UNIVERSIDAD
DE
OVIEDO
Departamento
de
Biología
Funcional
Área
de
Fisiología
T
ESIS
D
OCTORAL
Retinoides en el desarrollo embrionario
bovino in vitro
Aida Rodríguez Pérez
Oviedo, 2008
Vicerrectorado de Ordenación Académica y Nuevas Titulaciones
FO
R
-OFE-V
CE-024
AUTORIZACIÓN PARA PRESENTACIÓN DE TESIS DOCTORAL
Datos Académicos:
Programa de Doctorado cursado: Biología Funcional y Molecular Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL
Departamento en que presenta la tesis doctoral: BIOLOGIA FUNCIONAL Título definitivo de la Tesis: RETINOIDES EN EL DESARROLLO
EMBRIONARIO BOVINO IN VITRO Autorización del director/es de la tesis
D/Dª: ENRIQUE GOMEZ PIÑEIRO
Universidad: Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario
D/Dª: CARMEN DIEZ MONFORTE
Universidad: Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario
D/Dª: LUIS J. ROYO MARTIN
Universidad: Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario Autorización del tutor de la tesis
D/Dª: JUAN ARGUELLES LUIS
Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL
Asimismo el director/directores de la tesis doctoral, cumplen con el requisito establecido en el artículo 32.1.b del Reglamento de Tercer Ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de Doctor y otros cursos de Postgrado, aprobado por Consejo de Gobierno de fecha 11 de julio de 2005 (BOPA 10.08.2005), y emiten el informe que se adjunta sobre la calidad científica de la misma, en cumplimiento de lo establecido en el R.D. 56/2005 y en el art. 35.1.a.bis del Reglamento de Tercer Ciclo de estudios universitarios, mencionado anteriormente.
Datos del alumno: Curso: 2007/2008
Apellidos: RODRIGUEZ PEREZ Nombre: AIDA
DNI: 11085629C Domiciliado en: OVIEDO Teléfono: 665976870 Calle: Avenida de Pumarín, 38,5ºB C.P. 33011
Resolución
El Departamento BIOLOGIA FUNCIONAL en su reunión de fecha 26 de Junio de 2008, acordó dar su conformidad para la presentación de la tesis doctoral a la Comisión de Doctorado, en cumplimiento de lo establecido en el RD 56/2005 de 21 de Enero.
Oviedo, 26 de Junio de 2008 EL TUTOR Director de la Tesis
Fdo: JUAN ARGÜELLES LUIS Fdo: ENRÍQUE GÓMEZ PIÑEIRO Directora de la Tesis Director de la Tesis
Fdo: CARMEN DÍEZ MONFORTE Fdo: LUIS J. ROYO MARTÍN El Director del Departamento
AGRADECIMIENTOS
Han sido muchos los que han participado de una u otra manera en el
transcurso de mi etapa predoctoral, sin ellos, la realización de esta tesis no habría sido posible, quiero agradecerles sinceramente su ayuda a lo largo de estos años.
A mis directores, del Área de Genética y Reproducción Animal del SERIDA,
por haberme dado la oportunidad de realizar la tesis doctoral, que en algún
momento ahora ya lejano, no distaba mucho de ser un sueño. Al Dr. Enrique
Gómez Piñeiro, por haberme dado la oportunidad de iniciarme en el campo de
la investigación, lo que ha supuesto una gran oportunidad personal y
profesional en mi vida. A la Dra. Carmen Díez Monforte por apoyarme a lo
largo de este camino, por sus directrices y orientaciones y por compartir
conmigo su experiencia en la producción embrionaria in vitro. Y al Dr. Luis
José Royo Martín, por guiarme en el mundo de la Biología Molecular y
conseguir que no me haya dado por vencida en los momentos más difíciles, por su tiempo y su generosidad. A los tres, muchas gracias por hacer que este campo me haya interesado cada día más.
Asimismo, quiero agradecer al Ministerio de Educación y Ciencia la concesión
de la beca de Formación de Personal Investigador (BES‐2003‐2900)
cofinanciada por el Fondo Social Europeo y enmarcada en el proyecto “Los
retinoides en el desarrollo y la diferenciación del embrión bovino producido in
vitro” (AGL 2002‐01175), que me ha permitido tener la financiación
necesaria durante este periodo.
Gracias también a los doctores Marta Muñoz y J. Néstor Caamaño, miembros del equipo investigador del Área en el que he realizado mi tesis, y al Dr.
Shuntaro Ikeda, de la Universidad de Kyoto. A los tres, gracias por su
generosidad en las publicaciones, por su tiempo y, principalmente, por
mostrar su interés en explicarme y discutir diversas técnicas y metodologías.
A los miembros del departamento de Biología Funcional de la Universidad de
Oviedo, donde en todo momento su amabilidad y disponibilidad han estado
presentes, en especial a mi tutor el Dr. Juan Argüelles Luis.
ayuda, por facilitarme al máximo tantos trámites imprescindibles y por su
siempre buena disposición.
Quisiera agradecer especialmente a Keith H.S. Campbell su generosidad, por
darme la oportunidad de colaborar durante seis meses en su grupo del
departamento de Animal Physiology de la Universidad de Nottingham,
brindándome la posibilidad de conocer metodologías complementarias a mi
formación. Mi agradecimiento también a Pat Fisher, por todo el tiempo
dedicado, por su amabilidad, y por haber despertado en mi un gran interés por
el establecimiento de cultivos embrionarios primarios.
A todas aquellas personas con las que estoy casi a diario y que contribuyen a
empezar el día con una sonrisa: Ángel, Mª Jesús, Carolina, David, Lucía
(gracias por tus ideas), Mª José, Ana, Adelino, José Antonio, Mª Carmen…
También mi agradecimiento a Érica y Celia, con las que he compartido
despacho y laboratorio, épocas de mucho trabajo y muy buenos momentos.
Muchas gracias también a Nieves, por haberme enseñado a trabajar en el
laboratorio de producción in vitro y por hacer que la época de la puesta a
punto de la FISH resultase hasta entretenida.
Al Dr. Carlos O. Hidalgo y a mi actual grupo de trabajo, por llevar tan bien
mi estrés en esta recta final de la tesis, facilitarme al máximo disponer de
tiempo para su escritura y por haberme dado la oportunidad de trabajar con
ellos.
Y, principalmente, a mi familia, que con su ayuda, esfuerzo y sacrificio han
contribuido enormemente a que llegue este momento; tanto a ellos como a mis
amigos les he dedicado mucho menos tiempo del que debería durante estos
años. Todo mi cariño y agradecimiento por entenderme en todo momento, por
creer en mí y participar en la culminación de este trabajo.
A Juanma A Luis
Í
NDICE
Pág.
