1. Resumen
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud, el paludismo es una de las seis enfermedades parasitarias más importantes a nivel mundial, cuyo control aún no es satisfactorio (WHO, 2004). Además, el desarrollo de cepas de plasmodios resistentes a los fármacos más frecuentemente empleados y el alto costo económico de los nuevos compuestos los hace poco accesibles a la mayor parte de las personas palúdicas (WHO, 2006). Por lo anterior, el desarrollo de alternativas para el control del paludismo a través de la quimioterapia y/o productos naturales, es una actividad prioritaria, sobre todo en países donde la enfermedad es endémica como México. El modelo murino por Plasmodium berghei ha demostrado su utilidad en el estudio de diversos aspectos semejantes al paludismo que afecta al hombre (Fidock et al., 2004).
Objetivo general evaluar la probable actividad antipalúdica in vivo de extractos crudos de la
semilla de Annona cherimola Miller (Chirimoya), de Artemisia ludoviciana var. mexicana y de dos compuestos desarrollados por nuestro grupo de investigación: ésteres etílicos N-metil oxámico y N-propil oxámico utilizando al modelo murino por Plasmodium berghei.
Material y métodos: Se empleó el procedimiento estándar internacional para la evaluación in vivo de fármacos antipalúdicos en el modelo murino por Plasmodium berghei (Fidock et al.,
2004). Ejemplares de la cepa CD1 de ratones fueron obtenidos del bioterio de la ENCB-IPN.
Resultados: El modelo murino por Plasmodium berghei en ratones CD1 semeja lo informado
en los protocolos frecuentemente utilizados para evaluar la actividad de nuevos fármacos. La cloroquina presenta una alta actividad antipalúdica, a partir de dosis mayores de 40 mg/Kg elimina la parasitemia a partir del 4to día de tratamiento. Los ésteres etílicos N-metil oxámico y N-propil oxámico, a dosis de 50 mg/Kg aumentan la sobrevida hasta dos días y disminuyen la parasitemia un 25 y 50%, respectivamente. Los extractos crudos de la semilla de Annona
cherimola Miller (Chirimoya) aún a concentraciones de 625 mg/Kg, no presentaron una
importante actividad antipalúdica, mientras que su toxicidad fue más sobresaliente. Mientras que la infusión de Artemisia ludoviciana var. mexicana logró disminuir cerca del 60% de la parasitemia y originó dos días de sobrevida al lote de ratones a partir de concentraciones tan altas como 2500 mg/L. Conclusiones: El modelo murino por Plasmodium berghei y ratones CD1 semeja lo informado en los protocolos frecuentemente utilizados para evaluar la actividad de nuevos fármacos. La cloroquina elimina el 100% de la parasitemia a partir de dosis mayores de 40 mg/Kg del ratón. Ninguno de los compuestos y/o extractos presentó actividad antipalúdica comparable a la del fármaco de elección (cloroquina), por lo que no son candidatos a continuar sus estudios como antipalúdicos.
2. Introducción.-
La malaria es una parasitosis que causa un alto índice de morbilidad y mortalidad en niños y adultos en países tropicales. Se calcula que mueren más de un millón de personas, situación que se agrava con la aparición de cepas resistentes a los fármacos antipalúdicos tradicionales, como la cloroquina, sulfadoxina-pirimetamina (WHO, 2006).
