Adrián González Guzmán
Respuesta del trigo a los hongos
entomopatógenos: efecto del método
de inoculación, cultivo y suelo
AUTOR: Adrián González Guzmán
© Edita: UCOPress. 2020 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 A 14071 Córdoba
https://www.uco.es/ucopress/index.php/es/
Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y de Montes (ETSIAM). Departamento de Agronomía
Respuesta del trigo a los hongos entomopatógenos:
efecto del método de inoculación, cultivo y suelo
Tesis presentada por Don Adrián González Guzmán
Fdo. Adrián González Guzmán
V°B° de los directores
Profesora Dra. María del Carmen del Campillo García, Catedrática del
Departamento de Agronomía, ETSIAM, Universidad de Córdoba
Profesor Emérito Dr. José Torrent Castellet, Departamento de Agronomía, ETSIAM, Universidad de Córdoba
Córdoba, junio 2020
GONZALEZ GUZMAN ADRIAN - 77413854V
Firmado digitalmente por GONZALEZ GUZMAN ADRIAN - 77413854V Fecha: 2020.06.09 10:19:14 +02'00'
DEL CAMPILLO GARCIA MARIA DEL CARMEN -
05387706W
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TORRENT
CASTELLET JOSE - 37704567T
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School of Agricultural and Forestry Engineering Department of Agronomy
Response of wheat to entomopathogenic fungi:
effect of inoculation method, crop, and soil
Thesis presented by Mr. Adrián González Guzmán
Signed. Adrián González Guzmán
Director’s approval: Signed
Prof. María del Carmen del Campillo Prof. Emer. José Torrent Castellet
University of Córdoba, ETSIAM University of Córdoba, ETSIAM
Cordoba, June 2020
GONZALEZ GUZMAN ADRIAN - 77413854V
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DEL CAMPILLO GARCIA MARIA DEL CARMEN -
05387706W
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TORRENT
CASTELLET JOSE - 37704567T
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Fecha: 2020.06.09 11:47:35 +02'00'
para la obtención del título de Doctor con Mención Internacional:
• Estancia internacional predoctoral de 3 meses (del 17 de marzo al 17 de junio de 2019) en el grupo de investigación “Rhizosphere” perteneciente al “Center for Plant System Biology” adscrito al centro de investigación VIB de la Universidad de Ghent, bajo la supervisión de la Profesora Sofie Goormachtig, investigadora principal del grupo.
• La Tesis Doctoral cuenta con el informe previo de dos doctores externos con experiencia acreditada pertenecientes a alguna institución de educación superior o instituto de investigación diferente de España:
o Dr. Jessé R. Fink. Department of Soils, Federal Institute of Paraná, Brasil.
o Dr. Paul Hill. Environment Centre Wales, School of Natural Sciences, Bangor University, Reino Unido.
• Un miembro del tribunal de la tesis es un doctor perteneciente a alguna institución de educación superior o centro de investigación no español: Dr. Franco Ajmone Marsan. Department of Agricultural, Forest and Food Sciences, Università degli Studi di Torino, Italia.
• Parte de la Tesis Doctoral, de acuerdo con la normativa, se ha redactado y se presentará en dos idiomas, castellano e inglés.
• Los capítulos II y III corresponden a artículos publicados en las revistas Annals of
Applied Biology y Agronomy, ambas incluidas en el primer cuartil de su correspondientecategoría.
El doctorando
Fdo.: Adrián González Guzmán
GONZALEZ GUZMAN ADRIAN - 77413854V
Firmado digitalmente por GONZALEZ GUZMAN ADRIAN - 77413854V Fecha: 2020.06.09 10:20:02 +02'00'
cual estaba asociada al proyecto AGL2014-57835-C2-2-R, ambos financiados
por el Ministerio de Economía y Competitividad y el Fondo Europeo de
Desarrollo Regional (FEDER).
i
Agradecimientos
Agradezco cada gota de sudor para darnos una vida mejor, que me hayan enseñado que no sirve un “no soy capaz” por respuesta, y también el significado de la palabra esfuerzo y perseverancia que, al final, son imprescindibles en una tesis doctoral; gracias, Papá y Mamá. Agradezco su apoyo moral incondicional transmitiéndome su cariño en todo momento; gracias, San. No puedo dejar sin dedicar unas palabras a “La Pirri”, esa gran mujer luchadora, que, con su ejemplo, me ayudó a valorar las pequeñas cosas y la que allá donde esté me ayuda a alcanzar mis metas; gracias, Abuela.
Doy las gracias a mi segunda familia cordobesa comenzando con mis líderes Campi y Pepe y nuestro “MacGyver” Vidal, que además de ser unos reconocidos investigadores y grandes docentes son excelentes como personas. Ellos me han guiado y me han dejado volar permitiéndome cumplir uno de mis sueños; ser doctor. Se merecen la misma gratitud mi segunda madre en Córdoba, Merchuquis; el meticuloso, curioso y siempre dispuesto, Juanma; a Zipi y Zape, porque las salidas al campo no serían igual de divertidas sin vosotros y vuestras rimas tan famosas…, “Valen” y “Jusep”;
a los fichajes de invierno con las que tanto me he reído y tantas veces me han levantado el ánimo, Moni y Truji y a un referente en esta dura carrera como científico, con el que tantas tardes he compartido y del que he recibido numerosos y valiosos consejos, el ya profesor Antonio. No me puedo olvidar de quién me ayudó a dar los primeros pasos en la investigación científica, gracias, Jordi y Augusto.
La tesis necesitaba más ayuda, pero ahí estaba Silvi, la cual tiene una paciencia infinita y a la que le debo mucho de lo que he aprendido, gracias. Gracias por las cortas pero numerosas charlas y discusiones de ciencia que hemos tenido, ha sido un auténtico placer compartir esta etapa contigo, cuanto te voy a echar de menos Bro. Siempre me han tendido la mano y ayudado en lo que he necesitado, a pesar de “invadir” el AGR-163 no me han tirado de los pelos, gracias a Inma, Nati, María, Caramele y en especial a Enrique Quesada por sus consejos, sabiduría, y por aguantarme a pesar de su escaso pero valioso tiempo. No puede faltar en estas líneas el personal que está todos los años al “pie del cañon”, y que nos ha proporcionado la oportunidad de realizar los ensayos de campo, gracias Juan Carlos Moreno y Paco Moreno por vuestros conocimientos y sabiduría compartida.
Junto con ellos dos, el profesor y agricultor Dr. Mariano Fuentes, y los encargados de los ensayos de campo de la Agrupación Cordobesa de Agricultores (S.A.T.) Rafael Carranza y Miguel Sánchez, que han sido pilares básicos para desarrollar los ensayos de trigo en campo, no olvidaré el traje de apicultor!.
Quiero agradecer a Sofie Goormachtig y Emilie Froussart por darme la oportunidad de hacer una inmersión en el mundo de la genética y a todos los miembros del grupo Rhizosphere del VIB-UGent.
Lola se merece un hueco aquí por su gran generosidad y por introducirme en este mundo.
ii
Me gustaría agradecer al equipo anónimo de SCI-HUB por luchar y facilitar una información científica libre.
La tesis se extiende fuera del laboratorio y del despachito, llegando muchas veces a casa. ¡Pero no pasa nada! ahí estaban unas personas estupendas, “La Chicha”, “McMolder”, Rubén, Pablito y Luisiño y Silviña, para los cuales no tengo folios suficientes para agradecer y desmenuzar las aventuras vividas. ¡Gracias fenómenos!
Una bocanada de aire fresco, esos son mis grandes amigos de la infancia de Puente Caldelas, los cuales me hacen sentir como si no pasara un día sin verlos después de los 12 años que llevo fuera. En los pocos, pero intensos viajes a Galicia, Santiago es una parada obligada porque están mis
“Bichologos”, entre los que destaco a Pepa por aguantarme y apoyarme en grandes decisiones, a veces muy difíciles; las cuales también fueron refrendadas por Marcos y Jos, dos grandes sabios que uno siempre quiere tener cerca.
