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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS
FITOPATÓGENOS
DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO
APROBADO
____________________________ _____________________________
María Ximena Rodríguez Ph.D. Marcela Franco Correa Ph.D.
Directora Co-Directora
_____________________________ _____________________________
Balkys Quevedo. Profesor Asociado Ivonne Gutiérrez. Profesor Asistente Jurado Jurado
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS
FITOPATÓGENOS
DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO
APROBADO
_____________________________ _____________________________
INGRID SCHULER JANETH ARIAS Decana Académica Directora de Carrera Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a todos los que han aportado a nuestra formación a lo largo de la vida. A Dios por ser nuestra guía y brindarnos la fortaleza espiritual. A nuestros padres y hermanos por su apoyo permanente, por la confianza que han depositado en nosotras y el inmenso amor que nos han dado. A nuestros amigos por los buenos consejos y enseñanzas y a Ximena y Marcela por haber creído en nosotras hasta el final. Para ustedes, todos los frutos de esta experiencia.
AGRADECIMIENTOS
MARIA XIMENA RODRÍGUEZ, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por haber direccionado el desarrollo del proyecto de manera permanente, por sus enseñanzas, dedicación, comprensión, paciencia, confianza y motivación.
MARCELA FRANCO CORREA, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por su comprensión, apoyo, explicaciones y aportes a lo largo del proceso.
A NUESTROS AMIGOS DEL LABORATORIO Yeimy Rivera, Susana Díaz, Carolina Mazo, Diana Vega, Carolina Ortiz, Andrés Hernández Y Rodrigo Muñoz, por los favores realizados y por su apoyo incondicional que permitió la culminación de este proyecto.
A Mile, Paola y Juan David, del laboratorio de aguas por su paciencia y colaboración en todos los momentos de dificultad.
GISELA, por su asesoría en los análisis estadísticos.
A INESITA Y RUCA por habernos consentido tanto y salvarnos de unas cuantas.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 3
2.1. El suelo y su composición 3
2.2. Actinomicetos 5
2.2.1. Características generales 5
2.2.2. Condiciones de crecimiento 8
2.2.3. Composición química 8
2.2.4. Aplicación industrial 10
2.3. Control Biológico 10
2.3.1. Actinomycetes como Agentes Biocontroladores 12
2.3.2. Mecanismos de antagonismo 14
2.3.3. Hongos Fitopátogenos 17
2.3.3.1. Fusarium oxysporum 17
2.3.3.2. Fusarium roseum 18
2.3.3.3. Rhizoctonia solani 18
2.4. Actividades hidrolíticas para control de hongos patógenos 19
2.4.1. Quitinasas 19
2.4.1.1. Producción de Quitinasas 23
2.4.1.2. Uso Biotecnológico de las Quitinasas 24
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 26
4. OBJETIVOS 28
5. METODOLOGÍA 29
5.1. Reconstitución de cepas de actinomicetos 29
5.2. Evaluación de actividad quitinolítica 29
5.2.1. Preparación quitina coloidal 29
5.2.2. Diálisis de la quitina coloidal 30
5.2.3. Evaluación de producción de quitinasas en placa 31
5.2.3.1. Selección de cepas quitinolíticas 31
5.2.3.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica 32
5.2.3.3. Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 32
5.3. Ensayo de la estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica 33
5.3.1. Curvas de calibración para la cuantificación de N-acetilglucosamina y proteínas 33
5.3.2. Determinación del agente precipitante de las proteínas 33
5.3.3. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la 34
actividad enzimática 5.4. Ensayo de la actividad antifúngica in vitro 37
5.5. Análisis estadístico 38
6. RESULTADOSY DISCUSIÓN 39
6.1 Reconstitución de cepas de actinomicetos 39
6.2. Evaluación de la actividad quitinolítica 41
6.2.1. Medio de cultivo 41
6.2.2. Evaluación de la producción de quitinasas en placa 41
6.2.2.1. Selección de las cepas quitinolíticas 41
6.2.2.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica 43
6.2.2.3. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 44
6.3. Estandarización de la prueba para la evaluación cuantitativa de la actividad Quitinolítica 51
6.3.1. Determinación del agente precipitante de las proteínas 51 6.3.2. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la
actividad enzimática 53
6.4. Ensayo de actividad antifúngica in vitro 64
7. CONCLUSIONES 75
8. RECOMENDACIONES 77
9. BIBLIOGRAFÍA 79
10. ANEXOS 101
ÍNDICE DE TABLAS
Nª TABLA PÁG.
2.1. Tipos de paredes celulares de los actinomicetos 9
6.1. Detección de microorganismos quitinolíticos en medio mínimo
suplementado con quitina coloidal al 1% 43
6.2. Agrupamiento de Duncan para áreas bajo la curva-Área de
halo de hidrólisis para la actividad quitinolítica en placa 47
6.3. Agrupamiento de Duncan para medición de halo de
hidrólisis durante 9 días de evaluación 48
6.4. Agrupamiento de Duncan para días de medición 49
6.5. Agrupamiento Duncan para la comparación de halos de
hidrólisis de quitina por día 50
6.6. Evaluación agentes precipitantes de proteínas 51
6.7. Concentración de proteína extracto crudo Cepa 25 y Cepa Control 63
6.8. Agrupamiento Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Rhizoctonia sp. enfrentando
a los aislamientos de actinomicetos 66
6.9. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Fusarium sp. enfrentando
a los aislamientos de actinomicetos 68
6.10. Correlación Pearson para porcentaje de inhibición de crecimiento radial para Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. y área bajo la curva de
producción de quitinasas en ensayo en placa 72
ÍNDICE DE FIGURAS
Nª FIGURA PÁG.
2.1. Estructura molecular de la quitina 19
2.2. Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos 21 quitinolíticos
5.1. Preparación quitina coloidal 30
5.2. Diálisis de la quitina coloidal 31
5.3. Montaje enfrentamiento dual actinomiceto/hongo.
A. Actinomiceto, B. Hongo fitopatógeno 38
6.1. Aspecto macroscópico cepas 7,8 y 3, crecidas en agar Avena 39
6.2. Hidrólisis de quitina coloidal en placa 43
6.3. Evaluación de la concentración de quitina cepa 4, 12 y 26. A. 0.5%,
B. 1%. C. 2% 46
6.4. Evaluación de la actividad quitinolítica semicuantitativa. A. cepa 26.
B. cepa Control. C. cepa 22 47
6.5. Inducción de quitinasas cepa 25 y Control, empleando medio
quitina coloidal y medio quitina en polvo 54
6.6. Evaluación de la actividad enzimática y específica de las cepas
Control (C) y 25 57
6.7. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para cepas
de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición 66
6.8. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para
cepas de actinomicetos con los más bajos porcentajes de inhibición 67
6.9. Crecimiento libre de Rhizoctonia sp. en medio YGC 67
6.10. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas
de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición mcelial 68
6.11. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas
de actinomicetos con el más bajo porcentaje de inhibición 69
6.12. Crecimiento libre de Fusarium sp. en medio YGC 69
6.13. Técnica de enfrentamiento dual actinomiceto/hongo para la cepa Control, A. 67.41% de inhibición micelial de Rhizoctonia sp. B. 64.17%
de inhibición micelial de Fusarium sp 69
6.14. Difusión de metabolitos secundarios en agar PDA, cepa 4 72
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO PÁG.
