Eficiencia de la desinfección con aceites esenciales y ultrasonido sobre Escherichia coli inoculada en frutos de tomate y el impacto sobre la actividad antioxidante

www.elsevier.es/ram

R

E

V

I

S

T

A

A

R

G

E

N

T

I

N

A

D

E

MICROBIOLOGÍA

INFORME

BREVE

Eficiencia

de

la

desinfección

con

aceites

esenciales

y

ultrasonido

sobre

Escherichia

coli

inoculada

en

frutos

de

tomate

y

el

impacto

sobre

la

actividad

antioxidante

María

L.

Luna

Guevara

,

Juan

J.

Luna

Guevara,

Héctor

Ruiz

Espinosa,

Lucero

Leyva

Abascal

y

Carolina

B.

Díaz

González

ColegiodeIngenieríaenAlimentos,FacultaddeIngenieríaQuímica,BeneméritaUniversidadAutónomadePuebla,Puebla,México Recibidoel8deagostode2014;aceptadoel7deabrilde2015

DisponibleenInternetel29deagostode2015

PALABRASCLAVE Aceitesesenciales; Actividad antioxidante; Ultrasonido; Tomate; Escherichiacoli; Desinfecciónasistida

Resumen Lacrecientedemandadefrutosfrescospuedeconstituirunriesgoparalasaludde losconsumidores,teniendoencuentalagranvariedaddemicroorganismosqueestossuelen albergar.Elobjetivodelpresenteestudiofueevaluarlaeficaciadevariosprocedimientosde desinfecciónsobreEscherichiacolienterotoxigénica(enterotoxigenicE.coli[ETEC])inoculada entomateylaconservacióndelaspropiedadesantioxidantesdelosfrutosdesinfectados.Los frutosfueronsumergidosdurante5o10minendispersionesdeaceitesesencialesdeoréganoo tomillo(5o10ppm),combinadosonoconlaaplicacióndeultrasonido.Laactividadantioxidante sedeterminóporlaneutralizacióndelradical2,2-difenil-1-pricrilhidrazil(DPPH)ysereportó como porcentajedeinhibición(%I).Lostratamientosdedesinfecciónmáseficacesparauna significativareducciónlog10UFG/g(S)deETECfueroncon10ppmdeaceitedeoréganodurante

10min,conreduccionesS=3,05entratamientosindividualesyS=4,03enmixtos.Los%Imás altosselograroncontratamientosindividualesconsonicación(69,52y72,48)yentratamientos combinadosconaceitedetomillo5ppmyultrasonidodurante5y10min,convaloresde51,27 y53,31%,respectivamente.

©2015AsociaciónArgentinadeMicrobiología.PublicadoporElsevier España,S.L.U.Estees unartículoOpenAccessbajolalicenciaCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/ by-nc-nd/4.0/). KEYWORDS Essentialoils; Antioxidantactivity; Ultrasound; Tomato;

Efficacyofdisinfectiontreatmentsusingessentialoilsandultrasoundontomato fruitsinoculatedwithEscherichiacoliandimpactonantioxidantactivity

Abstract Freshproduceoftenharborsagreatnumberofmicroorganisms;hence,itsgrowing demandmayconstituteariskforconsumers.Theaimofthisstudywastoevaluatetheefficacy ofseveraldisinfectionproceduresagainst enterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)inoculated

∗_{Autorparacorrespondencia.}

Correoelectrónico:lunaguevara@yahoo.com.mx(M.L.LunaGuevara). http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2015.04.004

0325-7541/©2015AsociaciónArgentinadeMicrobiología.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.U.EsteesunartículoOpenAccessbajola licenciaCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Escherichiacoli; Assisteddisinfection

ontomatofruitsandtheconservationoftheantioxidantpropertiesofthesedisinfectedfruits. Fruitswereimmersedfor5or10mininoreganoorthymeessentialoildispersions(5,10ppm), withorwithoutultrasoundtreatment.Antioxidantactivityofdisinfectedfruitswasdetermined astheabilitytoscavenge2,2-diphenyl-1-pricrylhydrazyl(DPPH)radicalsandwasreportedas percentageofinhibition(%I).Themostefficientdisinfectanttreatmentsshowingsignificant differences(p_≤.05)betweenthereductionslog10CFU/g(S)ofETECwerethoseusing10ppm

oregano for 10min,withS=3.05inindividualtreatments andS=4.03inmixedtreatments. Thehighest%Iwasobtainedwithindividualsonicationtreatments(69.52and72.48),whilein combinedtreatmentsthe%Ivaluesincreasedwiththymeoil5ppmandultrasoundfor5min (51.27%)and10min(53.31%).