Es necesario descubrir fármacos antipalúdicos con baja toxicidad y alta efectividad. La investigación farmacéutica en productos naturales representa la principal estrategia para el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos (Kayser, 2002). El modelo murino por Plasmodium berghei ha demostrado su utilidad en el estudio de diversos aspectos
semejantes al paludismo que afecta al hombre (Fidock et al., 2004). P. berghei fue descubierto por Vincke y Lips en 1948, pertenece a un grupo de cuatro especies de
Plasmodium que infectan roedores murinos del África Central. Estas especies son P. vinckei, P. chabaudi, P. yoelii y P. berghei. Se han descrito variasespecies de parásitos de la malaria
de roedores diferentes a los murinos pero han sido poco estudiadas y aún no se tienen los ciclos de vida completos para ninguno de ellos, además, hay insuficiente material disponible para hacer comparaciones críticas.. Recientemente se ha empleado al paludismo murino como modelo biológico en el estudio de aspectos inmunológicos (Barnwell y Wertheimer, 1989; Sinden, 1996) y en la evaluación de la actividad antipalúdica en el desarrollo de nuevos compuestos ya que su metabolismo es semejante al de las especies que infectan al hombre (Ridley, et al., 1996; Wertheimer, 1989; Galinski, et al.,1992; Preiser, et al., 2000; Chitinis y Blackman, 2000; Cowman, 2001; Pinder, et al., 2000)
El metabolismo energético de los plasmodia es básicamente glicolítico, por lo que se evaluará la posible actividad antipalúdica de dos compuestos que han demostrado actividad inhibitoria de la glicolisis, los ésteres etílicos N-metil oxámico y el N-propil oxámico.
El empleo del conocimiento que se ha heredado por generaciones en la herbolaria mexicana ha demostrado su utilidad en el tratamiento de diversos padecimientos parasitarios, además con el antecedente de la demostrada utilidad de la semilla de la Chirimoya (Annona cherimola Miller). Como fármaco de referencia se utilizará a la Cloroquina, el cual es el fármaco de elección en el tratamiento del paludismo y un extracto de la planta de origen Chino (Artemisia annua). La artemisinina fue desarrollada a partir de un antiguo remedio herbal chino. Artemisia annua o “qinghao” (planta verde, en chino) utilizada desde hace más de 2 000 años por los chinos en el tratamiento del paludismo y de las hemorroides.
Las plantas de la familia Annonaceae contienen compuestos denominados acetogeninas que han demostrado tener actividad inhibidora del complejo I (NADH: ubiquinona oxidoreductasa) interviniendo por lo tanto en la respiración celular y por consiguiente en la formación de ATP. Por esta actividad biológica es que se está investigando efecto y dosis necesaria para la inhibición del desarrollo contra varios tipos de parásitos entre los cuales está incluido el Plasmodium.
Por lo anterior, en el presente trabajo se pretende evaluar la utilidad de extractos de la semilla de la chirimoya y de la Artemisia mexicana en cuanto su actividad antipalúdica en el modelo murino.
Se empleó el procedimiento estándar internacional para la evaluación in vivo de fármacos antipalúdicos en el modelo murino por Plasmodium berghei (Fidock et al., 2004).
3. Métodos y materiales:
Material Biológico.
Plasmodium berghei, cepa donada amablemente por el Dr. Filiberto Malagón del Laboratorio
de Malariología del Departamento de Parasitología y Microbiología de la Facultad de Medicina de la UNAM.
Fruta de la Chirimoya. Colectada en el municipio de Artega, Michoacán. La especie (Annona cherimola Miller) fue identificada por el grupo de investigación del Dr. Gerardo Zepeda Vallejo. Extracto etanólico de la semilla Annona cherimola, obtenida en el Departamento de Química Orgánica de la E.N.C.B por el Dr. Gerardo Zepeda Vallejo.
Cloroquina (Sulfato de hidroxicloroquina). Merck.
Artemisia mexicana: Se compró en el mercado de Sonora y se corroboró su identificación con apoyo del departamento de botánicas de la ENCB-IPN.
Equipo
Pipetas automáticas tipo Wilson de capacidad 1-20 μl, 20-200 μl, 200-1000 μl. Microscopios ópticos Carl Zeiss
Reactivos
Alcohol etílico absoluto. Merck Alcohol etílico 97º. Merck Metanol. Merck
Hexano. Merck
Goma arábiga. Sigma
Colorante de Giemsa. Sigma
Cloroquina en polvo (sulfato de hidroxicloroquina). Merck Preparación del extracto etanólico de la chirimoya
Se pesan 100 g de semillas secas de la Chirimoya procedente de la ciudad de Morelia Michoacán, México, se trituraron en un molino, se adicionó alcohol etílico 97º, se dejaron reposar por 72 h, luego se eliminó el alcohol por un método de vaporización, de esta manera se obtuvo una “miel” la cual corresponde al extracto crudo.
