TítuloNasáridos como organismos modelo en el Atlántico nordeste : Imposex y estructura de poblaciones

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(1)N3G ^. , sr. ^^ GN3 ®. N^G. n . . ii. l^lll^n_^^ ^^^nnÍW. ^. .. .. •. :. ®. y.

(2) ,... UNIVERSIDADE DACORUNA FACULTADE DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOXÍA ANIMAL, BIOLOXÍA VEXETAL E ECOLOXÍA. NASÁRIDOS COMO ORGANISMOS MODELO EN EL ATLÁNTICO NORDESTE: IMPOSEX Y ESTRUCTURA DE POBLACIONES. Memoria presentada por Dña. LUCÍA COUCEIRO LÓPEZ para optar al grado de Doctora en Biología. A Coruña, Abril de 2008.

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(4) ... UNIVERSIDADE DACORUNA FACULTADE DE CIENCIAS. D. RODOLFO BARREIRO LOZANO y D. JOSÉ MIGUEL RUIZ DE LA ROSA, profesores catedrático y titular, respectivamente, de Ecoloxía del Departamento de Bioloxía Animal, Bioloxía Vexetal e Ecoloxía de la Facultade de Ciencias de la Universidade da Coruña.. CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada: "Nasáridos oomo organismos modelo en el Atlántioo nordeste: imposex y estructura de poblaciones" presentada por Dña. LUCÍA COUCEIRO LÓPEZ para optar al Grado de Doctora en Biología ha sido realizada bajo su dirección. Asimismo, consideran que dicho trabajo está en condiciones de ser defendido ante el tribunal que deberá juzgarlo.. Y para que así conste a los efectos oportunos, firman la presente en A Coruña. y2. Dr. Roôlfo Barreiro Lozano. V. 25 de Abril de 2008.. Dr. José Miguel Ruiz de la Rosa.

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(6) Á memoria de Sergio.

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(8) La financiación de este trabajo ha sido posible gracias a los siguientes proyectos de investigación: Capacidad de respuesta de poblaciones de gasterópodos marinos frente al TBT estudiada con técnicas de ecología molecular (Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento; Xunta de Galicia; PGIDTO 1 MAM 10301 PR) Capacidad de respuesta de poblaciones de gasterópodos marinos frente al TBT estudiada con técnicas de ecología molecular (Ministerio de Ciencia y Tecnología; REN2001-0899) Evaluación avanzada y actualizada de la presencia y efectos del TBT en aguas costeras gaIlegas (Ministerio de Educación y Ciencia; CTM2004-04496) Evaluación avanzada y actualizada de la presencia y efectos del TBT en aguas costeras gaIlegas (Consellería de Innovación, Industria e Comercio; Xunta de Galicia; PGI DIT05PXIC 10302PN) Seguimiento de los efectos biológicos específicos del TBT para cumplir con OSPAR (Universidade da Coruña). Asimismo, la autora agradece la concesión de una Beca del Programa Nacional de Formación del Profesorado Universitario (FPU) durante el periodo 2003-2006 (AP2002-0928),.

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(10) Despois de tantos meses sentada diante deste ordenador, é de supoñer que a miña capacidade para transmitir ideas debería ter mellorado bastante. Sen embargo, sei que nunca atoparei as palabras axeitadas para expresarvos todo o meu agradecemento. Aos meus directores, Chemy e Rodolfo. Porque, anos antes de que esta tese fose só un proxecto, espertastes en min o interese pola Ecoloxía e pola ciencia en xeral. Por acollerme no voso grupo durante dous veráns e brindarme despois a oportunidade de facer parte del. Por todos os bos momentos que pasamos e, tamén, pola proximidade e comprensión nos días malos. Por ter convertido estes anos nos máis importantes da miña vida. A María. Por terme guiado polos camiños da ciencia e da vida. Tamén aquí, ao igual que nas nosas conversas, sobran as palabras. Por moitos quilómetros que nos separen, ruliña, ti sempre estarás moi preto do meu corazón. A Carlos Caramelo. Por estar sempre disposto a botarme unha man ou a percorrer a costa galega comigo. Tamén por todas esas conversas acompañadas de café e/ou tabaco. A Sirka, Andreea e as nenas de botánica. Aos meus pais, a quen Iles debo todo o que son. Polo voso apoio incondicional. Por non ter escatimado nunca esforzos na miña educación académica e, tamén, na que se recibe na casa e nos forma coma persoas. A Xulio Antón, Alicia, Emma e Mariña. Por estar sempre aí. A Iván. Por facer que a vida sexa marabillosa.. A Coruña, 23 de abril de 2008.

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(12) ÍNDICE GENERAL INTRODUCCIÓN GENERAL 1. DISPERSIÓN Y FLUJO GENÉTICO EN MEDIO MARINO. 1-60 7. 1.1. IMPORTANCIA Y APROXIMACIONES TRADICIONALES A SU ESTUDIO. 7. 1.2. APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES AL ESTUDIO DE LA DISPERSIÓN. 8. 1.3. TÉCNICAS MOLECULARES EMPLEADAS EN ESTA MEMORIA 1.3.1. ADN POLIMÓRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE (RAPD). 11 11. 1.3.1.1. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS MARCADORES RAPD. 12. 1.3.1,2. APLICACIONES DE LA TÉCNICA RAPD. 14. 1.3.2. ADN MITOCONDRIAL. 15. 1.3.2.1. TÉCNICAS EMPLEADAS EN ESTUDIOS DE ADN MITOCONDRIAL. 17. 1.3,2.2. UNA NUEVA DISCIPLINA CIENTÍFICA: LA FILOGEOGRAFÍA. 18. 2. CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT). 20. 2.1, EL PROBLEMA DE LA BIOINCRUSTACIÓN Y SU PREVENCIÓN. 20. 2.2. LOS DAÑOS COLATERALES DEL TBT. 21. 2.3. EL IMPOSEX EN GASTERÓPODOS MARINOS. 23. 2.3.1. PRIMERAS OBSERVACIONES ACERCA DEL IMPOSEX. 23. 2.3.2. EL IMPOSEX Y LA BIOMONITORIZACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN POR TBT. 26. 2.3.3. EXTENSIÓN GEOGRÁFICA Y TAXONÓMICA DEL IMPOSEX. 30. 2.3.4. DISRUPCIÓN ENDOCRINA Y EL MECANISMO DEL IMPOSEX. 31. 2,4. DEGRADACIÓN DEL TBT EN EL MEDIO MARINO. 33. 2.5. LEGISLACIÓN RELATNA AL USO DEL TBT. 34.

(13) 3. NASSARIUS RETICULATUS: UN ORGANISMO MODELO EN EL ATLÁNTICO NORDESTE. 37. 3.1. BIOLOGÍA Y ECOLOGÍA DE LA ESPECIE. 37. 3.2. VENTAJAS DE NASSARIUS RETICULATUS COMO ORGANISMO MODELO. 42. 3.2.1. NASSARIUS RETICULATUS Y EL ESTUDIO DE LA DISPERSIÓN. 42. 3.2.2. NîSSAR1US RETICULATUS Y LA BIOMONITORIZACIÓN DEL TBT. 43. 4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 45. 61-64. OBJETIVOS. CAPÍTULO 1: IMPOSEX Y BIOACUMULACIÓN DE ORGANOESTÁNNICOS EN POBLACIONES DE NASSARIUS RETICULATUS (L.) DE GALICIA (NO PENÍNSULA IBÉRICA): SITUACIÓN ACTUAL Y EVOLUCIÓN TEMPORAL (2000-2005). 65-122. 1. INTRODUCCIÓN. 69. 2. OBJETIVOS. 72. 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 74. 3.1. ESCALA GEOGRÁFICA DEL ESTUDIO Y RECOGIDA DE LAS MUESTRAS. 74. 3.2. EVALUACIÓN DEL IMPOSEX. 76. 3.3. ANÁLISIS DE ORGANOESTÁNNICOS. 78. 4. RESULTADOS. 81. 4.1. INCIDENCIA DEL PARASITISMO Y PROPORCIÓN DE SEXOS. 81. 4.2. NNELES DE IMPOSEX. 83. 4.3. NIVELES DE BUTILESTÁNNICOS (BTs) EN TEJIDOS. 89. 4.4. RELACIÓN ENTRE LOS ÍNDICES BIOLÓGICOS Y LA CONTAMINACIÓN. 92. 4.5. IMPOSEX Y TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT) EN LA COSTA GALLEGA: VARIACIÓN ESPACIAL. 95. 4.6. IMPOSEX Y BUTILESTÁNNICOS (BTs) EN LA COSTA GALLEGA: VARIACIÓN TEMPORAL. 97. 4.6.1 IMPOSEX. 100. 4.6.2 BUTILESTÁNNICOS (BTs). 100. 4.6.3 RELACIÓN IMPOSEX - TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT). 104. c.