ÍNDICE
I
ÍNDICE
de
FIGURAS
V
ÍNDICE
de
TABLAS
VII
INTRODUCCIÓN
3
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO 5
1.1. Gametogénesis 7
1.1.1 Ovogénesis y ovulación. 8
1.1.2. Espermatogénsis. 10
1.2. Formación y desarrollo del embrión preimplantacional. 11
1.2.1. Maduración del ovocito. 11
1.2.2. Capacitación espermática. 13
1.2.3. Fecundación in vitro. 14
1.2.4. Cultivo in vitro. 18
1.3. Embriones bovinos producidos in vitro e in vivo. 22
2. RETINOIDES EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO 25
2.1. Absorción, almacenamiento y metabolismo intracelular de la
vitamina A. 25
2.2. Retinoides y la producción de embriones bovinos in vitro. 30
2.3. Control génico del desarrollo por medio de los retinoides. 32
3. REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR 37
3.1. Ciclinas. 39
3.2. Puntos de control del ciclo celular. 43
OBJETIVOS
49
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO 55
1.1. Obtención de ovocitos. 55
1.2. Inhibición meiótica. 56
1.3. Maduración in vitro. 57
1.4. Fecundación in vitro. 58
1.5. Cultivo in vitro. 60
2. RECUENTO CELULAR 63
3. APOPTOSIS Y NECROSIS CELULAR 65
4. BIOLOGIA MOLECULAR 69
4.1. Calidad del transcrito. 69
4.2. Expresión génica. 70
4.2.1. Extracción de ARNm. 70
4.2.2. Transcripción inversa. 71
4.2.3. PCR a tiempo real. 72
4.2.3.1. Cuantificación del producto amplificado. 74
4.2.3.2. Identidad del producto amplificado. 75
4.2.3.3. Protocolo de PCR a tiempo real. 77
4.2.3.4. Validación de un protocolo de PCR a tiempo real. 81
4.2.4. Normalización de la expresión génica. 82
4.2.4.1. Normalización en el Experimento 1. 86 4.2.4.2. Normalización en el Experimento 2. 86 4.2.4.3. Normalización en el Experimento 3. 87 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 91
RESULTADOS
1. EXPERIMENTO 1 95
1.1. Resumen y Resultados más destacables. 95
1.2. Retinoid‐Dependent mRNA Expression and poly‐(A) contents
2.1. Resumen y Resultados más destacables. 105
2.2. Retinoids during the in vitro transition from bovine morula to
blastocyst. 107
3. EXPERIMENTO 3 117
3.1. Resumen y Resultados más destacables. 117
3.2. Retinoid‐ receptor‐specific agonists regulate bovine in vitro
early embryonic development, differentiation and expression of
genes related to cell cycle arrest and apoptosis.
119
DISCUSIÓN
131
1. EFECTO DEL ÁCIDO RETINOICO DURANTE LA
MADURACIÓN IN VITRO DEL OVOCITO BOVINO. 133
2. EFECTO DE LOS RETINOIDES DURANTE EL CULTIVO
IN VITRO DEL EMBRIÓN BOVINO. 139
2.1. Papel de los receptores RAR en el desarrollo embrionario
bovino, adición de ATRA (ácido all‐trans‐retinoico) al cultivo. 139
2.2. Papel de los receptores RXR y del tiempo de exposición a
ATRA en el efecto de los retinoides durante el cultivo in vitro del
embrión bovino. 147
CONCLUSIONES
155
BIBLIOGRAFÍA
159
ANEXOS
ACRÓNIMOS
183
ANEXO I: Preparación de reactivos.
187
ANEXO II: Secuencias (Gene Bank) de los genes analizados por
PCR a tiempo real.
191
Índice
de Figuras
Pág.
Figura 1. Representación esquemática de Espermiogénesis yOvogénesis.
7
Figura 2. Esquema del desarrollo folicular.
9
Figura 3. Interacción de espermatozoide y ovocito durante lafecundación, momento en el que se desencadena la
reacción acrosómica en el espermatozoide.
15
Figura 4. Reacción cortical en el ovocito durante lafecundación.
17
Figura 5. Cronología del desarrollo embrionario bovino in
vitro.
18
Figura 6. Blastocisto bovino de día 8 producido in vitro.
20
Figura 7. Moléculas precursoras de retinol.25
Figura 8. Moléculas precursoras de ácido retinoico (AR).26
Figura 9. Principales compuestos biológicamente activos enel metabolismo de los retinoides.
27
Figura 10. Mecanismo de acción intracelular en retinoides.28
Figura 11. Control transcripcional de genes Hox mediado porAR.
34
Figura 12. Activación-inactivación de los complejos
Ciclina-CDK.
39
Figura 13. Implicación de los principales complejos
Ciclina-CDK en la evolución del ciclo celular.
40
Figura 14. Complejo cumulus-ovocito bovino inmaduro.55
Figura 15. Cultivo en monocapa de células Vero.61
día 7.
Figura 17: Diversas morfologías en núcleos positivos a la técnica TUNEL en blastocistos bovinos.
67
Figura 18. Cuantificación del ARNm poliA.69
Figura 19. Purificación del ARNm.
70
Figura 20. Funcionamiento de Sybr Green.
73
Figura 21. Cinética de la reacción de PCR a tiempo real.75
Figura 22. Curvas de disociación del producto amplificado.76
Figura 23. Recta de regresión para la estimación de losparámetros principales de un protocolo de PCR a
tiempo real.
81
Figura 24. Estabilidad en la expresión de los genes control.
88
Figura 25. Determinación del número óptimo de genesÍndice
de Tablas
Pág.
Tabla 1. Composición del medio Sperm-TALP.
58
Tabla 2. Composición del medio Fert-TALP.59
Tabla 3. Estadios del desarrollo embrionario y edad de losembriones expresada en días post-inseminación.
60
Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados para la detección de laIntroducción
La alta efectividad de las técnicas de producción de embriones
in vitro en bovino ha convertido esta especie ganadera en un modelo
de estudio del desarrollo embrionario.
Mediante el cultivo in vitro se producen embriones con
capacidad de establecer gestaciones a término una vez transferidos a
hembras receptoras. La producción de embriones bovinos in vitro es
hoy en día rutinaria y sus aplicaciones son diversas, no sólo desde el
punto de vista de la investigación y como modelo para otras especies
(humana) sino también para obtener descendencia a partir de vacas de
alto mérito genético.
En la presente memoria de tesis se estudian los efectos en el
desarrollo y la proliferación celular, alteraciones en el transcurso del
ciclo celular y la expresión génica derivadas del tratamiento in vitro de
ovocitos o embriones bovinos con retinoides.
