FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A
Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN”
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR: Bach. Scavino Doñez, Roy Roger Bach. Saldaña Sanjurjo, Claudio Andre
ASESORES:
Ing. Alenguer Gerónimo Alva Arévalo. Dr. Blga. Jessy Patricia Vásquez Chumbe
Q.F. Henry Vladimir Delgado Wong
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS:
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A
INDICE:
3.5Distribución y producción……… 26
3.6Usos del Indano……… 26
3.7Composición química………... 27
3.8Farmacología………. 28
3.9Metabolitos principales………. 29
IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS……….…. 30
a. Principios del método……….. 30
4.1CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO…….. 31
A. Fenotipo de la cepa Candida albicans………. 31
B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum………. 32
V. DEFINICIONES OPERACIONALES……… 33
a. Variables……… 33
I. Independiente………... 33
II. Dependiente………... 33
VI. INDICADORES………... 33
VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES………... 34
CAPITULO N° 02………36
VIII. METODOLOGÍA……… 37
a. Tipo de investigación……… 37
IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN……….. 38
a. Procedimiento experimental………... 38
a. Recolección de la muestra vegetal……….. 38
b. Identificación de la muestra vegetal……… 38
c. Obtención del extracto etanólico………. 38
X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO………. 41
a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios….. 41
1.Identificación de Alcaloides……….. 41
Ensayo de Dragendorff……….. 41
2.Identificación de Triterpenos y Esteroides………. 41
Ensayo de Liebermann-Buchard……… 41
Ensayo de la Espuma……….. 42
6. Identificación de Fenoles y Taninos………... 42
Ensayo de Cloruro Férrico………. 43
7. Identificación de Aminoácidos y Aminas……….. 43
Ensayo de Ninhidrina………. 43
8. Identificación de Flavonoides………. 43
Ensayo de Shinoda……….. 43
XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS………. 44
B. Controles positivos y negativos……….. 44
C. Cepas de hongos empleadas para estudio……… 45
D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos en estudio………... 45
I. Candida albicans………… 45
II. Trichophyton Rubrum………… 45
E. Preparación del inóculo………..….. 46
F. Interpretación de los resultados……… 46
G. Lectura de los resultados de la concentración mínima inhibitoria (CMI)………. 46
XII. POBLACIÓN Y MUESTRA………. 47
a) Población vegetal………. 47
b) Muestra vegetal……… 47
c) Población microbiológica……… 47
d) Muestra microbiológica………... 47
e) Criterios de inclusión………... 47
f) Criterios de exclusión……….. 47
XIII. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS………. 48
a. Material de vidrio………. 48
b. Material de metal……….. 48
c. Otros materiales………... 48
d. Equipos………. 49
e. Reactivos……….. 49
f. Medios de cultivo……… 49
g. Material de bioseguridad……….. 49
XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA……… 50
XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN…………. 51
XVI. RESULTADOS……….. 53
a) Tamizaje fitoquímico……… 55
b) CIM encontrado de candida albicans……… 55
c) CIM encontrado de trichophyton rubrun………….. 55
XVII. DISCUSION……….... 57
Imagen satelital de la ubicación geográfica de la reserva natural ALLPAHUAYO – MISHANA 2. ANEXO Nº 02………. 69
Ficha de especies de las plantas medicinales en estudio 3. ANEXO Nº 03... 70
Muestra botánica 4. ANEXO Nº 04... 71
Descripción de cepas en estudio 5. ANEXO N° 05... 72
Secado y molienda de la muestra vegetal 6. ANEXO N° 06………. 73
Obtención de la extracto etanólico 7. ANEXO Nº 07... 74 Periodo de crecimiento de los hongos 10.ANEXO N°10……….. 77
Resultados de la actividad antifungica
12.ANEXO N°12……….. 79
Resultado de controles positivos 13.ANEXO Nº13……….. 80
Metodología de macrodilución para hongos 14.ANEXO N°14……….. 81
Diluciones de controles positivos: 15.ANEXO Nº15……….. 82
TITULO:
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN”
Bach. Roy Roger, Scavino Doñez & Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo*
RESUMEN:
El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antifúngica In Vitro mediante el Método de macrodilución para hongos, con el extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano). La muestra fue recolectada en la Zona Reservada Allpahuayo -Mishana; la muestra se identificó taxonómicamente en el Herbarium Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue depositada para su conservación en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería Alimentarias – UNAP. La determinación del screening fitoquímico se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias - UNAP. Las dosis del extracto fueron 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 y 0.1953 mg/mL, se utilizó como control positivo ketoconazol obteniendo un CIM de 2.5 ug/mL y fluconazol obteniendo un CIM de 3.12 ug/mL. El screening fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la presencia de Taninos, flavonoides, lactonas y azucares reductores; para el estudio de la actividad antifúngica In Vitro mediante el Método de macrodilución para hongos se utilizó cepas de Candida albicans ATCC 90028 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. El extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano) permitió evaluar la actividad antifungica Candida albicans ATCC 90028 que evidenció un CIM de 1.5625 mg/mL en comparación con la otra cepa en estudio Trichophyton rubrum ATCC 28188 que evidenció como resultado un CIM de 0.39063 mg/mL.
"EVALUATION OF IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF BARK nanche (indane) against Candida albicans and Trichophyton rubrum, by the method macrodilution"
Bach. Roy Roger Scavino Doñez& Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo *
ABSTRACT:
The aim of this study was to evaluate the antifungal activity in vitro by the method macrodilution for fungi, with the ethanol extract of the bark of nanche (indane). The sample was collected in Allpahuayo -Mishana Reserved Zone; the sample is taxonomically identified in the Amazonian Herbarium of the National University of the Peruvian Amazon (UNAP) and was deposited for preservation in the xiloteca of the Faculty of Food Engineering - UNAP. Determining the phytochemical screening it was conducted in the laboratory of the Faculty of Engineering of Food Industries - UNAP. Extract doses were 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 and 0.1953 mg / mL, was used as positive control to obtain a CIM ketoconazole 2.5 ug / mL and obtaining a MIC of fluconazole 3.12 ug / mL. The phytochemical screening of the ethanol extract of the bark of nanche (indane) showed the presence of tannins, flavonoids, lactones and reducing sugars; for studying the in vitro antifungal activity by macrodilution method of fungal strains Candida albicans ATCC 90028 and Trichophyton rubrum ATCC 28188. The ethanol extract of the bark of nanche (indane) was used to evaluate allowed antifungal activity Candida albicans ATCC 90028 which showed a MIC of 1.5625 mg / mL compared with other strain ATCC 28188 Trichophyton rubrum study that showed results in CIM 0.39063 mg / mL.
“DEDICATORIA” y a mi otra inspiración, aquella mujer que nunca me ha dejado, luchadora incansable, que es también mi guerrera invencible, y siempre tendrá sus brazos abiertos para mi MAMÁ ROSITA EMERITA DOÑEZ PIZANGO.
A mi gran inspiración, de hacer todo día a día de la mejor manera, el pilar más grande que tengo, mi pequeña hija: CAMILA LUCIANA SCAVINO MENDOZA, quien es todo para mí, es el regalo más grande que Dios me pudo dar.