Para finalizar, cuando alguna batalla parecía perdida, llegaba el escuadrón de caballería desde Sevilla y Cádiz, ellos saben a quienes me refiero… Entre ellos quiero destacar a los miembros del
“trío calavera” y en especial, a mi hermano mayor y fiel amigo que tanto le debo y con el que tan buenos momentos he disfrutado, aprendiendo siempre de su experiencia, gracias, Deivid.
Como creo que la más sincera gratitud se consigue con gestos y no con palabras, espero haber estado a la altura —tanto como lo habéis estado vosotros— y demostrar lo que se os quiere y aprecia.
Desde el corazón Adri (El Galle).
iii
Abreviaturas/Abbreviations
ACCE: Active CaCO3 equivalent or active lime
ADM: Aerial dry matter
AME: Ascomicetos mitospóricos entomopatógenos
ANOVA: Analysis of variance
Bb-Seed: Beauveria bassiana applied by seed dressing
Bb-Soil: Beauveria bassiana applied to the soil surface
C: Control
CCE: Total CaCO3 equivalent
CECT: Spanish Collection of Culture Types CFU: Colony forming units
DAS: Days after sowing
DTPA: Diethylenetriaminepentaacetic acid EC: Electrical conductivity
EF: Entomopathogenic fungi
EMA: Entomopathogenic Mitosporic Ascomycetes
ENC: Encineño farm soil ENC2: Encineño farm soil 2
FAO: Food and agriculture organization of the United Nations
HE: Hongo entomopatógeno IQR: Interquartile range
ISR: Induced systemic resistance LSA: Leaf surface area
LSD: Least significant differences LT: Leaf thickness
Mb-Seed: Metarhizium brunneum applied by seed dressing
Mb-Soil: Metarhizium brunneum applied to the soil surface
OC: Organic carbon ORI: Origuero farm soil
PAR: Photosynthetic active radiation PRAG: Pragdena farm soil
RDM: Root dry matter RL: Root length RSA: Root surface area
SDAC+D: Sabouraud dextrose chloranphenicol agar plus dodine
SDCA: Sabouraud dextrose chloranphenicol agar
SDW: Sterile deionized water SI: Supporting information SLA: Specific leaf area SM: Supplementary material
SPAD: SPAD unit (Leaf chlorophyll content) SRA: Specific root area
SRL: Specific root length Ta: Triticum aestivum Td: Triticum durum
TGW: Thousand grain weight WHO: World health organization WRB: World reference base WUE: Water use efficiency
v
Resumen
Los hongos entomopatógenos (HEs) son efectivos agentes de control biológico de especies fitófagas —causantes de pérdidas de rendimiento y calidad de los cultivos. Estudios recientes destacan nuevos caracteres funcionales en la ecología de los HEs: endófitos de plantas vasculares, antagonistas frente a patógenos, promotores del crecimiento y mejoradores nutricionales de la planta huésped. No obstante, la mayoría de los estudios previos se han realizado en condiciones controladas, minimizando los factores ambientales que pueden condicionar su comportamiento. En esta tesis, dos HEs, Beauveria bassiana (cepa EABb 04/01–Tip) y Metarhizium brunneum (cepa 01/58-Su), caracterizados por su uso en prácticas de biocontrol, se inocularon en trigo cultivado en suelos naturales no estériles, a fin de observar sus efectos en el crecimiento, rendimiento y nutrición de la planta.
Se evaluó en primer lugar el comportamiento de trigo duro y blando cultivado en dos vertisoles calcáreos tras la aplicación de B. bassiana y M. brunneum usando diferente metodología —aplicación directa de la suspensión fúngica al suelo o revestimiento de la semilla—, en condiciones de laboratorio y usando suelos no estériles. Ambos hongos demostraron ser competentes en la rizosfera, persistentes en el suelo a lo largo de todo el cultivo y colonizadores de trigo duro y blando. En el cultivo de trigo blando se incrementó la biomasa aérea en un 17.4% con B. bassiana aplicada a la semilla y un 20.6 y 26.9% con la aplicación de M. brunneum al suelo y a la semilla, respectivamente, a los 69 días después de la siembra. En el trigo duro, la aplicación de B. bassiana y M. brunneum directamente al suelo disminuyó leve pero significativamente la biomasa aérea en cosecha (5.3% y 6.1%, respectivamente) y el rendimiento en grano (6.6% y 5.5%, respectivamente), mientras que la aplicación a la semilla de ambos hongos incrementó hasta en un 4.3% y 2.9% la biomasa aérea en cosecha y rendimiento de grano, respectivamente. En trigo blando no se vieron diferencias significativas de rendimiento a pesar de que este llegó a incrementarse con la aplicación de B. bassiana a la semilla hasta en un 10.5%
respecto al control. La aplicación al suelo de ambos HEs y la aplicación a semilla de B. bassiana incrementó la absorción y la concentración de Mn en el grano de trigo duro. Metarhizium brunneum incrementó significativamente la cantidad de Zn en el trigo blando cultivado en el suelo con los valores de Zn más bajos. Finalmente, la concentración de Zn en grano estuvo inversamente relacionada con la producción de este.
En el siguiente experimento en cámara de cultivo se examinó como afectan las propiedades edáficas al rendimiento del trigo duro inoculado con B. bassiana y M. brunneum —aplicación a la semilla— y cultivado en 12 suelos agrícolas. Las plantas fueron fertilizadas con todos los nutrientes excepto P y Zn. Las plantas inoculadas con B. bassiana tuvieron mayor rendimiento en grano e índice de cosecha (17% y 14%, respectivamente), mientras que en las tratadas con M. brunneum el aumento
vi
no fue significativo (6% y 6%, respectivamente). El incremento en el rendimiento en grano del trigo inoculado con B. bassiana estaba positiva y significativamente correlacionado con los niveles de P disponible del suelo y en el del inoculado con M. brunneun con el contenido de óxidos de Fe poco cristalinos. Además, el incremento en la biomasa aérea de las plantas inoculadas con B. bassiana respecto al control estaba inversa y significativamente correlacionado con los niveles de Zn disponible en el suelo. Se observó también un efecto dilución (disminución de la concentración en grano por un incremento en el rendimiento) para P y Zn. Sin embargo, se incrementó la removilización de Zn al grano y el contenido total de Zn en el mismo con el tratamiento de B. bassiana.
Finalmente, en dos campos de la Campiña de Córdoba —y durante 2 campañas sucesivas (2015- 2017)— se examinó el comportamiento y efecto de las dos cepas de HEs sobre trigo duro cultivado en vertisoles calcáreos pobres en Zn. Los hongos se aplicaron directamente al suelo (campaña 2015–
2016) o por revestimiento de la semilla (campaña 2016–2017). La persistencia de ambos hongos en el suelo durante la primera campaña fue relativamente baja. El re–aislamiento de M. brunneum en plantas de trigo fue del 16.6% y 4.1% con la aplicación al suelo y a la semilla, respectivamente, mientras que B. bassiana fue re–aislada únicamente tras la aplicación a la semilla (16.6%). La diferencia en la producción de grano entre la primera y segunda campaña (~1 frente a ~4 t ha-1, respectivamente) se debió en esencia a la mayor precipitación en la segunda. Ambos hongos incrementaron la biomasa aérea en 5 de los 7 muestreos realizados antes del espigado en el periodo de estudio, 3 de los cuales con P < 0.10 con ambos hongos y 2 con P < 0.05 con B. bassiana. Además, el tratamiento con B.
bassiana incrementó significativamente la longitud radicular y el área superficial en las raíces más finas con ambos métodos de aplicación, mientras que la longitud radicular y el área superficial total de la raíz lo hizo únicamente con la aplicación al suelo. El rendimiento final del cultivo no se vio significativamente afectado por ningún HE ni por la forma de aplicación. Finalmente, M. brunneum incrementó la concentración de P y Na en grano con la aplicación al suelo mientras que B. bassiana aplicada a la semilla disminuyó la vitrosidad del grano.
