 4n del mat€ rial insoluble. Posteriormente a este paa se sometió la solución a titulación pare determinación de capacIdad aglutinante y se deterninó la concentraci4n. da prateina Determinación de lo. pureza de le fracción enmettendo una muestra a ij..

(53) • 42. Para la realízocidn de la ln.uioølectroforaoia ea munoelectroforesie. eiguid el eiuinte procedimiento: Se coloca uno capa de agar do. dO,jÓ. 2-3. mm de espesor sobre lee idainas y as. $oU4ificar. Se perforaron loe orificios donde se zlocd el euero, previo temocidn del aar por •eucción. $e nared le tenura central donde se depositó -deopuas de le eietro?oresis el antteuero correspondiente.. Con una micropipeta fue depoitad p el ~ro necesario e ceda ori?icío.. Se inicid jo electrofbreejs eplicandó una corriente de 6 voltios por on (total 150 voltios) durante 75 iniautoe. Fué colocsdo el antisuero. crreepondients con una micropipeta. en le r. hura central Lo ljnins se cc3 acaran en .çmert Jn3meda• pare diftjeidn a temperatura. ambiente 8urante. LB g hOraS. $e procedió si eM•ljeio. y Observación de les bendae. resultantes. Se colocaron loe Idminea con rojo Poneeau eegdnel siguiente eequesna: $e levaron las placeo en solución salina bufferado pH 7.4 durante 18 horas en agitación constante, para eliminar lee conStituyen tea solubles que no reaccionaron Se Colocó papel filtro: sobre las placee lavados y se dejó Secar.

(54) 'Se colocaron l* plecce durante 15 minutoe en el colorante rojo Ponceau Lea placee fueron lavadas en oolución de ácido ecetcaal 5% para eliai.. nar la coloración de fondo. y 90. dejoror eaar. Purificación de lo proteína obtenida, por crotografLa da intercambioónica 3.3.2.. tprie. ti procedimiento pare la croinatcgraf. La. de intercambio iónico fua ree]j. Zado ea1: 58. concentré con .pouvinflpirroiidona ( P. U. 9.) la fracción. j9. gl.o. bultna cruda obtenida por precipitación do proteica aprnp4.ade(40.$. -. rn. SO dializó la muea.tra a tratar con eolucidn bu?far.. tris 0.0114 pH 8.6 y centrifugó para 'remover material insoluble luego de filtración par filtro tlillipore 0.45 m. - Se colocaron 5-ml de la mueetree en la supeficle 0$ una columna de Sephadex DEAE A 50 - Se inició el proceso de elución por gradiente diecntinuo can buffer tris pH 8.6 aumentando su moriidod por etapas da 0.01 a 0.1 y 0.5 - Se. colectaron fraccionas de 3 ml para determinación de ~tenido. P4.

(55) p44. áito por lectura en si eøpectrofotórnetro a 280 nrn Se reunieron le frecciones perteneciente* a. primer Pico de lo curva de pro tema - Se oeteccionaron ae fracciones que a determinación ioe1ctrofor tica moetreron tndxirna pureza lgC - Se detevinihó toncentra cidn de proteína y capacidad aglutinante da lee. -. Lea fracciones óptimas ea reunieron y llevaron a concatracidn da 10 mG/M l. de proteína purificada, ya que la concøntrevión ideal está en-. tra 10 y 30 inq/rnl pero proceace do marcación - Se elaborÓ una prueba de irununoeiectroforeei, cn el fin da asegurar la pureza da la fracción 3.3 .3.. eeinación .i ntenida proteico. Para .a determinación del contenido protóico se siguié el método de Folin- tocalteau( 39) método por el cual conociendo le •concentracidn de proteina de un atondar, ea posible obtener valores desconocidos de. la mama protelna aplicando la siguiente formule: [Muestr =. ç. b3 rot £na gtandarifl 0.0. standard. U atondard as preparó con gibi3mina liofilizada 400 Mg por mililitro 3.3.4. onuoaci4n La protaina ya purificada con concentreetn Ideal (10 mg/mi) se omatid.