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
El establecimiento de protocolos de maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro (CIV) para la producción de embriones bovinos ha permitido profundizar en el conocimiento de los sistemas biológicos, incrementar el número de descendientes y acortar el intervalo generacional, acelerando así la mejora genética. De forma natural, una vaca produce normalmente una única cría por año, con un intervalo desde la concepción al parto de entre 280 y 285 días. Así, la reproducción bovina es menos eficaz que otras especies ganaderas como el cerdo o la oveja, las cuales paren dos veces al año (Gordon, 1994).
Con los objetivos de mejorar el rendimiento reproductivo y de lograr un mayor conocimiento de los procesos fisiológicos relacionados con la reproducción, las biotecnologías reproductivas han avanzado de modo notable desde sus comienzos a mediados del siglo XX.
En el ganado bovino, las técnicas más utilizadas para lograr dichos objetivos incluyen la multiovulación y transferencia embrionaria (tecnología MOET), y la producidos in vitro (PIV) de embriones a partir de ovocitos obtenidos de vacas vivas o sacrificadas.
La tecnología convencional de transferencia de embriones se basa en la superovulación de hembras donantes que son inseminadas artificialmente. Los embriones se recuperan mediante lavado uterino 7 días después. Esta operación se puede repetir varias veces por año en sucesivos ciclos de estimulación hormonal e inseminación artificial.
Los trabajos de Chang (1951, 1968) y Austin (1951) orientados al establecimiento de los mecanismos básicos de la fecundación en mamíferos y al estudio de la capacitación del semen, abrieron nuevos frentes en el campo de la FIV en mamíferos. El primer sistema de FIV y CIV se realizó en conejos (Chang, 1959). Más tarde, Whittingham (1968) realizó con éxito la fecundación de ovocitos de ratón en un
medio simple y químicamente definido, desarrollándose los embriones hasta día 17 post‐fecundación. Eyestone y First (1989) utilizaron un cocultivo con células de oviducto para superar el bloqueo del desarrollo en el estadio de 8‐16 células.
1.1. Gametogénesis.
Durante el crecimiento de las células sexuales se alternan generaciones de células haploides (células de la línea germinal: gametos) y diploides (células somáticas), debido a la coexistencia de dos formas de división celular, la mitosis y la meiosis.
Figura 1. Representación esquemática de Espermiogénesis y Ovogénesis. Modificada de http://www.bio.miami.edu Universidad de Miami, Departamento de Biología.
La gametogénesis se inicia en la vida embrionaria y da lugar a células competentes para la fecundación (Baker, 1982).
Las células precursoras de los gametos se originan en el tejido endodérmico extraembrionario y migran a la zona gonadal intraembrionaria donde se diferencian en oogonias (Eddy y cols., 1981) o espermatogonias.
En el feto femenino, las oogonias ya poseen constituyentes celulares típicos (aparato de Golgi, mitocondrias, núcleo y uno ó más nucleolos). Por su parte, el espermatozoide, gameto masculino, se forma a través de los procesos consecutivos de espermatogénesis (a partir de la espermatogonia) y de espermiogénesis.
1.1.1. Ovogénesis y Ovulación.
En la formación del ovocito, la meiosis, proceso de reducción cromosómica (momento en el que las oogonias que son diploides darán lugar a los ovocitos, células haploides), antecede a una fase de crecimiento del ovocito.
Las oogonias comienzan la meiosis durante la vida intrauterina, pasando a denominarse ovocitos primarios (Figura 1). La primera división de la meiosis (meiosis I) se inicia con la profase I y comienza antes del nacimiento. El ovocito presenta un núcleo prominente denominado vesícula germinal, el cual sufrirá varias transformaciones en su material genético, tales como sobrecruzamientos y recombinaciones (Byskov, 1982). En este punto de la meiosis el ovocito detiene su división de forma que al nacimiento, la hembra presenta los ovarios completamente formados y conteniendo una cohorte de ovocitos primarios detenidos en la primera fase de la división meiótica (Baker y Franchi, 1967). Diversos autores han sugerido que la detención del ovocito en esta etapa de profase I puede deberse a factores tales como el contacto con las células que rodean al ovocito (Ohno y Smith, 1964) o la actuación de las células germinales ectópicas de las glándulas adrenales (Zamboni, 1970).
El ovocito primario está rodeado por 2 ó 3 capas de células, constituyendo el folículo primordial. Thibault y cols., (1987) sostienen que en este estadio, las células foliculares que rodean al ovocito
inhiben el crecimiento del mismo de forma que el desarrollo de las células que lo rodean y el del propio ovocito transcurren en paralelo.
Algunos, del total de estos folículos primordiales, comenzarán a crecer y desarrollarse de un modo no dependiente de las gonadotropinas, para dar lugar a los folículos primarios, donde el ovocito aparece rodeado de una única capa de células foliculares. Las secreciones de estas células producen mucopolisacáridos, que se dispondrán alrededor del ovocito formando una membrana llamada zona pelúcida.
La zona pelúcida es una capa extracelular de relativa dureza y refringente a la luz. Esta capa protege al embrión durante la segmentación y previene al
embrión de fijarse al oviducto en su migración al útero (Moore y Persaud, 2000).
Cuando el animal alcanza la pubertad, el folículo responde al estímulo de las hormonas gonadotropinas, pasando a denominarse folículo secundario o antral, formado por las tecas (externa e interna), las células de la granulosa y el antro (Figura 2).
A medida que el antro aumenta en volumen, el folículo secundario crece y pasa a denominarse folículo terciario (Figura 2).
Para que el folículo terciario llegue a la fase de ovulación, es
necesaria la acción de la gonadotropina LH, que actuando sobre la teca interna sintetiza andrógenos que se transforman en estrógenos en las células de la granulosa por acción de la FSH. Al mismo tiempo el
Figura 2. Esquema del desarrollo folicular. Modificada de www.erin.utoronto.ca. Universidad de Toronto.
folículo madura alcanzando la fase de folículo preovulatorio o de Graaf (Zuckermann, 1962). La elevada concentración intrafolicular de estrógenos dará lugar a la sintomatología típica del celo y a la liberación de GnRH del hipotálamo anterior, que desencadena el pico preovulatorio de LH y FSH que provoca la ovulación. El folículo ovulatorio puede alcanzar un diámetro de 19 mm, y el ovocito que se libera completa la primera fase de la meiosis y entra en la segunda fase (ovocito secundario).
Tras la ovulación, el folículo es sustituido por el cuerpo lúteo, principal responsable de la secreción de progesterona. Serán las variaciones en la concentración de progesterona producida las que, a través del eje hipotálamo‐hipófisis‐gonadal, controlen las sucesivas ovulaciones y ciclos estrales de la hembra.