En esta tesis, las cepas de HEs, Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip y Metarhizium brunneum 01/58- Su han demostrado, en resumen, su potencialidad como biofertilizantes y bioestimulantes, pero condicionadas a factores ambientales y métodos de aplicación que deben de tenerse presentes antes de la inoculación.
Palabras clave
Beauveria bassiana; Metarhizium brunneum; revestimiento a la semilla; aplicación al suelo; promoción del crecimiento de la planta; rendimiento del grano; fósforo, zinc; interacción planta–suelo–hongo;
manejo del trigo; alternativas verdes.
vii
Summary
Entomopathogenic fungi (EF) are effective biocontrol agents against phytophagous species, which can severely impair crop quality and yield. Recent studies have revealed new traits in EF ecology and exposed previously unknown roles as vascular plant endophytes, pathogen antagonists, growth promoters and nutritional enhancers for host plants. However, most of the studies uncovering the new roles were performed under controlled conditions and hence with a minimal influence of environmental factors. In this doctoral work, the entomopathogenic fungal strains Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip and Metarhizium
brunneum 01/58-Su, which are typically used for biocontrol purposes, were inoculated onwheat grown in non-sterilised natural soils in order to examine their effects on plant growth, yield and nutrition.
Experiments involved assessing the performance of durum and bread wheat grown in two calcareous Vertisols under the effect of B. bassiana and M. brunneum directly applied to the soil or used for seed dressing, and also under growth chamber conditions and on non- sterilised soils. Both fungi proved rhizosphere-competent, persistent in soil throughout the crop cycle and effective colonizers of the two wheat species. Seed dressing with B. bassiana increased aerial dry matter (ADM) 69 days after sowing (DAS) in bread wheat by 17.4%; on the other hand, application to soil and seed dressing with M. brunneum increased this variable by 20.6 and 26.9%, respectively. By contrast, direct application of B. bassiana and M. brunneum to the soil slightly but significantly decreased ADM at harvest in durum wheat by 5.3 and 6.1%, respectively, and grain yield by 6.6 and 5.5%, respectively. On the other hand, seed dressing of either fungus increased ADM and grain yield by 4.3 and 2.9%, respectively. Bread wheat exhibited no significant differences in grain yield despite its levels with B. bassiana seed dressing being up to 10.5% higher than with the Control treatment (no fungus added).
Application to soil of either fungus, and seed dressing with B. bassiana, increased Mn absorption and grain concentration in durum wheat. Metarhizium brunneum significantly increased the Zn content of bread wheat grown in the soil with the lowest available Zn levels.
Finally, Zn grain concentration was inversely correlated with yield.
A growth chamber was used to examine the effects of edaphic properties on performance
in durum wheat seed-dressed with B. bassiana or M. brunneum and grown on 12 different
agricultural soils. Plants were supplied with all nutrients except P and Zn. Fungal inoculation
viii
increased grain yield and harvest index significantly with B. bassiana (17 and 14%, respectively), but not with M. brunneum (6 and 6%, respectively). The increase in grain yield was positive and significantly correlated with soil available phosphorus in plants inoculated with B. bassiana, and also with soil content in poorly crystalline Fe oxides in those inoculated with M. brunneum. The increase in ADM resulting from inoculation with B. bassiana was negatively correlated with soil available Zn. There was also a dilution effect (viz., grain nutrient concentrations were decreased by effect of an increased grain yield) for P and Zn.
However, inoculation with B. bassiana increased Zn remobilization and plant Zn uptake.
In an additional experiment, two experimental fields in the countryside Cordoba, southern Spain, were used to examine the behaviour and effects of the two EF on durum wheat grown on Zn-poor calcareous Vertisols over two consecutive seasons (2015–2017). The fungi were either directly applied to the soil (2015–2016 season) or used for seed dressing (2016–2017 season). Fungal persistence of both species in the soil was low in the first season. Re-isolation of M. brunneum within wheat plants was 16.6% with soil application and 4.1% with seed dressing. On the other hand, re-isolation of B. bassiana within durum wheat was only observed with seed dressing and amounted to 16.6%. The difference in grain yield between the first and second season (~1 t ha
–1vs 4 t ha
–1) was basically a result of increased precipitation in the second. Both fungi increased ADM in 5 of the 7 samplings conducted before the wheat heading stage for the period of study (3 of them significantly at P < 0.10 with both fungi and 2 at P < 0.05 with B. bassiana). Additionally, B. bassiana increased root length and root surface area in the finest roots with both application methods, and application of this fungus to soil significantly increased total root length and root surface area at the stem elongation stage. Grain yield was significantly affected by neither fungus nor application method. Finally, M. brunneum increased P and Na grain nutrient concentrations, whereas B. bassiana applied by seed dressing decreased grain vitrosity.
In summary, the EF strains Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip and Metarhizium brunneum 01/58-Su can be effective biofertilizers and bioestimulants provided the potential effects of environmental factors and application method are assessed before inoculation.
Keywords
Beauveria bassiana, Metarhizium brunneum, seed dressing, soil application, plant growth promotion.
grain yield; phosphorus; zinc; plant–soil–fungus interaction; wheat management; green alternatives.
ix
Índice
Agradecimientos ... i Abreviaturas/Abbreviations ... iii Resumen ... v Summary ... vii Índice ... ix
CAPÍTULO I: Introducción y objetivos... 1 1. Microorganismos en la agricultura ... 3 Bacterias ... 5 Hongos ... 6
1.2.1. Micorrizas ... 6 1.2.2. Hongos asociados a las raíces (HAR) ... 6 1.2.3. Hongos entomopatógenos ... 7 1.2.3.1. Clasificación y diversidad ... 7 1.2.3.2. Ciclo reproductivo ... 7 1.2.3.3. Hábitat o reservorio natural ... 10 1.2.3.4. Influencia de factores ambientales: bióticos y abióticos ... 10 1.2.3.5. Uso de los hongos entomopatógenos: método de aplicación ... 112. Los hongos entomopatógenos como promotores del crecimiento y
mejoradores de la nutrición vegetal ... 12 Promotores del crecimiento de las plantas ... 13 Mejoradores de la nutrición vegetal... 13 3. Aspectos específicos del uso de hongos entomopatógenos sobre cultivos en ambientes mediterráneos ... 14
Características de los suelos de las regiones mediterráneas ... 14
Problemas nutricionales típicos ... 14
3.2.1. El fósforo (P) ... 14 3.2.2. El zinc (Zn) ... 16 3.2.3. La interacción P–Zn ... 18 3.2.4. Mejora de la nutrición de Zn: técnicas y posibilidades ... 194. Objetivos de la presente tesis doctoral ... 20
x
CAPÍTULO II: Effects of entomopathogenic fungi on growth and nutrition in wheat grown on two calcareous soils: influence of the fungus application method . 21
1. Summary ... 25 2. Introduction ... 26 3. Material and methods ... 27 Experimental design, crops, soils, and pots ... 27 Fungal treatments ... 28 Fungal re-isolation ... 29 Plant growth: height, dry matter, and nutrient concentrations ... 30 Statistical analysis ... 30 4. Results ... 31 CFU monitoring ... 33 Fungal re-isolation from inoculated plants ... 34 Plant height and dry matter production ... 35 Plant nutrient uptake ... 40