1. Aislamiento e identificación microscópica y macroscópica de cepas de
actinomicetos 101
2. Medios de cultivo 110
3. Curva Patrón para la cuantificación de azúcares reductores en términos
de N- acetilglucosamina 113
4. Curva Patrón para la cuantificación de proteínas, empleando Suero
albúmina de bovino (BSA) como proteína standard 115
5. Valores de medición en milímetros del diámetro de halos de hidrólisis en
agar quitina coloidal al 1% 117
6. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica. Análisis de
varianaza (ANOVA) 118
7. Estandarización de prueba para la evaluación cuantitativa de la
Actividad Quitinolítica 121
8. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). Enfrentamiento cultivo
dual actinomiceto/hongo fitopatógeno 123
9. Porcentaje de inhibición de crecimiento radia. Análisis de varianza (ANOVA) 124
RESUMEN
El papel ecológico de los actinomicetos en la rizosfera como microorganismos antagonistas ha generado gran interés en los últimos años. En el presente estudio se evaluó la producción de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas de actinomicetos y su posible efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. En primer lugar se realizó un screening a partir del banco de trabajo constituido por 23 cepas con el fin de determinar cuales presentaban actividad quitinolítica, las cepas fueron sembradas por método de estría en medio mínimo suplementado con quitina coloidal 1% pH 6.8; 19 de las 23 cepas evaluadas mostraron zona de hidrólisis después de 5 días de incubación a 25ºC, siendo consideradas preliminarmente como productoras de quitinasas.
Para determinar la concentración más baja de quitina que permitía una mejor visualización de la hidrólisis enzimática, las cepas 4, 12 y 26 seleccionadas aleatoriamente fueron sembradas en medio mínimo suplementado con tres concentraciones de quitina coloidal 0.5, 1 y 2%, la concentración de 1% fue la seleccionada para continuar con el ensayo en placa.
Para evaluar la actividad quitinolítica de las 19 cepas seleccionadas se realizó una prueba semicuantitativa en placa; para su efecto, en medio mínimo quitina coloidal al 1% se realizaron 4 pozos equidistantes en los cuales se adicionaron 5 µL de un inóculo a una concentración de 107 cél·mL-1, posteriormente las placas de petri se llevaron a incubar a una temperatura de 25 ºC por un período de 9 días. Las cepas 24 y 22 presentaron los promedios de diámetros de halos de hidrólisis más significativos 8,13 y 7,50 mm respectivamente, en comparación a las demás cepas en estudio; por el contario las cepas 11, 19 y 1 presentaron los promedios de diámetros de halo de hidrólisis más bajos o no evidenciables. Las cepas control y 25 fueron seleccionadas aleatoriamente para realizar la estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica. El medio quitina coloidal al 0.5% demostró ser el medio más adecuado para la inducción de producción de quitinasas después de 7 días de agitación a temperatura ambiente, encontrándose la mayor cantidad de azúcares reductores en comparación al medio quitina en polvo al 1.5%. Las variables temperatura (40 y 50ºC) y proporción enzima/sustrato (1:1, 1:2 y 1:4) mostraron no generar ninguna influencia sobre la actividad enzimática y actividad enzimática específica para las dos cepas evaluadas. Adicionalmente se evaluó el efecto que generaba la precipitación de proteínas con acetona en el proceso de preparación de extracto enzimático, encontrándose que ésta no concentró la enzima en la medida esperada. La máxima actividad enzimática específica alcanzada para la cepa 25 fue de 67,944 U/g, mientras que un valor más bajo se obtuvo para la cepa control (60, 22 U/g). Finalmente se evaluó el efecto
antagónico de 13 cepas de actinomicetos sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp, para ello se realizó un enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno. Las cepas 11, 7 y 4 presentaron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial más altos para Rhizoctonia sp. con valores de 84.44, 74.07 y 68.89% respectivamente; para el caso de Fusarium sp, las cepas 7, 8, 16,12 y 11 generaron la mayor inhibición sobre su crecimiento radial, en donde los PICR obtenidos fueron 86,67, 84,17, 82, 50, 80,83 y 80%
respectivamente. Se realizó una correlación entre los valores de área bajo la curva obtenidos en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes de inhibición de crecimiento radial (PICR) con el fin de identificar la relación existente entre éstas dos variables. Los resultados mostraron una correlación de -0.264 entre las variables área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp. y de -0.505 entre área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Fusarium sp., indicando que posiblemente en el efecto antagónico generado también estuvieron involucrados otros mecanismos adicionales a la acción de las quitinasas.
Palabras claves: actinomicetos, quitinasas, quitina coloidal, antagonismo, fitopatógenos, Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
ABSTRACT
Actinomycetes ecological roll, at rhizosphere, as antagonistic microorganisms has developed a huge interest in the last years. This study evaluated the production of hydrolytic enzymes, chitinases, by native actinomycetes strains and their possible antagonist effect against phytopathogens (Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.) The first step was a screening of the native actinomycetal strains bank, comprising 23 strains, in order to determine chitinolytic activity. The strains were inoculated by streaking in a minimal medium supplemented with 1%
colloidal chitin (pH 6.8); 19 of 23 evaluated strains showed a hydrolysis area after 5 incubation days at 25ºC, preliminarily considering them as chitinases producers. In order to determine the lower chitin concentration which allow the better enzymatic hydrolysis observation, strains 4, 12 and 26, randomly selected, were inoculated in minimal media supplemented with 0.5, 1 y 2% colloidal chitin, concentration of 1% was selected for plate enzymatic assay. A semi quantitative plate assay was performed to test the chitinolytic activity of the 19 selected strains; to develop this 4 wells were done on a 1% colloidal chitin minimal medium plate and then inoculated with 5 µL of a cells suspension (107 cell·mL-1). The plates were incubated at 25 ºC for 9 days. Strains 24 and 22 showed the most significant hydrolysis halos (8.13 and 7.50 mm, respectively); contrarily strains 11, 19 and 1 did not show or showed the smaller hydrolysis halos. Then, strains 25 and control were selected for quantitative chitinolytic activity assay standardization. The higher enzyme activities were observed with colloidal chitin (0.5%) medium extracts, after 7 days shaking at room temperature, compared to chitin powder (1.5%) medium extracts. Variables like temperature (40 and 50ºC) and enzyme/substrate proportion (1:1, 1:2 y 1:4) did not influence the enzymatic activity for both strains. Additionally, the effect of acetone protein precipitation in the enzyme extract preparation was evaluated, determining that acetone did not concentrate proteins as expected. The maximum specific enzymatic activity was reached by strain 25 with 67.944 U/g, while control strain rendered 60.22 U/g. Finally, the antagonist effect of 13 actinomycetal strains towards Rhizoctonia sp and Fusarium sp. was evaluated by dual cultures actinomycete/fungal phytopathogen. The highest radial growth inhibition percentages for Rhizoctonia sp., 84.44, 74.07 and 68.89% corresponded to strains 11, 7 and 4, respectively. In the case of Fusarium sp, strains 7, 8, 16, 12 and 11 showed the maximum inhibition percentages, 86.67, 84.17, 82.50, 80.83 and 80% respectively. A correlation test between the area under the curve values, obtained for semi quantitative chitinolytic activity, and radial growth inhibition percentages were performed in order to identify the correlation between this two variables. The results showed a correlation value of -0.264 between
chitinolytic activity and Rhizoctonia sp. inhibition, and -0.505 between chitinolytic activity and Fusarium sp. inhibition, suggesting that the antagonist effect involves additional mechanism rather than chitinases activity.
