Marcadores Moleculares

Curso 2017

Marcadores Moleculares

Esteban Hopp

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Marcadores Morfológicos

Fenotipos que resultan de mutaciones en el ADN

¿Qué son los marcadores genéticos?

Gregor Mendel (Moravian Museum, Brno)

• El concepto de marcador surge con los trabajos de Mendel:

Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres morfológicos) como marcadores que le permitieron

estudiar los patrones de la herencia

Jardín del monasterio donde Mendel realizaba sus experimentos con las arvejas

• Permiten establecer diferencias (polimorfismos) entre

dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la misma especie (o a especies emparentadas).

• Su herencia suele responder a las leyes de Mendel. • Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo

morfológico (fenotípicos), por ejemplo, color de la flor.

• Permiten la confección de mapas genéticos o de

ligamiento.

• Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas.

¿Qué son los marcadores genéticos?

¿Puede un marcador genético ser fenotípico y genotípico?

Fenotípicos: los polimorfismos de los genes se detectan a través de sus productos

- Morfológicos: por ejemplo, color de flor

- Bioquímicos: básicamente perfiles electroforéticos de isoenzimas y de proteínas de reserva

Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel del ADN

- Restricción + hibridación molecular (ejemplo, RFLP)

- Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites) - Restricción + PCR: (ejemplo, AFLP)

- (re)Secuenciación directa, indirecta o parcial (SNP/GBS)

Tipos de

marcadores genéticos

TIPOS DE MARCADORES

:

“Neutros” Random DNA Markers

(marcadores al azar)

derivados de cualquier parte del genoma,

fenotípicamente neutros (teóricamente asumidos

como tales para los programas bioestadísticos)

“Funcionales” Functional Markers (marcadores

funcionales)

sitios polimórficos dentro de genes afectando

causalmente la variación del carácter fenotípico.

Surgen como marcadores moleculares de las

regiones transcriptas/expresadas del genoma

Pueden no ser genotípicos: por ej el período de

Para:

• Identificación (genotipificación) de hospe- dantes o de patógenos

• Mapeo de genes y QTLs de resistencia • Selección asistida por marcadores

• Clonado posicional de genes basado en mapa

• Estudios de variabilidad/diversidad genética en distintas

especies (plantas y fitopatógenos), germoplasma, identificación de genotipos indicadores, etc

¿Para qué queremos usar

MM?

Comparación entre marcadores morfológicos y moleculares Marcadores morfológicos

Influencia del ambiente Bajo número

Baja cobertura del genoma Bajo nivel de polimorfismo Menos informativos

(dominantes o recesivos) Caracteres de madurez

Entrenamiento y subjetividad

Sin influencia ambiental y neutros

Cantidad ilimitada

Amplia cobertura del genoma Alto nivel de polimorfismo Más informativos

(en general codominantes) Análisis en fases tempranas Sencillos, rápidos y objetivos Marcadores

moleculares

Sin embargo…. Hoy en día, a los morfológicos los empezamos a llamar fenómicos

Mapa genético de tomate basado en marcadores morfológicos

• Isoenzimas

Grupo de múltiples formas moleculares de una misma enzima presente en una misma especie, como resultado de la presencia de uno o más genes que codifican cada una de estas formas.

Las que son relevantes como marcadores genéticos son las aloenzimas (o alozimas) que son variantes alélicas del mismo gen (o locus) y que presentan una migración electroforética diferencial.

Marcadores bioquímicos: isoenzimas

Ejemplo:

detección de isoenzimas de maíz

F isomerasa

Identificación de variantes isoenzimáticas. Se observan genotipos homocigotas y heterocigotas para diferentes alelos en una población de maíz analizada para dos loci isoenzimáticos (MDH y F isomerasa), lo que

revela la existencia de polimorfismos dentro de la misma.

Malato deshidrogenasa (MDH)

Perfiles electroforéticos de proteínas de reserva de distintas variedades argentinas de avena.

Marcadores bioquímicos: Proteínas de reserva

¿Se siguen usando?