(56) • 45. a conjugacidn: - Se mantuvo. la prctena a 4 C a1adiándó1e solución tamponada de crb nato 0.05 tnolaZ pH 93 en cantidad Equivalente a]. 10% - Se ofladit5 ieotiocinato de fi. ecna en polvo en proporcitín da 0.. 024 ag por 1.0 m de prote!na. - Se agitó la mezcla durante 18 horas en frío Pero la eliminetión del colorante no adherido y evitar aal reaccionas inespecLficee ce eomotid a oeparacLn en basas su tamaflo por rnedio da loe 1'tamices moleculares" (phadex G25) - Se colocó al cbnjuedo en columna de septadex .G-25 equilibrada y elia. ida con aoiucidri tampon de fosfato pH 1.2, 0.01 N - Se determin* la relación fluoreseeina y proteína (F/Pø) de lasfrecol enes resultantes haciende lecturas en el espactrofotoinetro a 280 y 495 nin respectivamente Rlaci6n ?iaDescefna/proteins: Fi. Proteína 2Jr7:.x 0..0.495 col. D.G. 280 nm, - 0.35 * D.C. 495 ne. $e título. conjugado para determinar la óptima dilución que colores -. con un mínimo de coloración no especifica - Se determínó la capacidad aglutinante del conjugado.

(57) • 46 3.4. cjn d1: ti Conjugado Cué eometido. a. una Saris de diluciones que Iban desde 1:. 2 hasta 1:64 con el fin de establecer la dilucidn más apropiada, copr,. bando asi que la di1uc1n mdc alta que produjo, fluorescencia especifica fue 1:8 9 69 tomo corno di.tucidn d: trabajo 1:4 3.4.1k Se prapard una doble serie de frotia de antígenos correspondientes ejOeDira. e:j14 pOionº. enfrentados a ". cOnø netjvo,. busnda le especificidad del conjugado obtenido. A. lee idminas previamente marcadas y del mit das løo zonas de ?rotie. se lee sal aid los Sitios correspondientes con signas eB!:. Leptosp1z.. na (+), keptOPira ÇafliQoIa (-) cos . prirnora parte dB le prueba.. La egunda parte de la prueba o nsietid en el enrrentmanto del antL gano de L. DLr4a OGMEM. a una suepeidn de jalrnonelia ., pare --. comprobar especificidad con respecto a otro tipo de bacterias. En ambas. pruebas se efectud el Siuente. procedimiento:. Centrifugción del conjugado ,a 3.000 rn por 10 minutos a 4 C.

(58) • 47 • - Contrifugacídn del aPtieflD a 5.001) rpm Para concentrar las laptosp. r5 eUinando el $obrenacit y sesuepensión en 11I0 del volumen riginal - a hizo un frotis en le lótnna praprade, co'lcancfo en cada demarcacdn el .ar•tiono adecuado y secadas al aire. - El ftOtie fud fijado con una mezcla acetona-etanol en proporción 6041P% respectivamente, en portalminae e-2d C durante 10 minutas - 'Se dejaron estar' Zas lminas a temperaturas ambiente * Se agtegd una gota de conjugado a cada una de lee demarcaciones que conteniaa los frotis tanto poitivoe coma neativoe. Se incubaron les láminas durante 30 minutos a 37 C 'en cdmara humada - Se realizaron una serie de lavados. aSi: tres lavados can sqlucidn --. buffet fosfato .( P.D. 5) durante 10 n.tnutae ceda uno y en Continua ita'ci&u renovando al final lee ealumianee. Un lavada final con agua dEStilada. por diez minutos.. - Secado y montado al microscopio. 3.412. EV l4aci4fl in. vivo Para este prueba se siguió le tcnice descrita por Ab& y $1eg1it (1).