Obtención de Plasmodium berghei
De los parásitos mantenidos en viales Eppendorff con dimetilsulfóxido en criopreservación en nitrógeno líquido en el Laboratorio de Protozoología del Departamento de Parasitología de la E. N. C. B. Inocular tres ratones vía intraperitoneal; y hacer un pase hasta establecer la parasitemia en forma regular. Una vez establecida tomar sangre de la vena caudal de cada ratón en condiciones asépticas y ajustar con solución salina de tal manera que en un volumen de 0.2 ml contengan 1 x 106 glóbulos rojos parasitados.
Inoculación a ratones
Infectar ocho lotes de cinco ratones cada uno con 0.2 ml de la suspensión de eritrocitos parasitados vía i. p. (en el caso del extracto de la semilla Annona cherimola, 5 ratones como testigo (Curva de parasitemia, goma arábiga + etanol), 5 ratones para la dosis de 156 mg/ Kg ratón, 5 ratones para la dosis de 312 mg/Kg ratón, 5 ratones para la dosis de 625 mg/Kg
ratón; 5 para la curva de parasitemia en el caso del fármaco Cloroquina, 5 ratones para la dosis de 30 mg/Kg, 5 ratones para dosis de 40 mg/ Kg y 5 ratones para la dosis de 50 mg/ kg) y tomar muestras de sangre de la cauda diariamente a partir de 24 horas de inoculados. Hacer frotis y teñirlos por el método de Giemsa (Perea-Sasiaín, 2003).
Curvas de parasitemia
A partir de los frotis teñidos contar los parásitos (trofozoítos esquizontes y gamontes) en 5 campos a un aumento de 100x (Petersen, 1996). Contar eritrocitos infectados y no infectados calculando el porcentaje de parasitados. A partir de 24 horas postinfección cada ratón debe ser tratado con 200 μl del extracto etanólico de la semilla Annona cherimola y la cloroquina. Cada dosis del extracto de la semilla (previamente disuelto en alcohol etílico absoluto 50μl y utilizando goma arábiga 150μl como vehículo) y la cloroquina (disuelta en 200μl de goma arábiga como vehículo) deben ser preparadas diariamente y dadas a tomar de cada concentración cada 24 horas durante 15 días a partir del mismo día de inoculación con el plasmodio.
El intervalo de inhibición del desarrollo de Plasmodium berghei in vivo en presencia del extracto (fármaco) : [(Parasitemia en el grupo control – Parasitemia en el grupo tratado con el extracto (fármaco) /(Parasitemia en el grupo control) x 100%] para cada una de las concentraciones del extracto (fármaco)..
Resultados:
Se informan meta por meta:
Meta 1: Establecimiento del modelo biológico. actividades: Determinación de la curva de parasitemia de Plasmodium berghei en la cepa CD1 de ratón. Estandarización de la toma, tinción y lectura de muestras sanguíneas.
En la figura 1 se esquematiza la parasitemia registrada en el lote de cinco ratones inoculados con 1x106 de eritrocitos infectados con Plasmodium berghei. Este inóculo permite seguir la parasitemia durante aproximadamente 6 días, sólo un ratón llegó a sobrevivir hasta los 7 días. A partir de primer día se observan eritrocitos parasitados, por lo que el periodo prepatente fue de sólo un día. El incremento fue casi lineal a partir del tercer día, con un máximo de parasitemia del 29.7 %
Tiempo (Días postinculación) 0 2 4 6 Porcentaje de parasitemia 8 0 10 20 30 40 50
Figura 1. Curva de parasitemia de ratones de la cepa CD1 inoculados por vía intraperitoneal con 1 X 106 eritrocitos infectados con Plasmodium berghei. Los valores mostrados son el promedio de cinco ratones. El lote fue tratado por vía oral diariamente con una suspensión de 150 µl de goma arábiga más 50 µl de alcohol absoluto.
En las figuras 2 y 3 se observan los estadios más frecuentes de P. berghei que se presentan durante la curva de parasitemia. No se observaron cambios, con relación al grupo control, en la morfología de los diferentes estadios como consecuencia del tratamiento por la cloroquina ni por el tratamiento con el extractos de la Chirimoya.
