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Biología Molecular y Celular

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Academic year: 2021

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Índice General

Inicio

Biología Molecular y Celular

Salir

Luis Enjuanes

Laboratorio Coronavirus

Mariano Esteban

Poxvirus y vacunas

Lluís Montoliu José

Modelos animales por manipulación genética

José Ramón Naranjo

Análisis funcional del represor

transcripcional DREAM

Amelia Nieto

Mecanismos de interacción entre el virus

de la gripe y la célula infectada

Juan Ortín

Transcripción y replicación del RNA del virus de la gripe

Dolores Rodríguez Aguirre

Caracterización molecular y epidemiología

de torovirus

José F. Rodríguez Aguirre

Biología molecular de birnavirus

Antonio Alcamí

(Investigador visitante)

Modulación de la respuesta inmune por virus

Estructura cristalina de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus de la bursitis infecciosa.

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Índice Sección

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Inicio

Laboratorio Coronavirus

Resumen

Los coronavirus tienen un genoma RNA de cadena sencilla y positiva con un tamaño de 30 kb, y son responsables de infecciones en las mucosas del trac-to respiratrac-torio y entérico. Los corona-virus tienen un alto impacto en salud humana y animal. Nuestro grupo está interesado en las bases moleculares de la replicación y transcripción, ensambla-je e interacción virus-huésped utilizan-do como modelos experimentales el coronavirus de la gastroenteritis porci-na transmisible (TGEV) y el virus pro-ductor del síndrome respiratorio agudo y severo (SARS-CoV). La información derivada de estos estudios se está apli-cando a la ingeniería de vectores basa-dos en genomas de coronavirus. La replicación y transcripción, así como las interacciones virus-huésped, están mediadas por uniones entre el

RNA y proteínas virales y del huésped, y por interacciones proteína–proteína. Nosotros hemos postulado que la replicación y transcripción del genoma de coronavirus implica la interacción de los extremos 5’ y 3’ del genoma y estamos comprobando esta hipótesis e identificando las proteínas virales y celulares implicadas en este proceso. La transcripción de coronavirus requiere la síntesis discontinua de RNA, mediante la que el líder se une a las secuencias codificantes, en un pro-ceso de selección de copia mediada por recombinación de RNA asistida por homología de secuencias. Basándonos en una colección de datos generados por genética reversa, nues-tro laboratorio ha propuesto un mecanismo de transcripción.

Hemos demostrado que la extensión del apareamiento entre la cadena naciente de RNA y secuencias del líder regulan la cantidad de RNA sub-genómico. No obstante, existen meca-nismos reguladores adicionales que modulan la cantidad de RNA subge-nómico producido, tales como las interacciones RNA–proteína. Un obje-tivo importante de nuestro programa es el estudio del papel de las chapero-nas de RNA en el cambio de molde durante la síntesis de RNA viral. Hemos demostrado que las proteínas N de coronavirus son chaperonas de RNA.En la segunda área de trabajo del grupo, interacción virus-huésped, hemos postulado que proteínas espe-cíficas del virus, tales como la proteína N que se ha encontrado en el núcleo de la célula, y proteínas virales no

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Figura 1: Las chaperonas de RNA posiblemente están implicadas en el cambio de molde durante la trans-cripción de coronavirus. El panel de la izquierda muestra los elementos implicados en el cambio de molde durante la transcripción en corona-virus. TRS-B y TRS-L, secuencias que regulan la transcripción, situadas en la zona codificante de un gen o des-pués del líder, respectivamente. En el panel de la derecha se representa el umbral mínimo de energía que se requiere sobrepasar durante el cam-bio de molde, y que se reduce mediante la colaboración de la cha-peronas de RNA.

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Laboratorio Coronavirus

esenciales, modulan estas

interaccio-nes. Utilizando estrategias de genética reversa, basadas en la construcción de dos clones cDNA infectivos produci-dos en nuestro laboratorio para los virus TGEV y SARS-CoV, estamos estudiando la influencia de los genes de coronavirus en la atenuación de estos virus, sobre el ciclo celular, o sobre funciones relevantes del hués-ped tales como la respuesta inmune. La información generada por proteó-mica y genóproteó-mica funcional será esen-cial para estos estudios. Hemos des-arrollado una vacuna recombinante que previene el SARS.).

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Figura 2: Análisis ultraestructural de un mutante de deleción del SARS-CoV que carece de la proteína E (rSARS-CoV-∆E), al infectar célulasVero E6. CélulasVero E6 se infectaron con el virus recombinante rSARS-CoV y el mutante de deleción rSARS-CoV-∆E y se procesaron para microscopía electrónica de cortes ultrafinos. El panel de la izquierda muestra el citoplasma de una célula infectada, conteniendo sacos de Golgi llenos de partículas virales virulentas. El panel de la derecha muestra el citoplasma de una célula infectada con el mutante de deleción, conteniendo los sitios de ensamblamiento del virus defectivo. Este mutante está atenuado in vivo y proporciona protección completa frente al SARS-CoV virulento.