A mi hermana, la única persona que siempre estuvo para mí, que a pesar de estar muy lejos, es decir en otro país, siempre influenció en mí, desde la manera de pensar y actuar, para formar y ser profesional, la cual es y siempre será una gran inspiración para mi ELLEN CRISTINA SCAVINO RIVERA.
Claudio André, Saldaña Sanjurjo:
Dedico este trabajo de tesis a mis queridos padres Isabel Sanjurjo Vilchez y Rusbel Saldaña Saldaña, por el apoyo incondicional que me brindaron a lo largo de toda mi formación profesional, logrando así que uno de mis más grandes sueños se haga realidad.
A mis hermanos Fatima Cecilia y Bruno que son mi motivación y la razón para seguir adelante siendo un ejemplo constante para ellos.
A toda mi familia sin excepción; mis queridos tíos Manuel, Marjorie, Carolina, Martin, mis abuelitos que siempre han estado pendientes de mi durante esta etapa de mi vida.
“AGRADECIMIENTO”
“Que mejor que escalar la montaña, si te detienes, puedes ver todo, pero a la vez te puedes caer, mejor es llegar a la cima y verlo todo, más tranquilo, sintiendo deleite de un
logro más…”
Dedicamos este trabajo de investigación especialmente a todas aquellas personas que de una u otra forma estuvieron compartiendo con nosotros, tanto en el ámbito profesional como en el personal, conocimientos, experiencias, anécdotas e intercambios de opinión.
La culminación de esta presente tesis no habría sido posible sin la ayuda de las siguientes personas:
Al Ing. ALENGUER GERONIMO, ALVA ARÉVALO DR, por la ayuda inconmensurable. Por ello queremos expresarle nuestra gratitud por habernos aceptado en su sitio de trabajo. Gracias a sus ganas de querer empezar pero siempre con la mira de culminar y su crítica rápida pero acertada nos llenaron de entusiasmo y al querer hacer.
Al Blga. JESSY PATRICIA. VASQUEZ CHUMBE, por haber dedicado una importante parte de su tiempo en compartir sus conocimientos, por abrirnos las puertas de su centro laboral.
A la Ingeniera TANY, por habernos apoyado de manera desinteresada en la parte microbiológica durante el desarrollo de la tesis.
Al Q.F. HENRY VLADIMIR DELGADO WONG, por su apoyo durante la redacción y culminación de la tesis.
Al Q.F. JEAN PIERRE LOPEZ MESIA, por su ayuda en puntos muy críticos de la tesis, y ayudarnos con ello a lograr un objetivo de ser Químico Farmacéutico.
A todas aquellas personas que de una y otra forma colaboraron en la realización de la presente tesis.
I. INTRODUCCION:
Durante las últimas décadas la utilización de las plantas medicinales y productos que se originan de ellas se han extendido en el mundo y han ganado una gran popularidad, sin embargo, muy pocas especies y productos se han estudiado con fines médicos y un número menor cuenta con estudios realizados sobre su seguridad eficacia y calidad.1
Se calcula que cerca del 10 por ciento de las más de un cuarto de millón de especies de plantas que se conocen en la actualidad tienen propiedades medicinales, es decir, para el año 2020 la población mundial, habrá alcanzado la cifra de 7,5 mil millones de habitantes, de los cuales el 75% vivirá en países de vía de desarrollo que hoy consumen menos de 15% del mercado farmacéutico.2
El Perú lleno de riquezas naturales en donde las mismas han sido la base para el desarrollo de generación tras generación, las investigaciones científicas son un gran aporte para la población, gracias a la valiosa información brindada los recursos naturales son mejor aprovechados.3
Los dermatofitos son hongos queratinolíticos; es decir, tienen la capacidad de digerir y utilizar la queratina como sustrato. 6 Las infecciones producidas por estos hongos se denominan dermatofitosis, aunque comúnmente también son llamadas tiñas, término que procede del latín tinea y que significa gusano o polilla. Esta palabra se usa de forma descriptiva dado el aspecto de serpentina o anular que presentan las lesiones cutáneas con una apariencia de gusano enterrado en la piel.7
Las infecciones por Candida son un problema de salud pública, que abarcan desde alteraciones en la flora normal hasta infecciones sistémicas graves en pacientes inmunodeprimidos. Candida es parte de la flora normal del tracto gastrointestinal pero es un patógeno oportunista capaz de causar infecciones que comprometen la vida de los pacientes infectados.8
La micosis es una enfermedad que provoca a escala mundial entre 300 a 500 millones de casos clínicos cada año. Esto se debe a que la mayoría de la población mundial está distribuida en zonas altamente endémicas correspondientes a zonas subtropicales y tropicales.9
Algunas dermatofitosis son también llamadas “tiñas”, y según su distribución corporal se clasifican en tiña de la cabeza, tiña del cuerpo, tiña de la mano, tiña de los pies, tiña de la ingle, tiña del área del pañal y tiña de las uñas.10 Trichophyton rubrum es el agente causal más frecuente en tiñas del cuerpo, de la ingle, de los pies, así como de las uñas.11
aumentado en los últimos años como causa de tiña de las uñas, tiña del cuerpo, tiña de la ingle, tiña de la mano y tiña del pie.12
Al igual que en otros estudios, se ha observado que la piel lampiña suele afectarse fácilmente; el cuero cabelludo, en cambio, rara vez se ve afectado por este dermatofito. 13 En Europa, la afección por hongos del cuero cabelludo se ha descrito con una incidencia menor al 1%. Generalmente se asocian a esta entidad clínica otros dermatofitos, como
Mycrosporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton tonsurans. Este último dermatofito es el más prevalente en las tiñas de la cabeza en Estados Unidos.14
En el Perú, los microorganismos aislados con mayor frecuencia son
Trichophyton tonsurans, de 54 a 78%, y Microsporum canis, de 7 a 26%.6 Sin embargo, Cárdenas et al. en un estudio realizado en la ciudad
de Trujillo, Perú, encontraron mayor frecuencia de Microsporum canis
(84,7%) que de Trichophyton mentagrophytes (9,1%) y Trichophyton rubrum (3,1%).12 Otro estudio realizado por el Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM - 2000), resalta que en el grupo de hongos dermatofitos, el
Trichophyton mentagrophytes es la especie de mayor incidencia (38.06%), seguido de Trichophyton rubrum (6.71%). En el mismo estudio se resalta que la frecuencia de dermatofitos y levaduras es mayor en el sexo masculino (62.68%) que en el femenino (37.33%).13
II. OBJETIVOS:
a. General
Evaluar la actividad antifúngica del extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano), por el método de macrodilución In Vitro
frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum
b. Específicos
Obtener el extracto etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
Realizar el tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima crassifolia,
(Indano)
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de macrodilución In Vitro frente a Cándida albicans