(14) 5. DISCUSIÓN. 106. 5.1. UTILIDAD BIOINDICADORA DE LA ESPECIE. 106. 5.2. IMPOSEX EN NASSARIUS RETICULATUS versus CONTAMINACIÓN POR TBT. 108. 5.3. NNELES ACTUALES DE CONTAMINACIÓN E IMPOSEX EN LA COSTA GALLEGA. 1 10. 5.4. TENDENCIA TEMPORAL. 1 13. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 117. CAPÍTULO 2: ESTRUCTURA GENÉTICA DE POBLACIONES DEL PROSOBRAN6Û10 NASSARIUS RETICULATUS (L.) EN LA COSTA DE GALICA (NO PENÍNSULA IBÉRICA) REVELADA CON MARCADORES RAPD. 123-164. 1. INTRODUCCIÓN. 127. 2. OBJETIVOS. 130. 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 131. 3.1. ESCALA GEOGRÁFICA DEL ESTUDIO Y RECOGIDA DE LAS MUESTRAS. 131. 3.2. EXTRACCIÓN DEL ADN. 132. 3.3. REACCIÓN RAPD. 133. 3.4. ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS. 135. 3.5. ESTUDIO PILOTO E IDENTIFICACIÓN DE PRODUCTOS RAPD. 136. 3.6. ANÁLISIS DE DATOS. 137. 3.6.1. DNERSIDAD GENÉTICA. 137. 3.6.2. DIFERENCIACIÓN GENÉTICA Y ESTRUCTURA GEOGRÁFICA. 138. 3.6.2.1. AMOVA. 138. 3.6.2.2. TEST DE MANTEL. 141. 3.6.2.3. ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS. 142. 3.6.2.4. ESCALAMIENTO MULTIDIMENSIONAL NO MÉTRICO. 144. 4. RESULTADOS 4.1. PERFILES RAPD EN NASSAI?IUS RETICULATUS. 145 145.

(15) 4.2. DNERSIDAD GENÉTICA. 146. 4.3. DIFERENCIACIÓN GENÉTICA Y ESTRUCTURA DE POBLACIONES. 147. 5. DISCUSIÓN. 154. 5.1. CONECTNIDAD DEMOGRÁFICA DE LAS POBLACIONES. 154. 5.2. LAS RÍAS GALLEGAS Y EL INCREMENTO DE LA DIFERENCIACIÓN GENÉTICA. 157. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 160. CAPÍTULO 3: AISLAMIENTO GENÉTICO POR DISTANCIA ENTRE POBLACIONES DE NASSARIUS RETICULATUS ( L.) A LO LARGO DE LA COSTA ATLÁNTICA EUROPEA. 165-208. 1. INTRODUCCIÓN. 169. 2. OBJETNOS. 17 2. 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 173. 3.1. ESCALA GEOGRÁFICA DEL ESTUDIO Y MUESTREO. 173. 3.2. EXTRACCIÓN DEL ADN. 174. 3.3. AMPLIFICACIÓN POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). 175. 3.4. PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS. 178. 3.5. SECUENCIACIÓN DE LOS PRODUCTOS. 178. 3.6. ANÁLISIS DE DATOS. 180. 3.6.1. DETERMINACIÓN DEL MODELO DE EVOLUCIÓN DEL ADN. 180. 3.6.2. ESTIMAS DE DNERSIDAD GENÉTICA. 181. 3.6.3. DIFERENCIACIÓN GENÉTICA Y ESTRUCTURA GEOGRÁFICA. 182. 3.6.3.1. ANÁLISIS DE LA VARIANZA MOLECULAR (AMOVA) Y TEST DE MANTEL. 182. 3.6.3.2. RED HAPLOTÍPICA. 183. 3.6.4. DEMOGRAFÍA HISTÓRICA 4. RESULTADOS. 184 186. 4.1. ESTABLECIMIENTO DEL CONJUNTO DE DATOS. 186. 4.2. DNERSIDAD GENÉTICA. 187.

(16) 4.3. DIFERENCIACIÓN GENÉTICA Y ESTRUCTURA GEOGRÁFICA. 189. 4.4. DEMOGRAFÍA HISTÓRICA. 192 195. 5. DISCUSIÓN 5.1. CONECTIVIDAD DE LAS POBLACIONES. 195. 5.2. DEMOGRAFÍA HISTÓRICA. 199 203. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. CAPÍTULO 4: PRESENCIA DE CYCLOPE NERITEA (L.) (GASTROPODA, PROSOBRANCHIA) EN EL NO DE LA PENÍNSULA IBÉRICA: ORIGEN Y GRADO DE IMPOSEX DE LAS POBLACIONES. 209-240. 1. INTRODUCCIÓN. 213. 2. OBJETIVOS. 217. 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 218. 3.1. ESCALA GEOGRÁFICA DEL ESTUDIO Y RECOGIDA DE LAS MUESTRAS. 218. 3.2. CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT) E IMPOSEX EN CYCLOPE NERITEA. 219. 3.3. ADN MITOCONDRIAL Y ORIGEN DE LAS POBLACIONES GALLEGAS DE CYCLOPE NERITEA 220 4. RESULTADOS. 222. 4.1. CARACTERÍSTICAS DEL IMPOSEX. 222. 4.2. INCIDENCIA DEL IMPOSEX. 224. 4.3. DIVERSIDAD GENÉTICA. 228. 4.4. COMPOSICIÓN HAPLOTÍPICA Y ESTRUCTURA GENÉTICA. 228. 5. DISCUSIÓN 5.1. CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT) E IMPOSEX EN CYCLOPE NERITEA. 232 232. 5.2. ADN MITOCONDRIAL Y ORIGEN DE LAS POBLACIONES GALLEGAS DE CYCLOPE NERITEA 235 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 238.

(17) CAPÍTULO 5: DNA BARCOD/NG EN DOS ESPECIES MORFOLÓGICAMENTE SIMILARES DEL GÉNERO NASSARÛS DUMÉRIL: NASSARIUS RET^CULATUS (L.j Y NASSARIUS NlT^DUS (JEFFREYS). 241-2ó4. 1. INTRODUCCIÓN. 245. 2. OBJETIVOS. 249. 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 250. 3.1. MATERIAL BIOLÓGICO Y OBTENCIÓN DE SECUENCI^S COI EN NASSAI?IUS NITIDUS. 250. 3.2. ANÁLISIS DE DATOS. 251. 4. RESULTADOS. 253. 4.1. VARIACIÓN INTRA E INTERESPECÍFICA. 253. 4.2. LUGARES DE RESTRICCIÓN DIAGNÓSTICO. 256. 5. DISCUSIÓN. 258. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 262. CONCLUSIONES GENERALES. 265-268. ANEXOS. 269-283. 1. LISTA DE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS. 271. 2. ÍNDICE DE TABLAS. 275. 3. ÍNDICE DE FIGURAS. 279 •.

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(20) 1'. r. !^7 ^.

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(22) INTRODUCCIÓN GENERAL 1. DISPERSIÓN Y FLUJO GENÉTICO EN MEDIO MARINO 1.1. IMPORTANCIA Y APROXIMACIONES TRADICIONALES A SU ESTUDIO 1.2. APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES AL ESTUDIO DE LA DISPERSIÓN 1.3. TÉCNICAS MOLECULARES EMPLEADAS EN ESTA MEMORIA 1.3.1. ADN POLIMÓRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE (RAPD) 1.3.1.1. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS MARCADORES RAPD 1.3.1.2. APLICACIONES DE LA TÉCNICA RAPD 1.3.2. ADN MITOCONDRIAL 1.3.2.1. TÉCNICAS EMPLEADAS EN ESTUDIOS DE ADN MITOCONDRIAL 1.3.2.2. UNA NUEVA DISCIPLINA CIENTÍFICA: LA FILOGEOGRAFÍA 2. CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT) 2.1. EL PROBLEMA DE LA BIOINCRUSTACIÓN Y SU PREVENCIÓN 2.2. LOS DAÑOS COLATERALES DEL TBT 2.3. EL IMPOSEX EN GASTERÓPODOS MARINOS 2.3.1. PRIMERAS OBSERVACIONES ACERCA DEL IMPOSEX 2.3.2. EL IMPOSEX Y LA BIOMONITORIZACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN POR TBT 2.3.3. EXTENSIÓN GEOGRÁFICA Y TAXONÓMICA DEL IMPOSEX 2.3.4. DISRUPCIÓN ENDOCRINA Y EL MECANISMO DEL IMPOSEX.

(23) 2.4. DEGRADACIÓN DEL TBT EN EL MEDIO MARINO 2.5. LEGISLACIÓN RELATNA AL USO DEL TBT 3. NASSAR/US RETICULATUS: UN ORGANISMO MODELO EN EL ATLÁNTICO NORDESTE 3.1. BIOLOGÍA Y ECOLOGÍA DE LA ESPECIE 3.2. VENTAJAS DE NASSARIUS RETICULATUS COMO ORGANISMO MODELO 3.2.1. NÎSSARIUS RETICULATUS Y EL ESTUDIO DE LA DISPERSIÓN 3.2.2. N/aSSAR1US RETICULATUS Y LA BIOMONITORIZACIÓN DEL TBT 4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ^.