© 2015Asociación Argentina de Microbiología. Publishedby Elsevier España, S.L.U.This is anopenaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/ by-nc-nd/4.0/).

Eltomate(SolanumlycopersicumL.)esunodelos culti-vosdemayorimportanciaanivelmundialdebidoasugran consumo, comercialización e industrialización. Asimismo, este fruto se reconoce por sus propiedades antioxidantes y es la principal fuente de licopeno, de vitaminas A y C y de flavonoides; varios de estos compuestos están aso-ciadoscon laprevención deserias enfermedadescomo el cáncerylasafeccionescardiovasculares4_{.Sinembargo,el} consumode tomatetambiénseha relacionado con múlti-plesbrotesdeenfermedadesgastrointestinalescausadaspor patógenoscomoListeriamonocytogenes,Escherichiacoliy

Salmonella1_.

Conlafinalidadderemovery/oinactivaralos microorga-nismospresentesenestefruto,serequierentratamientosde lavadoydesinfecciónefectivosquecontribuyanamejorar lainocuidaddelosproductos.Reportesrecienteshan inves-tigadolaactividadantibacterianayantioxidantedeaceites esencialesprovenientesdelorégano(Origanumvulgare) y deltomillo(Thymusvulgaris)3,6_{.Asimismo,existenestudios} sobreelusodelultrasonidocomounmétodode desconta-minaciónde productos frescos.Este resultapocoefectivo contralaeliminacióndemicroorganismospatógenosy,por tanto,requiereaplicarseenconjuntoconotrostratamientos dedesinfección12_{.Deacuerdoconlosantecedentes} mencio-nados,enelpresente estudioseevaluaron losefectosde diferentestratamientosdedesinfeccióndetomateen tér-minosdeefectividadantimicrobiana yel impactosobrela actividadantioxidantedelosfrutosdesinfectados.

Untotalde110tomatesRomaVFgradodemadurez fisio-lógica provenientes de un invernadero con fertirrigación, ubicadoenlaSierraNortedePuebla,México,fueron colo-cadosenbolsasdeplásticoestérilesytransportadosparasu análisis.

Losfrutosenterosfuerondesinfectadosenhipocloritode sodioal5%por5min,enjuagadosconaguaestéril,secados durante5min e inoculadoscon ETEC aisladapreviamente ensuelosdeinvernaderosyfrutosdetomate.La identifica-cióndeestacepaserealizómediantepruebasbioquímicas IMViC,conlaadicióndepruebasdelsistemaautomatizado VITEK® _{(bioMérieux,México), yla confirmaciónseefectuó}

mediantelareacciónencadenadelapolimerasa(PCR)con laamplificacióndelgenIngA7_.

Paralapreparacióndelinóculobacterianoseaseguróuna poblaciónmayorde107_{UFC/mlconel ajusteauna}

densi-dad óptica(OD) de 1,1 a 620nm. Esto fue verificado por

recuento en placa en medio agar eosina y azul de meti-leno(EMB,BDBioxon,México),trasunaincubacióna37◦C durante 24h. La identidad delas coloniasfue confirmada conpruebasbioquímicasclásicasIMViC.

La inoculación de los frutos se realizó por inmersión en caldo de soja tripticaseína (TSB, BD Bioxon, México) mediante agitación constante por 5min, luego de lo cual losfrutosfueronretirados delasoluciónyalmacenadosa 37◦Cdurante90min;elmencionadoprocedimientopermitió garantizarunapoblaciónmicrobianainicialde1×107_UFC/g

defrutofresco.

Los frutos inoculados fueron sometidos a tratamientos de desinfección individuales (TxI) y mixtos (TxM) en dis-persionesde aceitesesencialesde oréganoytomillo, con ultrasonido o sin este, con tiempos de contacto de 5 y 10min.

Los aceitesfueron extraídosa partirde 100gde hojas secasdecadaespecieen1ldeaguabidestilada,yseempleó el método de hidrodestilación Clevenger con destilación durante2h10_{.Los aceitesfueron dispersados enunbuffer} salinodefosfato,demododealcanzarconcentracionesde 5y10ppmenlassolucionesdesinfectantes.