( a ) ( b )
Figura 2. Trofozoítos de P. berghei. Se observan los eritrocitos con multiparasitación (dos trofozoítos). Los eritrocitos parasitados están deformados en relación al eritrocito sano. Tinción con Giemsa. Observación con objetivo de inmersión. En la figura (b) se observa un esquizonte joven.
( a ) ( b ) ( c ) Figura 3. Esquizontes de P. berghei. Se observan los eritrocitos con multiparasitación (dos trofozoítos). En la figura (a) se observan cuatro merozoítos y un esquizonte Joven. En la figura (b) se observa un esquizonte maduro. En la figura (c) se observa un eritrocito que ha estallado liberando al esquizonte maduro. Tinción con Giemsa. Observación con objetivo de inmersión.
Meta 2: Obtención de dos extractos de la semilla de la Chirimolla actividades: Colecta de semillas de la chirimoya (Annona cherimola Miller) y obtención del extracto etanólico y con cloruro de metileno. Se obtuvieron 2 g cristalizados de los
extractos, el trabajo se realizó bajo la supervisión del Dr. Gerardo Zepeda Vallejo del Depto. de Química Orgánica de la ENCB-IPN.
Meta 3: Obtención de dos estractos de la planta Artemisia ludovaciana var. mexicana actividades: Colecta de la planta yobtención del extracto acuoso y etanólico. Se
obtuvieron las infusiones día a día, con el fin de mantener la estabilidad, ya que de un día para otro, cambian los extractos de color en menos de 24 horas. Las plantas fueron obtenidas en el mercado de Sonora e identificadas en el Departamento de Botánica de la ENCB.
Meta 4: Actividad antipalúdica de dos derivados del oxamato actividades: Evaluación de la actividad antipalúdica de los ésteres etílicos N-metil oxámico y del N-propil oxámico
Los compuestos fueron sintetizados por el Dr. Carlos Wong Ramírez del Departamento de Bioquímica de la ENCB-IPN. Tiempo (días) 0 2 4 6 8 Porc entaje de paras itemia 10 0 10 20 30 40 50 60 Cloroquina
N-metil oxamato de etilo CURVA DE TESTIGOS
Ester N-propil oxamato de etilo
Testigos
Ester N-metil oxamato de etilo
Ester N-propil oxamato de etilo
Cloroquina
Figura 4. Curva de Parasitemia de lotes de 5 ratones inoculados por vía intraperitoneal con 1 X 106 eritrocitos infectados con Plasmodium berghei. Los compuestos a evaluar fueron
administrados a una dosis de 50 mg/Kg, diariamente a partir del día cero hasta el día 4 posteriores a la inoculación.
Meta 6: Actividas antipalúdica de extractos de la chirimoya actividades: Evaluación de la actividad antipalúdica de dos extractos de la semilla de la chirimoya.
Los ensayos de las infusiones se iniciaron a dosis de 156 mg/Kg del extracto etanólico de la chirimoya (Annona cherimola miller), la administración fue por vía intragastrica administrado por medio de una cánula, en la cual no se observó ningún efecto antipalúdico, la tendencia de la parasitemia es parecido a la curva tipo de los ratones testigo y con los datos obtenidos nos pudimos dar cuenta que favorece la parasitemia de los ratones, los cuales presentaron algunas reacciones como piloerección y debilitamiento. A una dosis más alta (312 mg/Kg) del extracto etanólico de la chirimoya, se observa el mismo efecto que la primera dosis utilizada.