(24) "Animals living in the waters, especially the sea waters... are protected from the destruction of their species by Man. Their multiplication is so rapid and their means of evading pursuit or traps are so great that there is no likehood of his being able to destroy the entire specíes of any of these animals" (Jean-Baptiste Lamarck, Phílosophie Zoologíque, 1809). "Man marks the Earth with ruin/his control stops with the shore" (George Gordon Byron, Apostrophe to the Ocean, 1818). "It is inconceivable that the great sea fisheries, such as those for cod, herring and mackerel, could ever be exhausted" (Thomas Henry Huxley, International Fisheries Exhibition, 1884) Durante siglos, el hombre creyó que los océanos eran una fuente inagotable de recursos y un sumidero ilimitado de residuos. Sin embargo, este punto de vista ha cambiado en las últimas décadas y en la actualidad no existe ninguna duda acerca de la magnitud creciente del impacto humano sobre ecosistemas costeros y oceánicos (Roberts & Hawkins 1999). En una revisión reciente de datos paleoecológicos, arqueológicos e históricos para distintos ecosistemas marinos (incluyendo bosques de kelp, arrecifes de coral, praderas de fanerógamas tropicales y subtropicales, estuarios, y comunidades bénticas de aguas abiertas) Jackson et al. (2001) han concluido que, atendiendo a su importancia, las principales perturbaciones antrópicas que sufren los océanos pueden ordenarse del siguiente modo: sobreexplotación de recursos, contaminación, destrucción del hábitat, introducciones biológicas y, finalmente, cambio climático (Fig. 1)..

(25) En la presente memoria, Nassarius reticulatus (L.) (Gastropoda, Prosobranchia) es utilizado como organismo modelo con el objetivo de abordar dos grandes líneas de investigación íntimamente relacionadas con las dos principales perturbaciones antrópicas que sufre el medio marino: (i) la conectividad demográfica de poblaciones y(ii) un caso particular de contaminación que ha recibido considerable atención en las últimas décadas (contaminación por tributilo de estaño, TB^. Además, el hallazgo de una especie invasora durante el transcurso de las anteriores investigaciones, Cyclope neritea (Gastropoda, Prosobranchia), ha permitido abordar también el estudio de esta clase de amenazas relativamente recientes y sus posibles relaciones con otras perturbaciones (e.g. contaminación, cambio climático).. Expansión humana. ^ 3. Destrucción del hóbitat 2, Contaminación 1. Sobrepesca. Figura 7 ,-. ecosistemas marinos. Adaptado de .âckson et al. (2001).. ^.

(26) 1. DISPERSIÓN Y FLUJO GENÉTICO EN MEDIO MARINO 1.1. IMPORTANCIA Y APROXIMACIONES TRADICIONALES A SU ESTUDIO Un aspecto prioritario de la investigación científica en nuestros días es determinar la capacidad de dispersión de las especies y la conectividad demográfica de sus poblaciones. En medio marino tales estudios constituyen particularmente un reto dada la gran extensión de las masas oceánicas (^70% de la superficie del planeta) y las dificultades que éstas plantean para observar los organismos y tomar muestras. Sin embargo, es también en este medio donde la conectividad de las poblaciones adquiere especial relevancia: las especies acuáticas son los únicos organismos que aún se siguen explotando en números considerables para consumo humano a partir de su medio natural (Waples 1998) y la gestión sostenible de tales explotaciones (principalmente peces pero también otros grupos taxonómicos como mamíferos, reptiles, crustáceos, moluscos, equinodermos o algas) necesariamente implica cierto conocimiento acerca de la estructura de sus poblaciones. De este modo, algunas aplicaciones prácticas de estos estudios en el medio marino incluyen definir stocks (Gomes et al. 1998, Burton & Tegner 2000, Thorpe et al. 2000, Castillo et al. 2004), diseñar áreas marinas protegidas (Botsford et al. 2003, Palumbi 2003, Sale et al. 2005) o controlar plagas y especies invasoras (Stcehr et al. 2000, Schaffelke et al. 2002, Roman & Palumbi 2004).. Tradicionalmente, el estudio de las distancias de dispersión ha sido abordado mediante marcaje-recaptura de individuos. Las estimas inferidas a partir de esta aproximación son propensas a tres tipos de sesgos (Johnson & Black 1995): (i) el estrés ocasionado a los individuos durante la captura, marcado y liberación puede provocar un incremento de su tasa de dispersión; (ii) la probabilidad de recaptura es mayor en individuos que han recorrido menores distancias de modo que las estimas obtenidas estarán generalmente infravaloradas; y(iii) la importancia de eventos esporádicos sobre la.

(27) capacidad de dispersión de las especies fluctuará con la escala temporal del estudio. Además, en el caso particular de los organismos marinos estos trabajos presentan una serie de limitaciones adicionales ocasionadas, no sólo por las características del medio acuático, sino también por las peculiaridades de los ciclos vitales de muchas especies. Así, la existencia de fertilización externa y/o una fase larvaria planctónica caracteriza a muchos de estos organismos pero el marcaje resulta únicamente factible en individuos adultos de tamaño considerable. Como consecuencia de lo anterior, la aplicación de tales estudios al medio marino ha sido relativamente escasa. Ante tal ausencia de datos, la conectividad de las poblaciones en dicho medio se infirió a partir de ciertas características generales del hábitat y de las propias especies. Así, durante mucho tiempo se asumió que las poblaciones de organismos marinos presentaban menos estructuración que las de organismos terrestres puesto que (Caley et al. 1996): (i) el medio marino es homogéneo y carece de barreras a la dispersión; (ii) las especies marinas presentan tamaños poblacionales relativamente grandes; y(iii) muchas de esas especies también poseen una fase larvaria que asegura la dispersión. Sin embargo, ciertos hechos ocurridos durante la segunda mitad del siglo XX, entre los cuáles destaca el colapso de muchas pesquerías y el descubrimiento de numerosas especies crípticas, han puesto en alerta a la comunidad científica. Tales sucesos parecen indicar que el aislamiento en el medio marino es más frecuente de lo que se había sospechado. De este modo, surge nuevamente la necesidad de estimar la conectividad de las poblaciones en dicho medio y determinar qué factores la condicionan. 1.2. APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES AL ESTUDIO DE LA DISPERSIÓN A finales de la década de 1960 el advenimiento de las técnicas moleculares proporciona una nueva aproximación al estudio de la conectividad demográfica de poblaciones. En el año 1966, Lewontin & Hubby demuestran que se puede estimar el flujo genético entre poblaciones de Drosophila pseudoobscura a partir de las diferencias entre individuos reveladas por la técnica de electroforesis de proteínas (Lewontin & Hubby 1966). Tal aproximación presenta ciertas ventajas sobre los trabajos clási-.

(28) cos de marcado-recaptura (Johnson & Black 1995, Lowe et al. 2004): (i) menor dificultad logística y mayor rapidez al no ser necesario monitorizar los individuos a lo largo del tiempo, (ii) costes relativamente bajos que permiten analizar un número mayor de individuos y poblaciones, (iii) proporciona una visión global de los procesos ocurridos durante cientos de generaciones mientras que las estimas obtenidas con estudios de marcado-recaptura son limitadas en espacio y tiempo y, finalmente, (iv) sólo refleja eventos de migración exitosos, i.e. los que conducen a un establecimiento de propágulos y/o migrantes en la población receptora. Estos estudios adquieren enorme popularidad en los años posteriores y son aplicados a una amplia variedad de grupos taxonómicos. Por lo general, dichas investigaciones refuerzan dos percepciones clásicas acerca de la conectividad entre poblaciones de organismos marinos: (i) relativa ausencia de barreras a la dispersión en comparación con sistemas terrestres (e.g. Ward et al. 1994) y (ii) flujo entre poblaciones elevado debido a la presencia de una fase larvaria (revisado en Bohonak 1999). AI tiempo que aumentan los estudios basados en electroforesis de proteínas, comienzan a desarrollarse otras técnicas cuyo objetivo es detectar variación en el propio ADN: (i) Maxam & Gilbert (1977) y Sanger et al. (1977) describen dos métodos distintos para secuenciar fragmentos de ADN; (ii) Avise et al. (1979) muestran la posibilidad de observar variación en la molécula de ADN mitocondrial usando endonucleasas de restricción y establecen así las bases de la técnica RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism o Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción); y(iii) Jeffreys et al. (1985b, 1985a) muestran que la variación genética entre individuos también puede ser cuantificada atendiendo al número de copias de ciertas secuencias repetitivas (mini- y microsatélites). Los estudios de variación genética del ADN presentan una importante ventaja sobre los que utilizan electroforesis de proteínas: los primeros pueden emplear tejidos preservados en etanol, tampones o incluso tejidos secos, mientras que los segundos necesariamente implican tejidos frescos o congelados. Las anteriores técnicas no alcanzan sin embargo gran popularidad hasta la descripción de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), a finales de la década de 1980 (Mullis et al. 1986, Mullis & Faloona 1987). La técnica de la PCR (básicamente una reacción de extensión de un cebador in vítro, cataliza-.