(59) • 48 Se utilizaron harnater ye que satr, estos estudios eon loe onitelea idea— lee para índucir experimantsimerto la infeccin de De lea capaa utilizadas para la inocuicdrn, urt de elles, ea habla. ai8l. do da porcinos de la ea,bans de Bogoté y la otra procedis del L&*ratorio. de Enfereddae del la Reproducción del LIffil- ¡CA Se utilizaron 20 hametare lipa cuales, fueron ropartidüe de la siguiente manera: fi .harnøter* inoculados con Lptoaira . pornoa; a hornatora Inoculodos ,. OOfl. cepa do campo y 4 hastteautilizadc* como control.. Pera le inoculación se realizo si siguiente procediniertoi - Centri?ugaciøn del medio de cultivo. pna a 2J29. )c. Stuart que contenía la. Leospira. 9 ( ?.000 rpm) durante 15 minutos.. - Reconetitución con eoluci& salina basto llegar a una concentracidn. de x 1O orçeniamos por ml aproximadamente,. - Inoculación da 8 harnetars con LO ml de le aolución preparada de tger*lra p ana por una vía, intraperitoneal lo. s. -. en concentración de .45 x. Organismos por ml.. Inoculación de 8 harneters con la cepa de campo con 2 mi del medio, con concentración regular de Leptospiras y por vía iitraperitoaa.1..

(60) -f. -. Inoculacj4n de 4 hametera con 1.0 ml de medio stuart puro uia intrepej toneal, para ser utilizodi* como control. Cl din de aacrfivio para cada grupo de hantatero M determinado al azar Dos animales inoculados con Dpjra .PnoM dos anímales inOculados Con cepa de campo y un hanster control formaron cada grupo que fur'sacrL ficado los dios cuero, edptirno, décimo y 13 Poetinoculación. Se empezaron los sacrificios a partir del di cuarto debido a que las leptospiras están: presentes en al rif6n desde este dio, hasta, que loe animales son *acrlfi dos (1). £1 método utilizado de sacrificio fiad el da cc ninosidn cerebral; luego se llevi a cabo el siguiente proceso: - $e hiciorpn frotis da erina que fueron tomados directamente de la veJj 9a - Se realizaron impresiones de corte de riidn, prauf e limpiOza con papel de filtro - £1 ridn restante es coneewÓ en refrigaráQUn y camolatl6n. pare posteriormerte re1izar cortes de tejido y enfrertarloe el conjugado Para los desde pasos, dOCCIO la fiJacidn del frotis hasta la obearvacidn.

(61) el microscopio e sigui6 el sniorno procedimiento que le demostración in vitro. Para la jtoBcoj da :luz ultravoleta se utiiiz un microscopio Rait cherl . Fíltro 22, barrera 3..

(62) 1. W.. RESULTADS. Pera la obtenciÓn del suero hiperinmune es detemLndi. Inicialmente que los tres eqiinbe no registraran antiwtps edricos entileptoapira, p re lo cual sus sueros fueron aflalizØLlsG por el m5tcdo de aglutinaidn lisie , CqMprobendo su au8eflcia total. En el transcurso de le in uniza( jón se analizaran o intervalos da 7 dias los suellas equinos por la terminar. misma. técnica, con el propósito da de-. e]. momento Óptimo en el cual 103 eqt nos mostraren titube ,. aglutinantes en cantidad tal que su suero .puediesa esi' canSideredo co mo ftiperinmune ) ;poV. 10 tanto apto poro. 88 caflJUQdP.. La tabla NO 2. demuestre loe resultados de estas titulaciones. Como se puede observar a partir del día 64 .8:1 equino El jreaent6 el mdximo titulo, se prosi9ujd le determinación de persistencia de antiuBrpo5 sin la adminietraciÓn de antLenoe ni droga que pudiese afectar didi.. titulo. Los equinos £2 y £3 fueron descartados a partir del. .dLa 55. por consi-.

(63) • 52. deraree que sub titulas eran inadecuados (Ver tabla No.2)..

(64) TABLA No.. : No. de tituIc1n. 6. 2. Titu1acipneo. ••. .: Día* despu0ado la primera iscuIcidn. Intervalos de Lncu1acin. Ttu10 rin3i LiT. _-. 1. 15. 0. ).:200. 1:400. 1* 41)0. 2. 33. 16. 1:: 1.600. 11 800. 1: 800. 3. 40. 25. li, 3.200. 1: 1.600. 13 800. 4. 47. 1: .6.400. h 1.600. 1: 1300. 5. 55. 39. 1:6.400. 11..60Ø. It 800. 6. 64.. 4,0. L:12.00. 7. 71. 48. 1: 25.600. 6. 78. 46. 1:3.200. -. 9. 85. 48. 1:800. -. -. 10. 95. 48. 1: 900. -. -. -. -. .:,.