4.4.1. Effects of crop and soil ... 40 4.4.2. Effects of fungal treatment 69 days after sowing ... 41 4.4.3. Effects of fungal treatment at harvest ... 42 4.4.4. Grain nutrient concentration ... 425. Discussion ... 44
Fungal presence in soils and plants ... 44 Influence of soil type on plant growth and nutrient contents ... 44 Influence of the fungal treatments on plant growth ... 45 Influence of fungal treatment on nutrient uptake ... 46 6. Conclusions ... 47 7. Acknowledgments ... 47
CAPÍTULO III: Soil nutrients effects on the performance of durum wheat
inoculated with entomopathogenic fungi ... 49
1. Abstract ... 53
2. Introduction ... 54
3. Materials and methods ... 55
Experimental design ... 55
Crop ... 55
xi
Soils and soil properties ... 55 Fungi ... 58
3.4.1. Fungal Isolates ... 58 3.4.2. Fungal Preparation ... 58 3.4.3. Fungal treatment: seed dressing ... 58Pot experiment ... 58 Plant growth, gas exchange, water use efficiency (WUE) and nutrients analyses 59 Statistical analysis ... 60 4. Results ... 61 Plant growth and yield ... 61 Nutrient uptake and grain nutrient concentration ... 62 Gas exchange variables and water use efficiency ... 65 Effect of fungal inoculation on plant performance in relation to soil properties 65 Changes in nutrient availability ... 68 5. Discussion ... 70 Plant Growth in Relation with Soil Nutrients ... 70 Effect of fungal inoculation on plant growth, grain yield, photosynthesis rate and water use efficiency ... 70
Effect of Fungal Inoculation on Plant Nutrition and Grain Quality ... 72 6. Conclusions ... 73 7. Acknowledgments ... 74
CAPÍTULO IV: Effects of entomopathogenic fungi on durum wheat nutrition and growth in the field ... 75
1. Abstract ... 77
2. Introduction ... 78
3. Material and methods ... 79
Study site and experimental design ... 79
Crops ... 80
Environmental conditions ... 80
3.3.1. Weather ... 80 3.3.2. Soil ... 81Fungi ... 82
xii
3.4.1. Soil application (2015/2016 season) ... 83 3.4.2. Seed dressing (2016/2017 season) ... 83
Fungi in soil and plants ... 83
3.5.1. Colony forming units ... 83 3.5.2. Plant colonization by EF ... 84Plant performance over the plant cycle ... 85 Statistical analysis ... 86 4. Results ... 89 Soil properties and climate ... 89 Presence of the fungi in soil and plants ... 89 Germination and leaf morphophysiology ... 91 Root biomass and architecture ... 91 Aerial dry matter and grain yield ... 94 Nutrient uptake and grain quality ... 95 5. Discussion ... 98 Fungal re-isolation ... 98 Plant growth ... 98 Nutrient uptake and grain quality parameters ... 100 6. Conclusions ... 101
CONCLUSIONES GENERALES ... 103
REFERENCIAS ... 107
ANEXOS ... 125
Anexo 1. Material suplementario del Capítulo II ... 127
Anexo 2. Material suplementario del Capítulo III ... 141
Anexo 3. Material suplementario del Capítulo IV ... 155
Anexo 4: Producción científica en el periodo de realización de la tesis ... 167
Anexo 5: Estancia de investigación ... 171
1
CAPÍTULO I:
Introducción y objetivos
3
La agricultura se origina con la llamada “Revolución Neolítica” hace más de 9000 años. Desde entonces grandes hallazgos han permitido el crecimiento de la población humana a lo largo de su historia. La selección de caracteres fenotípicos de gran interés (por ejemplo, el tamaño del fruto) o la invención del proceso de Haber-Bosch (1906-1913) para la producción de amoníaco son algunos de los más destacados. Debido al crecimiento acelerado de la población humana a mediados del siglo pasado y la consecuente demanda de alimento surgió la primera Revolución Verde (1966- 1985), de la que emergieron nuevos y grandes avances científicos que triplicaron la producción alcanzada hasta el momento con solo un aumento del 30% de la tierra cultivada (Pingali, 2012). Las principales causas fueron los acuerdos de gobiernos y la mejora genética de las variedades de cultivos de primera necesidad —trigo, arroz y maíz (Alloway, 2008a). Este notable incremento de la producción trajo asociado un mayor uso de insumos tales como fertilizantes y pesticidas, provocando la disminución de las reservas de nutrientes tan esenciales como el fósforo (P) (MacDonald et al., 2011) o la contaminación y/o eutrofización de suelos y aguas por un uso abusivo y descontrolado de pesticidas y/o fertilizantes. A su vez, la agricultura intensiva ha reducido en muchos casos los niveles de nitrógeno (N) y P en los suelos pero también los de otros macro- y micronutrientes (Alloway, 2008b).
Estos hechos, asociados a la demanda de enormes cantidades de energía en los procesos industriales (viz. proceso Haber–Bosch) y de combustibles fósiles, está provocando hoy en día una crisis de sostenibilidad ambiental. El problema continua con el rápido crecimiento de la población humana, estimándose que los recursos alimenticios producidos no cubrirán las demandas requeridas por el ser humano en 2050 (Mueller et al., 2012; Searchinger, 2013). En consecuencia, la sociedad requiere nuevas alternativas sostenibles en el campo de la agricultura que protagonizarán la segunda Revolución Verde —basándose en la ingeniería genética, las tecnologías de la mecanización, la optimización de cultivos y el uso de microorganismos (Jhala, 2017)— necesaria para una vida más limpia, saludable y sostenible para las siguientes generaciones de humanos, fauna y flora en el planeta.
1. Microorganismos en la agricultura
El uso de microorganismos en la agricultura es un reto clave del siglo XXI para alcanzar una producción sostenible y de calidad. Estos organismos son esenciales en los procesos funcionales del suelo tales como la descomposición de los residuos orgánicos y la mejora de su fertilidad (Johansson et al., 2004) —regulando su calidad y productividad (Harris, 2009)—, o como agentes de control de plagas (O’Brien, 2017).
Se estima que existen unas 300000 especies de plantas en el planeta, cuya gran mayoría contienen microorganismos endófitos (Smith & Read, 2008) —microorganismos capaces de penetrar dentro de la planta sin causarle daños aparentes— siendo prácticamente una excepción aquellas plantas que no los contienen (Partida-Martínez & Heil, 2011), las cuales son más susceptibles de sufrir estreses
CAPÍTULO I
4
ambientales (Timmusk et al., 2011). Estos microorganismos —bacterias, hongos, actinomicetos, protozoos y algas— están representados en un 95% por bacterias (Glick, 2012).
Los llamados bioinoculantes son microorganismos que interaccionan positivamente con la planta y suelen presentar especificidad con esta, lo que implica un estudio exhaustivo previo para su correcta aplicación (Berg & Smalla, 2009) y no alterar así la estabilidad del ecosistema. El uso frecuente de bioinoculantes en la agricultura durante los últimos 35 años (Inglis et al., 2001) ha permitido esclarecer una serie de ventajas frente a pesticidas y fertilizantes químicos (Timmusk & Wagner, 1999; Berg, 2009). Consecuentemente, el uso de bioinoculantes se ha incrementado a razón de un 10% anual (Berg, 2009) llegando su valor en el mercado global a unos 1300 millones de dólares en 2020 (Transparency-Market-Research, 2014).
Los bioinoculantes se pueden clasificar de diversas formas (Berg, 2009; Rodriguez et al., 2009), utilizándose en esta tesis la clasificación propuesta por Gray & Smith (2005) y Owen et al (2014), la cual ha sido resumida y adaptada para enfatizar los organismos evaluados en esta (Figura 1). En ella se diferencian dos grandes grupos principales, bacterias y hongos. Los primeros se subdividen en intra- e intercelulares mientras que los últimos se dividen en micorrizas (ecto- y endomicorrizas) y hongos asociados a las raíces (HAR).