Los tratamientos de desinfección TxI consistieron en introducirlosfrutosinoculadosenbolsasdeplástico esté-riles con agua destilada o con dispersiones de aceites de orégano y tomillo a las concentraciones y los tiempos de contacto previamente definidos.Para lostratamientos TxM,lostomatesembolsadossecolocaronenunba˜no ultra-sónico Elmasonic S30H (Elma, Singen, Alemania) con una cubade2,75ldecapacidadmáxima,queseoperóauna fre-cuenciade40kHz,unapotenciade80Wyunatemperatura de40◦Cduranteeltiempoestablecido.

Losrecuentosmicrobianosdelosfrutosdesinfectadosse realizaronmediantedilucionesdecimalesdesde10−2_hasta

10−7_{;deestassesembraron100␮lporextensiónen}

super-ficie en placas EMB, que luego fueron incubadas a 37◦C durante24h.Apartirdelosrecuentosmicrobianosse calcu-laronlosfactoresdereducciónlogarítmicaS,sobrelabase delosvaloreslog10UFC/gantesydespuésdelaaplicaciónde

cada tratamiento dedesinfección. Serealizaroncontroles defrutossininocularquefueronsometidosalos tratamien-tos TxI y TxM de desinfección; en todas las muestras se confirmólaausenciadeE.coli.

La evaluación de la actividad antioxidante de los fru-tos sometidos a distintos tratamientos de desinfección se

Tabla1 ReducciónSenrecuentosdeEscherichiacoliETECinoculadaenfrutosdetomatesometidosadistintostratamientos dedesinfección

S(reducciónlog10UFC/g)a

Tratamiento Concentración(ppm) tc=5min tc=10min

Sonicación − 0,85±0,07e,H 0,84±0,04f,H

AEorégano 5 1,57±0,025d,FG 2,65±0,17c,BCD

AEoréganoAEorégano+sonicación 10 2,53_±0,10b,CD 3,05_±0,03b,B

5 2,58±0,12b,CD 3,82±0,18a,A

AEorégano+sonicaciónEtomillo 10 3,04_±0,083a,B 4,03_±0,11a,A

5 0,01±0,035f,I 1,23±0,03e,GH

AEtomilloEtomillo+sonicación 10 1,57_±0,31d,FG 2,26_±0,04d,DE

5 0,97±0,16e,H 1,94±0,22d,EF

AEtomillo+sonicación 10 2,10±0,01c,E 2,89±0,01bc,BC

AE:aceiteesencial;tc:tiempodecontacto.

Lasletrasminúsculasdistintasindicandiferenciassignificativas(p_≤0,05)entrelospromediosdelostratamientosparaunmismotiempo decontacto.Lasletrasmayúsculasdistintasindicandiferenciassignificativas(p_≤0,05)entrelospromediosdetodoslostratamientos.

a _{Valorespromedios(n=3)±unadesviaciónestándar.}

desarrollómedianteelprocedimientodeneutralizacióndel radical2,2-difenil-1-pricrilhidrazil(DPPH,Sigma, EE.UU.).

Seutilizaronextractosmetanólicosqueconsistieronen6g de pericarpio y pulpa en 30ml de una solución de meta-nol:agua (80:20% v/v) agitados a 125rpm durante 12h a 40◦C.Semezclaron500␮ldelosextractoscon 2ml dela soluciónDPPH(0,1mM),ytras30mindeincubaciónseleyó laabsorbanciaa517nm,empleandometanolcomoblanco. Conlosdatosobtenidossecalcularonlosporcentajede inhi-bicióndelradicalDPPH(%I)mediantelasiguienteexpresión:

%I=(Acontrol−Amuestra/Acontrol)×100

donde Acontrol correspondea la absorbanciade la solución

DPPHyAmuestraeslaabsorbanciadelosextractos

metanóli-cos.Losfrutoscontrolfuerontomatessininocularysinser sometidosatratamientosdedesinfección.

Todoslosexperimentosfueron realizadosportriplicado considerando un dise˜no completamente aleatorizado. Los resultados de S y %I fueron evaluados mediante un aná-lisisde varianza(ANOVA) dedoblevía. Las medias de los tratamientosfueroncomparadasmedianteelempleodela prueba de Tukey (␣=0,05). Los análisis fueron realizados conelsoftwareestadísticoStatisticalAnalysisSystem,GLM, versión6.12.