Key words: actinomycetes, chitinases, colloidal chitin, antagonisms, phytopathogens,
Rhizoctonia sp., Fusarium sp.
1. INTRODUCCIÓN
La rizosfera es un hábitat propicio para el desarrollo de los microorganismos. Son muchas las poblaciones microbianas que se encuentran asociadas a esta zona del suelo. Las interacciones entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen los requerimientos nutritivos básicos para la planta y para las comunidades microbianas asociadas a ellas (Atlas, 2002). La estructura del sistema radicular contribuye a establecer la población microbiana en la rizosfera por medio de los exudados radiculares liberados; estos exudados consisten en una amplia variedad de componentes y sustratos simples de bajo peso molecular como azúcares, compuestos fenólicos, aminoácidos, ácidos orgánicos y otros metabolitos secundarios, y componentes de alto peso molecular tales como proteínas (Sullivan, 2004). Dependiendo de la naturaleza de los componentes en los exudados radiculares, estos pueden participar en la activación de genes microbianos responsables del reconocimiento e iniciación de la asociación simbiótica o actuando simplemente como una fuente de nutrientes y energía para los microorganismos (Sullivan, 2004). Las interacciones entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera se basan principalmente en la modificación interactiva del ambiente del suelo por procesos como captación de agua por la planta, liberación de compuestos orgánicos al suelo por las raíces, biodegradación de la materia orgánica, captura de nutrientes minerales por parte de los microorganismos y producción microbiana de factores de crecimiento vegetales (Atlas, 2002).
Se han realizado diversos estudios acerca de las interacciones entre plantas y actinomicetos (Weller, 1988; Benson y Silvester, 1993; Tanaka y Omura, 1993; Locci, 1994), determinándose que las asociaciones entre estos microorganismos y la raíz de la planta pueden ser deletéreas o benéficas. Mientras que algunos actinomicetos secretan compuestos herbicidas o causan daños tales como erupciones en el tejido vegetal, otros pueden fijar nitrógeno atmosférico simbiótica y no simbióticamente o proteger las raíces contra las infecciones fúngicas y bacterianas (Valois et al., 1996).
Mediante microorganismos antagonistas se puede llegar a disminuir la actividad de los patógenos causantes de enfermedades. Esto se consigue mediante la acción directa o indirecta que ejerce el organismo biocontrolador sobre el patógeno, por medio del efecto que genera sobre el hospedero o el ambiente donde se desarrolla, causando así una acción significativa en la interrelación hospedero-patógeno y ambiente. Esta acción puede afectar
las estructuras de supervivencia del patógeno y disminuir la gravedad de la infección de éste sobre el hospedero (Goodfellow y Williams, 1983). El parasitismo sobre hongos patógenos, facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control biológico de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son las de mayor importancia ya que la quitina es el principal constituyente estructural de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de propágulos y la elongación del tubo germinal, adicionalmente participan lisando las hifas (Ji y Ku, 1996;
Boer et al., 1998; Kishore et al., 2005).
Las cepas biocontroladoras con una alta expresión de quitinasas, presentan una buena actividad antifúngica; por el contrario, aquellos microorganismos deficientes en cuanto a la producción de éstas enzimas muestran tener una actividad antifúngica pobre y una baja habilidad en el control de la enfermedad (Kishore et al., 2005).
Esta investigación busca determinar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para producir enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas. Adicionalmente pretende evaluar el efecto antagónico de estos microorganismos sobre algunos hongos fitopatógenos, de tal manera que en un futuro pueda ser establecida la relación existente entre las enzimas producidas y el antagonismo generado por aquellas cepas en las cuales así sea evidenciado.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. EL SUELO Y SU COMPOSICIÓN
El suelo corresponde a la parte más externa de la corteza terrestre, este puede ser considerado como un sistema de interacción entre una fase sólida, formada por materia mineral y orgánica, una fase líquida, y una fase gaseosa. La materia mineral se origina a partir de las rocas del subsuelo y los procesos edáficos que hayan tenido lugar en su formación. La materia orgánica procede de la actividad de los organismos vivos del suelo, la composición y cantidad resulta ser variable. Este sistema complejo alberga una gran cantidad y variedad de especies vegetales, animales y microbianas (Cavaletti et al., 2006).
Los organismos del suelo establecen relaciones entre ellos de formas variadas y complejas, contribuyendo también a las características propias del suelo modificando las fases sólida, líquida y gaseosa del mismo. Los microorganismos resultan ser de gran importancia pues se relacionan con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos como el carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de las plantas, protección frente a patógenos, degradación de compuestos xenobióticos, entre otros (Nogales, 2005). Se considera que el suelo es uno de los ambientes más complejos en cuanto a vida microbiana se refiere, éste contiene cerca de 109 células bacterianas (por gramo) y un estimado de 104 especies microbianas distintas por gramo (Cavaletti et al., 2006).
La rizosfera es el volumen de suelo inmediato a las raíces de las plantas. Interacciones entre planta, suelo, microorganismos y microfauna, presentes en ésta parte del suelo, generan una significativa influencia en el crecimiento de las plantas y por ende en el rendimiento de los cultivos (Antoun y Prevost, 2005). En comparación a las demás partes del suelo el número de microorganismos en la rizosfera es sustancialmente más alto debido a la influencia de las plantas; así mismo se presentan modificaciones constantes en la biodiversidad de los microorganismos generados por los cambios físicos, químicos o biológicos en las raíces de las plantas o por las excreciones y desechos orgánicos producidos por éstas (Antoun y Prevost, 2005).
Los rizodepósitos de varios exudados, tejidos muertos y raíces en senescencia proveen un sustrato importante para la comunidad microbiana del suelo generándose un complejo en el que se relaciona la comunidad con la cantidad y tipo de compuestos liberados. No solo los rizodepósitos son rápidamente utilizados por los microorganismos, la adición de éstos al suelo puede también acelerar la descomposición de materia orgánica en el suelo. (Gregory, 2006).
La rizodeposición genera una rizosfera con diferentes niveles y tipos de sustratos microbianos en comparación al resto del suelo. Esto resulta en una rizosfera que contiene diferentes poblaciones de bacterias, actinomicetos, hongos, protozoos, virus y nematodos (Gregory, 2006).
Las raíces liberan un amplio rango de componentes orgánicos, aunque los azúcares y polisacáridos, ácidos orgánicos y aminoácidos, péptidos y proteínas constituyen la mayor parte de los rizodepósitos, gran parte de la investigación ha demostrado que otros compuestos liberados por las raíces pueden actuar como mensajeros que comunican e inician las interacciones raíz-raíz, raíz-microorganismo y raíz-fauna (Walker et al., 2003). Las interacciones raíz-microorganismo y raíz-insecto pueden ser positivas (simbióticas) o negativas para la planta; ellas involucran intercambio y percepción de señales, seguido por la invasión de la planta por el microorganismo o insecto y cambios estructurales resultantes de la interacción (Fray, 2002).