(29) da por una ADN polimerasa termoestable, con la finalidad de amplificar un fragmento específico de ADN) supone una auténtica revolución metodológica ya que el fragmento objeto de la amplificación puede ver incrementada su concentración en un factor de 106. Tal incremento hace posible ver los productos obtenidos directamente en un gel (tras tinción con ciertos colorantes, e.g. bromuro de etidio, y exposición a luz ultravioleta) eliminando así la necesidad de usar radionucleótidos y largos tiempos de exposición como se venía haciendo hasta entonces. Una segunda ventaja es la pequeña cantidad de material de partida necesaria, lo que permite aplicar métodos de muestreo no destructivos e incluso hace posible estudiar fósiles o ejemplares de museo. De esta manera, con la incorporación de la técnica de la PCR, los estudios de detección de variación genética del ADN sufren un crecimiento exponencial. Pronto dichos estudios van ganando terreno a los basados en electroforesis de proteínas, cuyo uso exhaustivo había revelado ciertas limitaciones (e.g. bajo polimorfismo en algunos casos, incapacidad para separar electroforéticamente todos los alelos de una muestra o comportamiento no neutral). Además, continúa la descripción de métodos de detección de la variación genética nuevos y más sensibles: Síngle Strand Conformatíon Polymorphísm (SSCP; Orita et al. 1989), Random Amplifíed Polymorphic DNA (RAPD; Welsh & McClelland 1990, Williams et al. 1990) o Amplífied Fragment Length Polymorphism (AFLP; Vos et al. 1995) entre otros. Del mismo modo, resulta muy importante el desarrollo paralelo en otros campos del conocimiento como la estadística o la informática, que permite mejoras importantes en el análisis de datos. EI gran número de estudios publicados en el medio marino con técnicas de detección de la variabilidad genética más sensibles muestra que los patrones de dispersión resultan más complejos de lo que previamente se había asumido en base a características generales del medio y del ciclo vital de los organismos. Así, se observa que dicho medio, aparentemente homogéneo, con frecuencia presenta barreras físicas de naturateza diversa que ocasionan retención de individuos y autoreclutamiento: (i) cuerpos de agua más o menos aislados (Heipel et al. 1998, Huang et al. 2000, Engelen et al. 2001, Perrin et al. 2004), (ii) canales de aguas profundas (Bentzen et al. 1996, Bernardi 2000), (iii). 10. corrientes oceanográficas (Arndt & Smith 1998, Alberto et al. 1999, Goldson et al. 2001, Sotka et al..

(30) 2004, Waters & Roy 2004), o(iv) afloramientos (Waters & Roy 2004). Igualmente, se describen barreras ecológicas provocadas por cambios de la temperatura, salinidad o tipo de sustrato (Riginos & Nachman 2001). Incluso se sugiere que ciertas larvas presentan comportamientos migratorios más dinámicos de lo que se pensaba (e. g. natación activa o selección de un sustrato adecuado; Barber et al. 2002). 1.3. TÉCNICAS MOLECULARES EMPLEADAS EN ESTA MEMORIA 1.3.1. ADN POLIMÓRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE (RAPD) En 1990 dos publicaciones independientes describen un método que utiliza la técnica de i^R y cebadores de secuencia arbitraria para obtener marcadores moleculares en cualquier tipo de genoma. Welsh & McClelland ( 1990) denominan dicho método "Arbitrarily Primed PCR" (AP-PCR) mientras Williams et al. ( 1990) se refieren a él como "RandomlyAmplified Polymorphic DNA" (RAPD). Estos autores convienen que ambos trabajos se han publicado simultáneamente y que deben por tanto citarse juntos; a fin de designar la técnica se acaba imponiendo sin embargo el nombre propuesto por WiIliams et al. (1990), y más frecuentemente su acrónimo. Con la técnica RAPD, el ADN genómico del organismo objeto de estudio se amplifica utilizando un único cebador de secuencia corta y arbitraria. En teoría, existen a lo largo del ADN molde numerosas secuencias diana complementarias al cebador; no obstante, la amplificación sólo ocurre en aquellas regiones donde dichas secuencias complementarias están presentes en ambas hebras del ADN en orientaciones opuestas y relativamente próximas (Fig. 2). Como resultado se obtienen un conjunto de fragmentos de distinto tamaño (200 - 2000 pares de bases o bp) que pueden separarse e identificarse mediante electroforesis. Los polimorfismos detectados pueden reflejar cuatro procesos mutacionales: (i) si una deleción afecta a una de las secuencias diana la amplificación no tiene lugar, (ii) la ausencia de amplificación también puede estar ocasionada por un cambio nucleotídico en una de las secuencias diana, (iii) de igual modo, una inserción de tamaño considerable entre las secuencias diana ocasiona un incremento en la distancia que las separa y, en consecuencia, la no amplifi-. 11.

(31) cación del marcador y, finalmente, (iv) la inserción o deleción de un fragmento de pequeña longitud entre las secuencias diana se traduce en una variación del tamaño del marcador. Sin embargo, como el último de esos procesos se ha observado sólo en raras ocasiones (Weising et al. 1994), dichos polimortismos se expresan mayoritariamente como presencia/ausencia del producto amplificado. Individuo A. ly. ♦6. ly Individuo B. 3 ■^^. 2y. 2^^ ♦6. ♦4. ♦5. 3y ♦5. «4. Figura 2.- ADN palimórfico amplificado aleatoriamente (RAPDj. La Iinea gruesa representa ei ADN molde. Las flechas indican ios iugares de hibridación dei cebador y la dirección en la cuái ocurre ia sintesis del ADN. En el individuo A existen b iugares para la hibridación del cebador, no obstante, unicamente se amplificarán dos productos (aquéllos situados entre los lugares 2-5 y 3-4). En ei caso dei individuo B, donde la diana 4 ha desaparecido, la ampiificación sólo procederá para !a región comprendida entre los lugares 2 y 5.. 1.3.1.1. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS MARCADORES RAPD Los cebadores RAPD-PCR no están diseñados para amplificar una secuencia diana específica. En consecuencia, los fragmentos resultantes son anónimos y se encuentran virfualmente distribuidos a lo largo de todo el genoma. Tales características confieren a estos marcadores dos ventajas considerables (Williams et al. 1990, Williams et al. 1993, Grosberg et al. 1996): en primer lugar, no es necesario ningún conocimiento a priori de la biología molecular del organismo objeto de estudio; en segundo lugar, una fracción imporfante de los fragmentos estudiados debe actuar como marcadores neutrales (i.e, no sometidos a selección natural). Otros aspectos destacables de la técnica son (Carlson et al. 1991, Hunt & Page 1992): -. Muestrea de modo relativamente insesgado una gran proporción del genoma del individuo.. -. EI número de segmentos amplificados en un individuo particular utilizando un cebador oscila típicamente entre 0 y 30; sin embargo, puesto que cientos de estos oligonucleótidos están dis-. 12. ponibles comercialmente, el número de marcadores que pueden estudiarse es, en potencia,.

(32) ilimitado. -. Un mismo cebador puede emplearse teóricamente en cualquier tipo de organismo.. -. Se requiere una cantidad mínima de tejido y éste puede almacenarse indefinidamente antes del análisis utilizando métodos de conservación adecuados.. -. Es un procedimiento sencillo, rápido, no excesivamente costoso ni laborioso. EI entusiasmo general motivado por las anteriores ventajas pronto se vio, sin embargo, ensom-. brecido por ciertos problemas técnicos y analíticos (revisado en Grosberg et al. 1996): -. Reproducibilidad de los patrones de bandas. Un problema recurrente de muchas técnicas basadas en la PCR radica en que distintas condiciones de amplificación generan distintos productos. La susceptibilidad de la técnica RAPD hacia tales amplificaciones artefacto es particularmente elevada pues; (i) los fragmentos que genera son anónimos; (ii) las condiciones de hibridación entre el ADN molde y el cebador son muy permisivas; y(iii) numerosas variables de la amplificación pueden afectar al patrón de bandas (e.g. modelo del termociclador; temperaturas de hibridación; tiempos de desnaturalización, hibridación y extensión; rampas de temperatura; concentraciones de cebadores, ADN molde, dNTPs, Mg2+ y Taq polimerasa).. -. Dominancia. Los polimorfismos detectados con la técnica RAPD se expresan mayoritariamente como presencia/ausencia del producto amplificado (Weising et al. 1994) y por tanto muestran herencia dominante: la ausencia de una banda en un locus particular indica un individuo homocigoto (genotipo -/-), pero su presencia puede denotar tanto un individuo homocigoto (+/ +) como uno heterocigoto (+/-). En consecuencia, los marcadores RAPD proporcionan menos información por locus que otros marcadores con herencia codominante (e.g. alozimas), y las frecuencias alélicas pueden estimarse sólo si se asume equilibrio Hardy-Weinberg.. -. Variación en la intensidad de las bandas y límites de detección. Las bandas RAPD se puntuan normalmente como caracteres discretos (i.e. presencia/ausencia). Sin embargo, algunas bandas muestran una amplificación más consistente que otras y una determinada banda puede. 13.

(33) variar su intensidad en distintos individuos desde prácticamente invisible a muy brillante. Así, un determinado locus puede puntuarse como homocigoto nulo cuando en realidad está presente un producto amplificado débilmente. -. Comigración de bandas. Los marcadores RAPD pueden ser numerosos y estar poco espaciados en el gel de agarosa. De este modo, la amplificación de distintos locí (o incluso distintos alelos de un mismo locus) puede no ser distinguible atendiendo únicamente a su peso molecular.. -. Variación no mendeliana. Algunos productos RAPD pueden exhibir reproducibilidad óptima pero carecer de base genética al tener su origen en distintos artefactos (e.g. contaminación o degradación del ADN).. Estas limitaciones ocasionaron en muchos casos un rechazo absoluto de la técnica. Otros autores, sin embargo, opinan que dichos inconvenientes han sido exagerados y pueden solventarse en muchos casos con sólo seguir protocolos adecuados (Grosberg et al. 1996). 1.3.1.2. APLICACIONES DE LA TÉCNICA RAPD En el ámbito de la ecología molecular, la técnica RAPD se ha aplicado con resultados satisfactorios a distintas cuestiones (revisado en Hadrys et al. 1992), por ejemplo: -. Determinar la identidad taxonómica. La técnica RAPD puede generar marcadores de diagnóstico que permiten reconocer distintas categorías taxonómicas. Así, se ha empleado en diversos estudios para determinar (i) diferencias intraespecíficas en poblaciones de algas (Patwary et al. 1993, Meneses 1996, Faugeron et al. 2001), fanerógamas (Russell et al. 1993, Bauert et al. 1998, Cardoso et al. 1998, Huff & 6ûinn 1998, Jiménez et al. 2002, Maldonado San Martín et al. 2003), moluscos (Heipel et al. 1998, Holmes et al. 2003), crustáceos (Aubert & Lightner 2000) o vertebrados (Exadactylos et al. 2003), (ii) diferencias interespecíficas en algas (Dutcher & Kapraun 1994, Barreiro et al. 2006), musgos (Zouhair et al. 2000), fanerógamas (Anzizar et al. 1998, Nebauer et al. 2000) o moluscos (Crossland et al. 1993, André et al. 1999, Warnke et al. 2000), y(iii) diferencias entre cepas salvajes y cepas cultivadas (Graham et al. 1997, Belaj et al. 1999, Mailer & May. 14^.