¡Sí! Para registro y protección de variedades comerciales Marcadores bioquímicos Aunque tienen algunos problemas con el sindicato de geles

Marcadores genotípicos o moleculares basados en la restricción enzimática

del ADN Marcadores moleculares RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de longitud de fragmentos

Mutaciones puntuales:

Ocurren en sitios de restricción.

Mutaciones estructurales:

Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.

Origen del polimorfismo de los RFLPs

Análisis utilizando RFLPs de los bulks resistente (R) y susceptble (S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas de restricción HinfI, DdeI, HindIII, DraI, EcoRI, XbaI y StyI (1 al 7).

Autoradiografía de los perfiles de RFLP obtenidos empleanado la sonda s1+A/as1+T(584) marcada con radioactividad.

Perfiles de RFLPs de Solanum

• Presentan bajo nivel de polimorfismo (en comparación con otros marcadores

moleculares).

• Se requiere disponer de sondas específicas

para la especie en estudio.

• La utilización de radiactividad introduce altos

costos y problemas de bioseguridad.

• Requieren alta cantidad de DNA.

El procedimiento es laborioso y lento.

• ¡¡¡¡¡¡¡OBSOLETOS!!!!!!

Desventajas de los RFLPs

Marcadores moleculares basados en la amplificación arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

Random Amplified Polymorphic DNAs

(polimorfismo de ADN amplificado al azar)

RAPDs

Amplificación de ADN anónimo con iniciadores de secuencia arbitraria

No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante

• La herencia es dominante (menor información

genotípica).

• Poseen problemas de

reproducibilidad.

• La interpretación de bandas presenta

dificultades.

• A medida que la distancia filogenética

aumenta, también aumenta la probabilidad de que dos fragmentos de ADN diferentes

comigren y se cometan errores de cómputo (no son confiables para comparación entre especies distintas).

• Sólo se puede computar presencia compartida

de bandas y no la ausencia.

Desventajas de los RAPDs

Amplified Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de longitud de fragmentos

amplificados)

Marcadores moleculares AFLP Marcadores moleculares basados en la amplificación arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

Procedimiento para la

obtención de AFLPs

AFLP fluorescentes

Detección de AFLPs usando durante la última etapa de amplificación iniciadores fluorescentes,

resolviendo los fragmentos en un secuenciador ABI3130XL

• Herencia dominante.

• Bajo contenido de información

genética por locus.

• Procedimiento medianamente

laborioso.

• Costo medio.

• Tecnología patentada (no es de

libre utilización).

Desventajas de los

Microsatélites

Repeticiones en tándem de secuencias cortas de DNA de 1 a 10 pb de longitud Ejemplos: (GA)₁₄ ...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA... (GAT)₁₀ ...GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT... (CATC)₈ ...CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC.. Sinónimos: SSLP, SSRP, SSR o STMS

Microsatélites

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’ 3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

16 repeticiones

5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’ 3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’

5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3’ 3’ CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCG 5’

105 pb

iniciador

CTGCGATCAGCCCATCATCG 5’

5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAG

iniciador

PCR con iniciadores específicos

Producto de amplificación obtenido

Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante

Microsatélites en diploides

1

2

3

1 2

3

(+)

Ejemplo: variedades de soja (Glycine max) analizadas mediante SSR

Patrones obtenidos para 43 variedades de soja. Gel de poliacrilamida teñido con plata.

Métodos de separación / detección

Agarosa/bromuro de etidio Poliacrilamida / nitrato de plata

Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego

Gentileza Lic. P. Talia y Dra. N. Paniego

Radiactividad

Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego

Fluorescencia

Empleo de secuenciador automático Homocigota alelo 1 Pico 147-149 pb Homocigota alelo 2 Pico 153-155 pb Heterocigota: ambos alelos

Electroferogramas para 3 genotipos de sorgo Gentileza Téc. L. Fernández

• Polimorfismo muy elevado (multialélicos)

• Enorme número de loci

• Herencia mendeliana codominante

• Interpretación sencilla de los resultados

• Reproducibilidad muy alta

• Resultados transferibles entre laboratorios

• Automatización

Ventajas de los

• Se requiere conocer la secuencia nucleotídica

involucrada  alto costo para desarrollar los primers (oligonucleótidos iniciadores)

- Inicialmente lentos - Inicialmente costosos

• Unilocus (aunque pueden hacerse multiplex)

• Alta tasa de mutación que puede afectar la

reproducibilidad en estudios genealógicos.