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Enjuanes, L., Sola, I., Alonso, S., Escors, D. and Zúñiga, S. (2005). Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression. Curr. Top. Microbiol. & Immunol.

287, 161-197.

Sola, I., Moreno, J. L., Zúñiga, S. and Enjuanes, L. (2005). Role of nucleotides immediately flanking the transcription-regulating sequence core in coronavirus subgenomic mRNA synthesis. J. Virol. 79, 2506-2516.

Galán, C., Enjuanes, L. and Almazán, F. (2005). A point mutation within the replicase gene differentially affects coronavirus genome versus minigenome replication.

J. Virol. 79, 15016-15026.

Almazán, F., De Diego, M. L., Galán, C., Escors, D., Álvarez, E., Ortego, J., Sola, I., Zúñiga, S., Alonso, S., Moreno, J. L., Nogales, A. Capiscol, M. and Enjuanes, L. (2006).

Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis s. J. Virol. 80, 10900-10906.

Enjuanes, L., Almazan, F., Sola, I. and Zuñiga, S. (2006). Biochemical aspects of coronavirus replication and virus host-interaction. Ann. Rev. Microbiol. 60, 211-230.

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Investigadores Postdoctorales: Fernando Almazán Isabel Sola Sonia Zúñiga Enrique Álvarez Investigadores Predoctorales: Carmen Galán Carmen Capiscol Jose L. Moreno Marta L. De Diego Aitor Nogales Jazmina L. González Beatriz Gil-Araujo Técnicos de Investigación: Carlos M. Sánchez Margarita González

Jefe de Línea:

Luis Enjuanes

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Poxvirus y vacunas

Resumen

Los objetivos fundamentales de nuestro laboratorio van dirigidos a comprender las bases moleculares en la patogenia de agentes infecciosos y su relación con el huésped, así como utilizar estos conoci-mientos para desarrollar vacunas que puedan ser efectivas en el control de enfermedades como SIDA, hepatitis C, Malaria y Leishmaniasis. Como sistema modelo de agente infeccioso y como vector de expresión, utilizamos el virus vaccinia que pertenece a la familia de los poxvirus.

Logros obtenidos en el período 2005-2006 fueron:

1) Definida la estructura de la forma infectiva mayoritaria del virus vaccinia (IMV) a una resolución de 4-6 nm por criomicroscopía y microscopía electrónica con reconstrucción

topográfica (Cyrklaff, M et al 2005). 2) Identificado el gen que codifica la proteína responsable del Síndrome de Wiskott-Aldrich como necesaria para la patogénesis del virus vaccinia facili-tando la salida del virus de la célula (Guerra et al, 2005).

3) Demostrado cómo los alfavirus (Semliki y Sindbis) escapan a la acción de la proteína dependiente de RNA bicatenario, PKR, por un novedoso mecanismo que evita los requerimien-tos del factor de iniciación eIF-2 alfa (Ventoso et al, 2006), identificado el factor transcripcional ATF-3 como necesario para la inducción de apop-tosis por PKR (Guerra et al, 2006), demostrado acción antiviral del gen supresor de tumores ARF por mediación de PKR y su liberación de

nucleofosmina (García et al, 2006); hemos escrito un artículo de revisión sobre el impacto de PKR en la biología celular (García et al, 2006).

4) Hemos desarrollado vacunas poten-ciales contra leishmaniasis (Pérez-Jiménez et al, 2006) y frente al VIH/SIDA (Gómez et al, 2006a, 2006b). 5) Los resultados obtenidos han dado lugar a la solicitud de tres patentes.

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Figura 1: Mecanismo de acción de la proteína quinasa PKR, un regula-dor antiviral y antiproliferativo.

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Cyrklaff, M., Risco, C., Fernández, J. J., Jiménez, M.V., Esteban, M., Baumeister, W. and

Carrascosa, J.L. (2005). Cryo-Electron tomography of vaccinia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 2772-2777.

Ventoso, I., Sanz, M. A., Molina, S., Berlanga, J. J., Carrasco, L. and Esteban, M. (2006). Translational resistance of late alphavirus mRNA to eIF-2 alfa phosphorylation: a strategy to overcome the antiviral effect of protein kinase PKR. Genes Development 20, 87-100. Guerra, S., López-Fernández, L. A., García, M. A., Zaballos, A. and Esteban, M. (2006). Human gene profiling in response to active protein kinase PKR in infected cells: involvement of the transcription factor ATF-3 in PKR-induced apoptosis. J. Biol. Chem 281, 18734-18745. García, M. A., Gil, J.,Ventoso, I., Guerra, S., Domínguez, E., Rivas, C. and Esteban, M. (2006). The impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action. Microb. Mol. Biol. Reviews 70, 1032-1060.