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de macrodilución In Vitro frente a Trichophyton rubrum
Comparar la actividad antifúngico de la corteza de Byrsonima crassifolia,
III. MARCO REFERENCIAL: 3.1 ANTECEDENTES:
El hombre amazónico a través de toda su historia, ha logrado identificar y utilizar una buena cantidad de especies vegetales, llegando a conocer y usar unas dos a tres mil plantas medicinales. Pocos estudios químicos y farmacológicos sobre las propiedades medicinales y tóxicas de estas plantas han sido realizados. De las 1516 especies (distribuidas en 145 familias y 594 géneros), un 50% tienen alguna investigación y la mayoría han sido examinada por su utilidad como maderas, para la confección de pulpa de papel o por sus aplicaciones en la alimentación humana o en la industria.14
La importancia de los conocimientos etnobotánicas y de la medicina tradicional se confirma cuando se ha encontrado que de los 119 fármacos derivados de plantas en uso actual, hay 88 (74%) que fueron descubiertos como resultado de estudios químicos para el aislamiento de las sustancias activas que motivaron el empleo de las plantas de origen en la medicina tradicional.15
BRACK (1995), estimo el número total de especies vegetales en el Perú en 25 000 especies; de éstas, se utilizan no menos de 3 140 especies nativas, de las cuales 1005 especies son utilizadas para diversos fines, como la artesanía.14
BRAKO y ZARUCCHI (1993), reporta para el Perú un total de 17 mil 144 especies conocidas, de las 150 000 que se conocen en el neo trópico y las 450 000 que se han identificado en el mundo, agrupadas en 2 mil 458 géneros y 224 Familias, con 5 mil 354 especies endémicas.15
de Loreto, uno de los bosques tropicales más diversos del mundo, como los de Yanamono con 300 especies, por su parte Ha y Mishana con 289 especies maderables.16
La corteza de Byrsonima crassifolia se utiliza en el tratamiento de llagas, vaginitis y tiña. Se ha demostrado que es activa contra entero bacterias 19, levaduras y dermatofitos además de ser astringente, cicatrizante e antiinflamatorio. Los compuestos responsables de la actividad son proanticiadinas y heterosidos.16
El nanchi se distribuye desde México hasta Brasil en los bosques secos, bosques húmedos y sabanas, desde los 0 a los 2000 msnm; diversas partes de la planta se emplean para tratar diarreas e infecciones de la piel, mientras que su fruto se recomienda contra la fiebre.17
CACERES, A. (1996): En un estudio de tres grupos de personas con lesiones confirmadas de candidiasis oral, agrupadas y tratadas aleatoriamente, se demostró mejoría negativización del exámen microscópico en 70% de los tratados con trociscos a base del extracto etanólico de corteza, 90% de los tratados con un enjuague a base de tintura de corteza y 83% en el grupo tratado con clotrimazol.18
MARTINEZ M, GONZÁLEZ R, CAZARES L, MORENO M, GARCÍA A. (1999): Se realizaron extractos con diferentes tipos de
solventes de Byrsonima crassifolia encontrando que el extracto de la raíz con acetato de etilo fue el que presento mayor poder antimicrobiano, teniendo efecto sobre K.pneumoniae, P. aeruginosa, S. typhi, S. flexneri, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae y M. luteus.19
México en un esfuerzo conjunto con el Laboratorio de Investigación Química y Farmacológica de Productos Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro, desarrollaron el proyecto de investigación denominado “Antibacterial Compounds Isolated From “Byrsonima crassifolia” en cuyo resultado se logró el aislamiento de ocho compuestos conocidos, β-amirina, betulina, ácido betulínico, ácido oleanolico, quercetina, (-)-epicatequina, ácido gálico y β-sitosterol de la fracción de diclorometano derivada del extracto metanólico de
Byrsonima crassifolia Todos los compuestos aislados se evaluaron para determinar su actividad antibacteriana contra un panel de doce bacterias y Cándida albicans. Los compuestos aislados inhibieron el crecimiento de las bacterias a concentraciones en el rango de 64 a 1088 μg/mL. 20
determinó la CIM mostrando C. grandis la mejor actividad (0.25mg/mL). Los extractos de C. pyramidata, P. jacquemontianum y V. prionophylla presentaron actividad de 1 mg/mL. Aunque se esperaban mejores resultados, una CIM de 0.25 mg/mL puede ser considerada como aceptable para futuros ensayos para validar el uso popular de la raíz de C. grandis en afecciones subcutáneas causadas por N. brasiliensis, L. graveolens, P. pseudoaureum, P. aduncum, R. mangle, y W. urens var. caracasan presentaron actividad contra al menos uno de los tres aislamientos clínicos. Esta variabilidad puede ser debida a la procedencia de las Nocardias ya que se tratan de aislamientos clínicos. 21
MONROY R. (2011): Evalué la actividad antimicótica in vitro de extractos de las plantas Byrsonima crassifolia, Cassia reticulata, Gliricidia sepium, Lippia graveolens, Litsea glaucescens y Psidium guajava contra los hongos dermatofitos Microsporum canis, Microsporum gypseum y Tricophyton mentagrophytes; y la actividad antilevadura In Vitro contra las levaduras Candida albicans y Malassezia pachydermatis; estos microorganismos se obtuvieron del cepario del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria, dichos microorganismos fueron aislados de casos clínicos de perros provenientes del hospital veterinario de la misma casa de estudios. En la CIM el extracto
etanólico de Byrsonima crassifolia y Gliricidia sepium presentaron actividad contra Malassezia pachydermatis a la concentración de 500 μg/ml. El extracto etanólico de Cassia reticulata presento actividad contra
Malassezia pachydermatis a la concentración de 1000 μg/ml, siendo estos los extractos queobtuvieron mayores valores CIM.22
micro-dilución en caldo, la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB), de los extractos de frutos (hexánico, EH; clorofórmico, EC; y metanólico, EM) contra 21 bacterias patógenas humanas. Los EH de Arrayán y Ayale mostraron la mayor actividad (CMI 0.25-2 mg/mL; CMB 0.5-16 mg/mL) contra enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella spp. y Shigella spp.). El EM de arrayán fue el más activo contra bacterias Gram positivas, presentando Staphylococcus aureus la mayor sensibilidad (CMI 2 mg/mL; CMB 2-4 mg/mL).23
3.2 Clasificación taxonómica:
LA CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ES LA SIGUIENTE 25 Reino : Plantae
Subreino : Embryobionta División : Magnoliophyta. Clase : Magnoliopsida Orden : Polygalales. Familia : Malpighiaceae Género : Byrsonima
Especie : Byrsonima crassifolia. N. científico: Byrsonima crassifolia L. N. común : Nanche
3.3 Sinonimia:
La sinonimia de Byrsonima crassifolia (L) H.B.K es amplia, los que más se emplean son: Byrsonima cumingana Juss.; Byrsonima fendleri Turkz.; Byrsonima panamensis Beurl.; Byrsonima pulcra Sesé.; Malpighia crassifolia L.; Malpighia pulcra Sesé. 20 Byrsonima cotinifolia Kunth, Byrsonima cubensis Juss; Byrsonima Karwinskiana; Byrsonima lanceolada dc., Byrsonima rufescens Bertol. Byrsonima cynerea Dec., y Byrsonima ferruginea, entre otros.25