(34) 1999, Gemas et al. 2000). -. Análisis de flujo genético interespecífico y especiación híbrida. Los marcadores RAPD pueden emplearse también para detectar híbridos en poblaciones o especies (Barker et al. 1996, Dawson et al. 1996, Perron & Bousquet 1997).. -. Estructura de poblaciones. En la literatura hay numerosos ejemplos de aplicación de marcadores RAPD al estudio de la estructura genética de poblaciones de algas (Bandeira & Nilsson 2001, Engelen et al. 2001), brioozoos (Hatton-Ellis et al. 1998, Goldson et al. 2001, Porter et al. 2002), crustáceos (Gouin et al. 2002), fanerógamas (Palacios & González Candelas 1997, Wolff et al. 1997, Jordano & Godoy 2000, Kri^ger et al. 2002), moluscos (de Wolf et al. 1998, Huang et al. 2000, Star et al. 2003, Holmes et al. 2004) y vertebrados (Haig et al. 1994, Vucetich et al. 2001, Maltagliati et al. 2003) entre otros.. -. Determinar el sexo. La técnica RAPD también puede proporcionar marcadores diagnóstico de sexo especialmente útiles en especies sin dimorfismo sexual (Lessells & Mateman 1998, Martínez et al. 1999).. -. Determinar resistencias. De igual modo, esta técnica ha sido ampliamente utilizada para identificar marcadores ligados a genes que confieren resistencia frente a infecciones y enfermedades, particularmente en plantas de cultivo (Michelmore et al. 1991, Paran et al. 1991, Banno et al. 1999, Fazio et al. 1999, Haymes et al. 2000).. 1.3.2. ADN MITOCONDRIAL Nuestro conocimiento científico del ADN mitocondrial es mayor que el existente para cualquier región de ADN nuclear de tamaño comparable (Avise 1994). EI genoma mitocondrial está constituido por una molécula de ADN de doble cadena típicamente circular; su longitud aproximada oscila entre 15000 y 20000 pares de bases (bp). En su interior se encuentra codificada la información de 37 genes: (i) 22 ARNs transferentes (tRNAs), (ii) 2 ARNs ribosómicos (rRNAs) y, (iii) 13 ARNs mensajeros (mRNAs) específicos de proteínas implicadas en la cadena de transporte electrónico y fosforilación oxidativa.. 15.

(35) Además, existe una región no codificante (aproximadamente 1000 bp) conocida como región control o D-loop donde se inicia la replicación y transcripción. EI orden de las distintas regiones y genes dentro de la molécula parece estable, si bien se han establecido algunas diferencias para ciertos animales superiores. Cuatro características de la molécula de ADN mitocondrial la convierten en una herramienta ideal para estudios de genética de poblaciones (Avise 1994, Féral 2002): -. Potiplasmia. EI número de copias de la molécula de ADN mitocondrial en una célula es elevado (cada mitocondria presenta típicamente entre 2 y 10 copias de su genoma; además, el número de tales orgánulos en el interior de una célula puede exceder el millar). Su estudio resulta así muy adecuado en especimenes degradados pues la probabilidad de encontrar porciones de ADN intactas es mayor para dicha molécula que para el genoma nuclear de copia única.. -. Homoplasmia. Este concepto hace referencia a la existencia de un único tipo de ADN mitocondrial en todos los tejidos de un individuo particular. Se ha sugerido que tal homogeneidad podría estar relacionada con cuellos de botella durante la oogénesis donde el número de mitocondrias se vería drásticamente reducido.. -. Herencia materna. EI ADN mitocondrial se transmite de modo no mendeliano, generalmente por vía materna (el citoplasma celular del zigoto ^londe se encuentran las mitocondrias- procede, en la mayoría de los casos, del óvulo). De este modo, la ausencia de recombinación permite su uso para trazar linajes maternos.. -. Tasa de mutación elevada. Por lo general, las secuencias de ADN mitocondrial evolucionan rápidamente y muestran así una alta resolución en estudios de genética de poblaciones. Varios motivos parecen explicar estas tasas de mutación elevadas (Wallace 1994): (i) ausencia de proteínas protectoras como las tipo histona existentes en el genoma nuclear, (ii) elevada exposición a radicales libres generados en el metabolismo oxidativo, (iii) sistemas genéticos de reparación menos eficientes que los del ADN nuclear, y(iv) gran susceptibilidad a los efectos de la deriva. lb. genética..

(36) 1.3.2.1. TÉCNICAS EMPLEADAS EN ESTUDIOS DE ADN MITOCONDRIAL A nivel intraespecífico, los polimortismos detectados en el ADN mitocondrial generalmente reflejan sustituciones puntuales (í.e. cambios en una única base) si bien se han registrado también fenómenos de inserción y/o deleción en algunos casos (e.g. Sotka et al. 2005). De este modo, el estudio de dicha variación para inferir la estructura genética de poblaciones se ha abordado empleando principalmente dos técnicas: RFLPs y secuenciación directa de fragmentos específicos. La técnica RFLPs se basa en el uso de endonucleasas de restricción: dichas enzimas son capaces de reconocer una secuencia particular de nucleótidos (por lo general 4-6 bp) y romper el ADN en dicho lugar. De este modo, dado que tales secuencias de reconocimiento y corte pueden aparecer o desaparecer a causa de mutaciones, distintos individuos producirán distintos patrones de bandas tras ser digeridos con un conjunto particular de enzimas. En un primer momento, la variación en el ADN mitocondrial se analizó utilizando la anterior aproximación sobre el total de la molécula. Estos estudios pioneros requerían así, como paso preliminar, aislar las mitocondrias y purificar su ADN (un proceso largo y laborioso que implica una centrifugación en un gradiente de cloruro de Cs). Posteriormente, el desarrollo de la PCR y la publicación de cebadores conservados filogenéticamente (ver Palumbi 1996) simplificaron enormemente la técnica, puesto que resultaba posible amplificar un fragmento de ADN mitocondrial específico que luego podía ser sometido directamente a digestión. Tal simplificación permitió una enorme proliferación de este tipo de estudios. Así, en el año 2000 los RFLPs constituían la aproximación más frecuente en los estudios de genética de poblaciones (Silva & Russo 2000).. Sin embargo, un nuevo avance en nuestros días (la secuenciación automática) va camino de poner fin a la dominancia de los RFLPs. Las bases de esta metodología se establecieron ya a finales de la década de 1970 (Maxam & Gilbert 1977, Sanger et al. 1977). Sin embargo, la ausencia de técnicas capaces de generar secuencias de ADN puras y homólogas limitó sus aplicaciones. De nuevo, el desarrollo de la i^R puso fin a tales inconvenientes y, como resultado, los estudios que emplean la secuenciación de fragmentos específicos de ADN mitocondrial (y en menor medida ADN nuclear) han. 17.

(37) crecido exponencialmente en et último par de décadas. La principal ventaja de este tipo de estudios es que la variabilidad genética se resuelve con la máxima resolución posible mientras que, por ejemplo, los estudios que emplean RFLPs sólo detectan diferencias en los lugares implicados en el reconocimiento y corte de las enzimas. Además, disponer de secuencias nucleotídicas permite recuperar información de niveles menos detallados (e.g. mapas de restricción, Geller et al. 1997) mientras que el proceso inverso no es factible. No obstante, la adquisición de tal elevada resolución se logra a expensas de un sacrificio en el número de loci e individuos estudiados ya que la técnica continúa siendo muy costosa. 1.3.2.2. UNA NUEVA DISCIPLINA CIENTÍFICA: LA FILOGEOGRAFÍA Los estudios de variación genética intraespecífica a nivel del ADN mitocondrial presentan dos características importantes: (i) habitualmente revelan numerosos haplotipos, ya que la molécula presenta una tasa evolutiva elevada y, (ii) dichos haplotipos pueden ordenarse filogenéticamente dado su particular modo de herencia (maternal y no recombinante). En consecuencia, la aparición de este tipo de estudios constituye no sólo una revolución metodológica sino también ideológica. Por primera vez se incorpora una perspectiva histórica a los estudios de genética poblacional, reconociendo así la profunda influencia que los procesos pasados pueden presentar sobre la distribución actual de las especies y sus linajes. De hecho, el impacto de las anteriores ideas es tan grande que incluso surge una nueva disciplina para acoger aquellos estudios que las contemplan: la filogeografía.. En el pasado reciente de nuestro planeta, los periodos glaciales probablemente son el evento histórico más relevante, de modo que las consecuencias de dichos periodos sobre la estructura genética contemporánea de las especies son un tema recurrente en estudios filogeográficos. Estas investigaciones han mostrado patrones muy coherentes para la flora y fauna terrestres del hemisferio norte en lo relativo a áreas de refugios glaciales, rutas de colonización postglacial y distribución geográfica de linajes (revisado en Hewitt 1999, Hewitt 2000, Hewitt 2004). En el medio marino, donde este tipo de estudios sólo ha comenzado a recibir una atención comparable en los últimos años, dicha concor-. 18.