Garcia, M. A., Collado, M., Muñoz, C., Mathew, A., Arroyo, J., Esteban, M., Serrano, M. and Rivas, C. (2005). Antiviral action of tumour suppressor ARF. The EMBO Journal 25, 4284-4292.

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Científicos Asociados: Alberto Ramos Alejandro Piris Investigadores Postdoctorales: Susana Guerra Carmen E. Gómez Jose Manuel González Paul Heinen Mariang García Beatriz Perdiguero Juan F. García Investigadores Predoctorales: Elena Domingo José Luis Nájera Eva Pérez Jiménez Magdalena Krupa Jacobo Nieto Ana Cáceres Lucas Sánchez

Técnicos de Investigación:

María Victoria Jiménez

Jefe de Línea:

Mariano Esteban

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Modelos animales por manipulación genética

Resumen

En el laboratorio estamos esencial-mente interesados en entender el fun-cionamiento y la organización de los dominios de expresión en el genoma de mamíferos. En particular nos gusta-ría conocer los elementos reguladores necesarios que identifican un dominio de expresión determinado y especifi-can su patrón de expresión en espacio, en tiempo y cantidad, con objeto de interpretar adecuadamente el genoma, especialmente la función de las secuencias intergénicas, y también para eventualmente mejorar el diseño de estrategias de transferencia génica, usadas en transgénesis animal y en terapia génica.

Usamos varios modelos experimenta-les: fundamentalmente el gen de la tirosinasa y también el gen de la proteína ácida del suero de la leche

de ratón, dos locus independientes, regulados a nivel de desarrollo y espe-cíficos de tejido, que nos han servido para identificar elementos reguladores fundamentales, como por ejemplo ais-ladores genómicos y regiones contro-ladoras de locus (LCR). Desarrollamos nuestros experimentos in vivo, median-te el uso de animales transgénicos, con grandes construcciones basadas en cromosomas artificiales que modifica-mos mediante recombinación homó-loga, con objeto de investigar el papel funcional de secuencias específicas. In

vitro, analizamos la función de las

secuencias aisladoras genómicas mediante análisis de bloqueo de

enhancers y de protección frente a los

efectos de posición.

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Figura 1: Determinación de la base molecular de mutaciones en alelos del gen de la tirosinasa de ratón. De izquierda a derecha: ratón albino (Tyr c), ratón

homocigoto para la mutación extreme chinchilla mottled (Tyrc-em/ Tyrc-em), ratón

homocigoto para la mutación chinchilla mottled (Tyrc-m/ Tyrc-m), (ver Lavado A,

Olivares C, Garcia-Borron JC, Montoliu L. Journal of Biological Chemistry 2005, 280:4817-24).

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Modelos animales por manipulación genética

Adicionalmente, nuestro laboratorio

ha generado y analizado nuevos modelos animales para el estudio de las anomalías en el desarrollo de la retina asociadas al albinismo. Mediante ratones transgénicos hemos logrado excluir a la melanina e identificado a los déficits en metabolitos intermedia-rios en la vía de síntesis del pigmento (como la L-DOPA) como la causa principal de las alteraciones visuales observadas en síndromes hipopigmen-tarios. Finalmente, a través de colabo-raciones, hemos desarrollado varios modelos animales adicionales (trans-génicos y mutantes) para el estudio de enfermedades o procesos asociados al SNC (Alzheimer, dolor).

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Figura 2: Recuperación de la conexión neuronal ipsilateral entre retina y cerebro de forma independiente de la pigmentación. Los ratones transgénicos fenotípicamente albinos y con expresión ectópica de tirosina hidroxilasa en el epitelio pigmentado de la retina (TyrTH) logran recuperar las proyecciones axonales ipsilaterales de las células ganglionares de la retina, indicadas mediante flechas y teñidas con el colorante fluorescente DiI, que aparecen muy disminuidas en animales albinos (izquierda) frente a las cla-ramente presentes en los ratones transgénicos TyrTH (centro), de forma similar a las existentes en animales pigmentados (derecha). OT = nervio óptico. La barra indica 0.5 mm (ver Lavado, A,. Jeffery, G., Tovar, V., de la Villa, P., Montoliu, L. Journal of Neurochemistry 2006, 96:1201-11).

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Lavado, A., Jeffery, G.,Tovar,V., de la Villa, P. and Montoliu, L. (2006). Ectopic expression of tyrosine hydroxylase in the pigmented epithelium rescues the retinal abnormalities and visual function common in albinos in the absence of melanin. Journal of eurochemistry. Feb; 96(4): 1201-11.