3.4 Descripción botánica:
que cambia a pardo rosado, fibrosa y amarga; grosor total de la corteza de 12 a 25 mm, y de madera, dura, rojiza, flexible, fuerte y pesada; la albura es de color más claro (crema amarillento) con vasos grandes, radios numerosos y estrechos; no toman un acabado lisio y natural.25
Las ramas cuando jóvenes son de color gris pardo, con cicatrices anulares de las hojas y estipulas caídas; lenticelas escasas, pubescentes en las hojas más jóvenes. Las hojas generalmente son alargadas, decusadas, simples; láminas de 5 por 2 hasta 15 por 7.5 cm, de forma elíptica, margen entero, ápice agudo o redondeado y base aguda, color verde oscuro y casi glabras en el haz y verde amarillento grisáceos con abundantes tricomas en el envés; peciolos pubescentes de 5 a 25 mm de largo; las yemas miden de 3 a 7 mm agudas y cubiertas por dos estipulas ferruginosas.25
Presenta flores en racimos terminales de hasta 12 cm de largo; cáliz con cinco sépalos de forma oval – triangular 23, cada uno con dos prominentes glándulas en la base. Son pubescentes; los pedicelos de 7 a 15 mm de largo. Las flores son de 1.5 cm de diámetro con cáliz de 5 mm de largo, cupular en la base, con cinco lóbulos ovados, agudos o redondeados, pubescentes en la superficie externa, con 10 glándulas grandes, oblongas, glabras en la base de la superficie externa. La corola consta de cinco pétalos amarillos anaranjados, libres, alternos respecto a los lóbulos del cáliz, de 1 cm de largo, orbiculares o reniformes, con la parte superior cóncava, con márgenes ondulados o dentados, unguiculados y glabro.26
inferior. Anteras pardas, alargadas, basifijas con filamentos glabros, insertados en un torus hirsuto.25
Los frutos presentan infrutescencias péndulas de 10 a 15 cm de largo; son drupas globosas de 1.2 a 2 cm de diámetro. El exocarpio es delgado, de color amarillo, verde o rojizo cuando el fruto está maduro; el mesocarpio (la parte comestible) es de consistencia pastosa, de color amarillos y de unos 5 mm de espesor; el endocarpio es redondeado u oval, rígido y reticulado.26
La semilla se encuentra encerrada en el endocarpio que es duro y leñoso; de forma ovoide o subglobosa arrugada, gruesa o ligeramente comprimida, de 4 a 4.5 mm de diámetro; la testa es de color café claro, lisa, lustrosa, membranosa, muy delgada. El embrión es curvo, enrollado, color amarillo verdoso y ocupa toda la cavidad de la semilla. Las semillas contienen dos cotiledones grandes, largos, planos, carnosos, frecuentemente desiguales, enrollados a manera de espiral; la radícula es corta, superior, oblonga, endospermo nuclear escaso o ausente.26
3.5 DISTRIBUCIÓN Y PRODUCCIÓN:
El género Byrsonima, se distribuye desde México hasta el Norte de Sudamérica debido a la tolerancia de los arboles a un amplio rango de condiciones ambientales.26 La especie se distribuye en altitudes comprendidas entre los cero y 1600 metros, pero preferentemente de los ceros a los 500 metros.26
3.6 USOS DEL INDANO:
El fruto es nutritivo y complementa la dieta de la población local, por su alto contenido de vitamina A y C (más de 369 g/ 100 g y 650 mg.g-1, respectivamente).28
En medicina tradicional es importante su uso; la infusión de hojas y corteza funciona como eficaz anti diarreico, antipirético, astringente, antiinflamatorio y expectorante; es un excelente antídoto para mordedura de víbora, corrige la dismenorrea, ayuda a expulsar la placenta, atenúa las contracciones durante el parto y es eficaz en casos de colitis aguda 29, además es útil en las afecciones renales y en la diabetes.30
El cocimiento de corteza y flores se usa por vía oral para tratar afecciones respiratorias (amigdalitis, bronquitis, fiebre, tos), digestivas (cólicos, diarrea, disentería, estreñimiento, indigestión), dolor de muelas, hemorragias, parásitos, y favorece el parto y la expulsión de la placenta.31
El fruto se usa para tratar fiebre y las semillas para disentería. Por vía tópica se usa para tratar afecciones dermatomucosas (estomatitis, leucorrea, piodermia, tinea, ulcera, vaginitis), tumores.32
3.7 Composición química:
La corteza contiene taninos (20-30%), ácido oxálico (2.7%), glucósidos, flavonoides, saponinas, sesquiterpenlactonas y triterpenos (β-amirina). 33
contiene terpenos (betulinaldehido, betulina, ácido betulínico, lupeol, ácido oleanólico, ursenaldehido), esteroles (β sisterol y su glucósido).33
Las hojas contienen 6% de grasa, β-sisterol, ácido maslínico y elágico, flavonoides (catequina, epicatequina, guayaverina, hiperina, quercetina, y galoilgalactosido), ésteres aromáticos (metil galato), amino ácidos (alanina, ácido aspártico, prolina, valina, ácido pipecolico y 5-hidroxipipecólico) y sulfonoglicolipido. La raíz contiene flavonoides, glucósidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas, taninos y triterpenos.33
3.8 Farmacología:
Estudios antimicrobianos demuestran que el extracto acuoso de hojas, corteza y raíz es activo contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus. La tintura de corteza es activa contra Shigella flexceri,
Salmonella typhi, Vibrio cholerae.33
3.9 Metabolitos principales:
Los metabolitos principales son los taninos, especialmente en corteza. Los responsables de la actividad farmacológica son los galatos de proantocianidinas ß2, que en este caso se utilizan como antifúngicos, antiinflamatorios y nematicidas. 33
IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS
En 1998 el National Committee for Clinical Laborator y Standards (NCCLS) publicó el Método de macrodilución para hongos filamentosos.35 donde se describe un método provisional para la realización de pruebas de sensibilidad antifúngica a los hongos filamentosos formadores de conidias.36
A pesar de todo, las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos no están tan desarrolladas como las de los antibacterianos. Los puntos de corte y los criterios de sensibilidad y resistencia de las levaduras para los antifúngicos fluconazol, itraconazol y 5-fluorocitosina, sólo están determinados para las micosis orofaríngeas de enfermos con SIDA. Por lo tanto, estos datos pueden variar en el futuro y hay que prestar atención a las nuevas normas que vayan publicando los comités de estandarización de ensayos In Vitro, tanto europeos (EUCAST) como americanos (NCCLS). 36
a. Principios del método
4.1 Características de las cepas en estudio:
A. Fenotipo de la cepa Cándida albicans:
Cándida albicans es considerada un hongo patógeno oportunista en mamíferos, entre ellos el hombre, que puede causar varias formas de candidiasis, desde infecciones superficiales en mucosas hasta enfermedades sistémicas que comprometen la vida. 37 predominantemente, en individuos con el sistema inmune debilitado.