Figura 1: Clasificación de los bioinoculantes [Extraído y modificado de Gray & Smith (2005) y Owen et al (2014)]. Se representan en la parte superior e inferior los dos grandes grupos, bacterias y hongos, respectivamente, con los diferentes tipos en negrita y los principales géneros dentro de las cajas. En el centro de la figura se localizan las principales funciones que desempeñan.
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Bacterias
Las bacterias (procariotas), al igual que los hongos (eucariotas), pueden interaccionar con la planta en la parte bajo tierra (rizoplano o rizosfera) o la parte aérea (filosfera), desde el exterior o interior (endófitas) de la planta. Ambos grupos de bacterias (intra y extracelulares) comprenden bacterias endófitas. Estas, que están representadas en un 98% por la división Proteobacteria (Santoyo et al., 2016), presentan una ventaja frente a las no endófitas debido a que están en contacto directo con la planta, lo que incrementa la probabilidad de ejercer un efecto beneficioso sobre la misma. Las bacterias y hongos endófitos representan un subconjunto de los que realmente habitan la rizosfera, el mayor reservorio de endófitos (Hallmann et al., 1997; Germida et al., 1998; Marquez-Santacruz et al., 2010). Consecuentemente, la penetración de las bacterias en la planta será principalmente vía rizosfera. Las células radiculares de las raíces laterales, las grietas, aberturas o fisuras generadas como resultado del crecimiento de la planta, y los metabolitos excretados por las raíces que atraen a las bacterias por quimiotaxis, permiten su entrada (Sprent & de Faria, 1988; Hallmann et al., 1997;
Santoyo et al., 2016), aunque, como ya se ha mencionado, los tejidos aéreos pueden ser también una vía de entrada (Roos & Hattingh, 1983).
Las bacterias intracelulares mantienen una comunicación tan compleja como sofisticada con la planta que les permite vivir dentro de las células de esta. Las mejor estudiadas, debido a su importancia en la agricultura, son las que producen unas estructuras muy especializadas llamadas nódulos. Estas permiten fijar el N atmosférico (N2) y transformarlo en formas asimilables para la planta como amonio o nitrato (Marschner, 1995). Las principales representantes de este grupo son las bacterias del orden Rhizobiales (Figura 1).
Las bacterias extracelulares residen en los espacios intercelulares tales como en el apoplasto (Compant et al., 2010) o en el exterior de la planta (Földes et al., 2000). Este tipo de bacterias tienen la función de promover el crecimiento de la planta mediante la síntesis de enzimas que degradan la materia orgánica, fitohormonas (ácido indolacético o giberélico) que interaccionan con el metabolismo hormonal de la planta (Gray & Smith, 2005; Glick, 2012; Owen et al., 2014), o ácidos orgánicos y compuestos quelantes (fitosideróforos) que acidifican la rizosfera y solubilizan nutrientes (Paredes-Mendoza & Espinosa-Victoria, 2010; Soumare et al., 2020), lo que resulta en una mejora de la nutrición de la planta (Hungria et al., 2016). Por último, aunque menos conocida, es la activación de la resistencia sistémica inducida (RSI), capaz de conferir una protección previa al ataque del patógeno y provocar, en ocasiones, un incremento en el crecimiento (Gouda et al., 2018).
CAPÍTULO I
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Hongos
1.2.1. Micorrizas
Las micorrizas son hongos asociados a las raíces (HAR) que merecen una especial atención y clasificación debido a sus particulares relaciones con la planta. Tienen así la gran capacidad de generar una extensa red de hifas asociadas a las raíces —lo que permite aumentar la superficie de absorción—
y manifiestan un claro intercambio de recursos (nutrientes y fotoasimilados) con su huésped (Collins et al., 2017). Estas se pueden clasificar en micorrizas vesículo–arbusculares, ectomicorrizas, ectendomicorrizas, arbutoides, ericoides, monotropoides y orquideoides (Smith & Read, 2008).
Las micorrizas vesículo–arbusculares y las ectomicorrizas son las micorrizas de mayor relevancia debido a su importancia ecológica en el medio ambiente, su amplio rango de distribución y sus características para ser comercialmente explotables. Las micorrizas vesículo–arbusculares (VA) necesitan un huésped para establecer la simbiosis y crecer mientras que las ectomicorrizas no. El hongo surte de agua y nutrientes a la planta mientras recibe a cambio azúcares y compuestos orgánicos (C) sintetizados en la fotosíntesis, generalmente azúcares simples fácilmente digeribles (Collins et al., 2017). Las ectomicorrizas también penetran dentro de la planta, extendiendo su red de hifas por los espacios intercelulares sin penetrar en la célula y pudiendo presentar una fase saprófita (Jones, 2016). Esta relación hongo–planta tan íntima se produce gracias a los compuestos secretados por la planta y el hongo, necesarios para facilitar su penetración y/o cambio fisiológico mediante una regulación hormonal (Kloppholz et al., 2011; Plett et al., 2011).
1.2.2. Hongos asociados a las raíces (HAR)
La gran mayoría de los hongos bioinoculantes asociados a las raíces son endófitos (Hallmann et al., 1997; Lugtenberg et al., 2016), no obstante la definición de este término está lejos de ser perfectamente nítida (Lugtenberg et al., 2016). Se estima que como mínimo existen 1 millón de especies de hongos endófitos en todo el planeta (Strobel & Daisy, 2003), con un amplio rango de relaciones simbióticas así como de tipos de vida. No obstante, como se ha mencionado anteriormente, estos microorganismos pueden presentar una interacción positiva con una especie, pero no con otra (Hardoim et al., 2015), mostrando un alto grado de especificidad. Esto puede acarrear que el coste del endófito pueda superar en ocasiones el beneficio reportado (Johnson et al., 1997; Walters & Heil, 2007), efecto estrechamente sujeto a las condiciones ambientales. La gran mayoría de especies de hongos endófitas pertenecen al filo Ascomycota y presentan un amplio rango de adaptación y distribución, encontrándose en climas tan extremos como los de los desiertos y la tundra ártica, en plantas vasculares, no vasculares, gimnospermas y angiospermas (Arnold, 2007, 2008; Arnold & Lutzoni, 2007).
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1.2.3. Hongos entomopatógenos
Los hongos entomopatógenos (HEs) representan un grupo muy diverso de hongos que difieren en su modo de acción, dispersión y requisitos nutricionales, pero que comparten la capacidad de infectar a artrópodos, penetrando su cutícula y causándoles la muerte directa (Inglis et al., 2001;
Goettel et al., 2005; Lacey, 2017) o indirectamente, debido a la ingesta de toxinas sintetizadas por los hongos en el interior de la planta (por ejemplo, destroxinas) (Molnár et al., 2010). Así, los HEs utilizan los artrópodos como una fuente importante de alimento para su desarrollo y reproducción.
La coevolución de estos microorganismos con los artrópodos a lo largo de la historia ha permitido controlar la población de estos de forma natural (Lu & St. Leger, 2016). No obstante, a pesar de su bien conocido papel como agentes de biocontrol, la ecología de los HEs no se ha descrito totalmente, en parte por sus novedosas y sorprendentes funciones descubiertas durante los últimos 25 años (Vega et al., 2009). Estudios recientes hipotetizan, por otra parte, que la coevolución con las plantas pudo ser previa a la coevolución con los insectos (Barelli et al., 2016).
1.2.3.1. Clasificación y diversidad
Los HEs se reparten entren las divisiones Basidiomycota, Blastocladiomycota, Entomophthoromycota y Ascomycota. Dentro de esta última división se albergan los Ascomicetos Mitospóricos Entomopatógenos (AMEs) que representan el 80% de los HEs y reúnen a más de 600 especies de las aproximadamente 750 descritas hasta el momento (Sung et al., 2007; Fernández Bravo, 2017). La Tabla 1 muestra la clasificación de estos AMEs.