(38) dancia parece reducirse a algunos ejemplos en el Indo-Pacífico y en las costas atlánticas de Norteamérica (Avise 1992, Wares & Cunningham 2001). Sorprendentemente, el pasado filogeográfico de los organismos del Atlántico costero Europeo sigue siendo poco conocido.. 19.

(39) 2. CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILO DE ESTAÑO (TBT) 2.1. EL PROBLEMA DE LA BIOINCRUSTACIÓN Y SU PREVENCIÓN Se conoce con el nombre de bioincrustación (del inglés biofouling) al conjunto de organismos que crece sobre estructuras sumergidas de origen antrópico: cascos de las embarcaciones, plataformas petrolíferas o de gas, boyas, emisarios marinos, instrumentos de investigación oceanográfica, equipamiento relacionado con la industria de la acuicultura e, incluso, los propios organismos objeto de cultivo (Omae 2003). Tal asentamiento y proliferación de organismos epibiontes genera distintos problemas. Por ejemplo, en las estructuras estacionarias se aceleran los procesos de corrosión mientras que en las embarcaciones se incrementa la rugosidad del casco ocasionando mayor fricción y gasto de combustible. Todo ello se traduce en importantes pérdidas económicas (Bennett 1996, Evans et al. 1998). EI desarrollo de métodos para combatir la bioincrustación se remonta ya a fenicios y cartagineses, quienes revestían con láminas de cobre los cascos de sus embarcaciones (Champ & Seligman 1996). Dichos recubrimientos siguieron utilizándose hasta el siglo XVIII, momento en el que comienzan a construirse buques de hierro y los recubrimientos dejan de ser efectivos ya que la asociación de cobre metálico con hierro ocasiona que el primero pierda su capacidad biocida. Ya en el siglo XIX se comercializan las primeras pinturas antifoulíng que consisten básicamente en resinas impregnadas con sulfato de cobre. Durante la primera mitad del siglo XX continúa la búsqueda de nuevas formulaciones y son patentadas otras pinturas basadas en plomo o mercurio. Sin embargo, su uso es prohibido en diversos países debido a la persistencia ambiental de estos metales (Champ & Pugh 1987). Así, el cobre continúa siendo el principal biocida de los tratamientos antiincrustantes hasta principios de la. 20. década de 1960 cuando irrumpen en el mercado las soluciones basadas en organoestánnicos.

(40) (principalmente tributilo de estaño -TBT- y, en menor medida, trifenilo de estaño -TPhT-). Las pinturas antifouling que contienen dichos compuestos muestran una serie de ventajas sobre los tratamientos tradicionales de cobre: (i) mayor eficacia y duración de su efecto; (ii) no provocan corrosión galvánica cuando se aplican a estructuras de aluminio; (iii) amplia gama de colores (el TBT es un compuesto incoloro); y(iv) bajos costes de fabricación. Estas ventajas hacen que en sólo una década se utilicen de modo generalizado por todo el planeta (de Mora 1996). Reflejo de esta enorme aceptación es la evolución temporal de su producción mundial: tan sólo 2000 toneladas en 1960 pero aproximadamente 16000 diez años después y unas 40000 a mediados de la década de 1980 (Omae 2003). 2. 2. LOS DAWOS COLATERALES DEL TBT En un primer momento, los compuestos organoestánnicos parecieron muy convenientes desde el punto de vista ambiental ya que eran degradados fácilmente por la luz ultravioleta y los microorganismos (Omae 2003). Sin embargo, pronto se comenzó a sospechar que su liberación al medio acuático podía presentar un impacto negativo sobre organismos no diana. Así, a finales de la década de 1960 se advierte del peligro que conlleva el empleo de estas pinturas en áreas próximas a instalaciones de acuicultura canadienses (Thomas 1969). No obstante, su uso continuó incrementándose durante la década de 1970. La primera evidencia clara de los efectos perjudiciales del TBT sobre organismos no diana se establece a principios de la década de 1980 en la bahía francesa de Arcachon, un área ostrícola de importancia mundial con una producción anual estimada en 10000-15000 toneladas. A finales de la década de 1960 tienen lugar en esta área los primeros registros de individuos de Crassostrea gigas que exhiben un engrosamiento anormal de la concha, una anomalía que afecta de modo considerable a la calidad del producto final destinado al consumo humano (Fig. 3). Dicha deformación se generaliza a partir de 1974, afectando no sólo a todos los parques de cultivo sino también a un porcentaje muy elevado de sus individuos. A la situación anterior se une una caída drástica de las puestas. Como consecuencia, la industria ostrícola de la zona sufre a principios de la década de 1980 un ^^.

(41) importante colapso con pérdidas que superan los 150 millones de dólares. Dichos acontecimientos son relacionados por Alzieu et al. (1982) con el lixiviado de TBT de las pinturas antiincrustantes. Esta relación se verá confirmada en años posteriores con la publicación de otros trabajos en diversas áreas geográficas: Inglaterra (Waldock & Thain 1983), Estados Unidos (Stephenson et al. 1986), Japón (Okoshi et al. 1987) o Australia (Batley et al. 1989).. ,. ^yL1^.. V.-. L..,J. VYf IVJ .,..,M^ V^....,V ...... .v.. ....,^. ,v^ .a...v ...v. Crassostrc.a grgas: (aj índividuo r:.ormal; (bj índivic:uo mostrando anor~âlías en la calrîficcción.. Es también a principios de la década de 1980 cuando se vincula la contaminación por TBT con otro fenómeno observado durante la década anterior en distintos puntos del planeta: la superimposición de caracteres sexuales masculinos sobre las hembras de algunos gasterópodos dioicos (i.e. imposex, Smith 1971). De nuevo, las observaciones obtenidas relacionan de modo concluyente ese imposex con el TBT procedente de las pinturas antiincrustantes (Smith 1981 c, 1981 a, 1981 b) y, al igual que en el caso de la ostra, a estos trabajos pioneros les suceden en poco tiempo otros en distintas regiones del mundo (Gibbs & Bryan 1996).. 2^.

(42) 2. 3. EL IMPOSEX EN GASTERÓPODOS MARINOS 2.3.1. PRIMERAS OBSERVACIONES ACERCA DEL IMPOSEX La mayoría de los gasterópodos marinos muestran sexos separados y permanentes a lo largo de la vida del individuo (i.e. especies dioicas). Hasta finales de la década de 1960, la distinción de machos y hembras en este grupo requería un simple examen macroscópico con la finalidad de detectar la presencia o ausencia de pene. Esta situación cambió radicalmente en torno a 1970: una estructura similar a un pene en morfología y posición se registra de modo independiente y casi simultáneo en hembras de 4 especies dioicas de regiones geográficamente distantes entre sí: Nucella lapillus en Inglaterra (Blaber 1970), Ocenebra erinacea en Francia (Poli et al. 1971), llyanassa obsoleta en la costa atlántica de Norteamérica (Smith 1971) y Thais emarginata en la costa pacífica de Norteamérica (Houston 1971). De hecho, las observaciones en /, obsoleta no se limitan únicamente a la presencia de un pene y se establece que las hembras afectadas también muestran otros dos rasgos característicos del sexo opuesto: (i) un conducto que sigue la misma trayectoria que el vaso deferente masculino y(ii) un oviducto convolucionado que refleja la morfología típica de la vesícula seminal; un fenómeno que es denominado en su conjunto con el término imposex por B.S. Smith, autor de estas observaciones (Smith 1971). Investigaciones posteriores sobre esta especie muestran que la frecuencia de individuos afectados se incrementa con la proximidad a áreas de tráfico marítimo intenso (Smith 1981 b) y, poco tiempo después, experiencias de exposición en el laboratorio vinculan de modo inequívoco dicha masculinización con el TBT procedente de las pinturas antiincrustantes (Smith 1981 a, 1981 c). Sin embargo, este fenómeno no recibe mayor atención una vez establecido el agente causal, puesto que el desarrollo de pene y conducto deferente en las hembras de este gasterópodo no parece perturbar de modo alguno el normal funcionamiento de los individuos afectados. Cinco años después de que la masculinización de hembras de Ilyanassa obsoleta se relacionase con el lixiviado de TBT, la investigación se retoma en Inglaterra, donde se observa que el imposex reduce severamente la capacidad reproductiva de las poblaciones de Nucella lapillus (Bryan et al. 1986). Las Investigaciones preliminares muestran que el imposex exhibe tres grados de desarrollo dosis-.