Cándida albicans al igual que otros patógenos tiene la capacidad de adherirse y formar biopelículas en aparatos implantados, especialmente catéteres intravasculares lo que les confiere mayor resistencia a antifúngicos.38
Cándida albicans es capaz de sobrevivir como comensal en distintas localizaciones, y por ello está sometido a distintas presiones medioambientales. Esta habilidad amplía el espectro de enfermedades causadas por Cándida albicans y otras especies de Cándida, siendo su incidencia mayor que la de otros microorganismoscomensales.37
B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum
Trichophytum rubrum es un hongo dermatofito moniliaceo, hialino, con estructuras de fructificación que infecta a tejidos queratinizados como uñas, pelo y estrato córneo de la piel. 41
Macroscópicamente, las colonias son de color blanco algodonoso y de consistencia dura.40 La cepa granular se caracteriza por colonias planas que carecen de micelio aéreo, y semejan polvo de azúcar. 41
V. DEFINICIONES OPERACIONALES:
a. Variables:
I. Independiente:
Extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano)
II. Dependiente:
Actividad Antifúngica
VI. INDICADORES:
a. Independiente (x): concentración del extracto
Concentración alta: 50 mg/mL
*
Concentración media: 3.125mg/mL*
VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES:
Variable Independiente Definición Conceptual
Definición Operacional Indicador Índices Escala de
Medición
Variable
Indicador Índices Escala de
Medición cultivos de las cepas
ensayadas
VIII. METODOLOGÍA
a. Tipo de investigación
Se empleara el Diseño descriptivo, longitudinal y prospectivo:
Descriptivo: Porque el estudio se realizó en forma clara y detallando los hechos obtenidos en la investigación.
Longitudinal: Porque permitió la recolección sistemática de las variables involucradas en función del tiempo.
IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN:
Se agregó 2 g del extracto etanólico total de corteza de Byrsonima crassifolia. (Indano) en 10 ml de Dimetilsulfóxido (DMSO), para obtener una concentración de 200 mg/ml. Posteriormente se procederá a realizar el método de las diluciones dobles seriadas aditivas, para obtener diferentes concentraciones del mismo. 42
I. Procedimiento experimental:
a. Recolección de la muestra vegetal:
Las muestras de corteza de Byrsonima crassifolia. (Indano) fueron recolectadas en la Reservada Natural Allpahuayo - Mishana, Iquitos, PERÚ.
b. Identificación de la muestra vegetal:
Parte de la muestra vegetal de corteza de Byrsonima crassifolia,
(Indano) fue estudiada en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería Forestal, de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) la materia prima restante fue transportado al laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la misma universidad ubicado en la Av. Freyre N° 610 – Iquitos. La identificación taxonómica de la especie vegetal fue otorgada por el Herbarium Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana.
c. Obtención del extracto etanólico
ESQUEMA N° 01
Flujograma del Procedimiento Experimental de la Obtención del Extracto Etanólico del corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
Preparación de la extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia
Identificación Taxonómica Recolección de Muestras
Evaluación actividad antifúngica In Vitro
Test de Macrodilución
Cándida albicans cepa ATCC 90028
Trichophyton rubrum cepa ATCC 24953
ScreeningFitoquímico
ESQUEMA N°02
OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO
MATERIA PRIMA (CORTEZA)
SECADO (EN ESTUFA A 37 °C)
MOLIENDA MACERACION
(ETANOL 96 %)
CONCENTRACION (ROTAVAPOR A 40°C) EXTRACTO
ETANOLICO (POLVO)
ACTIVIDAD ANTIFUNGICA
SCREENING FITOQUIMICO
SELECCIÓN (CORTEZA SIN
X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO
a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios
1. Identificación de Alcaloides
Ensayo de Dragendorff.- A 2g de la muestra disolver en 1 ml. de solución de ácido clorhídrico al 1%, en ausencia de solvente orgánico se mezcla con una gota de reactivo, si hay opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) de color rojo ladrillo. Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado y se procede de la misma forma.
2. Identificación de Triterpenos y Esteroides
Ensayo de Liebermann-Buchard.- A 2g de la muestra disolverán 1ml de anhídrido acético y mezclar bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan correr 2 o 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado, sin agitar: Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración:
Rosado a azul muy rápido
Verde intenso a visible aunque rápido
Verde oscuro a negro final de la reacción
A veces el ensayo queda en fases o desarrollo de color. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio ocurre generalmente cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos.
Esta reacción se emplea también para diferenciar las estructuras esteroidales de los Triterpenoides; las primeras producen coloración azul o azul verdosa, mientras que en las segundas se observa rojo, rosado o púrpura.
3. Identificación de Quinonas
Ensayo de Borntrager.- La fracción disuelta en 1 ml de cloroformo se agita con 1 ml de solución de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o hidróxido de amonio al 5% en agua. Si la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera positivo (naftaquinona y antraquinona).
Un ensayo no excluye la presencia de quinonas, ya que pueden encontrarse en forma de glicósidos, siendo necesaria la hidrólisis previa de los mismos para su posterior detección.
4. Identificación de Cumarinas
Ensayo de Baljet.- Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamientos lactónicos, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo el ensayo: como las lactonas sesquiterpénicas, cardiotónicos, etc.
Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño maría y disolverse en la menor cantidad de alcohol (1 ml).En estas condiciones se adiciona 1ml de reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo.
5. Identificación de Saponinas
6. Identificación de Fenoles y Taninos
Ensayo de Cloruro Férrico.- A la fracción disuelta en 1 ml de etanol se añade 0.5 ml de una solución de cloruro férrico al 5% en solución salina. La aparición de un color o precipitado verde oscuro indica la presencia de fenoles y/o taninos. En el extracto acuoso se adiciona acetato de sodio previo al ensayo.
7. Identificaciónde Aminoácidos y Aminas
Ensayo de Ninhidrina.- Se toma una alícuota de extracto en alcohol. Si el extracto se encuentra en otro solvente orgánico, éste se evapora a sequedad. En ambos casos, se mezclan con 2 ml de solución al 0.2% de ninhidrina en alcohol. La mezcla se calienta de 5 a 10 minutos en baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se presenta un color azul violáceo.
8. Identificación de Flavonoides
XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS:
Esta técnica fue utilizada para determinar la sensibilidad antifúngica del extracto etanólico obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia. (Indano) frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum. 43
El método ensayado fue realizado según los procedimientos establecidos en el Protocolo M38 - P, elaborado por la NCCLS y modificado por Espinoza et al (2007). En el ensayo se utilizó como control negativo dimetilsulfóxido (DMSO) y como control positivo se utilizó el Ketoconazol y Fluconazol.43
A. Preparación de los antifúngicos: Ketoconazol y Fluconazol
El antifúngico usado y recomendado en el estudio se combinó con DMSO, posteriormente se procedió a realizar el método de las diluciones dobles seriadas aditivas, para obtener diferentes concentraciones, siendo para Ketoconazol 1280ug/mL la más alta hasta y 1.25ug/mL la más baja. Y para Fluconazol las concentraciones fueron 1600 ug/mL y la más baja 3.12 ug/mL. Posteriormente se procedió a repartir en alícuotas de 0.5 ml en el primer tubo, y luego 0.5 ml a tubos restantes, siendo un total de 10 tubos usados. 43
B. Controles positivos y negativos:
Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles positivos. En dichos controles deberá considerarse la utilización de Extracto Control positivo Control negativo
C. Cepas de hongos empleadas para estudio:
Se emplearon dos (02) cepas, Cándida albicans y Trichophyton rubrum, las cuales fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Salud (INS-Perú), se realizó el control de calidad de la solución madre y se comprobaron de igual manera otras características fenotípicas de las cepas.