Desventajas de los

SNP +

(re)secuenciación (ej. GBS)

• Diversidad nucleotídica: 90% de la variación del genoma en cualquier organismo

• En general son bialélicos, aunque por definición puede haber 4 variantes

• Ubicuos: pueden estar en cualquier región del genoma

• Se encuentran cada 100 a 300 pb • Estables

• Pueden ser funcionales si están en regiones codificantes.

• Fáciles de procesar bioinformáticamente

SNPs Indels (Insertions/Deletions)

Caracterís-ticas de los SNPs

Ventajas y desventajas de los marcadores SNP • Ventajas:

- Baja tasa de mutación (mayor estabilidad que los SSR) - Muy abundantes

- Fáciles de analizar por métodos bioinformáticos

- Desarrollo continuo de nuevas metodologías analíticas para su detección

- Simplificación de los estudios comparativos cruzados.

• Desventajas:

- En la mayoría de los métodos, se requiere conocer la secuencia nucleotídica involucrada

- Costosos de aislar y caracterizar (secuenciación) - Bajo contenido de información para un único SNP

Técnicas para la detección de SNPs

Costo

Sensibilidad

Especificidad

Número de muestras a analizar

Posibilidad de automatización

Equipamiento necesario

Dificultad del ensayo



Intensa actividad comercial en este área

Detección

de SNPs: métodos de análisis

Métodos para pocas muestras (diagnósticos) para uno o pocos loci

 PCR de tiempo real

 Secuenciación por Sanger

Métodos de análisis masivo de todo el genoma

 Microarreglos de DNA  Nanotecnología

 Secuenciación en paralelo por NGS Detección

de SNPs: métodos de análisis

PCR en tiempo real: sistema TaqMan

Detección de SNPs: métodos de análisis

Detección de SNP empleando sondas TaqMan® para cada alelo

Química de la discriminación alélica

La sonda sólo hibrida con la secuencia blanco si existe complementariedad perfecta de bases. Así, la sonda marcada con FAM sólo reconoce al alelo 2 (AT)

y la sonda marcada con VIC sólo reconoce al alelo 1 (GC). Ambas sondas se colocan en la misma reacción de PCR y, de acuerdo con el alelo presente, se obtienen señales fluorescentes para uno u otro fluorocromo. En un individuo

Fig. 1 Example of intraspecies polymorphism of the ITS. The part of sequences of two different clones of

M. bovis (a, b) and Mycoplasma conjunctivae (c, d) are present.

Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71: 680–698. Sequence of the intergenic 16S-23S rRNA spacer (ITS) regionof

Métodos para pocas muestras (diagnósticos)

 PCR de tiempo real

 Secuenciación por Sanger

Métodos de análisis masivo

 Microarreglos de DNA  Nanotecnología

 Secuenciación en paralelo por NGS Detección

de SNPs: métodos de análisis

Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71: 680–698. Sequence of the intergenic 16S-23S rRNA spacer (ITS) regionof Mollicutes species and their

Unión de un clon a una microesfera

Análisis de fragmentos fluorescentes amplificados mediante una PCR alelo-específico

multiplexada.

Genotipificación Marcadores moleculares tradicionales de (SSR, RFLP, AFLP, etc):

- Bajo rendimiento o low- throughput: número de marcadores alrededor de 100.

- Desarrollo y descubrimiento es costoso y requiere de tiempo - SSRs son especie específicos.

- Baja capacidad de multiplexado.