1.1.2. Espermatogénesis.
La espermatogénesis es un proceso de diferenciación celular en el cual la célula germinal masculina o espermatogonia sufre varias divisiones mitóticas y meióticas hasta formar la espermátida. La espermátida sufrirá sucesivas transformaciones para dar lugar al espermatozoide, durante el proceso denominado espermiogénesis (Hess, 1999; Figura 1). Este proceso se realiza en los túbulos seminíferos de los testículos, cuyo epitelio está constituido por dos tipos de células, células germinales y células somáticas o de Sertoli. La producción de espermatozoides comienza con la pubertad y puede durar toda la vida en la mayoría de los machos. Los espermatozoides completarán su maduración en el epidídimo (Yanagimachi, 1994).
1.2. Formación del embrión preimplantacional.
La conjugación de los gametos femenino y masculino da lugar al zigoto. Para que esto ocurra en condiciones óptimas, tanto el ovocito como el espermatozoide deben estar en una fase determinada del ciclo celular.
El ovocito ha de completar el proceso de maduración, que implica cambios estructurales y bioquímicos en el núcleo, en el citoplasma y también en las células del cumulus oophorus que rodean al ovocito. Por su parte, los espermatozoides deben sufrir una serie de modificaciones conocidas como “capacitación”, proceso que in vivo tiene lugar en el oviducto (Austin, 1951).
1.2.1. Maduración del ovocito.
En los mamíferos, existen grandes diferencias individuales entre los ovocitos en cuanto a su capacidad para desarrollarse tras la fecundación, por lo que se ha acuñado el término “competencia para el desarrollo”, definido como el potencial de un ovocito para que, tras concluir los procesos de maduración y fecundación, se desarrolle hasta el estadio de blastocisto o dé lugar a un descendiente vivo (Duranthon y Renard, 2001). A pesar de las mejoras logradas hasta la fecha en el cultivo de ovocitos y embriones, las mejores tasas de desarrollo hasta blastocisto rondan el 30‐35%, partiendo de complejos cumulus‐ovocito inmaduros (Wrenzycki y cols., 2007).
Las gonadotropinas FSH y LH estimulan el crecimiento folicular, la maduración de los ovocitos, la producción de estrógenos (estradiol‐17β) y desencadenan la ovulación.
Durante la última fase de crecimiento folicular, el ovocito madura y su núcleo se prepara para llevar a cabo divisiones reductivas. La vesícula germinal se desintegra mientras que los cromosomas se condensan. El centrosoma se divide en dos centriolos alrededor de los
cuales aparecen los ásteres. Estos ásteres se separan y se forma un huso entre ellos. Los cromosomas, en pares diploides, se liberan en el citoplasma y se acomodan en la placa ecuatorial del huso (Metafase I). El ovocito primario sufre dos divisiones meióticas. En la primera, se forman dos células hijas, diploides. Una de las células resultantes de esta división contendrá la mayor parte del citoplasma: es el ovocito secundario. La otra célula contiene prácticamente sólo la dotación cromosómica, y se denomina primer corpúsculo polar (Figura 1).
La segunda división comienza poco después de la ovulación y se detiene nuevamente en la metafase de la segunda división meiótica (Metafase II). Esta división dará lugar a dos células haploides, una de ellas con la mayor parte del citoplasma, y un segundo corpúsculo polar. En el momento de la ovulación el ovocito tiene un diámetro de entre 145 y 150 μm y es capaz de reanudar la meiosis, iniciándose así la fase de maduración nuclear. La meiosis del ovocito sólo finalizará con la fecundación; por tanto, el segundo corpúsculo polar y el pronúcleo femenino se forman en el momento de la fecundación.
El citoplasma del ovocito juega un papel primordial en el correcto funcionamiento del desarrollo subsiguiente a la fecundación, aportando la energía suficiente para el funcionamiento celular del ovocito y los primeros estadios embrionarios. La maduración citoplasmática es un proceso que implica la relocalización y modificación de algunos orgánulos celulares del ovocito, así como modificaciones post‐transcripcionales del ARNm acumulado durante la ovogénesis (Grøndahl, 2008). De este modo, durante la maduración citoplásmica se detectan diversos sucesos, la migración de los gránulos corticales (Cran y Cheng, 1986), modificaciones en los retículos endoplásmicos liso y rugoso (Hyttel y cols., 1986b; Hyttel, 1988; Kuzmina y cols., 2007) y fundamentalmente, en las mitocondrias, donde su organización y actividad metabólica son imprescindibles para la maduración citoplásmica del ovocito, así como para la correcta conclusión de la meiosis (Thibault y cols., 1987; Lonergan y cols., 2003c; Kuzmina y cols., 2007).
Todas estas modificaciones son necesarias para el progreso del ovocito hasta un estado que permita su fecundación, bloqueo de la polispermia y desarrollo del embrión producido (Grøndahl, 2008).
La cronología de la maduración de ovocitos bovinos ha sido estudiada tanto in vivo (Kruip y cols., 1983) como in vitro (Hyttel y cols., 1986a). En el ganado vacuno, los ovocitos madurados in vitro tienen menor capacidad para ser fecundados y desarrollarse posteriormente hasta estadio de blastocisto que los madurados in vivo (Sagirkaya y cols., 2007). Asimismo, se ha comprobado que el porcentaje de ovocitos que alcanzan el estadio de Metafase II (ovocito maduro) es mayor en ovocitos madurados in vivo (98%) que in vitro (86%) (Marquant‐Le Guienne y cols., 1989). Estas variaciones sugieren que los largos periodos de cultivo producen una sobremaduración del complejo cumulus‐ovocito, lo que impide la fecundación (Semple y cols., 1993). 1.2.2. Capacitación espermática.
En mamíferos, los espermatozoides no presentan capacidad fecundante inmediatamente tras la eyaculación, siendo necesarias diversas modificaciones para que la fecundación pueda llevarse a cabo con éxito. Se incluyen aquí la reorganización de la membrana celular del espermatozoide, alteraciones en su patrón de motilidad y cambios en la actividad metabólica. El conjunto de estos cambios fisiológicos se denomina “capacitación”, promovida por la acción de los componentes del fluido del tracto reproductivo femenino, incluyendo los iones de bicarbonato y calcio (Visconti y cols., 1998).
La capacitación es un proceso lento donde se suceden diversos cambios moleculares. El espermatozoide maduro del epidídimo no posee la capacidad de fusionarse a la zona pelúcida del ovocito por lo que el proceso de capacitación implica un remodelado de la estructura y funcionalidad de su membrana plasmática (Harrison y Gadella, 2005). Hace décadas que se describen indicadores bioquímicos y biológicos implicados en la capacitación, pudiendo destacarse los
(Langlais y Roberts, 1985; Harrison y cols., 1996; Lin y Kan, 1996), aumento del calcio intracelular (Visconti y cols., 1995), activación de canales iónicos (Florman y cols., 1998) o alteraciones en el patrón de los movimientos del flagelo (Tateno y Mikamo, 1987).