Las raíces de las plantas también pueden liberar compuestos que son capaces de interrumpir la comunicación con las bacterias, reduciendo así su susceptibilidad a la infección (Fray, 2002). Las bacterias de la rizosfera o rizobacterias se multiplican y colonizan rápidamente las raíces de las plantas, así como todos los nichos ecológicos que se desarrollan durante las etapas del crecimiento de éstas. La presencia de estas bacterias en las raíces puede generar un efecto neutral, benéfico o perjudicial en su desarrollo. Algunas rizobacterias pueden ocasionar efectos adversos como la producción de fitotoxinas, descenso de nutrientes disponibles o la inhibición del proceso de micorrización. Por otro lado, estas bacterias pueden estimular el crecimiento de la planta empleando diferentes mecanismos como la fijación de nitrógeno atmosférico, la síntesis de hormonas vegetales, la solubilización de minerales y la síntesis de enzimas. Estas bacterias pueden también generar modificaciones en la pared celular vegetal dando lugar a cambios bioquímicos y
fisiológicos en las plantas; adicionalmente se encuentran involucradas en los mecanismos de defensa de éstas, pudiéndose generar interacciones entre rizobacterias y patógenos, rizobacterias y planta y/o rizobacterias y rizosfera (Siddiqui, 2005).
2.2. ACTINOMICETOS
Los actinomicetos representan un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuido en ecosistemas naturales y presentan gran importancia por su participación en la degradación de materia orgánica (Ghanem et al., 2000). Estos microorganismos resultan ser abundantes en suelos, sin embargo, también son encontrados en ambientes acuáticos, dulces y marinos (Leiva et al., 2004), dentro de sus características particulares presentan un olor típico a suelo húmedo, debido a su actividad metabólica y a la producción de terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares con las que son capaces de degradar materia orgánica de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al., 2004).
2.2.1. Características generales
Los actinomicetos constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos; son bacterias Gram positivas que se caracterizan por formar filamentos ramificados. El orden de los Actinomicetales comprende 63 géneros constituyendo, aproximadamente del 20-60% de la población microbiana del suelo (Ezziyyani et al., 2004).
En la actualidad, los actinomicetos se encuentran incluidos en el domino bacteria debido a varias razones: la pared celular está compuesta por peptidoglucano y no por quitina o celulosa, son sensibles a los antimicrobianos pero presentan resistencia a los antifúngicos y la disposición de su material genético es típicamente procariótica (Salazar et al., 1997), aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN, siendo éste superior al 55%. Estas bacterias son aerobias y anaerobias, pudiéndose encontrar en animales o en el hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos, azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e hidrocarburos alifáticos. Utilizan como fuentes
de nitrógeno amonio, nitratos, aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas (Leveau y Bouix, 2000).
El ciclo de vida de los actinomicetos comprende cuatro importantes procesos fisiológicos:
crecimiento vegetativo, diferenciación, senescencia celular y muerte. Estas bacterias tienen la capacidad de formar filamentos ramificados en alguna de sus etapas de crecimiento, atributo que permite diferenciarlas de otras bacterias Gram positivas (Goodfellow y Williams, 1983). En un ciclo típico de crecimiento, las esporas se convierten en largas hifas filamentosas que crecen dentro y encima de la superficie de nutrientes; las hifas se van ramificando y se da paso a la aparición de un micelio que se forma gradualmente. Esta fase es conocida como una fase vegetativa de crecimiento; el crecimiento filamentoso de los actinomicetos se encuentra fuertemente condicionado por las propiedades elásticas de las paredes celulares y las propiedades físicas medioambientales. La fase vegetativa está seguida por una segunda fase de crecimiento aéreo la cual puede estar acompañada por la generación de antibióticos, en donde se genera una elongación de hifas constituyendo estructuras helicoidales, y una división final formando esporas, las cuales dan de nuevo origen al ciclo de crecimiento vegetativo (Goriely y Tabor, 2002). El crecimiento de los actinomicetos es más lento en comparación a otras bacterias, el tiempo de multiplicación en un cultivo oscila entre 2 y 3 horas. Ciertas bacterias como Mycobacterium tuberculosis poseen un desarrollo aún mas lento, con tiempos de generación superiores a 15 horas (Leveau y Bouix, 2000).
La diversidad morfológica de estos microorganismos varía desde formas cocoides o bacilares hasta la formación de un micelio bien desarrollado, así mismo algunos géneros pueden formar un micelio complejo generador de esporas envueltas en un esporangio, razón por la cual estas bacterias desarrollan sobre un medio sólido una masa de hifas que comprenden el micelio de sustrato y el micelio aéreo. La apariencia correosa y pulverulenta de las colonias se debe a la producción de los conidios o esporas. Los actinomicetos se asemejan a las bacterias por el contenido de peptidoglicano en su pared celular, siendo sensibles a la lisozima, y por poseer flagelos similares al bacteriano, los actinomicetos difieren de los hongos en la composición de la pared celular, al no poseer quitina ni celulosa, polisacáridos presentes en dicha estructura (Titus y Pereira,2007; Leveau y Bouix, 2000); los azúcares presentes en la pared celular de los actinomicetos son Madurosa, Arabinosa y Galactosa (Hidrin et al., 2001).
Los actinomicetos abarcan una gran proporción de la biomasa microbiana presente en el suelo, exceptuando aquellos que presentan condiciones extremas, por esta razón éste resulta una fuente predominante de aislamiento; sin embargo, la disponibilidad de nutrientes constituye un factor que controla su desarrollo (Goodfellow y Williams, 1983). La mayoría de los actinomicetos usualmente aislados del suelo pertenecen al género Streptomyces, ya que son los géneros que crecen fácilmente en medios sintéticos, caracterizándolos como los más comunes del suelo. Éstos han sido ampliamente estudiados por la industria farmacéutica debido a su habilidad para producir antibióticos (Goriely y Tabor, 2002). Las bacterias del género Streptomyces son aerobias estrictas, catalasa positivas y, no se colorean como ácido-alcohol-resistentes con la coloración de Ziehl-Neelsen, crecen en la superficie de medios simples o complejos (medios de Sabouraud, Bennett, Lowenstein-Jensen), formando filamentos ramificados (hifas) aéreos, que poseen cadenas de conidias que no se fragmentan. Sólo Streptomyces, Nocardia, Actinomadura y Nocardiopsis forman micelios aéreos en los cultivos (Hidrin et al., 2001). Los cultivos muestran su crecimiento entre dos y diez días de incubación a una temperatura de 25ºC, aunque algunos pueden llegar a desarrollarse entre los 27 y 30ºC, y algunos termófilos entre los 45–55ºC, los cuales resultan ser muy importantes en la transformación de diversos residuos orgánicos en el proceso de compostaje. Las colonias presentan aspecto ceroso, pulvurulento, de color blanco grisáceo, común en la mayoría de los Streptomyces, variando de color crema a negro, como sucede con S. somaliensis; sin embargo, estos aspectos no son específicos, y dependen de las condiciones de cultivo (Hidrin et al., 2001); cabe resaltar que éstos géneros en particular presentan una esporulación significativa en comparación con otros actinomicetos (Titus y Pereira, 2007; Park et al., 2002).
La presencia de estas bacterias filamentosas y demás microflora del suelo genera una importante influencia en la fertilidad de éste y en la salud de la planta participando en el crecimiento de ésta e incrementando el área de absorción superficial de sus sistemas radiculares. Los microorganismos del suelo, especialmente aquellos capaces de colonizar la rizosfera ayudan a las plantas en la toma de nutrientes altamente vitales, tales como fósforo, nitrógeno y potasio a partir del suelo; siendo así como la productividad y sostenibilidad de los sistemas agrícolas resultan ser dependientes de los procesos funcionales de las comunidades microbianas del suelo (Johansson et al., 2004; Ikeda et al., 2006).