La mayor dosis evaluada fue de 625 mg/Kg del extracto etanólico de la chirimoya, en donde a pesar de que el número máximo de parásitos alcanzados en la parasitemia fue de 18 %, los ratones en su mayoría mueren un día antes que con respecto a los ratones control (Figura 11). Aparentemente, hay un efecto antipalúdico importante, pero es más grave el efecto tóxico de la infusión. A esta dosis, se sugiere que el tratamiento continuo y a altas dosis causa daño. En este caso se concuerda con la literatura donde se menciona que las semillas son venenosas (Argueta; 1994) y es mayor el daño que le causa a los ratones que el efecto antipáludico que puede tener el extracto de estas semillas. A dosis mayores de 650 mg/Kg de extracto etanólico de la Chirimoya se observan efectos tóxicos importantes sobre los ratones y a dosis de 1250 mg/Kg se registró la muerte del 100% de los ratones a las 24 horas de administrados por vía oral el extracto etanólico. El extracto metanólico origina resultados semejantes. -5 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (postinoculación) Porc ent aje de paras item ia 8 Lote testigo
Figura 5. Efecto de la administración por vía oral de 625 mg/Kg del extracto etanólico de la chirimoya sobre la parasitemia por P. berghei en ratón. La administración del extracto se inició el mismo día que fue inoculado el plasmodio.
Meta 7: Actividad antipalúdica de extractos de la Artemisia actividades: Evaluación de la actividad antipalúdica de los extractos de la Artemisia.
En la figura 6 se muestra casi un 60 % en la disminución de la parasitemia y dos días más de sobrevivencia con respecto al lote control utilizando una infusión de 25 gramos de hojas secas por litro de agua de A. ludoviciana var. mexicana. También se muestra el promedio en el número de parásitos, así como su desviación estándar.
25 g/L de A. ludoviciana var. mexicana
TIEMPO (DÍAS) 0 1 2 3 4 5 6 7 % DE PARASITEMIA 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
LOTES DE RATONES CONTROL
TRATADOS CON 26 g/L DE LA HOJA SECA
MUERTE
MUERTE
Figura 6. Curva que muestra la parasitemia de ratones infectados con 1 x 106 eritrocitos infectados con P. berghei tratados con 25 g/L de hoja seca de A. ludoviciana var. mexicana
Meta 8: Actividad antipalúdica de los fármacos de referencia actividades: Evaluación de la actividad antipalúdica de los compuestos de referencia: Cloroquina y la infusión de la planta Artemisia annua L.
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
0
2
4
6
8
Tiempo (postinoculación)
P
or
cent
aj
e de par
as
itemi
a
Lote testigo Cloroquina (40 mg/Kg)Figura 7. Efecto de la administración de 40 mg/Kg de cloroquina sobre la parasitemia por P.
berghei en ratón. La administración del fármaco se inició el mismo día que fue inoculado el
plasmodio.
En la figura 8 se muestra que la curva de parasitemia no sobrepasa el 25% en los ratones tratados con 100 g/L de A. annua con una sobrevivencia de 13 días, o sea el doble.; mientras que el intervalo de inhibición de la parasitemia fluctúa entre un 96 y 100 % con respecto a la sobrevivencia de los ratones control.
100 g/L de extracto acuoso de A. annua TIEMPO (DÍAS) 0 2 4 6 8 10 12 14 % P A R ASIT E MIA 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 LOTE TESTIGO
TRATADOS CON EXTRACTO ACUOSO DE Artemisia annua
MUERTE
MUERTE
Figura 8. Curva que muestra la parasitemia de ratones infectados con 1 x 106 eritrocitos infectados con P. berghei tratados con extracto acuoso de 100 g/L de la hoja seca de
Meta 9: Integración de resultados actividades: Integración de resultados de los extractos naturales y de los compuestos químicos
Meta 10: Difusión de resultados. actividades: Difusión de los resultados ante reuniones científicas y revistas de circulación internacional. La difusión de los resultados se marcan
dentro de los subproductos que se obtuvieron.
Impacto.-
Se logró establecer una estrategia para evaluar in vivo la actividad antipalúdica de compuestos y/o extractos naturales, a través del modelo murino por Plasmodium berghei. Se formaron dos alumnos de posgrado (ya graduados), se presentaron conferencias y cursos sobre parasitología a nivel nacional, se colaboró en un programa de televisión (canal 5) y se publicaron dos artículos en revistas internacionales en relación al trabajo que se realiza por nuestro grupo de trabajo. No se detectó actividad antipalúdica relevante en los compuestos evaluados en comparación con el fármaco de elección (cloroquina) sin embargo la experiecia alcanzada nos permitirá continuar con la búsqueda de compuestos alternativos.