Los componentes clave en los medios de fecundación‐ capacitación son, Ca2+, bicarbonato/CO2 y albúmina sérica, siendo el
bicarbonato un agente crucial en la capacitación in vitro de diversas especies (Harrison y cols., 1996). La presencia de este ión bicarbonato, en la región del epidídimo donde los espermatozoides maduros son almacenados, es considerablemente más baja que en la circulación sanguínea. Mientras que en su transcurso por el tracto genital femenino, el espermatozoide entra en contacto con una elevada concentración de bicarbonato/ CO2. Este hecho, junto con los hallazgos
presentados por Harrison y Gadella en 2005, donde describieron que niveles fisiológicos de bicarbonato inducen rápidos cambios en la arquitectura de la membrana plasmática del espermatozoide, sostiene la importancia de este ión en la capacitación seminal. Sin embargo, la secuencia de pasos implicados en la completa capacitación del espermatozoide aún está sin aclarar.
Los rápidos efectos desencadenados por el bicarbonato están mediados por la actividad de la adenil ciclasa, produciéndose así un incremento en los niveles de AMP cíclico (AMPc) y una activación de las protein‐kinasas dependientes de AMPc, que fosforilarán residuos de tirosina en distintas proteínas diana, iniciando de este modo distintas rutas de señalización (Galantino‐Homer y cols., 1997; Harrison y Miller, 2000; Harrison, 2004).
1.2.3. Fecundación in vitro.
En cultivo con el ovocito, el espermatozoide hidroliza la matriz extracelular de ácido hialurónico del cumulus mediante la enzima hialuronidasa, que está localizada en la membrana externa del gameto masculino, alcanzando así la zona pelúcida del ovocito.
La zona pelúcida constituye una importante barrera ante las fecundaciones cruzadas interespecíficas, ya que participa activamente en el reconocimiento y unión específica entre los gametos.
Espermatozoide atraviesa la Zona Pelúcida Fusión de Membranas Plasmáticas Unión de Gametos Reacción Acrosómica 1 2 3 4 5 Núcleo del Espermatozoide entra en el Citoplasma del Ovocito ZP Ovocito Vesícula del Acrosoma Contenido del Acrosoma Célula Folicular Espermatozoide atraviesa la Zona Pelúcida Fusión de Membranas Plasmáticas Unión de Gametos Reacción Acrosómica 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Núcleo del Espermatozoide entra en el Citoplasma del Ovocito ZP Ovocito Vesícula del Acrosoma Contenido del Acrosoma Célula Folicular
Figura 3. Interacción de espermatozoide y ovocito durante la fecundación, momento en el que se desencadena la reacción acrosómica en el espermatozoide. (Zona Pelúcida, ZP) Modificada de Molecular Biology of the Cell (Cuarta Edición).
La zona pelúcida está formada por diferentes glicoproteínas especie‐específicas. La nomenclatura de estas glicoproteínas se basó en el aparente peso molecular, detectado mediante SDS‐PAGE, de las proteínas de la zona pelúcida de ratón. Estas proteínas se denominaron ZP1, ZP2 y ZP3 (Figura 4) de mayor a menor peso molecular (Goudet y cols., 2008).
En líneas generales, la ZP1 es un filamento homodimérico que estabiliza las uniones heterodiméricas de ZP2 y ZP3 (Green, 1997). La
mientras que la ZP2 sería un receptor secundario que se uniría al acrosoma reaccionado y contribuiría a establecer uniones más estrechas con el espermatozoide.
De acuerdo con este modelo, la proteína ZP3 juega un papel crucial durante la fecundación, mediando la unión específica de la zona pelúcida y el espermatozoide y desencadenando la reacción acrosómica (Hinsch y cols., 2005), previa capacitación del espermatozoide. De este modo, en el espermatozoide comienza la reacción acrosómica (Kuroda y cols., 2007), caracterizada por la aparición de adherencias entre la membrana plasmática del espermatozoide y la membrana superficial del gránulo acrosómico (Kirkman‐Brown y cols., 2002; Wassarman, 2005). El gránulo acrosómico tiene como origen un acúmulo de pequeños gránulos derivados del aparato de Golgi, está situado en el polo anterior del núcleo del espermatozoide y presenta una estructura muy densa y rica en enzimas hidrolíticas. El gránulo acrosómico está incluido en la vesícula acrosómica, la cual se aplana para aplicarse sobre los dos tercios anteriores del núcleo, en este momento se denominará capuchón cefálico o acrosoma (Climent y cols., 1998).
Por su parte, también el espermatozoide reconoce, con su proteína de superficie sp56 situada en el acrosoma intacto, los oligosacáridos presentes en la proteína ZP3 del ovocito (Hinsch y cols., 2005).
Una vez que el espermatozoide atraviesa la zona pelúcida mediante una mayor motilidad y la actividad hidrolasa de las enzimas acrosomales liberadas (Jones y cols., 2007), se une a la membrana plasmática del ovocito, que finalmente englobará la totalidad del espermatozoide (Figura 3).
Ante el contacto con el espermatozoide, en el ovocito se produce la liberación de los gránulos corticales (Figura 4), mediante un mecanismo que comienza en el punto de entrada del espermatozoide e irradia hasta finalizar en el punto opuesto. Finalmente estos gránulos corticales se fusionan a la membrana del
ovocito, lo que provoca la exocitosis de su contenido. Este fenómeno cumple dos importantes cometidos en el proceso de fecundación:
• disociación de los azúcares de la ZP3, impidiendo así que nuevos espermatozoides se fijen a la zona pelúcida.
• ruptura de las uniones entre la membrana plasmática y la zona pelúcida, formando así el espacio perivitelino.
Membrana Núcleo Espermatozoide ZP2 ZP3 ZP1 Ovocito Membrana Citoplasma ZP Oligosacáridos Gránulo Cortical (enzimas hidrolíticas) Reacción Cortical (exocitosis)
Secreción del Contenido del Gránulo Cortical
Modificación de la Estructura de la ZP Membrana Núcleo Espermatozoide ZP2 ZP3 ZP1 Ovocito Membrana Citoplasma ZP Ovocito Membrana Citoplasma ZP Membrana Citoplasma ZP Membrana Citoplasma ZP Oligosacáridos Gránulo Cortical (enzimas hidrolíticas) Reacción Cortical (exocitosis)
Secreción del Contenido del Gránulo Cortical
Modificación de la Estructura de la ZP
Figura 4. Reacción cortical en el ovocito durante la fecundación. La liberación del contenido de los gránulos corticales elimina los oligosacáridos unidos a la ZP3, impidiendo el reconocimiento del ovocito por parte de otros espermatozoides. (Zona Pelúcida, ZP). Modificada de Molecular Biology of the Cell (Cuarta Edición).