2.2.2. Condiciones de crecimiento
La adición de materia orgánica a los suelos estimula la multiplicación y actividad de los actinomicetos. Los suelos alcalinos y neutros resultan ser más favorables para el desarrollo de estas bacterias; el rango de pH óptimo para las actividades de estos microorganismos se encuentra entre 6.5 y 8.0. Los actinomicetos al ser principalmente aerobios se desarrollan favorablemente en suelos bien aireados; suelos con humedades entre el 80 y el 90% son perjudiciales para el crecimiento de los actinomicetos. El porcentaje de actinomicetos en la población total microbiana incrementa en la profundidad del suelo, sin embargo pueden ser encontrados en la superficie de éste. Los géneros Streptomyces, Nocardia, y Micromonospora se encuentran frecuentemente como habitantes del suelo (Titus y Pereira, 2007).
2.2.3. Composición química
Las células de los actinomicetos químicamente están compuestas por un 45% de carbono y un 10% de nitrógeno, el contenido lipídico varía de un 12 a un 65% (Titus y Pereira, 2007).
Su pared celular difiere químicamente según los grupos, dando paso a la identificación y clasificación de los mismos; básicamente se diferencian siete tipos de pared celular, teniendo en cuenta el aminoácido diaminado, los azúcares característicos y la presencia de glicina en el puente interpeptídico (Tabla 2.1).
TIPOS DE PARED CELULAR
AMINOÁCIDO DIAMINADO
AZÚCARES CARACTERÍSTICOS
GLICINA EN EL PUENTE INTERPEPTÍDICO
MICROORGANISMOS REPRESENTATIVO
I L-DAP NA + Streptomyces
Intrasporangium
II m-DAP NA + Actinoplanes
Micromonospora
III m-DAP Madurosa - Microbispora, Frankia
IV m-DAP Arabinosa, Galactosa - Corynebacterium Nocardia
V N.A. NA - Actinomyces israelii
VI N.A. Galactosa - Oerskovia turbata
Cellulomonas
VII DAB NA + Agromyces
NA (no aplicable, o bien no se detecta un azúcar diferencial); DAB (Ácido diaminobutírico);
DAP (Ácido diaminopimélico).
Tabla 2.1. Tipos de paredes celulares de los Actinomicetos (Serrano y Sandoval, 2008; Duque y Quintana, 2008).
Algunas especies presentan hexosamina en la pared celular en un 2 a un 18%.
Adicionalmente especies como Streptomyces y Nocardia contienen alanina, metionina, valina, arginina, lisina, leucina, hexosamina, isoleucina, ácido glutámico, treonina y asparagina (Titus y Pereira,2007). De igual manera se presentan diversos tipos de peptidoglucano que se clasifican de acuerdo al tipo de aminoácido ubicado en la posición 3 de la cadena lateral del tetrapéptido, a la posición del puente entre dos cadenas vecinas (posición 3 y 4 para peptidoglucano tipo A y 2 y 4 para peptidolucano tipo B) y al tipo de péptido presente en la cadena interpeptídica (Serrano y Sandoval, 2008).
2.2.4. Aplicación industrial
Los actinomicetos son cuantitativa y cualitativamente importantes en la rizosfera, pueden influir en el crecimiento de las plantas y la protección de sus raíces contra la invasión por hongos patógenos. Adicionalmente éstos pueden participar en la formación de micorrizas, y en la producción de compuestos herbicidas e insecticidas (Crawford et al, 1993).
Los actinomicetos participan principalmente en procesos de degradación de materia orgánica, incluyendo lignina y quitina, así como en la formación y estabilización de pilas de compostaje y humus (Titus y Pereira, 2007). Además de la función ecológica de los actinomicetos, estos microorganismos son de suma importancia debido a que han demostrado ser la fuente más importante de metabolitos secundarios bioactivos de valor industrial y comercial (Ezziyyani et al., 2004).
Los antibióticos constituyen la aplicación industrial más importante de los actinomicetos.
Éstas moléculas de origen natural manifiestan, a bajas concentraciones, actividades biológicas con efecto antibacteriano, antifúngico, anticanceroso, antiviral o antiparasitario.
Adicionalmente, estas bacterias tienen la capacidad de sintetizar enzimas hidrolasas extracelulares que permiten la descomposición de la materia orgánica o la degradación de las paredes de hongos o plantas (Leveau y Bouix, 2000). Los actinomicetos son considerados como los principales organismos involucrados en la producción de quitinasas y en consecuencia en la descomposición de la quitina en el suelo; teniendo en cuenta que la quitina es un componente significativo de la pared celular de la mayoría de los hongos, resulta lógico asumir que los actinomicetos pueden atacar las hifas y esporas de los hongos, pudiendo ser considerados como potenciales agentes de control biológico (Ames, 1989).
2.3. CONTROL BIOLÓGICO
Las enfermedades de las plantas causadas por hongos son una de las mayores preocupaciones en el campo de la agricultura. En el suelo se encuentran diversos hongos patógenos tales como Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Phytophthora, los cuales atacan cultivos de importancia económica ya sea atacando la raíz o las semillas antes de la germinación o posterior a que dicho proceso germinativo se haya llevado a cabo, resultando en grandes pérdidas monetarias. Muchos microorganismos quitinolíticos poseen la habilidad de controlar hongos fitopatógenos pero en ciertos casos no resultan ser satisfactorios, entre
otras razones, por causas ambientales. Es entonces como surge la necesidad de encontrar cepas altamente quitinolíticas que contribuyan al desarrollo de un agente biocontrolador potencial (Gohel et al., 2006).
La ecología microbiana se ha ido convirtiendo en una alternativa biológica para el control de plagas de plantas. El control biológico se encuentra dividido en efectos directos e indirectos, en los efectos directos se presenta competencia por nutrientes o por espacio, producción de enzimas líticas, antibióticos y parasitismo. Cuando se generan cambios biológicos y bioquímicos en las plantas tales como tolerancia al estrés y mayor adsorción de nutrientes inorgánicos, el control biológico está dado por efectos indirectos los cuales incrementan resistencia por parte de la planta ante el patógeno (Gohel et al., 2006).
El uso de agentes químicos para el control de patógenos ha mostrado problemas como por ejemplo la resistencia que la cepa patógena puede llegar a adquirir, con el fin de reducir el uso de éstos se ha estudiado el control biológico en plantas para el tratamiento de enfermedades causadas por fitopatógenos (Compant et al., 2005). Según Weller (1988), los microorganismos que colonizan la rizosfera son ideales para ser utilizados como agentes para el control biológico contra las enfermedades transmitidas por el suelo. La habilidad del microorganismo control para mantener una densidad poblacional suficiente en la rizosfera por un largo periodo de tiempo es crítico para el éxito del método de biocontrol (Getha et al., 2005).
Para determinar si un microorganismo puede ser empleado como agente biocontrolador se deben tener en cuenta características tales como: competencia significativa en la rizosfera, mantener in-situ un tamaño poblacional considerable, colonización rápida de la raíz, capacidad de antagonizar patógenos de rápido crecimiento y producción estable de agentes antifúngicos (Neiendam et al., 1998). Un agente ideal de control biológico de hongos patógenos generadores de síntomas infecciosos en la raíz de las plantas debe mostrar una suficiente actividad antagónica en la rizosfera y ser capaz de reducir significativamente la enfermedad (Yuan y Crawford, 1995).