(65) . 54 . 4.1. etarminacin da prateinp. La primera determinación deproteina sealizd por el método da Foijn ciocalteau (39) una vez efectuada la pracipiteci6n con sulfato do amo ajo (39) (ver tabla NO-3 ). Posteriormente al p860 por crcatografXa de intercambio idnico se colactaran. fraccLonas cta tres mililitros para determinación del conten. do p:rot5ico a 2:80 nm, con el fin de seleccionar aquellas fracciones cuya nceritreoi&, da proteína fuera aceptable. Se seleccionó el pool No3 que comprendie las fracciones 26a 29 de un total de 40 ( Ver -Gráfica No. 1) 4.2 Dete1i6n: do Dureza. or Inmunpalactrofr aje La calidad de lea fracciones obtenidas ea corroboró por inmunoe1ectr foresia,. bandas típicas de Inmunoglóbulína C se obtuvieron de las ea-. leccionadee como se obaOrv: en la Figura No. 1.. Otra initunoelsctroforesie realizada a la fracciÓn resultante de la O concentración de las concentración de. frccionØa del peo].. igG (Ver Figura No.2 ).. NO. 3 rnOatt5 •mXirna pureza y.

(66) TABLA No. 3. Títulos de algutinactdn- lisie y concentraciones proticas. TLtuIo Suero. it 12.800. faccón cruda. 1: 25.60fl. fraccidn purVicad3. li 800. Conjugado. 1: 400. -----Contentracl6n de protofna. 8.4 ng/nl 4.6 mg/mi ILO mf/m -.:-.. -•-.--.

(67) II. - -'----------,-. No tS527 A. -. __ Ig Luia. -----. 7Tff ¡. Antj-Ler)tc'$ira POr - 3hade A 50. d1'ica No. 1.. Croinatografia de intercambio inico. pico e1uCdo con buffer tris- Ilti pH 86 O,IM.

(68) -. '-'.. -,_,/•• •. fr. Figura No. 1.. Pureza do 19 .- Esquina anti*. PomOna. .., Suero total equino. 24 Suero de conejó anti-equino. 3. Fraci4n No.29 (crome togr,. fa DEAE- .Spheex A 50), !gG equina. • L -. ---'-•• _--_-------_. Figura No. 2.. Pureza de 1gG- Equina anti, j pmona 1. Suero total equino. w 2. Suero de Conejo enti-equino.3. pool. No.3 9 tgf equina anti .j. nmong.

(69) . 58 .. 4j. Lmun Los 3 co de proteína con centrcidn de Ui mg/ml 89 conjugaron Con ieotiacianat.o, de fluoreeceLno, luego fueron eomatidos 0 elimiracidn del colorante no adherido en baeS aeu temeflo par medio de los tamiesa moleculares Spehadex G 25 (Ver Cr&ica NOk2 ) Pateriormente *S determinó lo relación fiuoresceino/ prateina de -lee fracciones resultantes de deta cepareción haciendo lecturas en el e*pectrofotdnetro a 280 y 495 rm respectivamente. fueron ae1ecci nadas Jas fracciones :16 a fl, que poseían rslaci6n de 1.5 e 4. Se eeci4 el p001 No. 1 (frccionss 16 a 20), teniendo an cuente su bueno çoncentracin de proteina y eglutineoídn positiva con titulo •ls• 400. Loe demde ponlo fueron descartados. Se obtuvo una. cantidad de 15 co de conjugado el cual os sometid e evaluaCión de especificidad y titulo óptimo.. 4.4. tvaZuaçin. del c,•iJuqgdo 4.4.1.. Evaiit. Pera establecer le dilución mde apropiada a que debiese ser utilizado.

(70) flT t. !V INGT DlIArKrr f'kAflLI. I)'A. -1t. 1--. ------. Coijco ti-1etosira por. -. Sephadex Q-25. -. _J± ,. -. - --. Gráfica No.. 2. CrOMteqrafla de tamiz molecular, øeparacin de colorante no adherido a protolna. Se observa curva de proteine conjugada •eluX da con buffer fosfato PH 1.2 09 01 M.. -. 1.

