Universidad de Concepción Dirección de Postgrado
Facultad de Ciencias Biológicas - Programa de Magíster en Ciencias con mención en Microbiología
Efecto antibacteriano de compuestos derivados de
líquenes antárticos sobre
Acinetobacter baumannii
Tesis para optar al grado de Magíster en Ciencias con mención en
Microbiología
XABIER ANDONI VILLANUEVA MARTÍNEZ
CONCEPCIÓN-CHILE
2016
Profesor Guía: Gerardo González Rocha Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción
ii
Esta tesis ha sido realizada en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción.
Profesor Guía
______________________________ Dr. Gerardo González Rocha
Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción
Profesor Co-Guía ______________________________
Dra. Angélica Casanova Katny Núcleo de Estudios Ambientales Universidad Católica de Temuco
Comisión Evaluadora:
______________________________ Dra. Helia Bello Toledo
Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción
______________________________ Dr. Homero Urrutia Briones
Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción
______________________________ Dr. Mauricio Cuéllar Fritis
Escuela de Química y Farmacia Universidad de Valparaíso
Director de Programa
______________________________ Dr. Víctor Campos Araneda
Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción
iii DEDICATORIA
Dedico esta tesis a mis padres Juan y Marcela, y a mis hermanos Nicolás y Julián,
quienes han sido un pilar fundamental a hora de poder desarrollar este trabajo y a la
hora de orientar mi futuro académico y laboral.
Dedico este trabajo también a mi familia extendida, en especial a mi abuela Delfina.
Dedico también este trabajo a mis amigos más cercanos, por sus inestimables
consejos y su apoyo constante.
A todos quienes han estado presentes de alguna forma durante mis años de Magíster,
iv AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar al inestimable aporte del Instituto Nacional Antártico de Chile (INACH), a través de su proyecto de apoyo a tesis de Magíster INACH Gabinete MG_06-14 “Efecto antibacteriano de compuestos derivados de líquenes antárticos sobre Acinetobacter baumannii”.
A la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT), por su aporte a través del proyecto FONDEF IDeA CA12i10224 “Actividad antibacteriana de líquenes antárticos contra bacterias patógenas multiresistentes”, así como su apoyo financiero a través de la Beca CONICYT para financiamiento de estudios de Magíster.
A la totalidad del equipo del Laboratorio de Investigación en Agentes Antimicrobianos (LIAA), por entregarme las herramientas necesarias para poder desarrollar esta tesis de Magíster, en espacial a quienes trabajaron conmigo en el proyecto FONDEF IDeA IDeA CA12i10224: Raúl Molina, Marcela Espinoza y Claudia Torres. También a todos aquellos miembros del laboratorio que indirectamente aportaron a mi aprendizaje durante el Magíster: Andrés Opazo, Tomás Kappes y Mario Quezada, quién me enseñó a usar herramientas estadísticas que fueron indispensables para mi tesis de magíster. A las técnicas de laboratorio Angélica Oliva y Evelyn Benavente, por su paciencia y buena disposición a la hora de ayudarme a preparar material y enseñarme técnicas básicas de laboratorio. A la Dra. Celia Lima, por su buena disposición para resolver dudas y aportar mejoras a mi trabajo de investigación.
Finalmente, quisiera agradecer a los profesores que estuvieron a cargo mío durante mi desempeño en el LIAA: Mariana Domínguez, Helia Bello y mi profesor guía Gerardo González, por su confianza en mi trabajo y la buena disposición que tuvieron para enseñarme a ser un investigador competente.
v TABLA DE CONTENIDO
ÍNDICE DE TABLAS ... VIII
ÍNDICE DE FIGURAS ... X
ABREVIATURAS ... XI
RESUMEN ... XII
ABSTRACT ... XIV
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. La resistencia a antibióticos: una emergencia sanitaria mundial ... 1
1.2. Características de Acinetobacter baumannii ... 5
1.3. Virulencia de Acinetobacter baumannii ... 9
1.4. Persistencia y capacidad de formación de biopelículas en A. baumannii ... 9
1.5. Realidad de Acinetobacter baumannii en Chile ... 12
1.6. Alternativas para el control de cepas resistentes de Acinetobacter baumannii ... 13
1.7. La Antártica como fuente de metabolitos antibacterianos... 15
1.8. Objetivo general ... 17
1.9. Objetivos específicos ... 18
2. MATERIALES Y MÉTODO ... 19
2.1. Cepas sobre las que se ensayó la actividad antibacteriana y anti-biopelícula de los extractos totales y compuestos puros derivados de liquenes ... 19
vi
2.3. Determinación de actividad antibacteriana de extractos totales de liquenes antárticos sobre cepas clínicas de A. baumannii por ensayo de difusión en agar
... 20
2.4. Identificación de fracción con actividad antibacteriana del extracto total liquénico ... 22
2.5. Obtención de compuestos de las fracciones liquénicas... 22
2.6. Determinación de CMI y CMB por microdilución en caldo ... 23
2.7. Realización de ensayos de descontaminación de superficie ... 25
2.8. Determinación de capacidad de inhibición de biopelícula... 26
2.9. Determinación de actividad de erradicación de biopelícula ... 27
2.10. Análisis estadístico ... 28
3. RESULTADOS ... 28
3.1. Objetivo 1: Determinar los extractos totales de liquenes antárticos con actividad antimicrobiana sobre cepas clínicas de A. baumannii ... 28
3.2. Objetivo 2: Identificar las fracciones de extractos totales de liquenes antárticos responsables de la actividad antibacteriana sobre cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 30