D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos en estudio:
XII. Cándida albicans:
Se dejó crecer la cepa de Cándida albicans agar glucosado de sabouraud por 24 horas hasta obtener levaduras, para luego ser estudiadas. 44
XIII. Trichophyton Rubrum:
Se prepara a partir de un cultivo de 7 días de crecimiento a 35 °C en agar glucosado de patata (PDA), medio que induce la formación de conidias o esporangiosporas. 44
Para las especies del género Trichophyton Rubrumse parte de un cultivo de 48 a 72 h a 35 °C y posteriormente a 25-28 °C hasta completar siete días, en PDA
1. Para facilitar la recogida de conidias, introducir el asa de cultivo en Tween 20 y pasarla por encima de las conidias; después suspender en solución salina.
E. Preparación del inóculo
A partir de la solución madre, se tomara varias colonias y se deposita en un tubo conteniendo 9 ml de solución salina estéril al 0.9%; de esta suspensión ajustada a la escala 0,5 de Mc Farland 43 se diluye en medio Caldo RPMI 1640 (concentración 0,4 a 5x104 UFC/ml).43
F. Interpretación de los resultados:
El procedimiento experimental, se realizó 3 veces, para poder compararlos CMI, encontrados en los resultados diversos. La lectura se realizó visualmente a las 24 horas de incubación para Cándida albicans
y 72 horas de incubación para Trichophyton Rubrum comparando la turbidez de los tubos con la del control. 45
G. Lectura de los resultados de la concentración mínima inhibitoria (CMI): La concentración más baja a la que se produzca el cambio de turbidez se tomó como el valor de la CMI. El promedio de tres valores fueron calculados y se reportaron como la CMI. (Veces que repite el experimento)Para una correcta lectura se siguió las recomendaciones de Wiegand I. y col. 45
Se consideró que los extractos tenían una actividad antifúngica significativa cuando el CMI ≤ 1600 μg/mL. La actividad significativa se clasifica así:
Débil actividad antifúngica: CMI de 500 a 1600 μg/mL
Moderada actividad antifúngica: CMI de 100 a < 500 μg/mL
Buena actividad antifúngica: CMI < 100 μg/mL
XII. POBLACIÓN Y MUESTRA:
a) Población vegetal
La población vegetal en estudio estaba constituido por la especie vegetal de Byrsonima crassifolia (Indano)
b) Muestra vegetal Corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)
c) Población microbiológica La población microbiológica lo constituyen los hongos
d) Muestra microbiológica
Las muestras microbiológicas están constituidas por los hongos del género:
Cándida albicans cepa ATCC 90028
Trichophyton rubrum cepa ATCC 28188
e) Criterios de inclusión Sólo serán empleadas hongos jóvenes
f) Criterios de exclusión
XIII. MATERIALES,EQUIPOS Y REACTIVOS:
a) Material de vidrio
Embudos GERMANY
Erlenmeyers de 250 y 500 ml GERMANY
Frasco ámbar con tapa rosca TYREX
Matraz 1000 ml GERMANY
Micro pipeta Pasteur DIFCO
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml ANUX
Asa de Kolle para siembra bacteriológica STAN
Cuchillo mediano STINLES
Escobillas lava tubos DEX
Espátulas medianas STINLES
Gradilla metálica MERCK
Pinza estéril DIFCO
c) Otros materiales
Algodón INKAFARMA
Detergente ARIEL PODER LIMON
Guantes quirúrgicos INKAFARMA
Hisopos para medios de cultivos NENITOS
Mascarillas QUALITY
Papel de despacho WHON
Papel secante ELITE
d) Equipos
Autoclave AUTESTER
Balanza analítica SARTORIUS
Baño termostático SELECTA PRECISTERM
Cámara de flujo laminar POLIANRE CLASS II
Cámara fotográfica profesional SONY
Centrifuga CHRIST
Estufa SELECTA
Potenciómetro - pH meter CORNING PR 15
Refrigeradora FRIOLUX
Rotavapor BÜCHI
e) Reactivos:
Q.P. Ketoconazol AVANTOR
Q.P. Fluconazol AVANTOR
Ácido Sulfúrico 0.2M AVANTOR
Agua destilada MEDIFARMA
Carbonato de sodio ALDRICH
Dimetilsulfóxido (DMSO) AVANTOR
Etanol 96º INKAFARMA
f) Medios de cultivo
Agar Glucosado de Sabouraud OXOID
Agar Papa Dextrosa MERCK
Caldo RPMI 1640 DIFCO
g) Material de bioseguridad
Mandiles MEINZ
Guantes quirúrgicos descartables Nº7 ½ QUALITY
XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
2. Conocer la metodología de trabajo de cada sección del laboratorio. 3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia
Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son posibles.
Medidas a aplicar
• El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.
• El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad.
• Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención.
• Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN
XVI. RESULTADOS:
A. Rendimiento de la droga en estudio: Se obtuvo de la siguiente manera
𝑥 =R x 100%
w
R= Peso de muestra inicial – peso del extracto concentrado W= Peso seco (después de haberlo puesto en estufa)
𝑥 =(1200g − 500g) x 100%
1050g 𝑥 = 66.6 %
Equivalente a 799.2 gramos de muestra.
B. Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia “Indano”
Se encontraron los siguientes metabolitos secundarios en el extracto etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” taninos, flavonoides, lactonas y azucares reductores.
C. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo contra el hongo en estudio “Cándida albicans”
CuadroN°03
Se compararon los CMI encontrados en 3 repeticiones realizadas al mismo tiempo, al hongo Cándida albicans, teniendo como resultado 1.5625 mg/ mL
D. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo con el hongo en estudio “Trichophyton Rubrum”
CuadroN°04 N° VECES REALIZADAS
HORAS N° DE TUBO
CIM ENCONTRADO
1 REPETICION 72 08 0.39063 mg/mL
2 REPETICION 72 08 0.39063 mg/mL
3 REPETICION 72 08 0.39063 mg/mL
Grafico N°03
CuadroN°05
HONGO N(VECES) MEDIA
Cándida albicans 3 1,5625 mg/ml
Trychophyton rubrum 3 0.39063mg/ml
Resumen de los CMI encontrados a los hongos en estudio en el mismo tiempos y 3 repeticiones.
Grafico N°04
CONCENTRACIONES mg/Ml Trichophyton rubrum 0
10 20 30 40 50
1 2 3 4 5 6 7 8 9
CIM
XVII. DISCUSION:
Los resultados del tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano”, se realizó en el laboratorio de Fitoquimica de la Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias, siguiendo el procedimiento de acuerdo a los protocolos estandarizados del área de fitoquímica del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitarios - LIPNAA de la UNAP los resultados obtenidos fueron los siguientes: taninos, flavonoides, lactonas y azúcares reductores. Los resultados aportados por muchos autores, han atribuido la actividad antifúngica a los flavonoides identificados en varias especies vegetales, de las cuales se afirmó que poseen actividad antifúngica y actividad antibacteriana.