(71) • 60 • el conjugado, se sometió o. diluciones 2X. que comíprenclien desde 1: 2. haSta 1:64. Le 13•tenaid0d de fluorescencia eSpecifico se eeftela sri le TablaNo-4- En le falúme Tabla se observa le especificidad del cwjuqq do al Ser enfrentada a antigenos de Latoe pi pomona., Leptospira ,ni1e y almDneUe Las observaciones al microscopio de luz fluorescente se hicieron en Microscopio Reit•cher, filtro e4tador OG-1 (22), Barrera 3. Loe resultados da date prueba loe muestren las figuras 3 y 4. 4.4.2.. Izaba tinin vivo. Loe hametera inoculadbs con lea Cepas de L. p9mna, cepa de campo y m dio de cultivo Stuart (controles) fueron sacrificados loe diafi 4 1 7,.. 10, y .3, •abtanjóndooe de ellos muestras de riffón para frotis y cortes da tejido,. cono tambien muestras de arma para frotis;. resultados en. Tabla No-5 y friguras Nos.. 5 y ... U.

(72) TABLA N. 4. Ojluci4n y especificidad del conjugado. Prueba in vitro D í 1u o i o n e ...i:2. ntigenos. L pomona. L.. eicoip. g1mone1.a. 1:4. ..L ..j. .. 1:.8. ++++ (i). ++++ (1). ++++. ++++. +++ (i). ++ (1) + (L). 1:16. ++. l:2. +. 1:64. +.

(73) ft. T7 JI,. Cp •••.. .. d. -. o. -. '. -. t)'Ç. i'^?. •. 00 -. ..,. O• ;' -.. U :.. e'. u. .1•. --. fi.. •'. .9. ci. a .. Figure No.. ... 3.. frotis da L. porngnp. ví~lizada Con. conjugado eapecULco dilución 1:4 txpooiión 2 rnts, 400 X.

(74) •. .. •. ••. .. •. -4•. -. - -. • •. 1. •--. •. .•••-. y,. -. -. -. j.. ?. -;. ,. ... -' •. . •••I.'. -•_\. .. -. -.. .. -. .l, -. ^7 -.•.. •::. _•. -;;•. ft. -•. e;----. • -. .. o * '--. Figura No. No. 4,. 2r-. •.-. -. l. ) •i •' -. -.. -. •;_•ft_. -. ,. - --'. . Frotis d viaU33.izd3 con conjugado específico * dilución 1:8 £xpoccidrt .2 uta, 400 X. .-;-•.•___•. -.

(75) £va2uacón del ronjuado. Prueba in vivo. TABLA NO. S.. Frotis de. Impreolén de tejtdo renal- Ccntro de tejido renal L.pcmcna 4. campo. Control L .pomna campo. Control L.pmuna campo. contt. -. -. ++. ++. -. ++. -. -. +. +. -. -. ++. ++. -. -. +. -. ++. 7. capa de. cepa de. Cep de. De de sacri-. la. ++. ++. -. +++. +++. 13. +++. ++. -. +++. ji.. --. :S!.

(76) Figura No. 5.. innuno?Xuoreocancia de . Pomo en corte de riflon de Hmsters, 10 ttLee postinocu1, cidn vIa Lntreperitoneal con cepa horndloga. txpaoicidn 2 mte, 4fl0X.

(77) Figura N. 6.. 1nrnunor1uorecevtcia 4. j. Pomona cepa de campo en itnpraei6n do riílon do Haøitot,. 7 días poatinoeulactdn via intraperitonoal. Expoeicidr 2 rnts, 1000 X.

(78) d. V4. DISCUSION. Por -los resuitacka .obtenidoG en la paparacidn del nuera hiperinmune equino, se deduce que áats especie es adecuada debido a la facLljdad buede menjo, e su buena teapuasta írmunoldgicay lo miamo que a la buen cantidad ce volumen de suero que eurninistra, cae* excepcional sune cedtd en los equinos £2 y £3 cuya respuesta inmunoidic no Vud 10 su? ic±etern9nts eatiøfactora. pUBa loe. resultados obtenidos desde el. die 40 (1:800 y 1:1.600) apectivcmnte) hizo panear que un exceso en la concentración da antfgenon en el inoculo, haya bloqueado el ma. caniemo productor de anticuerpos • posiblemente el hecho so pueda etribuit a una ueriacidn de individuos dentro da lo especie. Para logar loe mejores resultados 90 aconSeja la prctLca de un buen exnen c1inco y de laboratorio haciendo énfasis en al estado parees tarjo del animal y en especial la presencia de 6ecarie ya que estos.