“The ideal molecular approach for population genomics should uncover

hundreds of polymorphic markers that cover the entire genome in a single, simple and reliable experiment. Unfortunately, at present there is no

such approach.” Luikart et al 2003

(Davey et al, 2011)

SNP arrays de alto rendimiento

- High throughput: pero “solo” miles de marcadores

- La producción de una matriz de alta calidad requiere una inversión sustancial de los recursos.

- Conocimiento previo de secuencias.

- Específicos de la población con la que los desarrollaron. - Evaluación de uno o dos individuos a la vez.

NGS marker discovery and genotyping methods

- High throughput: miles a cientos de miles de marcadores - Descubrimiento o desarrollo de nuevos marcadores

- Secuenciación y genotipificación simultánea - Decenas o centenas de individuos

- Sin conocimiento previo de secuencias

En un sólo ensayo!

Cómo reducir costos secuenciando

solo lo necesario

Para estudios de poblaciones: Resecuenciación de genomas:

Especies con genoma de referencia:

• Secuenciación del genoma a baja profundidad (<30X) para descubrir

SNPs en muchos individuos es costosa e innecesaria.

Especies sin genoma de referencia:

• La secuenciación y ensamblado del genoma de un individuo de novo es un gran desafío, y costoso.

Genotipificar reduciendo la representación:

•Secuenciar sólo la región de interés de cada individuo: menor costo •Más sencillo el análisis bioinformático de datos

•Menor tiempo

Restriction site-associated DNA sequencing (RAD-Seq) (Baired et al., 2008)

 Reduce Representation Libraries (RRLs)

 Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPS)  Restriction fragment sequencing (RESTseq)

 Multiplexed shotgun genotyping (MSG)  EzRAD

 Sequence-Based Genotyping (SBG)  2b-RAD

Genotyping by Sequencing (GBS) (Elshire et al., 2011) Más populares:

Double digest Restriction site-associated DNA sequencing (ddRAD-Seq) (Peterson et al., 2012)

1. Digestión de ADN genómico de muchas muestras

2. Selección o reducción de los fragmento de PCR

resultantes

3. NGS del subconjunto de fragmentos (< a 1000pb)

Los polimorfismos de los fragmentos secuenciados se

utilizan como marcadores moleculares.

RADseq

Digestión Ligación adaptadores-index Pool Corte al azar Selección de tamaños Ligación adaptadores Y PCR Lectura SE (50pb)

GBS

Digestión Ligación adaptadores-index Pool PCR Lectura SE 86pb (48 o 96plex en GA) RADSe q GBS

Truong HT, et al. (2012) Sequence-Based Genotyping for Marker Discovery and Co-Dominant Scoring in Germplasm and Populations. PLoS ONE 7(5): e37565. doi:10.1371/journal.pone.0037565

dd RAD-Seq Digestión doble Ligación adaptadores-barcode Pool Selección de tamaños PCR-index Lectura PE 125pb

• Elimina el corte por azar

- Se reduce 5 veces el costo de preparación de libraries en comparación con RAD-Seq • Size Selection preciso

- Reduce duplicados de las regiones a secuenciar

- Profundidad de lectura similar entre individuos en cada región del genoma

GBS: bioinformática para la identificación y anotación de marcadores asociados

MEJORAMIENTO VEGETAL - TECNICAS CLÁSICAS

OBJETIVOS

a) Obtener un mayor rendimiento agronómico b) Mejorar la calidad del producto

c) Aumentar la seguridad de cosecha

CARACTERÍSTICAS GENERALES

a ) Acumulativo: las nuevas mejoras se suman a las anteriores

b) Continuo: debido a que siempre se exige más

– cambios de hábitat

– cambios en las técnicas de cultivo – cambios en los mercados compradores

– cambios en las poblaciones de fitopatógenos

c) Competitivo: las nuevas variedades deben superar a las ya difundidas (ensayos comparativos de rendimientos — ECR)

CONSIDERACIONES RESPECTO DE LA ESPECIE Y EL CARÁCTER A MEJORAR

a) Modo de reproducción (alogamia, autogamia o agamia). Biología floral, sistemas de autoincompatibilidad, etc. b) Cantidad de genes y momento de expresión.