Para el control positivo se usó Ketoconazol y Fluconazol, que son antifungicos de primera línea según las especies de hongos en estudio, además son antifungicos más usados para diferentes pruebas de sensibilidad, presentando para Cándida albicans un CIM de 2.5 µg/mL encontrado en el tubo n° 10 y para Trychophyton rubrum un CIM de 3.12 µg/mL encontrado en el tubo n° 10 respectivamente dentro de este estudio.
El rendimiento del extracto de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” (aproximadamente 66.6 %), para obtener el máximo posible de extracto bruto.
una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia. QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó actividad antifúngica contra dos especies de Cándida albicans, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto de Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA), encontrado un CIM 0.312 mg/mL y 0.0078mg/mL
La corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” macerado en etanol mostraron buena actividad antifúngica, frente al hongo dermatofito Trychophyton rubrum, 0.39063 mg/mL, en el caso de MONROY R. (2011) evaluó una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, donde se obtuvo un extracto etanólico de Byrsonima crassifolia y de Malassezia
pachydermatis encontrando un CIM de 500 ug/mL respectivamente, QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó actividad antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM encontrado de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto de Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA).
En el presente estudio se mostró que el extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” presentaron efecto antifúngico, inhibiendo el crecimiento in vitro de los hongos Cándida albicans y Trychophyton rubrum por el método de macrodilución, estos resultados se acercan a los encontrados, RIVERO F. (2009) aislando 8 compuestos de Byrsonima crassifolia encontró muy buena actividad antifúngica del extracto etanólico contra Cándida albicans. MONROY R. (2011), evaluó una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia, también evaluó una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando un CIM de 500 ug/mL Malassezia
un CIM 0.312 mg/mL y 0.0078mg/mL, también demostró actividad antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM encontrado de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto de Dermatología y Cirugia de Piel (INDERMA).
XVIII. CONCLUSIONES:
o El análisis fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia. “Indano”, presentó los siguientes metabolitos secundarios: taninos, alcaloides, lactonas y azucares reductores.
o La concentración inhibitoria mínima de la Ketoconazol fue de 2.5µg/mL tanto para Cándida albicans y Fluconazol fue de 3.12µg/mL
Trichophyton rubrum.
o El extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia. “Indano”, presentó actividad antifúngica In Vitro sobre Cándida albicans y
Trichophyton rubrum.
XIX. RECOMENDACIONES:
Se debería desarrollar el ensayo antifúngico con los extractos macerados en diferentes solventes
Se recomienda realizar diseños de ensayos antifúngico con diferentes controles positivos y cepas de hongos a esta especie vegetal con el objetivo de profundizar su estudio.
Desarrollar otros ensayos como disco difusión, micro dilución, E – test, para corroborar la sensibilidad antifúngica de esta especie y así validar los resultados obtenidos en este estudio.
Las pruebas de sensibilidad antifúngica son influenciadas por un gran
número de factores como el tamaño del inóculo, temperatura, composición del medio y tiempo de incubación, por ello se debe controlar adecuadamente durante el desarrollo de la evaluación de sensibilidad antifúngica, para evitar la contaminación de otros hongos ambientales que puedan interferir en el ensayo.
XX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. SCHWINN A, EBERT J, BRÖCKER B.: Frequency of Trichophyton rubrum in Tinea capitis. Mycoses; 1995 4 (38): 1-7
2. RICHARDSON M, LASS-FLÖRL C. Changing epidemiology of systemic
fungal infections. Clin Microbiol Infect 2008; 14 Suppl 4: 5-24.
3. GONZALES M, RAMIREZ D.: Antecedentes y situación reguladora de la medicina herbaria en Cuba. U.A. E. M. 2007 – 45(3): 36 – 45
4. BALBACHAS A, HERMINIO, R.: Las plantas curan, .E.E.U.U., R. H. P. A.1999 – 7(9). 377 – 379.
5. KANE J, SUMMERBELL R, SIGLER L, KRAJDEN S, LAND G.1997. Laboratory handbook of dermatophytes: a clinical guide and laboratory handbook of dermatophytes and other filamentous fungi from skin, hair, and nails. Star Publishing Co, Belmont.
6. MÉNDEZ J, LÓPEZ R, HERNÁNDEZ F. (2004) Micosis superficiales. Dermatofitos. Micología Médica. México, UNAM, 2004 - 5 (2): 109-142.
7. SOUZA V, CASTILLO A, ROCHA M.: Ecología evolutiva de Hongos filamentosos. INCI 2001; 26(10): 513-17.
8. AMPARO H, PATRICIA C, RAMÓN F, ROBERTO A.: Dermatofitosis por Trichophyton rubrum. Experiencia de 10 años (1996-2005) en un servicio de dermatología de un hospital general de la Ciudad de México. Departamento de Micología del Hospital General Dr. Manuel Gea González, México,2005 - 5(3): 164 – 169
10.AL SOGAIR S, HAY R.: Fungal infection in children: Tineacapitis. C.D. 2000 – 18(2):679-85
11.WADE K, GHANNOUM A, ELEWSKI E.: Epidemiologic surveillance of cutaneous fungal infection in the United States from 1999 to 2002. J.A.A.D.2002 5(10): 748-752
12.OSTROSK - ZEICHNER, L.: New approaches to the risk of Candida in the intensive care unit. O. I. D.2003, 6 (16): 533-537.
13.RODRÍGUEZ J.: Dermatofitosis: Algunos aspectos epidemiológicos del Hospital Regional Docente de Trujillo de 1994 a 1998. Trujillo. Tesis para obtener el grado de Bachiller en Medicina. Escuela de Medicina, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Libertad. (2000)
14.BRACK. E.: El Oro Verde del Perú – Plantas Naturales.1995 – 3(14): 246 – 248
15.BRAKO L, ZARUCCHI J.: Catalogue of the Flowering Plants and Gymnosperms of Perú. Monographs in Systematic Botany from the Missouri Botanical Garden.1993 - 5(45): 124 – 127
16.GENTRY R.: Changes in plant communidad y diversity and floristic composition on environmental and geographical gradients. Missouri Bot. Gard., 1988 - 7(75): 1-34.
17.ARGUETA C., MATA S: Atlas de las plantas de la medicina tradicional
mexicana. Byrsonima crassifolia (L.) Kunth.
http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t= Nanche&i d=7985.2009. 45
19.MARTINEZ M, GONZÁLEZ R, CAZARES L, MORENO M, GARCÍA A.: Antimicrobial activity of Byrsonima crassifolia (L.) H.B.K. Journal of Ethnopharmacology 1999 - 66(1):79-82.