Actualmente el biocontrol ya es considerado como una de las prácticas de manejo de enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora y Fusarium entre otros. En la
lucha por la erradicación de dichas especies, resulta importante la selección de potenciales bioantagonistas que puedan ser utilizados como controladores biológicos para lo cual es necesario realizar ensayos in vitro que generen una orientación respecto a su capacidad antagónica y permitan que posteriormente puedan ser formulados y utilizados en pruebas de campo (Duñabeitia et al., 2007). La búsqueda de microorganismos nativos puede ser eficaz en el control biológico de fitopatógenos y una alternativa principal a la utilización de productos químicos (Ezziyyani et al., 2004).
2.3.1. Actinomicetos como agentes biocontroladores
Los actinomicetos se caracterizan por producir enzimas con actividad antimicrobiana, aspecto que ha sido evaluado en relación al biocontrol de fitopatógenos (Crawford et al., 1993; Anderson y Wellington, 2001; Park et al., 2002). El parasitismo de los hongos patógenos, facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control biológico de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son de suma importancia teniendo en cuenta que la quitina es el mayor constituyente de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de las esporas fúngicas y la elongación del tubo germinal, y lisan los tipos hifales (Kishore et al., 2005). Hasta la fecha se sabe que varios antifúngicos activos contra hongos patógenos se han aislado y caracterizado a partir de cepas de Streptomyces sp (Aizawa et al., 1982; Kim et al., 1999; Hwang et al., 2001; Rodríguez et al., 2002; Remsing et al., 2003).
Varias cepas de Streptomyces sp han mostrado suprimir el crecimiento de fitopatógenos in vitro, muchos de sus metabolitos han sido usados para inhibir el crecimiento de éstos patógenos in vivo, algunos de estos metabolitos incluyen macrólidos, benzoquinonas, aminoglucósidos entre otros. De igual forma, enzimas extracelulares como quitinasas y β- 1,3- glucanasas desempeñan una significativa función en la actividad antifúngica y biocontroladora, siendo posiblemente responsables del micoparasitismo potencial ejercido por algunas cepas de Streptomyces sp. y la supresión de enfermedades de las plantas, que se observa cuando el suelo es modificado, siendo suplementado con pared celular fúngica, quitina y/o laminarina (González et al., 2003). Estudios de Streptomyces sp. han reportado la capacidad que tienen los microorganismos de esta especie para generar efecto antagónico y control sobre una amplia gama de enfermedades de las plantas, en su gran mayoría generada por compuestos de origen antibiótico y no enzimático. En la década de los años
50´s Pridham y colaboradores reportaron la represión de al menos una enfermedad generada en plantas tratadas en invernadero por 9 de los 10 metabolitos secretados por Streptomyces sp. Así mismo, Reddi y Rao (1971) reportaron el control de Pythium y especies de Fusarium nativas, patógenos de plantas de tomate y algodón respectivamente en suelos infestados artificialmente. Otros estudios muestran la represión del desarrollo de estos fitopatógenos empleando Streptomyces sp en forma de esporas y micelios o combinación de los dos (Yuan y Crawford, 1995).
La adición de quitina al suelo ha sido estudiada como un posible método para el control de hongos patógenos. El suplemento del suelo con quitina puede facilitar el incremento en el número de organismos quitinolíticos que podrían degradar la quitina de la pared celular de los hongos, conllevando a la supresión de los patógenos. Otra posibilidad es usar los actinomicetos directamente como productores de quitinasas actuando contra la pared celular de los patógenos fúngicos (Gomes, 1999).
Se han realizado estudios que determinan el efecto de microorganismos quitinolíticos aislados de la rizosfera y del suelo no rizosférico sobre el desarrollo de hongos patógenos, determinándose que los microorganismos rizosféricos presentan mayor actividad quitinolítica en comparación a los no rizosféricos. Streptomyces violaceusniger, microorganismo asociado la rizosfera de Paraserianthes falcataria, ha demostrado antagonismo frente a hongos fitopatógenos tales como Pythium sp., Phytophthora sp. y Fusarium sp.; esto ha permitido determinar que existen diferencias en el perfil de las quitinasas basado en el hábitat a partir del cual fueron aislados (Trejo et al., 1998; Sembiring et al., 2000).
En el mar se encuentra acumulada una alta proporción de quitina, presumiendo que la mayoría de bacterias marinas tienen la capacidad de degradar este polímero, sin embargo estudios han reportado que son pocas las bacterias marinas capaces de hidrolizarlo (0,4- 19%). El uso de enzimas quitinolíticas presenta gran importancia en la industria de comida de mar, de ahí los numerosos estudios en donde se comparan las enzimas derivadas de organismos terrestres con las de origen marino, mostrando que éstas últimas presentan una mayor tolerancia a condiciones altas de salinidad y pH, presentando un posible potencial biotecnológico (Han et al., 2008).
La actividad de los actinomicetos como patógenos de humanos, animales y plantas ha sido más que compensada por los beneficios que éstos tienen en el suelo, tales como antagonistas de patógenos en plantas, estimuladores de crecimiento vegetal, productores de biocidas, productores de antibióticos e hiperparásitos de hongos. Los actinomicetos han desempeñado un importante papel en el control de los fitopatógenos, sin embargo han recibido poca atención como agentes de control biológico de nemátodos y parásitos de plantas (Park et al., 2002).
Estos microorganismos son de suma importancia en la rizosfera, en la medida en que pueden influir sobre el crecimiento vegetal y proteger las raíces de las plantas contra la invasión de hongos patógenos (Crawford et al., 1993). Además de la función ecológica, los actinomicetos han demostrando ser la fuente más importante de metabolitos secundarios bioactivos de valor industrial y comercial. Estos microorganismos se encuentran entre los agentes biocontroladores más estudiados, especialmente aquellos pertenecientes al género Streptomyces sp., los cuales se conocen ampliamente por la capacidad de producir antibióticos y compuestos bioactivos que participan en el control de patógenos de las plantas (Goodfellow y Williams, 1983; Fermino et al., 2006). Diferentes especies de Streptomyces han sido estudiadas extensivamente como potenciales agentes controladores contra hongos fitopatógenos tales como Pythium ultimum, Fusarium oxysporum, Sclerotinia homeocarpa, Phytophthora fragariae, Phytophthora infestans y Verticillium dahliae (Franco-Correa, 1999;
Getha et al., 2005).
Los actinomicetos al producir metabolitos secundarios biológicamente activos, tales como quitinasas, son agentes prometedores en el biocontrol de hongos patógenos de plantas (Ezziyyani et al., 2004).
2.3.2. Mecanismos de antagonismo
Los métodos de biocontrol se han puesto en práctica para tratar enfermedades causadas en las plantas por los patógenos presentes en el suelo; por ésta razón el suelo representa una fuente óptima para el aislamiento de microorganismos con actividad antagónica, los cuales pueden ser empleados como agentes de control (Goodfellow y Williams, 1983).
Entre los mecanismos de acción que utilizan los microorganismos antagonistas para el control biológico se encuentran: antibiosis, competencia, parasitismo, lisis celular y resistencia inducida en el hospedero. Diversos investigadores citan a las quitinasas, glucanasas y proteasas como enzimas involucradas en el control biológico de fitopatógenos (Nuero, 1995; Aceves et al., 2005).
La antibiosis es el fenómeno mediante el cual un organismo antagonista inhibe o destruye a otro organismo por medio de la producción metabólica de pequeñas moléculas tóxicas volátiles y de enzimas líticas, las cuales disuelven o dañan polímeros estructurales, como quitina y β- 1,3- glucanos de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos, produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo, actividad metabólica y diferenciación.