De este modo, en bovino, debido a la descarga del contenido de los gránulos corticales del ovocito al espacio perivitelino, existe un eficiente mecanismo de bloqueo de la polispermia (Crozet, 1990; Hinsch y cols., 2005) (Figuras 3 y 4).
1.2.4 Cultivo in vitro.
Tras la fecundación, el desarrollo de los organismos multicelulares continúa con el proceso de división celular, consistente en una serie de divisiones mitóticas que darán lugar a nuevas células, denominadas blastómeros, que presentan un tamaño mucho menor que el ovocito, debido a la eliminación del periodo de crecimiento entre las divisiones celulares (Figura 5).
Figura 5. Cronología del desarrollo embrionario bovino in vitro. Etapa del desarrollo y periodo post-inseminación (horas, h) en el que surge cada estadio.
Aunque el genoma del zigoto no está activado en los estadios embrionarios iniciales, las primeras divisiones celulares pueden realizarse de modo apropiado. El material genético se transmite en las sucesivas mitosis, incluso en presencia de inhibidores de la transcripción (Gilbert, 2000). El ovocito bovino posee toda la dotación de ARNm y proteínas necesarias para alcanzar el cuarto o quinto ciclo celular. Sin embargo, el embrión no continuará su desarrollo más allá del estadio de 8‐16 células (Meirelles y cols., 2004) si su propio genoma no se activa correctamente y en el momento adecuado. Tal y como describen Van Soom y cols. (1992), la mayor concentración de embriones bovinos de dos, cuatro, ocho y dieciséis células surgen a las 36, 42, 60 y 102 horas post‐inseminación (hpi), respectivamente (Figura 5).
Uno de los mecanismos cruciales en el desarrollo embrionario temprano es la compactación, caracterizándose por la formación de uniones intercelulares muy estrechas. En el embrión bovino, normalmente el proceso de compactación ocurre seis días después de la fecundación, aunque no se produce en determinados sistemas de CIV, teniendo lugar a partir del estado de 32 células (mórula) (Bondioli y cols., 1990 y Van Soom y cols., 1992).
A medida que avanza el desarrollo, los blastómeros que conforman la parte externa de la mórula compactada muestran cierta expansión debido a la acción de la bomba de Na+/K+, que transporta
iones a través de las membranas celulares. La entrada de agua y Na+
permite que se forme una cavidad en el seno del embrión, el blastocele. Este proceso, denominado blastulación, culmina con la formación del blastocisto (Figura 5). El embrión en estadio de blastocisto está formado por dos poblaciones celulares que, por medio de técnicas de coloración diferencial, pueden ser cuantificadas. En la Figura 6 se muestra la localización de ambas poblaciones, trofectodermo y masa celular interna (MCI):
• Trofectodermo o trofoblasto: tejido diferenciado que se origina a partir de las células más externas de la mórula y del que surgirán la placenta y el corion.
• MCI: tejido indiferenciado que dará lugar a células pertenecientes a las tres hojas embrionarias (ectodermo, endodermo y mesodermo).
Figura 6. Blastocisto bovino de día 8 producido in vitro. En la imagen se aprecia la rotura de la zona pelúcida, inicio de la eclosión del blastocisto.
El uso de cocultivos de células del tracto reproductivo (células oviductales y del epitelio uterino) permitió, al inicio del desarrollo de la tecnología in vitro, superar el bloqueo del desarrollo embrionario en la fase de 8‐16 células, coincidente con el momento del inicio de la transcripción del genoma embrionario. Los medios utilizados en los cocultivos de embriones con células somáticas se caracterizan por tener una composición compleja que incluye vitaminas, aminoácidos, sales y nucleótidos, entre otros componentes, reflejo de los requerimientos de las células para las que fueron formulados (Bavister, 1995). Las interacciones que se establecen entre el medio de cultivo y las células somáticas enmascaran las características bioquímicas del medio y, por tanto, la identidad de los componentes con acción embriotrófica. El uso de cultivos de células somáticas, cuando se pretende identificar tales factores, está desaconsejado (Bavister, 1992).
Con el fin de tratar de reproducir las condiciones fisiológicas que rodean al embrión en sus primeras divisiones celulares, se ha investigado mucho sobre la función y formación del fluido oviductal en los mamíferos. De esta forma, en 1988, Hunter describió al oviducto como el ambiente fisiológico necesario para el transporte y capacitación del semen y para la fecundación del ovocito bovino. Más tarde, diversos autores han contribuido al conocimiento de las fluctuaciones y composición del fluido oviductal bovino en función del momento del ciclo estral. Así, la identificación de los productos secretados por el oviducto ha permitido elaborar medios sintéticos que permiten producir embriones bovinos in vitro. Uno de los sistemas de PIV más extendidos es el desarrollado por Holm y cols. (1999) mediante el que se obtiene una elevada tasa de desarrollo de embriones hasta estadio de blastocisto. Estos autores modificaron el Fluido Oviductal Sintético (modified‐Synthetic Oviduct Fluid; mSOF) añadiendo citrato sódico y mio‐inositol.
Aunque se ha conseguido obtener embriones bovinos tras cultivo en medios completamente definidos (Bavister y cols., 1992; Eckert y Niemann, 1995; Graham y cols., 1995; Keskintepe y cols., 1995; Holm y cols., 1999), con frecuencia los sistemas de cultivo incorporan suplementos proteicos como el suero, normalmente FCS o suero de vaca en estro, o derivados del suero como la albúmina sérica bovina (bovine serum albumin, BSA). La utilización de este tipo de suplementos, cuya composición exacta se desconoce, confiere a los medios unas características indefinidas.
1.3. Embriones bovinos producidos in vitro e in vivo.
Los sistemas de producción in vitro dan lugar a embriones con características morfológicas y metabólicas diferentes a los que se obtienen in vivo. Los embriones FIV tienen en fase de una célula un espacio perivitelino bien apreciable morfológicamente; en el estadio de 8 células, los blastómeros son de forma y tamaño regulares; la compactación de la mórula ocurre de forma sincrónica y las células de la MCI de los blastocistos están bien definidas. Por el contrario, los zigotos producidos in vitro presentan un espacio perivitelino limitado y los blastómeros en fase de 8 células son poco regulares. La compactación de la mórula es poco perceptible en los embriones producidos in vitro (EPIV) y las células de los blastocistos se muestran oscuras y difuminadas (Holm y Callesen, 1998). Otra característica de los EPIV es que su zona pelúcida, aunque de mayor resistencia a la eclosión, resiste menos tiempo la digestión por la enzima pronasa, que la de los embriones obtenidos in vivo (Leibo y Loskutoff, 1993).