Lavado, A. and Montoliu, L. (2006). New animal models to study the role of tyrosinase in normal retinal development. Frontiers in Bioscience. Jan; 1;11: 743-52.

Lavado, A., Matheu, A., Serrano, M. and Montoliu, L. (2005). A strategy to study tyrosinase transgenes in mouse melanocytes. BMC Cell Biology. Apr; 12; 6(1): 18.

Gimenez, E., Lavado, A., Jeffery, G. and Montoliu, L. (2005). Regional abnormalities in retinal development are associated with local ocular hypopigmentation. Journal of Comparative

Neurology. May; 16; 485(4): 338-47.

Lavado, A., Olivares, C., García-Borron, JC. and Montoliu, L. (2005). Molecular basis of the extreme dilution mottled mouse mutation: a combination of coding and noncoding genomic alterations. Journal of Biological Chemistry. Feb; 11; 280(6): 4817-24.

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Investigadores Postdoctorales:

Rosa Roy Barcelona (hasta Abril 2005) Victoria Tovar Herrador (hasta Junio 2006)

Magdalena Valdivieso Ugarte (desde Junio 2006)

Investigadores Predoctorales:

Lucía Regales Álvarez (hasta Marzo 2005) Julio Pozueta Larios (hasta Abril 2006) Ángel García Díaz Julia Fernández Punzano (Titulado Superior) Esther Zurita Redondo (desde Diciembre 2005)

Técnicos de Investigación:

Patricia Cozar López (hasta Febrero 2005) Marta Cantero González Juan José Lazcano Duque (desde Mayo 2005 hasta Noviembre 2006) Cristina de Juana Ortín (técnico en formación, desde Enero 2005 hasta Junio 2005)

Jefe de Línea:

Lluís Montoliu José

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Análisis funcional del represor transcripcional DREAM

Resumen

La línea de investigación de mi labora-torio durante los últimos años ha ido enfocada a comprender las redes transcripcionales que controlan la expresión génica en respuesta a señales externas que inducen despola-rización de la membrana plasmática y que se traducen en cambios de la concentración intracelular de calcio. En concreto, nuestro trabajo se centra en aquellas redes reguladas por el represor transcripcional sensible a Ca2+, DREAM.

Nuestros objetivos incluyen I) el cono-cimiento de estos mecanismos moleculares tanto en sistemas experi-mentales sencillos como su análisis in

vivo mediante modelos animales

modi-ficados genéticamente o protocolos usando ARNs de interferencia en ani-mal entero y 2) la caracterización

fenotípica de modelos animales de patologías humanas con valor potencial para el rastreo farmacológico o su apli-cación en estrategias de terapia génica. En el periodo 2005-2006 los principa-les logros de nuestro grupo de investi-gación están relacionados con 1) la caracterización de potenciales domi-nios funcionales en la proteína DREAM, en particular aquellos mediando el pro-ceso de tetramerización, el dominio de unión a DNA y los relacionados con el tráfico de la proteína DREAM entre los distintos compartimentos subcelulares, y 2) el análisis funcional in vivo del represor transcripcional DREAM en ratones transgénicos.

Estos estudios nos han permitido iden-tificar genes diana en la glándula tiroi-dea, en el timo y en la médula espinal,

lo que ha contribuido a desvelar el papel de DREAM en la función tiroi-dea, en la respuesta del sistema inmu-ne y en la respuesta endógena al dolor.

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Figura 1: La localización celular de DREAM es un proceso finamente regulado. El panel superior muestra DREAM-IR en el núcleo y en el citosol (wt DREAM) o exclusiva-mente en el citosol (mutantes DREAM). El panel inferior muestra la expresión de una GFP dirigida al núcleo de esas mismas células. Figura 2: La expresión de EFmut-DREAM en el hipocampo de rato-nes transgénicos DREAM/β-Gal (A) se correlaciona con cambios en la maduración dendrítica de neuronas piramidales (B) y en aprendizaje espacial. Trabajo realizado en cola-boración con los Drs. Mara Dierssen and Javier De Felipe.

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Scsucova, S., Palacios, D., Savignac, M., Mellstrom, B., Naranjo, J. R. and Aranda, A. (2005). The repressor DREAM acts as a transcriptional activator on Vitamin D and retinoic acid response elements. Nucleic Acids Res. 33: 2269-79.

Savignac, M., Palzcewska, M., Pintado, B., Gutierrez-Adan, A., Mellström, B. and Naranjo, J. R. (2005).Transcriptional repressor DREAM regulates T lymphocyte proliferation and cytokine gene expression. EMBO J. 24: 3555-3564.

Gomez-Villafuertes, R., Barrio, J.,Torres, B., Gabellini, N., Savignac, M., Rizzato, F., Pintado, B., Gutierrez-Adan, A., Mellström, B., Carafoli, E. and Naranjo, J. R. (2005).The down regulation of the Na+/Ca2+exchanger 3 by Ca2+-insensitive DREAM mutants regulates neuronal viability. J. Neurosci. 25: 10822-10830.