(79) • 68 . alteran al mecanismo productor de enttcuarpos. Según lo demue*tra la Tabla No. 2 0. el mejor nivel 4$ antLcuerpos as logró a partir del cita-. 55 hasta el día ?i. En el día64 ea hizo la última inoculación en viste da que ya ea habL e llegado al tope Ideal para le realización del trabajo(].* 6.400 -1:12 800). Se obtuvo el. mBJQt. titulo da 1*25.600 a loe 8 días de la última. Inoculación pare empozar e descender bruscamente e loe 15 días 1: 3.200 y 1.800 a los 21 días. Se recomendaría en estudios posteriores evaluar hasta qué día y en qué cantidad da anUgeno ea llega el tope m4ximo. de respuesta inmunitaria y tembien el punto en el cul se produce al bloqueo inmunn1dico.. Al observar le Tabla No, 3 en la cual Ge enfrentan los títuloS obtenidos mediante al método de aglutinación y lee concentraciones prot iceo do cada título referentes al suero, fracción cruda, frecctdn PM1 rificada y el conjugado, se nota un ascenso del título en al peso de suero e la fracción cruda, debido a la precipitación y concentracidn de proteínas e5ptifcadae. La fraccidn cruda al ser pasada por le columna de intercambio idnicp y procesada por métodos de diálisis, presentó un descanso en al título aglutinante proporcional al. descenso.

(80) z. en su concentrcidn de protaina, explicable por la selección de pretal fla. (pG pura con detrimento de II4 que tamtien. Lo anterior. tambieri ea. es aglutinante.). aplicable a, los resultados obtenidos en el pase. de fracción purificada e conjugado en que bajó el titulo aglutinante a 1: 400. En Bate momento le concentración de proteína era de 4.6 mg/mi, Lo que hizo necesario practicar una Concentración hasta ajustar e la cantidad ideal requerida para conjugación: 10 .rng/mi. Le fracciór (26 a 29 pool No.3) aacogida para conjugación ea evidentemente XgG pura y de alta concentración como ea pudo observar en la Ci fica No.l, primera fracción eluida en Sephadex DEAE A 50 e igualmente por identificación inmunoelectrófordt•jca (figura No .2.). Le Gráfica NO-2 igualmente comprueba que la fracción ya conjugada poBOS aitp. contenido protéitp y dptima relci4n de marcaje con fluore-. cama, cono tambien titulo aglutinante eepecifiáo. 5.1 Evaluacjdn dI coriiucado 9.1.1. Va. p. n in vUro. 69.

(81) • 10. ti criterio adoptado pera establecer la ineepecificided del conjugado con reapeito a la Tabla No.4 en la cual 108 antígenos do .L.. pomona, y L. W-1, cola en sus primeras diluciones se les eea16 fluorescencia i neapeçUica (i). SO. bas6. en las observaciones. dé. conglomerados fluore. centee en lee que no so notaba índividualízacUn ni morfologis acptA bise de la ieptoepra, como era de esperares, ti sfr igoflo de j.. 09 1! oú9. a partir de concentracidn 1:4 9 1:13, 1:16, 1:. 32, y 1:64 del conJuada permitió observar la morfologia clara y eep cZflca de las leptO piras ecentu á ndosa m6e dicha s. caracterizaciones a. concentraciones, 1:4 y 1*8 corno ea observa en lee Figuras N*8 3 y 4. Lee observaciones hachas por el antígeno de . nj001 con respecto e .su. fluoreeceñoja I nespecífica sugiere que loe onttcuerpos de mem-. brana Presentes Son ca'partidoe con respecto el antigeno de .pomona. hecho que es obe*rva c0n con metodologio de aglutinación-. lisie. en -. le cu& . ea presentan reacciones: cruzadae(33) Ea importante el hecho do que la alrnon ^.S.0gk utilizada no presentó reacción fluorescen-. te, como era esperado, puesto que su especie óe totalmente diferente a la leptospira4 .1.2. Lvalyacídn iii vivo Se cnrohor5 que Los hanrntexm son las animales apropieadbe para ind.