c) Tiempo por generación

d) Número de cromosomas y nivel de ploidía

Genética cuantitativa clásica

Generación parental

Progenie

Ganancia Diferencial de

F₂

P₂

F₁ P_{1 x}

Grandes poblaciones segregantes con miles de recombinantes

SELECCION FENOTÍPICA

Mejoramiento convencional

Resistencia a estrés hídrico Resistencia a enfermedades _{Deficiencia nutricional}

Diapositiva del IRRI Tomado de Bert Collard & David Mackill

Los métodos de mejoramiento se

basan en los mismos fundamentos

conceptuales que los vistos en Genética I

F₂

P₂

F₁ P_{1 x}

Grandes poblaciones segregantes con miles de recombinantes

SELECCION FENOTÍPICA

¿Y qué es lo moderno?... Repasemos: mejoramiento convencional

Resistencia a estrés hídrico Resistencia a enfermedades _{Deficiencia nutricional}

F₂

P₂

F₁ P₁ x

Grandes poblaciones segregantes con miles de recombinantes

Resistente

Susceptible

Selección asistida por Marcadores Moleculares (MAS)

Mejoramiento asistido por marcadores

En este esquema, la selección “fenotípica” se basa en marcadores moleculares

Diapositiva del IRRI Tomado de Bert Collard & David Mackill

Ventajas del MAS

• Método más sencillo

- comparado con la selección fenotípica si la

evaluación de la característica fenotípica es

laboriosa o compleja (recesiva, epistática,

compleja como contenido de proteínas)

• La selección se realiza a nivel de plántula

– Importante para características como calidad

del grano

• Aumenta la confiabilidad

– Se independiza de efectos ambientales

– Permite discriminar entre homcigotas y

heterocigotas y seleccionar plantas

individuales

Desventajas II

• Recursos

– Equipamiento, personal

calificado

• Costos!!!!

• Conocimiento de los

caracteres a seleccionar

(

posición en el mapa

genético:

disponer de

marcadores ligados)

¿Cómo hacemos para mapearlos?

Identificación de regiones genómicas asociadas a caracteres de interés

Diapositiva gentilmente cedida por Ing. Gabriela Pacheco

Mapeo de QTLs

Mapeo

de QTLs

Mapeo de Asociación y Genome-Wide

Association Studies (GWAS)

Diapositiva gentilmente cedida por Ing. Gabriela Pacheco

DL

• Desequilibrio de ligamiento

Mapeo por asociación

•Estrategia alternativa al mapeo de ligamiento.

•Ambos detectan asociaciones entre genotipos y fenotipos basados en la coheredabilidad de polimorfismos.

Mapeo de ligamiento Mapeo por asociación

Zhu 2008

•Parentales con fenotipo

contrastantes para el carácter •Número limitado de eventos de recombinación

•Baja resolución (pero mayor probabilidad de encontrar marcadores ligados)

•Población natural •Múltiples eventos de

recombinación debido a la historia de la población

•Alta resolución (pero menor probabilidad de encontrar marcadores ligados)

Mapeo por Asociación para la Podredumbre Húmeda del Capítulo en girasol

Evaluación fenotípica (Y)

• Se evaluó la incidencia de PHC en cada ensayo y se obtuvo la media ajustada para cada línea endocriada.

• Las LE se comportaron de manera diversa frente a la enfermedad.

• 52% de las líneas mostraron un comportamiento intermedio frente a PHC.

Analisis estadístico Alelos asociados Y = G + Q ó P/K + E 500 1000 In cid en ce

Candidate gene haplotypes

Un haplotipo de RhoBP_B mostró asociación

significativa con una

menor incidencia de PHC. •Las estructura del gen RhoBP_B

está caracterizada por 4 exones y 3 intrones.

•El genotipo 3:3 amplifica un

GWAS (Manhattan Plot)

Esclerosis sistémica en humanos