1.2.3.2. Ciclo reproductivo
Los hongos entomopatógenos pueden presentar dos tipos de reproducción, la sexual y la asexual (Roy et al., 2006) o únicamente la segunda, como es el caso de los hongos imperfectos anamorfos (Inglis et al., 2001). Además, en los HEs se diferencian una fase patogénica y otra saprófita detalladas en la siguiente sección (Figura 2).
CAPÍTULO I
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Tabla 1: Clasificación sistemática de los Hongos Entomopatógenos. Modificada de Hibbett et al., 2007; Humber, 2012 y Gryganskyi et al., 2013
División Clase Orden Familia Género
Entomophthoromycota Basidiobolomycetes Basidiobolales Basidiobolaceae Basidiobolus
Neozygitomycetes Neozygitales Neozygitaceae Apterivorax, Neozygites, Thaxterosporium Entomophthoromycetes Entomophthorales Ancylistaceae Ancylistes, Conidiobolus, Macrobiotophthora
Completoriaceae Completoria
Meristacraceae Meristacrum, Tabanomyces
Entomophthoraceae SUBFAMILIA Entomophthoroideae: Batkoa, Entomophaga, Entomophthora Eryniopsis, Massospora
SUBFAMILIA Erynioideae: Erynia, Eryniopsis, Furia, Orthomyces, Pandora, Strongwellsea, Zoophthora
Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Paecilomyces
Sordariomycetes Hypocreales Clavicipitaceae Aschersonia, Hypocrella, Regiocrella, Metarhizium Cordycipitaceae Cordyceps, Lecanicillium,Beauveria, Isaria
Ophicordycipitaceae Tolypocladium,Ophiocordyceps
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Figura 2. Ciclo de vida generalizado de Ascomicetos Mitospóricos Entomopatógenos. (1) Liberación y dispersión (por aire, lluvia u otro insecto) de los conidios al medio ambiente. (2) Reinfección de nuevos hospedantes. (3) Reproducción sexual en el hospedante mediante la formación de ascosporas (4) Dispersión de las ascosporas y reinfección. Dispersión de conidios asexuales (5 y 7) y colonización aérea (6) o subterránea (8) epi- o endófita, respectivamente. Infección a fitófagos por ataque de estos a la planta colonizada (9 y 10). Fuente: Extraído y resumido de Fernández Bravo (2017).
CAPÍTULO I
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1.2.3.3. Hábitat o reservorio natural
El suelo es el principal reservorio natural de los HEs (Keller & Zimmerman, 1989; Hajek, 1997), por lo que los diferentes tipos de suelos naturales y agrícolas, así como el manejo de estos últimos condicionará la concentración, diversidad y dinámica poblacional (Kessler et al., 2003; Meyling &
Eilenberg, 2006; Quesada-Moraga et al., 2007). La principal vía de entrada a los suelos puede ser a través de insectos infectados o por la propia deposición de los conidios transportadas por el viento (Inglis et al., 2001). Una vez en el suelo, y dependiendo del comportamiento que adopten estos microorganismos, podemos diferenciar los patógenos obligados y facultativos. Los primeros no presentan crecimiento en el suelo para persistir mientras que los segundos pueden crecer de forma saprófita hasta alcanzar un nuevo hospedante al que infectar. De este modo, el suelo y sus componentes —tales como la materia orgánica en descomposición— también actúan de medio de crecimiento y dispersión para algunas especies de HEs. De la misma manera, si las condiciones ambientales (la humedad, por ejemplo) no son adecuadas para la formación de conidióforos — estructuras reproductoras que sostienen los conidios— los cadáveres momificados de los insectos actúan como su segundo reservorio natural. Sin embargo, el comportamiento endófito de muchas especies indica que las plantas pueden ejercer de reservorio natural de los AMEs (Barelli et al., 2016), afirmando otros autores que la supervivencia de estos hongos está estrechamente ligada a su papel como simbiontes de plantas (Ortiz-Urquiza & Keyhani, 2015). Estas pueden albergar a los microorganismos como epífitos o endófitos, en el filoplano (Meyling & Eilenberg, 2006, 2007; Keyser
& Meyling, 2016) o en el rizoplano (Hu & St Leger, 2002), lo cual ha abierto un campo novedoso e interesante a la investigación por la potencial aplicación y uso de los HEs que esto conlleva.
1.2.3.4. Influencia de factores ambientales: bióticos y abióticos
Los factores ambientales son determinantes en la supervivencia de los AMEs y, consecuentemente, en su ecología, dinámica de poblaciones y poder de acción (Jaronski, 2010). Los factores bióticos más importantes son en primer lugar la artropofauna susceptible de ser infectada, esencial para la reproducción y la dispersión (Meyling & Eilenberg, 2007; Lacey et al., 2015), así como para la germinación de los conidios y comienzo de la patogénesis (Jaronski, 2010). En segundo lugar, otros microorganismos que residen en el suelo, en el insecto o incluso en la planta pueden ejercer un efecto fungistático impidiendo el crecimiento de los AMEs, o incluso provocando su muerte. Por último, las plantas interaccionan estrechamente con estos hongos, principalmente excretando substancias químicas a través de las raíces (Cory & Hoover, 2006; Cory & Ericsson, 2010), favoreciendo su supervivencia frente a estreses bióticos y abióticos y apoyando la hipótesis de coevolución conjunta a lo largo de la historia (Rangel et al., 2015; Barelli et al., 2016).
Los principales factores abióticos naturales son la textura (Garrido-Jurado et al., 2011a) y el pH del suelo (St. Leger, 2008), la humedad y temperatura del ambiente donde residen y la radiación UV
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(Inglis et al., 2001; Klingen & Haukeland, 2006). Los propágulos fúngicos son altamente susceptibles al daño por radiación UV–B (285–315 nm) mientras que las temperaturas próximas a 23 °C y una actividad de agua superior a 0.975 favorecen la infección de insectos, así como la conidiogénesis (Inglis et al., 2001). El pH no es un gran limitante de la actividad fúngica debido a la capacidad de los HEs de sobrevivir en un rango amplio de pH. No obstante, la textura del suelo y la materia orgánica si determinan la retención y movimiento vertical de los conidios, sujetos ambos a la humedad del suelo. En general, los suelos con textura más arcillosa y con elevado contenido de materia orgánica retienen más los conidios de los HEs (Ignoffo et al., 1977; Storey & Gardner, 1987; Keller &
Zimmerman, 1989). Estos factores afectan a la persistencia del inóculo, a su supervivencia, y a la capacidad infectiva de insectos o plantas, por lo que condicionan el uso de los AMEs (Klingen &
Haukeland, 2006; Garrido-Jurado et al., 2011b; Johnson et al., 2016).
Los factores abióticos antrópicos tales como el manejo de cultivos o el uso de pesticidas y fertilizantes pueden condicionar la supervivencia de estos microorganismos (Yousef et al., 2015). Los géneros Metarhizium y Beauveria comparten características como la prevalencia en suelos agrícolas con poco manejo (Hummel et al., 2002). Otros estudios comparan la abundancia y persistencia de Metarhizium en bosques, zonas sombrías o setos con la presencia en áreas cultivadas, existiendo controversia al respecto ya que parece depender de la región geográfica (Bidochka et al., 1998; Kessler et al., 2003; Meyling & Eilenberg, 2006; Vannette & Hunter, 2011).