Por otra parte, los EPIV presentan uniones intercelulares incompletas entre la MCI y el trofectodermo, hecho que parece deberse a las características propias del proceso in vitro (Wrenzycki y cols., 1996). Según Rizos y cols. (2003) los EPIV muestran menos microvellosidades, más gotas lipídicas intracitoplasmásticas y más fragmentos celulares localizados en el espacio perivitelino y en las cavidades intracelulares. Estas características pueden explicar, en parte, las diferencias observadas en términos de resistencia a la congelación de los EPIV frente a los embriones obtenidos in vivo.
Aunque los EPIV pueden presentar un número de células totales comparable a los producidos in vivo, la cantidad de células de la MCI es significativamente inferior en el caso de los EPIV (Van Soom y cols., 1997), presentando además mayores índices de muerte celular programada o apoptosis (Lonergan y cols., 2003a; Hansen y Block, 2004; Pomar y cols., 2005; Knijn y cols., 2003). El porcentaje de células de la MCI, también indicador de calidad embrionaria, es menor en el caso de los EPIV (Iwasaki y cols., 1990). Estas diferencias se traducen
en una menor viabilidad de los EPIV frente a los embriones producidos in vivo.
Para establecer la gestación se estima necesario que exista un número mínimo de células de la MCI, mientras que el exceso de células en el trofectodermo puede conducir a anomalías de la gestación asociadas con la transferencia de embriones bovinos cultivados in vitro (Van Soom y cols., 1997). Ciertamente, los embriones cultivados in vitro originan placentas con mayor masa y área caruncular reducida (Farin y cols., 2001), incremento de la duración de la gestación, mortalidad perinatal, mayor frecuencia de fetos machos, edema fetal, alteración del desarrollo de órganos como corazón, cerebro y médula espinal (Farin y cols., 2006), además de hidroalantoides e hidroamnios (Van Langtendonckt y cols., 1997; Farin y cols., 2006) con fallos en el desarrollo de las membranas corioalantoideas y vasos sanguíneos (Farin y cols., 2006). En ocasiones, la unidad feto‐placental es capaz de compensar y adaptarse a alguna de las alteraciones mencionadas, si son de poca gravedad, dando lugar al nacimiento de terneros en los que se apreciará incremento del peso y algunas alteraciones metabólicas menores. Por el contrario, en otros casos más severos ni el feto ni la placenta pueden hacer frente a alteraciones graves, dando lugar al nacimiento de animales enfermos y con modificaciones de los parámetros hematológicos y bioquímicos. Estos animales necesitan atención clínica continuada y en ocasiones mueren durante el periodo perinatal (Farin y cols., 2006).
Con respecto a la expresión génica, existen diferencias entre los EPIV bovinos en estadio preimplantacional y sus homólogos producidos in vivo. Estas diferencias se deben tanto a cambios en los genes sometidos a imprinting genómico (silenciados), como a los niveles de ARNm de aquellos genes que se expresan tanto en unos como en otros embriones (Young y cols., 2001; Bertolini y cols., 2002; Rizos y cols., 2003). De igual modo, existen cambios en los niveles de expresión entre EPIV en función de la clase de albúmina con la que haya sido suplementado el medio de cultivo (Wrenzycki y cols., 2001).
Los EPIV tienen una elevada incidencia de aberraciones cromosómicas produciendo embriones no viables si todas sus células
son poliploides (Viuff y cols., 2000). La alteración más común es, sin embargo, la mixoploidía (Viuff y cols., 1999), caracterizada por núcleos normales coexistiendo con núcleos poliploides y haploides. Los EPIV pueden tolerar una elevada incidencia de células aneuploides y continuar el desarrollo (Hyttel y cols., 2000), pero estas alteraciones indican una menor viabilidad que la de los embriones producidos in vivo.
Las diferencias en el número de células de los EPIV (Fischer‐ Brown y cols., 2002), o en la expresión génica (Lim y cols., 2007), el metabolismo y el desarrollo (Krisher y cols., 1999) parecen estar claramente relacionadas con el medio de cultivo utilizado (Crosier y cols., 2001).
La utilización de ovocitos con alteraciones funcionales (difícilmente distinguibles en los ovocitos inmaduros y rodeados de las células del cumulus), explicaría las diferencias de porcentajes de desarrollo embrionario entre ovocitos de diferentes orígenes (Snijders y cols., 2000). No obstante, las condiciones de cultivo subóptimas también producen estas alteraciones. De ahí la necesidad de sistemas de CIV adecuados a las necesidades del embrión, tal como se demuestra por los mayores índices de desarrollo (Enright y cols., 2000) y la mejora de la supervivencia a la congelación (Lonergan y cols., 2003b) experimentadas por los EPIV cuando se cultivan en oviducto.
2. RETINOIDES EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO
2.1. Absorción, almacenamiento y metabolismo de la vitamina A.
Los retinoides juegan un papel importante en la fisiología de los vertebrados, estando implicados en la visión, el desarrollo embrionario, el crecimiento, y también en la diferenciación celular.
Figura 7a. β-caroteno
Figura 7b. Éster de Retinol
Figura 7. Moléculas precursoras de retinol, procedentes de alimentos de origen vegetal (β-caroteno) o animal (éster de retinol). Modificado de Ikeda y cols., 2005.
Como fuentes dietéticas de retinoides podemos encontrar, entre los alimentos de origen vegetal los carotenos, que producen dos moléculas de retinol (ROH) por escisión central de una molécula de β‐ caroteno (Figura 7a; Duszka y cols., 1996). Por otra parte, entre los alimentos de origen animal están los ésteres de retinol (Figura 7b).
El ROH, o vitamina A, es un precursor metabólico del ácido retinoico (AR) en las células animales. En el ganado vacuno, los ésteres
de retinol (Figura 7) son hidrolizados en el lumen intestinal para producir ROH.
Tanto el ROH como el β‐caroteno son absorbidos por las células de la mucosa intestinal donde el β‐caroteno sufre una digestión enzimática que dará lugar al retinal (RAL; Figura 8a), molécula que será posteriormente reducida a ROH (Figura 8b).
Figura 8a. Retinal (RAL)
Figura 8b. Retinol (ROH)
Figura 8. Moléculas precursoras de ácido retinoico (AR). RAL procede de la digestión enzimática de β-caroteno. ROH es absorbido por la mucosa para su metabolización. Modificado de Ikeda y cols., 2005.