Se obtuvierondiferenciassignificativas (p≤0,05)entre losvaloresdeSconlostratamientosaplicados,yseobservó unincrementoenelefectoinhibitoriosobreel microorga-nismoinoculadoamayortiempodecontacto(t=10min)con ambasconcentraciones,5y10ppm(tabla1).

Los TxI con el aceiteesencial de orégano presentaron valores de S mayores que los del tomillo, con reduccio-nes cercanas a 3log10 UFC/g con 10ppm y 10min. Esta

observaciónsepodría relacionarconlapresenciade com-puestosantimicrobianos como timol, carvacrol,␣-pineno,

␥-terpinenoyp-cimeno,yareportadosporOyedemietal.8_, oa laacciónejercidaporlahidrofobicidad delosaceites deorégano,quepropicianlalisiscelularalalterarla dispo-sicióndeloslípidosdelamembrana,conefectossobresu permeabilidad.

Con referencia a los TxI con tomillo, los valores de S observados, entre 1,57 y 2,26 log10 UFC/g con 10ppm

(tabla1),fueronsimilaresalosobtenidosporSinghetal.13_, quienesaplicarontratamientosdedesinfección con 5ppm durante 10min en germinados de alfalfa inoculados con

E.coli.LasinvestigacionesdeSartorattoetal.10_yBurt2 aso-cianlosefectosantimicrobianosdeltomilloconcontenidos detimol,␥-terpinenoyp-cimeno.

El tratamiento individual con ultrasonido como única accióndesinfectanteresultópocoefectivoycon reduccio-nes(S)similaresparalos2tiemposdecontactoempleados (tabla 1); los valores S obtenidos fueron comparables a los encontrados por Seymour et al.12 _{con condiciones de} 26KHzyaguadestilada(39◦C)paraladesinfecciónde pere-jil.DeacuerdoconlocomunicadoporScherbaetal.11_,el efectoinhibitoriodelasonicaciónsobreE.coliserelaciona conel incrementoenlaintensidadyesindependientede la duración de lostratamientos. La pérdida de viabilidad microbianasedebeaefectos mecánicos,primordialmente porcavitación,yestefenómenoproduceunincrementoen la temperatura y en la presión, que da˜nan la pared y la membranacelularbacteriana3_.

Los TxMexhibieronenciertascondiciones de desinfec-ción efectos sinérgicos, y en otras, aditivos (tabla 1). El efectosinérgicosemanifestóconlosaceitesdeoréganoa 10ppmdurante10min,mientrasqueeladitivosepresentó coneste mismoaceitea5ppmdurante10min.Laeficacia delostratamientosmencionadossoncomparables con los resultadosdeKimetal.5_{,quienesreportaronvalores} simi-laresconunasolucióncloradaa2mMenlechugainoculada conE.coli0157:H7.

Seha demostrado que el uso delultrasonido en forma conjunta con agentes desinfectantes o antimicrobianos incrementalaletalidadmicrobiana.Yu etal.15 comunica-ronunincrementoenlaactividadbactericidadeantibióticos conlaaplicacióndeultrasonidodebajaintensidad(70KHz), yatribuyenelefectoalfenómenodesonoporación,elcual afectalapermeabilidaddelamembranacelularyfacilitael flujodeantimicrobianoshaciaelinteriordelacélula.

Para los TxM con aceite de tomillo y sonicación, las reduccionesmássignificativasseobtuvieroncon10ppmde

Tiempo de contacto (min) (% ) Inhibición 0 20 40 60 80 Sonicación AE Oreg 5 ppm AE Oreg 10 ppm AE Tom 5 ppm AE Tom 10 ppm a A c D b BC b BC_{b C} a A b BC b B b BC bBC

Figura1 Actividadantioxidanteexpresadacomo %de inhi-bición del radical DPPH en frutos de tomate sometidos a tratamientosindividualesdedesinfección.

Las columnas representan valores promedios. Las barras verticales muestran±una desviación estándar (n=3). Letras minúsculasdistintasindicandiferenciassignificativas(p≤0,05) entrelospromediosdelostratamientosparaunmismotiempo decontacto. Lasletras mayúsculas distintas indican diferen-ciassignificativas(p_≤0,05) entrelospromedios detodos los tratamientos.

concentracióndeaceiteaplicadodurante5y10min(tabla 1).Elvalormáximo(S=2,89)obtenidoparaestetratamiento fuecomparableconeltratamientoindividualdeaceitede orégano a 5 y 10ppm durante 10min de contacto. Estos resultadosfueronsimilaresaloscomunicadosporRuiz-Cruz

etal.9_{,quienesaplicaronácidoperacéticoen} concentracio-nesde80ppmparaalcanzarvaloresdeSde2y3conE.coli

ySalmonella,respectivamente.