1.2.3.5. Uso de los hongos entomopatógenos: método de aplicación
Los HEs pueden ser aplicados de diversas formas, dependiendo del propósito de su uso y de los factores ambientales descritos en la sección anterior. Los métodos más usados son la inoculación con conidios o hifas (menos frecuente) por pulverización aérea, recubriendo la semilla, mediante aplicación al suelo por inundación, por inmersión de raíces en una suspensión adecuada y por inyección directa del material fúngico en la planta (Bamisile et al., 2018). Las principales diferencias entre los métodos de inoculación residen en la cantidad de hongo introducido en el sistema, la precisión de la localización del inóculo, la superficie afectada y el tiempo de contacto entre el hongo y la planta, así como la mayor o menor viabilidad de la aplicación a gran escala. Estas diferencias pueden condicionar la colonización de las plantas (Posada et al., 2007), siendo la dosis de conidios aplicada al sistema una de las principales variables (Ownley et al., 2008). Sin embargo Tefera & Vidal (2009) reportaron una misma tasa de colonización de la planta independientemente del método utilizado, en el caso particular de un substrato artificial de vermiculita. En condiciones reales —suelo no estéril y muy alejado en su composición de los substratos artificiales— sí se obtienen sustanciales diferencias en la tasa de colonización. En conjunto, se puede decir que la superación de las barreras de entrada a la planta depende de los métodos de inoculación, del tipo de sustrato y también de la especie del HE y de la planta huésped, existiendo escasos estudios en condiciones naturales.
CAPÍTULO I
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2. Los hongos entomopatógenos como promotores del crecimiento y mejoradores de la nutrición vegetal
No fue hasta 1990 cuando se descubrió que la relación de los HEs con las plantas se extendía más allá de la protección sistémica de los cultivos frente a fitófagos, obteniéndose así la primera evidencia del comportamiento endófito de estos hongos al registrarse la presencia de B. bassiana en el interior de la planta de maíz (Vakili, 1990; Bing & Lewis, 1991). Este gran hallazgo suscitó el estudio intensivo de la capacidad de estos hongos para residir, persistir y comunicarse con las plantas. Como resultado, numerosos estudios desvelaron el amplio abanico de especies (maíz, trigo, sorgo, girasol, tomate) susceptibles de ser colonizadas por los HEs (Hu & St Leger, 2002; Quesada-Moraga et al., 2006a, 2014; Meyling & Eilenberg, 2007; Posada et al., 2007; Vega et al., 2008; Ownley et al., 2010; Sasan &
Bidochka, 2012; Garrido-Jurado et al., 2016; Bamisile et al., 2018; González Mas, 2019). En línea con este carácter endófito, se desveló como las especies de los géneros Metarhizium y Beauveria (de alto interés económico) eran capaces de utilizar diferentes vías de entrada en la planta —raíces, tallos u hojas— y de colonizarla de forma sistémica, extendiendo sus hifas por los espacios intercelulares vegetales (apoplasto), a través del xilema (Ownley et al., 2008; Wyrebek et al., 2011; Behie et al., 2015;
Yan et al., 2015 y Espinoza et al., 2019), o incluso llegando a alcanzar el fruto (Quesada-Moraga et al., 2014).
Este comportamiento endófito está relacionado con su carácter como colonizadores de la rizosfera (Hu & St Leger, 2002) y a su vez con la capacidad de estos HEs de crecer sobre material procedente de la rizodeposición. Tanto B. bassiana como M. anisopliae crecen bien en medios artificiales presentando un comportamiento saprófito. No obstante, ninguno es buen competidor por los recursos orgánicos frente a hongos puramente saprófitos (Keller & Zimmerman, 1989; Hajek, 1997). Un ejemplo de ello, es la adaptación de M. anisopliae a la vida saprófita o patógena, mostrando diferentes expresiones genéticas en la rizosfera o en medios ricos en nutrientes, comparado a la expresión genética durante la colonización del insecto (Wang et al., 2005). Por otro lado, Elliot et al.
(2000) hipotetizaron que la planta podría estar favoreciendo el crecimiento de los HEs para obtener así un beneficio indirecto frente al ataque de fitófagos, actuando como escolta de plantas (“bodyguards”). La versatilidad de los HEs como protectores de cultivos se amplía cuando recientes investigaciones con B. bassiana (Jaber, 2015) o Metarhizium (Sasan & Bidochka, 2013) reportan su papel como antagonistas frente a otros patógenos, tales como Plasmopora vitícola o Fusarium solani, respectivamente. Además, existe otro método de protección sistémica previa a la infección o ataque de fitófagos, la protección por “priming”, que consiste en la activación del sistema inmune de la planta generando resistencia frente a nuevos ataques, como se ha visto con B. bassiana (Ownley et al., 2008, 2010).
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Tras las primeras investigaciones enfocadas a la promoción del crecimiento de los cultivos con HEs, se pensaba que ello era debido a los efectos indirectos de la protección frente a fitófagos y patógenos —los cuales reducen la cosecha— anteriormente descritos. Sin embargo, poco después se vio que también existía una promoción del crecimiento y mejora nutricional de forma directa, con o sin la presencia de fitófagos/patógenos (Vega et al., 2009; Jaber & Ownley, 2017; Bamisile et al., 2018).
Promotores del crecimiento de las plantas
Diversas especies de HEs han demostrado promocionar el crecimiento en un amplio abanico de especies de plantas (Jaber & Ownley, 2017) mediante diferentes métodos de inoculación y bajo diferentes condiciones de crecimiento. El papel de los géneros Metarhizium y Beauveria como promotores del crecimiento es bien conocido. Esta promoción del crecimiento viene asociada a la colonización de la planta, como es el caso de Vicia faba con B. bassiana o M. brunneum (Jaber & Enkerli, 2016), Gossypium hirsutum con B. bassiana y Paelomices lilacium (Lopez & Sword, 2015), Triticum durum y T. aestivum con B. bassiana (Reddy et al., 2014; Sánchez-Rodríguez et al., 2018), Solanum lycopersicum con M. anisoliae (Elena et al., 2011), Capsicum annum con B. bassiana y M. brunneum (Jaber & Araj, 2017) y en otras especies descritas en Sasan & Bidochka (2012), Liao et al. (2014) y Bamisile et al. (2018). Los efectos más destacados han sido el incremento o mejora en altura, en longitud y número de raíces (Sasan & Bidochka, 2012), en la biomasa aérea (Liao et al., 2014), o en ambos (Raya-Díaz et al., 2017a), producido a veces indirectamente por el incremento de la resiliencia del cultivo a factores abióticos como el estrés salino (Khan et al., 2012).
Mejoradores de la nutrición vegetal
La capacidad de los HEs de promover el crecimiento en planta puede deberse en parte a la mejora nutricional de la planta huésped. Los estudios más reveladores pueden ser los llevados a cabo por Behie et al. (2012, 2017), los cuales demostraron el intercambio de N y C con la planta.
Por otro lado, se ha descrito como estos microorganismos pueden solventar problemas tan importantes en los cultivos como la clorosis férrica, causada principalmente por una alteración en la nutrición de Fe en la planta (Sánchez-Rodríguez et al., 2015, 2016; Raya-Díaz et al., 2017b). En este sentido, Silvia Raya-Díaz indagó en profundidad este tema en su tesis doctoral publicada en 2017, abriendo un campo interesante de estudio tras demostrar como los HEs pueden servir como herramienta para aliviar las deficiencias de micronutrientes tan comunes en suelos calcáreos, típicos de regiones mediterráneas, donde el trigo es uno de los cultivos más extendidos.
CAPÍTULO I
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3. Aspectos específicos del uso de hongos entomopatógenos sobre cultivos en ambientes mediterráneos
Características de los suelos de las regiones mediterráneas
El clima mediterráneo se caracteriza en términos generales por tener una precipitación media anual comprendida entre 300 y 1200 mm, inviernos frescos o fríos (< 10°C) y veranos cálidos (>
20°C), con una sequía estival de uno a cuatro meses (Matar et al., 1992). Bajo estas condiciones climáticas, bastantes suelos son calcáreos o con propiedades calcáreas, al igual que muchos de los suelos típicos de climas áridos o semi–áridos. Muchos de estos suelos calcáreos presentan un horizonte u horizontes con carbonato cálcico (calcita) de origen edafogénico. En todo caso, los suelos de las regiones mediterráneas presentan una enorme diversidad debido a la gran variedad de materiales parentales y de tiempos de formación. Calcisoles, cambisoles, luvisoles, leptosoles, regosoles, fluvisoles y vertisoles (IUSS Working Group WRB, 2014) representan gran parte de la cobertura edáfica de la región mediterránea stricto sensu (Torrent, 2005). Comúnmente presentan un grado moderado de meteorización de los minerales primarios, dominio de los minerales de la arcilla tipo 2:1 (Illita y esmectitas) y un bajo contenido en materia orgánica, especialmente si son cultivados.