Entre mayor sea la cantidad de productos metabólicos, el poder antagónico se incrementa (Aceves et al., 2005). En la antibiosis no se requiere contacto directo entre el microorganismo antagonista y el patógeno, debido a que el efecto negativo que se está ejerciendo es generado por la molécula de antibiótico, razón por la cual la inhibición del crecimiento del fitopatógeno puede continuar incluso después de la muerte del antagonista;
por el contrario el parasitismo involucra un contacto directo entre el hospedero y el parásito, éste último sustrae todos los nutrientes necesarios para su desarrollo a partir del hospedero e involucra la producción de enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular del hospedero (Di Pietro et al., 1993; Nuero, 1995).
La lisis celular, genera la degradación enzimática total o parcial de la pared celular del patógeno. La actividad de las enzimas quitinasas y β-1,3-glucanasas se encuentran involucradas en la hidrólisis de la pared celular fúngica, causando la inhibición de crecimiento microbiano. Así mismo, las plantas también pueden sintetizar enzimas hidrolíticas, las cuales pueden ser inducidas por el ataque de hongos fitopatógenos o por la presencia de sustancias químicas como el etileno. Los hongos también secretan de manera constitutiva o inducida, enzimas de éste tipo generando la hidrólisis de la pared celular de otros hongos o de su propia pared cuando en medio de cultivo estas se encuentran como única fuente de carbono. Actualmente, Trichoderma sp. es uno de los pocos agentes antagonistas que se encuentra disponible comercialmente para el biocontrol de patógenos en el suelo, se ha reportado que este género produce quitinasas y β-1,3-glucanasas que inhiben el crecimiento de Fusarium oxisporum f.sp. radicis-lycopersici y Rhizoctonia solani en
medios de cultivo que contienen las paredes de éstos microorganismos como única fuente de carbono disponible (Nuero, 1995).
La liberación de enzimas extracelulares como quitinasas y β- glucanasas por parte de algunos microorganismos hace parte de un mecanismo de defensa contra patógenos como hongos ya que éstas degradan polímeros estructurales como quitina y glucano respectivamente, presentes en la pared celular de estos organismos, actuando como agentes de protección (Gomes et al., 2000). Estas enzimas han mostrado ejercer un significativo control biológico, por este motivo algunas estrategias suponen la expresión de los genes que codifican para estas enzimas en plantas, para así aumentar y/o reforzar la defensa primaria ante un ataque de patógenos, suprimiendo la colonización del tejido vegetal. La expresión de estos genes conduce a una más rápida interacción y neutralización de los fitopatógenos (Gohel et al., 2006).
Adicionalmente, entre los mecanismos de acción que impiden la infección de la planta por el patógeno se encuentran la competencia y la inducción de resistencia sistémica en la planta.
Los saprofitos compiten por los nutrientes disponibles en la rizosfera mientras que los patógenos lo hacen por zonas de infección en la raíz. Mediante la resistencia sistémica se induce una respuesta de defensa en la planta por agentes bióticos o abióticos, la raíz puede ser colonizada por microorganismos que desencadenan una cascada de reacciones de defensa contra el patógeno (Larkin y Fravel, 1999).
Los actinomicetos tienen la capacidad de producir una amplia variedad de hidrolasas extracelulares que les otorga un importante papel en la descomposición de la materia orgánica en el suelo. Adicional a su función activa en la descomposición, los actinomicetos parecen tener importancia entre la flora microbiana de la rizosfera (Valois et al., 1996).
El antagonismo de los actinomicetos contra hongos ha sido demostrado para una amplia variedad de patógenos de plantas, tales como Alternaria, Rhizoctonia, Verticillum, Fusarium y Macrophomina sp. Además, los actinomicetos del género Streptomyces han sido usados comercialmente para el control de los daños en plantas. Por ejemplo, la cepa 5406 de Streptomyces sp. ha sido usada en China por mas de 30 años para proteger los cultivos de algodón de patógenos del suelo (Valois et al., 1996). Adicionalmente, Lahdenpera y
colaboradores (1991) desarrollaron un biofungicida que contiene células de Streptomyces griseoviridis para proteger los cultivos contra infecciones de Fusarium y Alternaria. Por otro lado, estudios han reportado que Streptomyces sioyaensis exhibe antagonismo contra varios hongos patógenos como Pythium aphanidermatum, Colletotrichum higginsianum, Acremonium lactucum y Fusarium oxysporum (Hong et al., 2002).
2.3.3. Hongos fitopatógenos
2.3.3.1. Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum es un hongo que se presenta principalmente como saprófito en el suelo, o como patógeno especializado, siendo capaz de generar enfermedad a un amplio rango de hospederos. Entre los síntomas generados en la planta por este fitopatógeno se encuentra el amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia el lado de la planta enferma, así mismo se presentan fenómenos de enanismo y disminución del crecimiento por parte de la planta. Los síntomas avanzan lentamente de manera ascendente hasta causar un marchitamiento generalizado y en consecuencia la muerte. Fusarium oxysporum penetra la epidermis de la raíz, la corteza y la endodermis, entra a los vasos del xilema, colonizando el sistema vascular e interfiere en la capacidad de la planta para adquirir agua y nutrientes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).
En agar papa dextrosa Fusarium oxysporum presenta un crecimiento rápido a 25ºC, macroscópicamente se puede evidenciar un micelio aéreo abundante, algodonoso y con pigmentación que varía de blanco a rosa durazno y generalmente un pigmento púrpura o violeta más intenso al reverso de la colonia. Este hongo se caracteriza por producir tres tipos de propágulos: microconidias, macroconidias y clamidosporas; estas últimas tienen paredes muy gruesas, lo cual las hace muy resistentes a condiciones ambientales desfavorables y a la ausencia de hospedantes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).
2.3.3.2. Fusarium roseum
Fusarium roseum es un fitopatógeno que se puede evidenciar en plantas jóvenes y se manifiesta como una podredumbre rosada o violácea desde la base del esqueje hasta el segundo nudo de la planta de clavel. Las lesiones que se manifiestan de color café rojizas se van extendiendo a partir de los tejidos infectados de manera ascendente hasta llegar a la base de la planta, la decoloración vascular de la planta a diferencia de la generada por Fusarium oxysporum solo se presenta en la zona inmediatamente cercana a los tejidos podridos (Sastoque, 2006).
2.3.3.3. Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de plantas, provocando la pudrición de raíces y órganos subterráneos y aéreos. Se caracteriza por producir basidiosporas y no producir esporas asexuales (conidios). Es un hongo de hábito saprófito, aunque en algunos casos puede formar micorrizas sobre orquídeas u otras plantas. Presenta pigmentación hifal dematiácea, estrechamiento de hifa y formación de septos doliporos a una distancia corta del ápice a la ramificación de la hifa y células multinucleadas en la hifa vegetativa joven. Macroscópicamente las colonias jóvenes de éste hongo se caracterizan por ser blancas, algodonosas adheridas al medio de cultivo, aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse la maduración, la colonia puede tomar una coloración marrón.