(43) dependientes en esta especie (Fig. 4; Gibbs & Bryan 1986): Estadio temprano: surgen las secciones proximal (í.e. en las inmediaciones de la papila genital) y distal (i.e. bajo el tentáculo ocular derecho, en el área donde los machos desarrollan el pene) del conducto deferente que se extienden progresivamente hasta fusionarse en un punto intermedio; además, aparece un pequeño pene. Estadio intermedio: el pene incrementa su longitud alcanzando en muchos casos el tamaño habitual en los machos de la especie, i, e. 2.5 - 4 mm. Estadio final: el conducto deferente continúa su crecimiento Ilegando a bloquear la apertura del oviducto (i.e. papila genital femenina). (a). (c). Fígura 4.- Prímeras observaciones acerca deI imposex . Estadios de desarrollo del imposex en Nucelia laprllus (Gibbs & Sryan 198á): (a) macho; (b) hembra mostrando un estadio intermedio de imposex; (c) hembra mostrando un estadia final de imposex. ,^,breviaturas: a{ano), gc (glándula de !a capsuia), p(pene), pg (papila genital), pr (prc^stata): r (recto) y vd (vaso deterente). Los estadios temprano e intermedio no presentan consecuencias para la reproducción del individuo. Sin embargo, el bloqueo de la papila genital femenina en el estadio final impide la deposición de cápsulas y las hembras afectadas sufren así una esterilidad funcional. Además, puesto que la formación de más cápsulas continúa, éstas siguen acumulándose dentro del individuo pudiendo provocar su muerte. EI estudio de poblaciones naturales y diversas experiencias de exposición (en el campo 0 en el laboratorio) permiten establecer también en Nucella lapillus una inequívoca relación entre impo-. 24. sex y contaminación con TBT. Se observa además que tal masculinización no sólo tiene lugar de un.

(44) modo dosis-dependiente, sino que también se inicia a concentraciones ambientales de TBT extremadamente bajas (<0.5 ng TBT-Sn I-'), por debajo de los límites de detección analítica de la época (Bryan et al. 1986, Gibbs & Bryan 1986, Bryan et al. 1987). A finales de la década de 1980, el imposex comienza a estudiarse en otros gasterópodos. Los resultados de esos estudios son abrumadores reflejando la ubicuidad de la contaminación por TBT. Así, en 1991 el fenómeno se ha visto ya en 69 especies (Fioroni et al. 1991). Estas investigaciones revelan que su desarrollo sigue una pauta muy similar en todas ellas, si bien se detectan diferencias en sensibilidad (í.e. concentración umbral que desencadena la respuesta) y consecuencias finales (í.e. esterilidad funcional). Uno de los gasterópodos más susceptibles al efecto masculinizante del TBT es Nucella lapillus. En este animal la imposición de pene y vaso deferente tiene lugar para concentraciones de TBT en agua de tan sólo 1-2 ng TBT-Sn I-', niveles de aproximadamente 5 ng TBT-Sn I^'ocasionan esterilidad y a concentraciones que superan los 25 ng TBT-Sn I-' se inicia la espermatogénesis (Gibbs et al. 1988). En el extremo opuesto destacan especies como el buccínido neozelandés Cominella glandiformis. Este gasterópodo no parece desarrollar imposex incluso tras ser expuesto durante 150 días a concentraciones de TBT tan elevadas como 500-600 ng TBT-Sn I-' (Smith & McVeagh 1991). De hecho, el imposex muestra consecuencias negativas para la reproducción principalmente en miembros de la familia Muricidae: e.g. N. lapillus (Gibbs & Bryan 1986), Nucella lamellosa (Bright & Ellis 1990), Nucella lima (Short et al. 1989), Purpura haustorium (como Haustrum haustorium, Stewart et al. 1992), Hexaplex trunculus (Axiak et al. 1995), Thais orbíta (Stewart et al. 1992), Thais clavigera (Horiguchi et al. 1995) o Urosalpinx cinerea (Gibbs et al. 1991 b). Se sugiere que este comportamiento diferencial es debido a que tracto genital masculino y femenino en murícidos muestran la misma distribución espacial dentro de la cavidad del manto (a diferencia de lo que ocurre en otras familias de neogasterópodos), de modo que la imposición del primero interrumpe el normal funcionamiento del segundo (Fig. 5, Gibbs & Bryan 1996). EI proceso subyacente que impide la reproducción de las hembras afectadas es determinado tan sólo en una pequña fracción de estas especies, pudiendo distinguirse dos mecanismos principales (Fig. 5):.

(45) -. EI crecimiento del vaso deferente en hembras puede Ilegar a ocluir la papila genital e impedir la deposición de cápsulas. Esto ocurriría en aquellas especies donde próstata y glándula de la cápsula ocupan idéntica posición dentro de la cavidad del manto (e.g. Nucella spp.). Este proceso puede implicar incluso una reorganización más profunda del oviducto anterior femenino. Por ejemplo, bajo condiciones de contaminación severa el tejido de la bursa copulatrix puede ser reemplazado por tejido prostático.. -. Estadios avanzados de imposex en hembras de otras especies (e. g. O. erinacea y U. cinerea) implican una glándula de la cápsula y una bursa copulatrix rasgadas longitudinalmente, lo que impide la cópula y formación de cápsulas. De nuevo, este proceso es un reflejo del correspondiente tracto genital masculino. Los machos de estas especies conservan un rasgo primitivo de los neogasterópodos por el cuál la sección posterior de la próstata muestra una apertura longitudinal que conecta su lumen con la cavidad del manto. Nucella lapillus:. Ocenebra erinacea:. Figura 5.- Primeras observaciones acerca del imposex. Consecuencias del imposex en especies donde tracto genital masculino y femenino presentan idéntica disposición dentro de la cavidad del manto, Abreviaturas: apertura de la próstata (ap), giándula de la cápsula (gc), pene (p), próstata (pr), recto (r) y vaso deferente (vd). Adaptado de Gibbs & Bryan (1996).. 2.3.2. EL IMPOSEX Y LA BIOMONITORIZACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN POR TBT EI imposex en neogasterópodos muestra una serie de características que lo convierten en un. 26. excelente biomarcador de exposición a la contaminación por TBT:.

(46) -. Es una respuesta altamente sensible. Su inicio ocurre a concentraciones de contaminante extremadamente bajas.. -. Su desarrollo ocurre de un modo dosis-dependiente. Resulta así posible no sólo determinar su presencia sino también cuantificar su intensidad.. -. Es una respuesta específica. Ningún otro agente ambiental ha demostrado producir esta anomalía (al menos a concentraciones ambientalmente relevantes).. -. A diferencia de los análisis químicos que determinan concentraciones del contaminante en diversas matrices ambientales, la evaluación del imposex no requiere de material costoso. Además, dicha respuesta constituye una medida de gran significado biológico que revela de un modo directo los efectos del contaminante sobre un ecosistema dado a nivel individual, poblacional e incluso comunitario.. -. Finalmente, medir las concentraciones del contaminante puede estar afectado por procesos puntuales mientras que esta respuesta integra los aportes que sufre un área dada a una escala espacial y temporal mayor.. Así, las investigaciones sobre el binomio imposex-TBT no se han detenido tras las primeras publicaciones que tenían por objetivo registrar la incidencia y características de la respuesta en las distintas especies. Desde finales de la década de 1980 hasta la actualidad el imposex en diversos gasterópodos ha sido extensamente utilizado para inferir los niveles ambientales del contaminante y su evolución temporal en distintas áreas geográficas. De hecho, el imposex constituye el primer efecto biológico específico obligatorio en los estudios de vigilancia requeridos por OSPAR (Convention for the Protection of the Marine Environment of the North-EastAtlantic; www.ospar.org) mientras que en los estudios de monitorización relativos a otros contaminantes basta con determinar sus concentraciones en ciertos organismos (generalmente Mytilus spp.) y sedimentos. Los índices de imposex empleados con mayor frecuencia en estudios de biomonitorización son los que cuantifican el grado de desarrollo de pene y conducto deferente: ^%.

(47) Índice del tamaño relativo del pene (Relat'Ne Penis Síze Index o RPSI). Este índice representa el volumen medio del pene de las hembras de una población expresado como porcentaje del de los machos de la misma población (100 x[longitud media del pene de las hembras]3 / [longitud media del pene de los machos]3). Su formulación se fundamenta en el hecho de que el desarrollo del pene en hembras tiene lugar de un modo dosis-dependiente pero su tamaño no puede compararse sin más al depender del tamaño corporal que, a su vez, varía enormemente entre poblaciones (e.g. los individuos de sitios expuestos al oleaje suelen ser más pequeños que los de sitios protegidos). EI RPSI se propuso originalmente en el murícido Nucella lapillus, una especie cuyo pene presenta una morfología columelar, y por ello cuantifica su desarrollo atendiendo a su volumen (Gibbs et al. 1987). Su posterior aplicación a otras especies ha requerido pequeñas modificaciones. Así, en aquéllas donde el crecimiento del pene tiene lugar preferentemente en un eje se ha optado por medir simplemente su longitud y calcular el denominado índice de la longitud relativa del pene (Relat'^ve Penis Length Index o RPLI): e.g. Nassarius reticulatus (Stroben et al. 1992b, Bryan et al. 1993, Barreiro et al. 2001, Barroso et al. 2002), llyanassa obsoleta (Bryan et al. 1989, Curtis & Kinley 1998) o Lepsiella scobina (Stewart et al. 1992). En otras especies se ha sugerido incluso que el índice más adecuado es aquél que tiene en cuenta el área o superficie de este órgano: e.g. Thaís spp. (Wilson et al. 1993). Índice de la Secuencia del Vaso Deferente (Vas Deferens Sequence Index o VDSI). Este índice calcula el valor medio de los varios estadios de desarrollo de imposex que exhiben las hembras de una población. De nuevo, este índice se propuso originalmente para el murícido Nucella lapillus donde Gibbs et al. (1987) describieron un esquema general de evolución del imposex con seis estadios de desarrollo (Fig. 6): hembra normal no afectada (estadio 0), desarrollo de la sección proximal del vaso deferente (estadio 1), desarrollo inicial del pene (estadio 2), desarrollo de la sección distal del vaso deferente e incremento de la longitud del pene (estadio 3), fusión de las secciones distal y proximal del vaso deferente y tamaño del pene comparable al de un macho (estadio 4), proliferación del tejido del vaso deferente en las proximidades de la papila. 28.