Problemas nutricionales típicos
Mientras que la fitodisponibilidad de los nutrientes catiónicos mayores (K, Ca, Mg) en los suelos mediterráneos es generalmente adecuada, las deficiencias en P y micronutrientes catiónicos (Fe, Cu, Mn y, en especial, Zn) son más frecuentes y asociadas en su mayor parte a la presencia de carbonatos (Matar et al., 1992; Ryan et al., 2012). En esta tesis se presta particular atención al P y al Zn.
3.2.1. El fósforo (P)
El fósforo (P) representa el 0.7% de la corteza terrestre ocupando el undécimo puesto en el ranking de los elementos más abundante (Schwedt, 2001). Es un nutriente esencial para las plantas y los animales y está involucrado en la mayor parte de los procesos de desarrollo y reproducción (López-Arredondo et al., 2014). El P, que las plantas toman en forma del anión ortofosfato (como H2PO4– o HPO42–), procede en último término de la alteración de los minerales primarios de P que se encuentran en la roca madre del suelo. Sin embargo, este aporte representa solo una pequeña fracción de la que necesita cualquier cultivo, siendo pues necesario aplicar P procedente de otras fuentes. En la actualidad, los yacimientos de roca fosfatada (RF) representan el 80% del P usado en la producción de fertilizantes a gran escala. Las reservas de RF son, sin embargo, limitadas y relativamente bajas (MacDonald et al., 2011; USGS, 2019), tanto, que se pueden agotar en un período de 50 a 100 años (Cordell et al., 2009). Otra fuente importante es el P orgánico añadido al suelo como
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enmiendas orgánicas tales como el estiércol, el compost o los restos de las cosechas. El uso desigual de fertilizantes de P en las últimas décadas ha determinado que haya zonas agrícolas del mundo con deficiencias de P y otras que han recibido una cantidad de P muy por encima de las necesidades de las plantas. Así, la cantidad aproximada de P añadido a tierras de cultivo en Europa durante el período comprendido entre 1965–2007 fue de 1115 kg ha-1, mientras que el retirado por el cultivo fue de 360 kg ha-1 (Sattari et al., (2012). De hecho, alrededor de 2010, el 71% de los suelos de todo el mundo recibían excesos de fertilizante fosfatado, provocando, tras la lixiviación del P hacia aguas fluviales, lagos o mares, problemas de eutrofización (MacDonald et al., 2011), no escapando a este problema muchas áreas de la región mediterránea (Torrent et al., 2007). Se estima por ello que los cambios en el manejo de los cultivos podrían reducir hasta un 20 % el exceso de P añadido (Bouwman et al., 2013).
En la práctica, el ion fosfato es rápidamente precipitado, inmovilizado o adsorbido por los minerales del suelo (Figura 3), de modo que su concentración en la disolución acaba siendo muy baja, haciendo que la disponibilidad del P para las plantas sea inherentemente baja (Marschner, 1995). En suelos calcáreos, tales como muchos de las regiones mediterráneas, gran parte del fosfato añadido acaba en forma de fosfatos de Ca poco solubles que, junto con su adsorción por las superficies de los minerales de la arcilla y óxidos de Fe, resulta en una baja fitodisponibilidad de este elemento (Matar et al., 1992; Ryan et al., 2012).
En la actualidad, el llamado “legacy phophorus” (legado de fósforo) —refiriéndose al P que se ha ido acumulando en el suelo, pero no es disponible a corto plazo para las plantas— representa un recurso importante, convirtiéndose su aprovechamiento en un gran reto para la ciencia (Sattari et al., 2012; DEFRA, 2014). Por ello, una de las estrategias más prometedoras es conseguir que las plantas movilicen los compuestos de P precipitados o adsorbidos, bien por su modificación por ingeniería genética o bien con la ayuda de los microorganismos edáficos (Hinsinger, 2001; Vance et al., 2003;
Owen et al., 2014).
Figura 3: Procesos biogeoquímicos de P en el suelo que regulan la disponibilidad de este.
CAPÍTULO I
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3.2.2. El zinc (Zn)
El Zn es esencial para plantas, animales y humanos. En animales superiores, incluido el ser humanos, se estima que 3000 proteínas contienen grupos prostéticos con Zn (Tapiero & Tew, 2003), siendo el único metal involucrado en los 6 tipos de enzimas: oxido-reductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas (Barak & Helmke, 1993). A pesar de las funciones vitales que tiene este nutriente en la planta —catalítica, estructural, transporte de CO2 en la fotosíntesis, metabolismo de auxinas, responsable del descenso en el número de flores y semillas cuando es limitante, o el papel en la síntesis de almidón—, nunca se habían asociado los problemas de los cultivos a la deficiencia de este elemento hasta 1932 —en cultivos de manzana y cítricos en California y Australia, respectivamente (Brown et al., 1993). En esta época se comienzan a realizar los primeros estudios que señalan la deficiencia de Zn como la principal causa de los bajos rendimientos [hasta un 50%, Alloway, (2008a)] y enfermedades asociadas al cultivo (Brown et al., 1993), no tardándose en afirmar que es el micronutriente que muestra mayor deficiencia en términos de distribución mundial.
Pero no fue hasta 1950, con la Revolución Verde y la introducción de nuevas variedades de cereales, poco adaptadas al medio, cuando se describieron severos descensos en la concentración de Zn en grano —variando desde 27 a 143 mg kg-1 (Cakmak & Kutman, 2018)—, siendo la principal causa el efecto dilución —descenso relativo de la concentración de los nutrientes en el fruto/grano provocado por un incremento en el rendimiento.
La principal fuente de Zn y de los otros 7 elementos traza esenciales (requeridos en concentraciones de 5–100 mg kg–1 materia seca de la planta) es la derivada de la alteración geoquímica de los minerales de la roca madre y depende, por lo tanto, de la composición de esta. Las deposiciones atmosféricas, el agua de lluvia o de inundación, por ejemplo, en llanuras fluviales, también aportan Zn al suelo (Alloway, 2008a). Por otro lado, en las área agrícolas, son frecuentes los insumos derivados del ganado tales como los purines y el estiércol, los fertilizantes inorgánicos y los quelatos (Cakmak
& Kutman, 2018). Sin embargo, hay que tener en cuenta que el 30% de los suelos agrícolas de todo el mundo son naturalmente deficientes en Zn (Wessells & Brown, 2012; Cakmak & Kutman, 2018), a pesar de que la concentración total media de Zn sea de 50–55 mg kg-1 suelo (Kiekens, 1995; Alloway, 2008b). Esto es debido a que la concentración disponible real de Zn para las plantas está condicionada por otros factores además de por su contenido total en el suelo. El pH, el potencial redox, los contenidos de carbonato cálcico, materia orgánica y arcilla, la actividad microbiana en la rizosfera, el estado de humedad del suelo, la concentración de otros elementos traza y macronutrientes (especialmente P) y el clima (Alloway, 2008a) son factores que determinan la fitodisponibilidad de este elemento. Los procesos edáficos que rigen la distribución de las formas de Zn son la adsorción–
desorción, precipitación–disolución y formación de complejos. Entre las variables edáficas destaca el pH, de tal forma que la fracción soluble de Zn está comprendida entre 4 y 270 µg L-1 de los 50–80 mg kg-1 totales que se estiman en un suelo básico, incrementándose en suelos ácidos a más de 7000