Cabrera-H, J. R., Sanchez-Pulido, L., Rojas, A. M.,Valencia, A., Mañes, S., Naranjo, J. R. and Mellström, B. (2006). Gas1 is related to the GDNF family receptorsα and regulates Ret signalling. J. Biol. Chem. 281: 14330-14339.

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Científicos Asociados: Britt Mellström Magali Savignac Investigadores Postdoctorales: Rosa Gómez Malgorzata Palczewska Marcos Rivas Estrella López Investigadores Predoctorales: J. Rubén Cabrera Jorge Barrio Sofía Domingo Tomaso Benedet Técnicos de Investigación: David Campos M. Paz Gónzalez Rafael Susin

Jefe de Línea:

José Ramón Naranjo

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Mecanismos de interacción entre el virus de la gripe

y la célula infectada

Resumen

En nuestro grupo, estamos interesados en el estudio de la contribución de factores celulares en la expresión del genoma del virus de la gripe. En este contexto hemos caracterizado la función celular de dos proteínas que interaccionan con la subunidad PA de la polimerasa del virus de la gripe, hCLE y CHD6. La caracterización de hCLE nos ha mostrado que es un modulador transcripcional y la de CHD6 su posible función de remodelador de cromatina. Estas inter-acciones parecen indicar un acopla-miento entre las polimerasas viral y celular y supondrían una unión física de la polimerasa del virus con los sitios intranucleares donde se están generando oligonucleótidos con cap

por la RNA polimerasa II, que el virus utiliza como iniciadores para su propia transcripción. Además hemos caracte-rizado que durante la infección con gripe se produce una degradación específica de la forma hipofosforilada de la RNA polimerasa II y que la poli-merasa viral parece ser la responsable de la degradación, ya que la polimera-sa viral reconstituida, es capaz de pro-ducir este efecto.

La interacción virus-célula infectada se complementa con el estudio de la fase citosólica en la que se realiza la traducción de los mensajeros virales. Además de la función previamente caracterizada de la proteína NS1 en el aumento selectivo de la traducción de

los mRNAs virales, hemos caracteriza-do la contribución de la polimerasa viral en este proceso. Hemos observa-do que la polimerasa viral se asocia a complejos de preiniciación de la tra-ducción, de una manera independien-te de NS1. Además la replicación viral ocurre en condiciones de baja funcio-nalidad del factor celular de unión a las estructuras 5´cap de los mRNAs, la proteína eIF4E, sugiriendo una posible independencia de este factor para la traducción de los mRNAs virales).

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Figura 1: Se representa la entrada del virus de la gripe en una célula, así como las interacciones que la polimerasa viral establece con componentes celulares tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula infectada.

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Pérez-González, A., Rodríguez, A., Huarte, M., Salanueva, I.J. and Nieto, A. (2006). hCLE/CGI 99, a human protein that interacts with the influenza virus polymerase, is a mRNA transcrip-tion modulator. J. Mol. Biol. 362, 887-900.

Lutz, T., Stöger, R. and Nieto, A. (2006). Chd6 is a DNA-dependent ATPase and localizes at nuclear sites of mRNA synthesis. FEBS Lett 580, 5851-5857.

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Investigadores Postdoctorales: Thomas Lutz Investigadores Predoctorales: Idoia Burgui Alicia Pérez Ariel Rodríguez Emilio Yangüez Roberto Alfonso

Jefe de Línea:

Amelia Nieto

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Transcripción y replicación del RNA del virus de la gripe

Resumen

Los virus de la gripe son patógenos humanos que causan epidemias anua-les y ocasionalmente pandemias con gran morbilidad y exceso de mortali-dad. Nuestro grupo está interesado en el estudio de los mecanismos de replicación y expresión génica del virus mediante abordajes de Genética, Biología Molecular y Estructural. Recientemente se han obtenido modelos 3D de la ribonucleoproteína y del complejo de la polimerasa mediante microscopía electrónica que mejoran y amplían la información pre-via publicada por nuestro grupo (Torreira et al., manuscrito en revisión; Coloma et al., en preparación). Las interacciones entre la polimerasa y la célula se han analizado mediante aná-lisis proteómico de complejos intrace-lulares purificados por cromatografía

de afinidad y se han identificado facto-res celulafacto-res normalmente involucra-dos en la transcripción, splicing, el transporte y la traducción de mRNAs celulares como asociados al complejo de la polimerasa (Jorba et al., manus-crito en revisión).