(48) genital ocasionando un desplazamiento y/o bloqueo del gonoporo femenino (estadio 5) y, finalmente, acúmulo de cápsulas abortadas en el interior de la glándula de la cápsula como consecuencia del anterior bloqueo (estadio b). Posteriormente, el principio general del esquema de evolución del imposex y del índice VDSI se ha aplicado a otras especies tras las oportunas modificaciones: e. g. Nucella lima (Short et al. 1989), Thais haemastoma (Spence et al. 1990), LepsieIla scobina (Stewart et al. 1992) o Nassarius retículatus (Stroben et al. 1992b, Barreiro et al. 2001).. Fígura ó.- EI imposex y la biomonitorización de la contaminación por TBT. Estacîos de :êsarrollo dei imposex en NuceJla iaprli±^s {Gibbs et al. ? 987). Abreviaturas: a(ana}, ca (eápsuias abortadas), gc {glándula de la c^psula), p (pene), pg (pap:.a genitai), v(vulva) y vd (vc^so deferentel,.

(49) Además de los dos índices anteriores, en determinadas especies bioindicadoras es posible calcular también otros índices basados en ciertas peculiaridades de la respuesta en el organismo en cuestión: -. Porcentaje de hembras estériles. Pese a que existe una relación evidente entre VDSI y restricción de la fertilidad, puede resultar útil calcular el porcentaje de hembras estériles y tener así una idea directa de la potencial capacidad reproductiva de una población. Obviamente, el cálculo de este índice está limitado a aquellas especies donde el imposex interrumpe el normal funcionamiento del tracto genital femenino.. -. Índice del grado de convolución del oviducto. Este índice refleja la masculinización que sufre la porción gonadal del oviducto de ciertos nasáridos (e. g. llyanassa obsoleta: Smith 1980, Nassarius retículatus: Barreiro et al. 2001, Barroso et al. 2002, o Gyclope neritea: Quintela et al. 2006): oviductos rectos (condición normal en hembras no afectadas) reciben el valor de 0, oviductos suavemente convolucionados son puntuados como 1, y a aquéllos fuertemente convolucionados (imitando la vesícula seminal masculina) se les asigna el valor de 2.. 2.3.3. EXTENSIÓN GEOGRÁFICA Y TAXONÓMICA DEL IMPOSEX La extensa información recabada durante los últimos 20 años muestra que el imposex es un fenómeno global y ampliamente extendido que afecta a decenas de gasterópodos (las revisiones más recientes elevan a cerca de 200 el número de especies que exhiben esta anomalía, Shi et al. 2005). Los efectos sobre las poblaciones no sólo se registran en zonas portuarias y estuáricas, sino también en áreas de costa abierta cercanas a rutas de tráfico marítimo (ten Hallers-Tjabbes et al. 1994, Chiavarini et al. 2003, Gomez-Ariza et al. 2006). A causa de su extrema sensibilidad, Nucella lapíllus exhibe poblaciones afectadas en todo su rango de distribución europeo: e.g. Noruega (Folsviksrk et al. 1999), Islandia (Svavarsson & Skarphéndinsdóttir 1995, Svavarsson 2000), Países Bajos (Ritsema et al. 1991), Irlanda (Minchin et al. 1996, Minchin & Minchin 1997), Inglaterra (Gibbs et al. 1987, Gibbs et al. 1991 a, Douglas 1993), Francia (Huet et al. 1996, Huet et al. 2004), España (Ruiz et al. 1998, Barreiro et. 30. al. 1999) o Portugal (Santos et al. 2000, Santos et al. 2002a, Galante-Oliveira et al. 2006). En esta espe-.

(50) cie se ha Ilegado al extremo de que el imposex es la norma y resulta realmente complicado encontrar poblaciones no afectadas. De hecho, incluso en especies menos sensibles como Nassarius reticulatus, las poblaciones no afectadas constituyen una excepción a lo largo de las costas europeas (Stroben et al. 1992b, Bryan et al. 1993, Huet et al. 1995, Gibbs et al. 1997, Barreiro et al. 2001, Pessoa et al. 2001, Barroso et al. 2002, Magnusson & Granmo 2004, Santos et al. 2004, Barroso et al. 2005, Ruiz et al. 2005, Sousa et al. 2005, Rato et al. 2006, Wirzinger et al. 2007). Fuera del continente europeo se han registrado poblaciones de distintos gasterópodos que exhiben imposex en Canadá (Tester & Ellis 1995, Prouse & Ellis 1997, Horiguchi et al. 2004, Viglino et al. 2006), Alaska (Short et al. 1989), Estados Unidos (Bryan et al. 1989, Curtis & Kinley 1998, Evans et al. 2001, Mann et al. 2006), Chile (Gooding et al. 1999), Argentina (Penchaszadeh et al. 2001), Brasil (Fernandez et al. 2004), Japón (Horiguchi et al. 1997, Horiguchi et al. 1998, Horiguchi et al. 2000), Corea (Shim et al. 2000, Cho et al. 2006), Taiwan (Liu et al. 1997, Hung et al. 2001), Tailandia (Swennen et al. 1997, Bech 1999, 2002a, 2002b), Singapur (Tan 1997, 1999), Indonesia (Evans et al. 1995), India (Vishwa Kiran & Anil 1999), Sudáfrica (Marshall & Rajkumar 2003), Australia (Kohn & Almasi 1993, Nias et al. 1993, Wilson et al. 1993, Reitsema & Spickett 1999, Rees et al. 2001, Gibson & Wilson 2002) o Nueva Zelanda (Stewart et al. 1992) entre otros. 2.3.4. DISRUPCIÓN ENDOCRINA Y EL MECANISMO DEL IMPOSEX EI imposex representa un caso paradigmático de la acción de un contaminante (el TB17 sobre la homeostasis y funcionamiento del sistema endocrino de un organismo (los gasterópodos). Los contaminantes que interfieren con el sistema hormonal constituyen un problema ambiental destacado y creciente puesto que a partir de la Segunda Guerra Mundial se ha liberado al medio ambiente un gran número y cantidad de tales sustancias (Matthiessen 2003). En este contexto, el binomio imposexTBT ha dejado de ser un fenómeno aislado para integrarse en una línea de investigación, la disrupción endocrina, que persigue caracterizar los compuestos químicos que alteran el sistema endocrino de los organismos y descubrir su modo de funcionamiento. ^^.

(51) Pese a que el imposex en gasterópodos prosobranquios se considera uno de los ejemplos mejor documentados de disrupción endocrina en invertebrados acuáticos (Matthiessen & Gibbs 1998), el mecanismo que desencadena dicha respuesta no ha sido establecido aún con certeza. Algunas de las teorías propuestas se resumen brevemente a continuación (revisado en Oehlmann et al. 2007): -. Hipótesis de la inhibición de la aromatasa (Spooner et al. 1991, Stroben et al. 1991): el TBT inhibiría la actividad de la aromatasa dependiente del citocromo P-450 provocando un incremento de los niveles endógenos de testosterona.. -. Hipótesis de la excreción de testosterona (Ronis & Mason 1996): el TBT bloquearía la conjugación de la testosterona con radicales sulfato disminuyendo considerablemente la eliminación metabólica de este esteroide.. -. Hipótesis de los efectos del TBT sobre los niveles de testosterona libre vs. testosterona esterificada (Gooding & LeBlanc 2002): el TBT interrumpiría la ruta metabólica de esterificación de la testosterona incrementando los niveles endógenos de testosterona activa.. -. Hipótesis de los efectos sobre el sistema de hormonas peptídicas (Oberddrster & McClellanGreen 2000): el TBT actuaría como una neurotoxina ocasionando una liberación anormal de hormonas peptídicas relacionadas con el desarrollo sexual.. -. Hipótesis de los efectos sobre el Receptor Retinoideo X(Nishikawa et al. 2004, Nishikawa 2006): el TBT se uniría a receptores de la superfamilia de las hormonas esteroideas induciendo la transcripción de genes relacionados con el desarrollo de los órganos sexuales.. La hipótesis de la inhibición de la aromatasa ha recibido numerosos apoyos experimentales desde su propuesta a principios de la década de 1990 (Schulte-Oehlmann et al. 1995, Bettin et al. 1996, Santos et al. 2002b, Barroso et al. 2005, Santos et al. 2005) y, de este modo, algunos autores la consideran actualmente la hipótesis mejor fundada (Matthiessen & Gibbs 1998, Oehlmann et al. 2007). La relevancia biológica de la hipótesis de la excreción de testosterona ha sido cuestionada debido principalmente a las elevadas concentraciones de TBT necesarias a fin de desencadenar dicho mecanismo. 3 2'. fisiológico (Oehlmann et al. 2007). La validez de la hipótesis de los efectos del TBT sobre los niveles de.