En el interior de las células intestinales, el ROH forma de nuevo ésteres que se agrupan en partículas llamadas quilomicrones. Estos agregados son transportados por el sistema linfático y, una vez en la sangre, se degradan produciendo remanentes de quilomicrón que son procesados en el hígado, donde los ésteres de ROH resultantes permanecen almacenados. En el hígado, la hidrólisis de los ésteres produce el ROH, molécula que se unirá a las proteínas de unión de retinol (retinol binding proteins, RBP) (Noy, 2000). Dichas RPBs, una vez liberadas a la sangre, se combinarán con transtirretina (TTR) formando un complejo ternario encargado de transportar el ROH hasta los
tejidos diana. El ROH entra en la mayoría de los tejidos libre de RBPs, y en el interior de las células se une a las proteínas celulares de unión al retinol (cellular retinol binding proteins, CRBP) (Noy, 2000), que modularán la acumulación intracelular del ROH. El ROH se transforma in vivo en ácido retinoico (AR) por medio de dos reacciones de deshidrogenación; en la primera de estas reacciones el ROH, por medio de la enzima retinol deshidrogenasa, pasa a all‐trans retinaldehído, que a su vez, se transformará en all‐trans AR (ATRA) por la acción de la retinaldehído deshidrogenasa, enzima que cataliza el último paso de la síntesis de ATRA.
Figura 9a. All-trans-ácido retinoico (ATRA).
Figura 9b. 9-cis-ácido retinoico (9-cis-AR)
Figura 9. Principales compuestos biológicamente activos en el metabolismo de los retinoides. Modificado de Ikeda y cols., 2005.
La conversión de ATRA a 9‐cis retinoico (9‐cis‐AR) y otros isómeros es reversible, produciendo compuestos biológicamente activos que, finalmente, penetran en el núcleo y se unen a receptores específicos del AR (Ikeda y cols., 2005). El isómero ATRA es el más importante metabolito derivado del ROH en la embriogénesis de los vertebrados (Morriss‐Kay y Ward, 1999; Ross y cols., 2000).
Los niveles intracelulares de AR están regulados localmente por la retinaldehído deshidrogenasa y el citocromo P450, encargado de degradar el AR. El acceso del AR al núcleo está controlado por las proteínas celulares de unión a AR (CRABP; cellular retinoic acid‐binding
proteins), las cuales modulan las concentraciones de AR en el citoplasma.
Los receptores retinoides pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares “Esteroide‐Tiroide‐Retinoide”. Existen dos tipos de receptores para el AR, los receptores de ácido retinoico (RAR) que son activados por ATRA y por 9‐cis AR, y los receptores X de retinoico (RXR) activados sólo por 9‐cis AR (Chambon, 1996).
Cada uno de estos receptores nucleares comprende tres subtipos α, β y γ. Estos tipos de receptores, junto con otros miembros de la superfamilia de receptores a la que pertenecen, pueden formar heterodímeros en respuesta a la activación por ligando.
Figura 10. Mecanismo de acción intracelular en retinoides. EL retinol (ROH) procedente de la sangre una vez alcanza el citoplasma, se une a la proteína celular de unión a retinol (CRBP). El ROH, tras dos reacciones consecutivas catalizadas por las enzimas retinol deshidrogenada (RoDH) y retinaldehído deshidrogenasa (RALDHs), es metabolizado a ácido retinoico (RA). El RA penetra en el núcleo y puede unirse a los receptores de retinoico RAR y RXR, cuya capacidad de reconocimiento y unión a determinadas secuencias (RARE) en el ADN puede activar la transcripción de un gen diana. Modificado de Maden, 2002.
Algunos de los componentes de la ruta intracelular de los retinoides se han detectado tanto en el ovocito como en el embrión
bovino (Mohan y cols., 2001, 2002), es el caso de los RAR α y γ, RXR α y β, retinaldehído deshidrogenasa (RALDH) y el heterodímero RXR‐ receptor γ del proliferador activado del peroxisoma (PPAR γ; peroxisome‐proliferator activated receptor gamma).
La expresión de RXR α, β y γ no se mantiene estable a lo largo del desarrollo preimplantacional, siendo en el ovocito y los estadios embrionarios previos a la activación del genoma materno donde se ha detectado una mayor tasa de expresión. En el embrión bovino PIV, a partir del estadio de 8 células y hasta la fase de blastocisto, la expresión de RXR α y β decrece drásticamente, mientras que el descenso en la expresión de RXR γ es más irregular (Mamo y cols., 2005). La expresión de RAR α y β se ha detectado en blastocistos bovinos, mientras que RAR α está presente en las células del cumulus
(Mohan y cols., 2001, 2002 y 2003).
2.2. Retinoides y la producción de embriones bovinos in vitro.
La extrema sensibilidad del desarrollo embrionario a la vitamina A es clara: tanto la hipervitaminosis como la hipovitaminosis pueden acarrear malformaciones embrionarias o abortos. La mayoría de los estudios realizados en torno a los efectos de los retinoides en el embrión se han centrado en estadios avanzados del desarrollo, debido al amplio espectro de malformaciones presentes en la progenie de humanos (Guillonneau y Jacqz‐Aigrain, 1997), roedores (Shenefelt, 1972; Kessel y Gruss, 1991), gallinas (Thaller y Eichele, 1987) y Xenopus (Durston y cols., 1989; Sive y cols., 1990). Estas malformaciones incluyen, desde defectos en el tubo neural y el sistema nervioso central hasta alteraciones craneofaciales, óseas, de diversos órganos internos y de las extremidades. Sin embargo, los retinoides son necesarios para un desarrollo normal, siendo su concentración y momento de actuación cruciales para evitar un efecto negativo sobre el desarrollo (Sporn y Roberts, 1991).
Los retinoides endógenos de las células embrionarias pueden proceder tanto del entorno de cultivo del embrión como del ovocito originario. Mientras que ATRA ha sido detectado en embriones de mamíferos, no se han encontrado rastros de su isómero 9‐cis‐AR, salvo en casos de administración de dosis de ATRA superiores a las fisiológicas. Ciertamente, también la isomerización de ATRA a 9‐cis‐ AR se ha descrito en medios de cultivo (Klaasen y cols., 1999). De este modo ATRA se muestra como único ligando claramente necesario en el metabolismo de los retinoides a través de receptor (Mic y cols, 2003).
La alteración en la homeostasis de retinoides tanto por exceso como por defecto de ATRA ha sido asociada con anormalidades en el desarrollo. La inhibición de la producción de AR por medio de la producción de dobles mutantes de ALDH (Niederreither y cols., 1999) o su inhibición por medio de citral, antagonista competitivo de ALDH (Griffith y Zile, 2000; Iwata y cols., 2003; Song y cols., 2004) da lugar a defectos graves en el desarrollo o muerte fetal. Los efectos de estos