Se han generado virus recombinantes con mutaciones puntuales o de dele-ción en la proteína NS1 que presentan fenotipo termosensible. Algunos de estos mutantes están afectados en la replicación del RNA viral o en su expresión génica tardía, mientras que otros presentan defectos en la morfo-génesis de los viriones (Garaigorta el al. 2005). Algunos de estos virus recombinantes son atenuados en infecciones experimentales en el ratón pero son tan inmunogénicos como los virus silvestres y protegen frente

a infecciones letales, por lo que podrían contribuir a la generación de cepas vacunales atenuadas (Falcón et al., 2005.

Otros de estos virus recombinantes han permitido evaluar la transmisibili-dad de virus de la gripe aviar en infec-ciones experimentales en hurones (Maines et al., 2006).

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Transcripción y replicación del RNA del virus de la gripe

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Figura 1: Atenuación e inmunogenicidad de virus de la gripe mutantes. El panel de arriba muestra los títulos de virus obtenidos en pulmones de ratones infectados experimentalmente con los virus WSN,Victoria y los virus mutantes indicados. El panel de abajo presenta la protección de los ratones inoculados con los virus mutantes indicados frente a un desafío letal con virus WSN, medida por la evolución del peso de los animales.

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Elton, D., Digard, P.,Tiley, L. and Ortín, J. (2005). Structure and function of the influenza virus RNP. In Kawaoka,Y. (ed.), Current Topics in Influenza Virology.

Horizon Scientific Press, Norfolk, pp. 1-92.

Falcón, A.M., Fernandez-Sesma, A., Nakaya,Y., Moran,T.M., Ortín, J. and García-Sastre, A. (2005). Attenuation and immunogenicity in mice of temperature-sensitive influenza viruses expressing truncated NS1 proteins. J. Gen.Virol., 86, 2817-2821.

Garaigorta, U., Falcon, A.M. and Ortin, J. (2005). Genetic analysis of influenza virus NS1 gene: a temperature-sensitive mutant shows defective formation of virus particles.

J Virol, 79, 15246-15257.

Maines,T.R., Chen, L.M., Matsuoka,Y., Chen, H., Rowe,T., Ortin, J., Falcon, A., Nguyen,T.H., Mai le, Q., Sedyaningsih, E.R., Harun, S.,Tumpey,T.M., Donis, R.O., Cox, N.J., Subbarao, K. and Katz, J.M. (2006). Lack of transmission of H5N1 avian-human reassortant influenza viruses in a ferret model. Proc Natl Acad Sci USA, 103, 12121-12126.

Or tin, J. and Parra, F. (2006). Structure and Function of RNA Replication.

Annu Rev Microbiol, 60, 305-326.

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Investigadores Postdoctorales: Susana de Lucas Investigadores Predoctorales: Roberto Alfonso Rocío Coloma Urtzi Garaigorta Núria Jorba Eva Torreira Mercedes Arredondo Patricia Resa Técnicos de Investigación: Yolanda Fernández Noelia Zamarreño

Jefe de Línea:

Juan Ortín

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Caracterización molecular y epidemiología de torovirus

Resumen

Los torovirus son virus con RNA de cadena simple y polaridad positiva que pertenecen a la familia Coronaviridae, y son causantes de enfermedades enté-ricas en distintos mamíferos entre los que se encuentra el hombre. Las par-tículas virales son polimórficas y cons-tan de cuatro proteínas estructurales: la proteína de la nucleocápsida (N), la proteína de membrana (M), la proteí-na hemaglutiniproteí-na esterasa (HE) y la proteína de las espículas (S). Estas dos últimas, HE y S, dan lugar a una doble corona de espículas en la superficie de la partícula viral, y están implicadas en la unión a receptores celulares. El aisla-do equino Berne virus (BEV) es el único que ha podido ser crecido en cultivo celular hasta el momento, por ello, es el virus que estamos utilizando como modelo para la caracterización molecular de torovirus.

Uno de los objetivos del laboratorio es estudiar la estructura y morfología de las partículas virales por distintos pro-cedimientos de microscopía electróni-ca. Por otra parte, para caracterizar el proceso de morfogénesis de torovirus estamos produciendo una colección de anticuerpos policlonales y monoclonales, con los cuales podemos estudiar la localización intracelular de las proteínas virales a lo largo de la infección, tanto por microscopía confo-cal como por inmunomicroscopía elec-trónica. De forma paralela estamos caracterizando las proteínas estructura-les de BEV mediante su expresión en sistemas heterólogos. La expresión y purificación de estas proteínas permiti-rá el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas, así como la generación de vacunas frente a torovirus.

Otro objetivo del laboratorio es el estudio epidemiológico de torovirus porcino en España. Para ello, en primer lugar estamos desarrollando las herramientas necesarias para estable-cer ensayos serológicos para la detección de anticuerpos frente al virus en muestras de suero, así como ensayos virológicos que nos permitan detectar la presencia del virus en muestras clínicas.