Porotraparte,eltratamientocombinadocon5ppmde tomillosolomanifestóreduccioneslogarítmicas significati-vasconunmayortiempodecontacto(tabla1).

Lamayoractividad antioxidanteseverificócon la apli-cación de sonicación, que fue significativamente mayor (p≤0,05) respecto de los frutos sometidos a los TxI con aceites (fig. 1). Estos resultados son congruentes con lo reportado por Vilkhu et al.14_{, quienes mencionan que la} aplicacióndel ultrasonido favorece la extracción yla dis-ponibilidaddeloscompuestosantioxidantesenvegetales. Los %I de los aceites esenciales presentaron diferencias significativasentresí,yengeneral,lamejoractividad anti-oxidanteseobservóconelaumentodeltiempodecontacto. Entrelosfrutostratadosconaceites,aquellosexpuestosa 10ppmdeaceiteesencial deoréganomostraron lamayor actividadantioxidante(fig.1).Sinembargo,los%I obteni-dos con losTxI con orégano y tomillofueron menores en comparaciónconlaaplicacióndesonicación,conlocualse podríainferirquesibienexistenvariosreportesque men-cionanlaspropiedadesantioxidantesdeestasespecias,los tratamientos con los aceites evaluados per se no permi-tieronincrementar la actividad antioxidantedelos frutos desinfectados.

Sehallarondiferenciassignificativas(p≤0,05)al compa-rarlos%IdelosfrutosexpuestosaTxMenrelaciónconla concentracióndeaceiteesencialempleada;lamayor acti-vidad antioxidanteseverificóen frutosdesinfectadoscon

Concentración (ppm) (% ) Inhibición 0 20 40 60

80 AE Oreg + Son 5 min AE Oreg + Son 10 min AE Tom + Son 5 min AE Tom + Son 10 min

5 10 b CDE ab ABC a AB_{a A} bc DE a AB c E ab BCD

Figura2 Actividadantioxidanteexpresadacomo%de inhi-bición del radical DPPH en frutos de tomate sometidos a tratamientosmixtosdedesinfección.

Las columnas representan valores promedios. Las barras verticales muestran±una desviación estándar (n=3). Letras minúsculasdistintasindicandiferenciassignificativas(p≤0,05) entrelospromediosdelostratamientosparaunamisma con-centración.Lasletrasmayúsculasdistintasindicandiferencias significativas(p_≤0,05)entrelospromediosdetodoslos trata-mientos.

tomillo 5ppm (fig. 2).Estos valores fueron 21% (5min) y 8,8%(10min)másaltosencomparaciónconlosfrutos some-tidos a desinfección asistida con orégano, en las mismas condiciones(fig.2).

Losresultadosobtenidosenestainvestigaciónpermiten concluir que losTxI y TxMcon aceites esenciales de oré-gano exhibieron la mayor actividad antimicrobiana sobre

E.coliETEC,quesemanifestócon valoresdereducciones logarítmicasentre3y4.Enrelaciónconlaactividad anti-oxidante, el tratamiento individual con sonicación fue el máseficaz;sinembargo,exhibióunefectoantimicrobiano mínimo(S<1).Los%Imásaltoscondesinfecciones combi-nadasselograronconaceitedetomillo5ppmyultrasonido durante5min(51,27%)y10min(53,31%).

Losresultadosdeeste trabajoalientan elinterésenla búsqueda denuevas alternativasparael tratamiento pos-cosecha detomate que consideren deformaconjunta las propiedadesantimicrobianasyantioxidantesde tratamien-tosconaceitesesencialesdeciertosvegetales,asistidoscon sonicación.

Responsabilidades

éticas

Proteccióndepersonasyanimales.Los autoresdeclaran queparaestainvestigaciónnosehanrealizado experimen-tosensereshumanosnienanimales.

Confidencialidaddelosdatos.Losautoresdeclaranqueen esteartículonoaparecendatosdepacientes.