20.RIVERO F., J., SÁNCHEZ S., BENÍTEZ, G., CASIMIRO, X., IBARRA-ALVARADO, ROJAS-MOLINA, A., RIVERO-CRUZ, B.: Antibacterial Compounds Isolated From Byrsonima crassifolia.Rev. Latino-americana de Química. 2009 – 4(7): 2003 (20)1 – 11
21. MORALES J.: Detección de la actividad inhibitoria de quince extractos de plantas con actividad antimicrobiana contra nocardia brasiliensis. universidad de san carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Cuímicas y Farmacia. Guatemala 2011. 1 - 3
22.MONROY R.: “Actividad in vitro de seis plantas medicinales nativas contra los principales hongos dermatofitos y levaduriformes que afectan piel y anexos en perros”, Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Escuela de Medicina Veterinaria. Guatemala 2011, 36 – 37
23.PIO LEON J., DIAZ S., LOPEZ M., URIBE M., LOPEZ G., DELGADO F.: Actividad antibacteriana de extractos de frutos de nanchi (Byrsonima crassifolia (L.) Kunth), arrayán (Psidium sartorianum (O. Berg) Nied.) y ayale (Crescentia alata Kunth) Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Universidad de Santiago de Chile Santiago, Chile. 2013 - 4(12):356 – 364
24.QUIÑÓNEZ Y.: Evaluación de la actividad antifúngica In Vitro de extractos etanólicos de plantas de uso medicinal en Guatemala - Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de ciencias Químicas y Farmacia. Guatemala, 2014 - 2(4): 24 – 34
26.CORDERO J., BOSHIER H.: Árboles de Centroamérica. Un Manual para Extensionistas. CATIE. San José, Costa Rica.2003 – 8(9): 1079 – 1086
27.CAVALANTE B.: Frutas Comestíveis da Amazônia. Museu Paraense Emilio Goeldi. Coleção Adolpho Ducke, Brasil. 1996 – 10(14): 279 - 286.
28.VILLACHICA H.: Frutales y Hortalizas promisorias de la Amazonia. Tratado de Cooperación Amazónica. Rev. Pro Tempore. Perú. 1996 – 10(5): 367 -377.
29.PENNINGTON T., SARUKHÁN J.: Arboles tropicales de México. Manual para la identificación de las principales especies. U.N.A.M. Instituto de Ecología. México 2005 – 13(3): 304 -305, 2005
30.MORENO N. “El nance [(Byrsonima crassifolia L) H.B.K.] como recurso natural antimicrobiano en enfermedades gastrointestinales y respiratorias”. Rev. U. C. A. Chiapas, México. 2000 – 15(7):74 - 85.
31.OLIVEIRA R., LEITAO G., SANTOS S., BIZZO R., LOPES D., ALVIANO S., Ethnopharmacolohical study of two Lippia species from Oriximiná, Brazil. J. Ethnopharmacol. 2006 – 108(24): 103-108.
32.AYALA F.: Notes on some medicinal and poisonous plants of Amazonian Peru. Rev. Economy Botany. 1. 1984 – 4(9).1-8.
33.JUÁREZ C.: La Familia Malpighiaceae en el estado de Morelos. Facultad de Ciencias Biológicas. Cuernavaca, Morelos. Rev. ASHS PRESS 1998 – 12(7): 90 – 113
34.GARCÍA R., GARCÍA M. “Contribución al estudio etnobotánica del Nanche Byrsonima spp., distribución geográfica y alternativas de conservación de su plasma germinal”. Rev. Etnobotanica Mexican, México. 1992 – 7(9):139 - 146.
36.NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. (1997) .Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A. Villanova, National Committee for Clinical Laboratory Standards.
37.PEDREÑO, Y., MAICAS, S., ARGÜELLES, J.C., SENTANDREU, R., VALENTIN, and E.: The ATC1 Gene Encodes a Cell Wall-linked Acid Trehalase Required for Growth on Trehalose in Candida albicans. Rev. J. Biol. Chem. 2004 – 12(27): 4085- 4096.
38.BROWN C., BAKER C., BARKER K.: Mycotic diseases of the gastrointestinal tract. Rev. Maxie 2007 – 14(6): 229-231.
39.FIDEL, P, VAZQUEZ, A., and SOBEL D.: Candida glabrata: reviewof epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Rev. Clin. Microbiol 1999 –12(9): 80-96.
40.OSTROSKY L.: New approaches to the risk of Candida in the intensive care unit. Rev. Opin.Infect. 2003 – 16(5): 533-537.
41.CANTÓN E., ESTRELLA MARTÍN E., ESPINEL-INGROFF A. (2001) Revista Iberoamericana de Micología - ISBN: 84-607-3050-6; Pruebas estandarizadas para el estudio de la sensibilidad a los anti fúngicos,
42.RUIZ M., SÁENZ W. SÁENZ C.: Screening Fitoquímico de Productos Naturales. Laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonía (LIPNAA) (2000).
44.MITSCHER L.et al.: Antimicrobial agents from higher plants. Introduction, rationale and methodology. Lloydia 1972 - 35: 157-166.
45.NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. (2002) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A2. Wayne, Pa, National Committee for Clinical Laboratory Standards.
46.GUERRA G. Y GUERRA H. (2000) Bioseguridad en el Laboratorio. Bioseguridad. Ministerio de Salud del Perú, Instituto Nacional de Salud-INS. Organismo Público Descentralizado del Sector Salud.
XXI. ANEXOS:
ANEXO Nº 01
IMAGEN SATELITAL DE LA UBICACIÓN GEOGRÁFICA DE LA RESERVA NATURAL ALLPAHUAYO – MISHANA
ANEXO Nº 02
DATOS DE PASAPORTE DE COLECCIÓN DE ESPECIES DE LAS PLANTAS MEDICINALES EN ESTUDIO Posición de Hojas:……….Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:…………. Forma del Tallo:……….Órganos Accesorios en Tallo:……… Características de la Corteza:………….…Látex:………….Color de Látex:………….….... Tipo de Inflorescencia:………….Posición de Inflorescencia:…………... Tipo de Flor por Sexo:...Nº de Pétalos:...Unión de Sépalos:…….…….. N de Estambres:...Posición de Estambres:……... Posición de Ovarios:…………...Nº de Carpelos:……….…..……… Tipo de Fruto:……….Consistencia:…………..…..Dehiscencia:…….……..….
DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS:
Uso Medicinal 1:……….…Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………... Uso Medicinal 2:……….…Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………... Uso Medicinal 3:……… Parte Usada:………... Cantidad Usada .:……… Forma de Preparación:…………...
ANEXO Nº 03 MUESTRA BOTÁNICA
ANEXO Nº 04
DESCRIPCIÓN DEL FENOTIPO DELAS CEPAS ESTUDIADAS
IMAGEN Nº 02: Imagen de colonias pertenecientes a Cándida albicans
ANEXO N° 05
SECADO Y MOLIENDA DE LA MUESTRA VEGETAL
ANEXO N° 06
OBTENCIÓN DE LA EXTRACTO ETANÓLICO
FOTO Nº 03: Obtención del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia
ANEXO Nº 07
TAMIZAJE FITOQUIMICO
ANEXO N° 08
CERTIFICACION INS – HONGOS
ANEXO N°09
INCUBACION DE HONGOS
FOTO 06: Se incubaron a 37 °C
PERIODO DE CRECIMIENTO DE LOS HONGOS
FOTO 07: Por 2 días para Cándida albicans
ANEXO N°10
PREPARACION DE ANTIFUNGICOS (Ketoconazol y Fluconazol)
FOTO N°09: Preparación de controles positivos FOTO N°10: Disolución de muestra
FOTO N°11: Preparación de baterías para pruebas FOTO N°12: Preparación de caldo RPMI 1640
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