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Caracterización molecular y epidemiología de torovirus

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Figura 2: Colocalización de la proteína M de BEV con la proteína ERGIC-53 del compartimento inter-medio celular a 10h post-infección.

Figura 1: Sección ultrafina de células infectadas con BEV mostrando estructuras tubulares presentes en el núcleo que se marcan específicamente con anticuerpos contra la proteína N de BEV.

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González, B., Reina, R., García, I., Andrés, S., Glaria, I., Alzueta, M., Mora, M. I., Rodríguez, D., Rodríguez, J. R., Esteban, M., Grilló, M. J., Jugo, B., Blacklaws, B. A., Harkiss, G. D., Chebloune,Y., Luján, G., de Andrés, D. and Amorena, B. (2005). Mucosal immunization of sheep with a Maedi-Visna virus (MVV) env DNA vaccine protects against early MVV productive infection.

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Abaitua, F., Rodríguez, J. R., Garzón, A., Rodríguez, D. and Esteban, M. (2006). Potentiation of the immune response to HIV with MVA and DNA vectors expressing env and the cytokines IL-12 and IFN-γ?. Virus Res. 116, 11-20.

Rodríguez, D., Bárcena, M., Möbius, W., Schleich, S., Esteban, M., Geerts, W. J. C., Koster, A. J., Griffiths, G. and Krijnse Locker, J. (2006). A vaccinia virus lacking A10L: viral core proteins accumulate on structures derived from the endoplasmic reticulum.

Cellular Microbiology 8, 427-437.

Morrot, A., Cockburn, I. A., Overstreet, M., Rodríguez, D. and Zavala, F. (2006). Protective CD8+T cells induced by malaria sporozoites do not undergo modulation of IL-7 receptor expression. Infec. and Immunity 74, 2495-2497.

Garzón, A., Maestre, A., Pignatelli, J., Rejas, M.T. and Rodríguez, D. (2006). New insights on the structure and morphogenesis of Berne virus. Adv. Exp. Med. Biol. 581, 175-180.

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Investigadores Postdoctorales:

Soledad Blanco Chapinal

Investigadores Predoctorales:

Ana Garzón Gutiérrez Ana Mª Maestre Meréns Jaime Pignatelli Garrigós Ana Isabel García Mace

Técnicos de Investigación:

Ignacio Rodríguez Otero

Jefe de Línea:

Dolores Rodríguez Aguirre

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Biología molecular de birnavirus

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Resumen

Los virus de la familia Birnaviridae se caracterizan por la posesión de una cápsida icosaédrica única que encierra un genoma dsRNA bipar tito. La estrategia replicativa de los birnavirus se diferencia en gran medida de la de los virus dsRNA prototípicos pertenecientes a la familia Reoviridae. Estas diferencias tienen un reflejo directo sobre la morfogénesis de la partícula y los procesos de replicación y transcripción del genoma viral. La mayor parte de nuestros estudios se realizan empleando el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un impor-tante patógeno aviar, como modelo viral. Nuestro interés se centra en la caracterización estructural y funcional de las diferentes proteínas virales y en el estudio del proceso morfoge-nético de la partícula viral y del complejo ribonucleoproteico (RNP).

La información obtenida se aplica al desarrollo de nuevas estrategias antivi-rales potencialmente transferibles al sector industrial.

La caracterización de la estructura atómica de la proteína de la cápsida (VP2) (Garriga et al., 2006) nos ha permitido determinar con precisión los contactos inter e intramoleculares implicados en el proceso de ensam-blaje de la partícula, así como la locali-zación de las regiones de la proteína responsables de su plasticidad estruc-tural (Luque et al., en prensa). Estos estudios han conducido al desarrollo de una vacuna de subunidad frente a IBDV, basada en la utilización de ensamblados subvirales (SVPs), actualmente en fase ensayos de campo. La reciente determinación de la estructura atómica de la RNA

polimerasa viral (VP1) (Garriga et al., en preparación) ha abierto nuevas vías para el estudio de los procesos de replicación y transcripción del genoma viral y para el diseño de nuevos agentes antivirales. La utilización de mutantes dominantes negativos de la proteína VP3, una proteína multifun-cional que dirige el proceso morfoge-nético y actúa como transactivador de la RNA polimerasa viral, nos ha permi-tido desarrollar una nueva estrategia de control de la replicación viral (González et al., 2005).

Figura 1: Estructura cristalina de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus de la bursitis infecciosa.

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Biología molecular de birnavirus

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Figura 3: Micrografía de microscopía confocal de una célula de insecto (HighFive) infectada con un baculovirus recombinante que dirige la expresión de la proteína VP3 del virus de la bursitis infecciosa. La señal verde (Alexa 488) corresponde a la proteína VP3. La señal azul (ToPro-3) corresponde a la tinción nuclear. Figura 2: Vista interna del eje quinario de la partícula del virus

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González, D., Rodríguez, J. F. and Abaitua, F. (2005). Intracellular Interference of Infectious

Bursal Disease Virus. J. Virol. 79: 14437-14441.