Derechoalaprivacidadyconsentimientoinformado.Los autoresdeclaranqueenesteartículonoaparecendatosde pacientes.

Financiación

Los autores agradecen al Programa para el Mejoramiento delProfesorado,pertenecientealaSecretaríadeEducación PúblicadeMéxico,porhaberfinanciadoesteestudioatravés delaconvocatoriadeapoyoaexbecariosN.◦deFolio BUAP-EXB-768.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconflictodeintereses.

Bibliografía

1.BergerC,SodhaSV,ShawRK,GriffinPM,PinkD,HandP,Frankel G.Freshfruitandvegetablesasvehiclesforthetransmissionof humanpathogens.EnvironMicrobiol.2010;12:2385---97. 2.BurtS.Essentialoils:Theirantibacterialpropertiesand

poten-tial applications in foods: a review. Int J Food Microbiol. 2004;94:223---53.

3.ButzP,TauscherB.Emergingtechnologies:Chemicalaspects. FoodResInt.2002;35:279---84.

4.JuroszekP,LumpkinH,YangR,LedesmaD,MaC.Fruitquality and bioactive compounds withantioxidant activity of toma-toesgrownonfarm:Comparisonoforganicandconventional managementsystems.JAgricFoodChem.2009;57:1188---94. 5.KimJ,YousefA,ChismG.Useofozonetoinactivate

microor-ganismsonlettuce.JFoodSaf.1999;19:17---34.

6.KulisicT,RadonicA,KatalinicV,MilosM.Useofdifferent met-hodsfortestingantioxidativeactivityoforeganoessentialoil. FoodChem.2004;85:633---40.

7.LunaGuevaraML,DelgadoAlvaradoA,TorresA,AvelinoF.A., NavarroOca˜naA,ParadaGuerraF.Diversityofenterobacteria

associatedwithtomato(LycopersicumesculentumMill.)fruits andgreenhousesoils.ScientiaAgropecuaria.2012;2:161---9. 8.Oyedemi S, Okoh A, Mabinya L, Pirochenva G, Afolayan J.

The proposed mechanism of bactericidal action of eugenol,

␥-terpineol and ␥-terpinene against Listeriamonocytogenes, Streptococcuspyogenes,ProteusvulgarisandEscherichiacoli. AfricanJBiotechnol.2009;8:1280---6.

9.Ruiz-CruzS,González-AguilarGA,Ornelas-PazJJ,Cira-Chávez LA, Ayala-Zavala JF.Effect of Sanitizersand Oregano Essen-tial Oils to Reduce the Incidence of Salmonella and Other Pathogens in Vegetables. En: Kumar Y, editor. Salmonella

---- A Diversified Superbug. Immunology and Microbiology. 2012. [On-line] [consultado 31 Jul 2014]. Disponible en: http://www.intechopen.com/bugs/Salmonella-a-diversified- superbug/effect-ofsanitizers-and-oregano-essential-oils-to-reduce-the-incidence-of-salmonella-andother-path.

10.SartorattoA,MachadoALM,DelarmelinaC,FigueiraGM,Duarte MCT, Rehder VLG. Composition and antimicrobial activity of essentialoilsfrom aromaticplantsusedinBrazil.BrazilianJ ofMicrobiol.2004;35:275---80.

11.ScherbaG,WeigelR,O’BrienW.Quantitativeassessmentofthe germicidalefficacyofultrasonicenergy.JApplEnviron Micro-biol.1991;57:2079---84.

12.SeymourI,BurfootD,SmithRL,CoxLA,LockwoodA.Ultrasound decontaminationofminimallyprocessedfruitsandvegetables. JFoodSciTechnol.2002;37:547---57.

13.Singh N, Singh RK, Bhunia AK. Sequential disinfection of Escherichia coli O157:H17 inoculated alfalfa seeds before and during sproutingusing aqueous chlorine dioxide, ozona-ted water, and thymeessential oil.Lebensm-WissU-Technol. 2003;36:235---43.

14.VilkhuK,MawsonR,SimonsL,BatesD.Applicationsand oppor-tunitiesforultrasoundassistedextractioninthefoodindustry. InnovFoodScieEmergTechnol.2008;9:161---9.

15.Yu H, Chen S, Cao P. Synergistic bactericidal effects and mechanismsoflowintensityultrasoundandantibioticsagainst bacteria:Areview.UltrasonSonochem.2012;19:377---82.