Rhizoctonia solani se caracteriza por ser un buen competidor capaz de colonizar diferentes sustratos y tolerar cambios amplios de ambiente, éstas características favorecen su supervivencia y su acción patogénica sobre tejidos juveniles vegetales. Este fitopatógeno ocasiona pérdidas importantes en plantas perennes y anuales, incluyendo la mayoría de los cultivos hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. El damping-off o caída de las plántulas es una de las enfermedades más conocidas, que a través de un estrangulamiento ocasiona necrosis del tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Adicionalmente, este hongo es causante de una reducción en el vigor de las plantas y en la producción de tubérculos en cultivos de papa (Tovar, 2008).
2.4. ACTIVIDADES HIDROLÍTICAS PARA CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS
2.4.1. Quitinasas
La quitina es un homopolímero formado por residuos de N-acetil-D-Glucosamina con enlaces β-1,4. Su estructura es similar a la de la celulosa exceptuando que el grupo hidroxilo (-OH), presente en el carbono dos de la celulosa, es reemplazado por un grupo acetamida (NH.CO.CH3) en la estructura de la quitina (Figura 2.1.). Este polímero es el recurso renovable más abundante después de la celulosa. Se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza como un componente estructural de hongos (22% - 44%), insectos y crustáceos (25% - 58%) y protozoos (Hoster et al; 2005, Mukherjee y Sen, 2006;
Bhattacharya et al., 2007).
Figura 2.1. Estructura molecular de la quitina (Fuente: Sabry, 1992).
La quitina y sus derivados presentan un especial interés por encontrarse involucrados en diferentes actividades biológicas como inmunoadjuvantes, floculantes de lodos en aguas residuales y disminución del uso de agroquímicos. El uso comercial de ésta se centra en la necesidad de desarrollar soluciones enzimáticas de quitinasas estables y de bajo costo.
Los residuos de mariscos han reportado ser una adecuada fuente de quitina, lo cual promueve aún más el valor económico de los productos marinos (Wang y Chang, 1997). Se ha demostrado que oligómeros de quitina y el quitosano (quitina con baja acetilación) tienen actividades antitumorales, inmunoreguladoras, antibacterianas y antifúngicas (Guo et al., 2004). La pesca comercial de crustáceos y su proceso subsiguiente, generan grandes cantidades de residuos que pueden ser un problema ambiental si no son tratados de la
manera adecuada. Estos residuos pueden ser aprovechados por medio de métodos biológicos ó químicos, desarrollando procesos que involucren la hidrólisis enzimática del polímero (Sastoque et al., 2007).
El proceso biológico es llevado a cabo mediante la acción de quitinasas, hidrolizando el enlace glucosídico β1-4 (Sastoque et al., 2007). La quitina es hidrolizada por un complejo quitinasa que comprende tres enzimas: exoquitinasa, endoquitinasa y β-N- acetilglucosaminidasa. La primera hidroliza el extremo no reductor de la cadena de quitina;
la segunda cliva los enlaces internos β- 1,4 glicosídicos de N-acetilglucosamina y la última hidroliza unidades secuenciales de N-acetilglucosamina en el extremo no reductor del sustrato. El clivaje enzimático que realizan las quitinasas se lleva a cabo aleatoriamente en la naturaleza en toda la estructura del polímero, esto genera la liberación de compuestos solubles de bajo peso molecular de N-acetilglucosamina como quitotetraosa, quitotriosa, quitobiosa y pequeños oligosacáridos los cuales resultan ser los más predominantes y pueden ser utilizados como sustrato por la β-N-acetilglucosaminidasa. El microorganismo quitinolítico reconoce la quitina por colisión aleatoria u otro mecanismo; la degradación de este polímero se lleva a cabo por la acción del complejo quitinolítico extracelular, generándose oligosacáridos que pueden entrar a la célula a través de la zona periplasmática. Estos oligosacáridos posteriormente son degradados a residuos de N- acetilglucosamina, los cuales son trasportados al citoplasma mediante la vía del fosfoenol- piruvato empleando el sistema N-acetilglucosamina fosfotransferasa. Finalmente la N- acetilglucosamina fosfato sufre una conversión en dos pasos, en el primero de ellos pierde su grupo acetil y en el segundo se libera amonio, generando como productos finales amoniaco, acetato y fructosa-6-fosfato (Figura 2.2.) (Sastoque, 2006; Bhattacharya et al., 2007).
Figura 2.2: Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos quitinolíticos (Fuente: Yu et al., 1991).
Di Pietro y colaboradores (1993) estudiaron la producción de enzimas quitinolíticas del tipo endoquitinasas, glucosaminidasas y quitiobiosidasas, indicando la existencia de un complejo patrón funcional y regulatorio para éstas enzimas, involucradas en funciones como la liberación de nutrientes a partir de sustratos de quitina, micoparasitismo, competencia y funciones reguladoras en el desarrollo fúngico.
Las quitinasas son glicosil hidrolasas y se encuentran presentes en una gran variedad de organismos tales como bacterias, hongos, insectos, plantas y animales. Estas enzimas
juegan roles fisiológicos y ecológicos importantes. Los invertebrados requieren quitinasas para la degradación parcial de sus exoesqueletos viejos y las plantas como un mecanismo de defensa contra hongos patógenos (Hoster et al., 2005). Las bacterias producen quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía.
Adicionalmente, algunas quitinasas de bacterias quitinolíticas son agentes potenciales para el control biológico de enfermedades de plantas causadas por diversos hongos fitopatógenos, pues hidrolizan la quitina presente en la pared celular del hongo. Las bacterias fitopatógenas también pueden ser controladas por estas enzimas debido a que algunas presentan actividad lisozimal, lo cual permite la degradación de la pared celular bacteriana (De la Cruz et al., 1992). Estas enzimas pertenecen a muchas especies bacterianas, entre las más conocidas se encuentran los géneros Aeromonas, Serratia, Myxobacter, Vibrio, Streptomyces y Bacillus (Hoster et al., 2005).
Las quitinasas se clasifican en dos categorías generales: las endoquitinasas clivan la quitina aleatoriamente en sitios internos, generando multímeros de N-acetilglucosamina de bajo peso molecular, tales como quitotetraosa, quitotriosa y diacetilquitobiosa. Las exoquitinasas pueden dividirse en dos subcategorías: quitobiosidasas que se encargan de catalizar la liberación progresiva de diacetilquitobiosa iniciando en el terminal no reductor de la quitina, y las β-(1,4) N-acetilglucosaminidasas, que clivan los productos oligoméricos de las endoquitinasas y quitobiosidasas, generando monómeros de N-acetilglucosamina. Una ruta alternativa involucra la deacetilación de la quitina a quitosano, que es finalmente convertido a residuos de glucosamina por acción de la quitosanasa (Dahiya et al., 2006).
Las quitinasas presentan diferente talla molecular que va desde 20 kDa hasta 90 kDa, las quitinasas bacterianas oscilan entre 20 y 60 kDa, presentando un peso molecular similar a las quitinasas secretadas por las plantas (25 – 40 kDa) pero menor a las enzimas producidas por los insectos (40 – 85 kDa). Las quitinasas resultan ser activas en diferentes rangos de temperatura y pH, esta variación se ve reflejada de acuerdo a la fuente de aislamiento, permitiendo que las quitinasas sean empleadas en diferentes procesos que difieren en las condiciones de pH y temperatura (Bhattacharya et al., 2007).
Las quitinasas se encuentran clasificadas en dos familias de glicosil-hidrolasas (18 y 19), sobre la base de la similitud de la secuencia de aminoácidos. La familia 18 de quitinasas se distribuye en una amplia variedad de organismos incluyendo bacterias, hongos, virus,