Garriga, D., Querol-Audi, J., Abaitua, F., Saugar, I., Pous, J.,Verdaguer, N., Caston, J. R., Rodríguez, J. F. (2006).The 2.6-Angstrom Structure of Infectious Bursal Disease Virus-Derived T=1 Particles Reveals New Stabilizing Elements of the Virus Capsid. J. Virol. 80: 6895-6905.

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Científicos Asociados:

Dolores González de Llano

Investigadores Postdoctorales:

Ana Oña Blanco

Investigadores Predoctorales:

Aitor Navarro Nieto Daniel Luque Buzo Laura Delgui

Nerea Irigoyen Vergara

Técnicos de Investigación:

Antonio Varas Ríos

Jefe de Línea:

José F. Rodríguez Aguirre

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Modulación de la respuesta inmune por virus

Resumen

Estamos investigando los mecanimos moleculares utilizados por virus DNA de gran tamaño (poxvirus y herpesvi-rus) para modular la respuesta inmune del huésped.

Estamos caracterizando proteínas vira-les secretadas que unen citoquinas y quimioquinas, importantes mediadores de las respuestas inflamatoria e inmune activadas tras la infección viral. Por ejemplo, hemos identificado un nuevo dominio de unión a quimioquinas, dominio SECRET (smallpox-encoded

chemokine receptor), que se encuentra

en cinco proteínas de poxvirus, bien formando parte del receptor viral del factor necrosante de tumores o expre-sado de forma independiente.

Este dominio está presente en la pro-teína CrmB del virus de la viruela, uno

de los virus más virulentos jamás cono-cidos en la historia de la humanidad. Estamos utilizando el modelo mousepox para estudiar la actividad inmunomodu-ladora de los receptores virales de cito-quinas y su contribución a la patogéne-sis viral. Mousepox es una enfermedad parecida a la viruela humana que está causada por el virus ectromelia, un patógeno natural del ratón, y constituye uno de los modelos más poderosos de patogénesis viral. La identificación de proteínas virales con actividad inmuno-moduladora nos ofrece nuevas herra-mientas y estrategias anti-inflamatorias que pueden tener aplicaciones terapéu-ticas en la clínica.

En colaboración con compañías biotecnológicas estamos trabajando en el desarrollo de las proteínas

inmunomo-duladoras virales como medicamentos para tratar enfermedades humanas cau-sadas por reacciones inmunopatológicas. Por último, hemos extendido el con-cepto de modulación de quimioquinas a otros patógenos y, en colaboración con parasitólogos, hemos descrito la primera proteína de unión a quimio-quinas identificada en un parásito humano (Schistosoma mansoni).

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Modulación de la respuesta inmune por virus

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Figura 2: Microscopía electrónica de células infectadas con el virus ectromelia

Figura 1: Una nueva familia de proteínas virales de unión a quimioquinas que contienen el dominio SECRET (smallpox virus-encoded chemokine receptor).

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Jamieson,T. , Cook, D., Nibbs, R. J. B., Rot, A., Nixon, C., Mclean, P., Alcami, A., Lira, S. A.,

Wiekowski, M. and Graham, G. J. (2005).The chemokine receptor D6 limits the inflammatory response in vivo. Nature Immunol. 6, 403-411.

Smith, P., Fallon, R. E., Mangan, N. E., Walsh, C. M., Saraiva, M., Sayers, J. R., McKenzie, A. N. J., Alcami, A. and Fallon, P. G. (2005). A human parasite blocks inflammation by secretion of a chemokine binding protein. J. Exp. Med. 202, 1319-1325.

Alejo, A., Ruiz-Argüello, M. N., Ho,Y., Smith, V. P., Saraiva, M. and Alcami, A. (2006). A chemokine binding domain in the tumour necrosis factor receptor from variola (smallpox) virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 5995-6000.

Fallon, P. G. and Alcami, A. (2006). Pathogen-deriven immunomodulatory molecules: future immunotherapeutics? Trends Immunol. 27, 470-476.

Poole, E., King, C. A., Sinclair, J. H. and Alcami, A. (2006).The UL144 gene product of human cytomegalovirus activates NFkB via a TRAF6-dependent mechanism.

EMBO J. 25, 4390-4399.

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Investigadores Postdoctorales: Alí Alejo Begoña Ruiz-Argüello Abel Viejo Edel McNeela

Alberto López Bueno Daniel Rubio

Investigadores Predoctorales:

Marcos Palomo Sergio Martín

Mar Fernández de Marco

Técnicos de Investigación: Rocío Martín

Jefe de Línea:

Antonio Alcamí

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