3.3. Objetivo 3: Cuantificar la actividad antibacteriana de compuestos puros obtenidos de las fracciones antes mencionada sobre cepas clínicas de A. baumannii ... 31
3.4. Objetivo 4: Determinar la efectividad como desinfectante de compuestos puros sobre superficies abióticas, contaminadas con cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 36
3.5. Objetivo 5: Determinar la capacidad de los metabolitos para desagregar la biopelícula formada por cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 42
vii
4.1. Objetivo 1: Determinar los extractos totales de liquenes antárticos con actividad
antimicrobiana sobre cepas clínicas de A. baumannii ... 48
4.2. Objetivo 2: Identificar las fracciones de extractos totales de liquenes antárticos responsables de la actividad antibacteriana sobre cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 49
4.3. Objetivo 3: Cuantificar la actividad antibacteriana de compuestos puros obtenidos de las fracciones antes mencionada sobre cepas clínicas de A. baumannii ... 50
4.4. Objetivo 4: Determinar la efectividad como desinfectante de compuestos puros sobre superficies abióticas, contaminadas con cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 52
4.5. Objetivo 5: Determinar la capacidad de los metabolitos para desagregar la biopelícula formada por cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos ... 55
5. CONCLUSIONES ... 59
6. PROYECCIONES ... 60
REFERENCIAS ... 61
ANEXOS ... 82
Anexo 1: Halos de inhibición promedio (mm) generados por discos de papel filtro de 6 mm de diámetro impregnados con 3 y 6 mg de extracto total de Himantormia lugubris sobre cepas de A. baumannii ... 82
viii INDICE DE TABLAS
TABLA 1. Características de las cepas de Acinetobacter baumannii de origen hospitalario utilizadas en el estudio ... 21
TABLA 2.Halos de inhibición (mm) de discos impregnados con 3,0 y 6,0 mg de extracto total de H. lugubris sobre aislados seleccionados de Kocuria rhizophila ATCC 9341, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 y clínicos de A. baumannii ... 29
TABLA 3.Halos de inhibición (mm) de discos impregnados con 4,5 mg de extracto total de 3 liquenes distintos sobre aislados seleccionados de Kocuria rhizophila ATCC 9341, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 y clínicos de A. baumannii ... 29
TABLA 4. Halo de inhibición (mm) generado por discos de papel filtro impregnados con 4,5 mg de distintas fracciones del ET de Himantormia lugubris sobre aislados seleccionados de Kocuria rhizophila ATCC 9341, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 y clínicos de A. baumannii ... 30
TABLA 5. Halo de inhibición (en mm) generado por discos de papel filtro impregnados con 4,5 mg de distintas fracciones del ET de Ramalina terebrata sobre aislados seleccionados de Kocuria rhizophila ATCC 9341, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 y clínicos de A. baumannii ... 31
TABLA 6. CMI y CMB (en µg/ml) de la fracción metanólica de H. lugubris sobre aislados de A. baumannii sensibles a colistín ... 32
TABLA 7. CMI y CMB (en µg/ml) de la fracción metanólica de H. lugubris sobre aislados de A. baumannii resistentes a colistín ... 32
ix
TABLA 8. Comparación entre CMI promedio, CMI50 y CMI90 de 12 aislados de A. baumannii susceptibles a colistín y 14 aislados de A. baumannii resistentes a colistín ... 33
TABLA 9. Actividad antibacteriana (CMI y CMB) de subfracciones de la fracción metanólica de H. lugubris ... 34
TABLA 10. Actividad antibacteriana (CMI y CMB) de atranol con inóculo estándar (5x105 ufc/ml), sobre cepas de seleccionadas de Acinetobacter baumannii .... 35
TABLA 11. Efecto del tamaño de inóculo en la CMI y CMB de atranol (µg/ml) e hipoclorito de sodio (% m/v) sobre A. baumannii A-496 ... 36
TABLA 12. Efecto de atranol, hipoclorito de sodio y etanol a distintas concentraciones y a distintos tiempos de contacto sobre superficies de acero inoxidable contaminadas con A. baumannii A-496.. ... 37
TABLA 13. Agrupamiento, según ANOVA de una vía (con p < 0,05), de las dosis y tiempo de contacto a las cuales el efecto desinfectante del compuesto es similar ... 38
TABLA 14. Formación específica de biopelícula (SBF) de cepas de A. baumannii en condiciones control a 24 h de incubación, calculada en unidades arbitrarias .. 43
TABLA 15. Formación Específica de Biopelícula (promedio) de la cepa multisensible ATCC 19606 y diversos aislados extensivamente resistentes de A. baumannii, en presencia de distintas concentraciones subinhibitorias de atranol y con un tiempo de incubación de 24 h ... 45
x
TABLA 16. Formación Específica de Biopelícula (promedio) a las 24 h de incubación de los aislados de A. baumannii ensayados, agrupados en un solo grupo, en presencia de distintas concentraciones subinhibitorias de atranol ... 46
TABLA 17. Tabla basada en análisis ANOVA de una vía, en el que se agrupan los SBF promedio obtenidos según concentración de compuesto (µg/ml) y semejanza estadística ... 46
TABLA 18. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima Bactericida (CMB), Concentración Mínima de Inhibición de Biopelícula (CMIB) y Concentración Mínima de Erradicación de Biopelícula (CMEB) de atranol sobre distintos aislados clínicos XDR de Acinetobacter baumannii ... 47
INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Correlación entre concentración de atranol (µg/ml) y la carga bacteriana (log10 de ufc/ml) sobre discos de acero inoxidable de 2 cm de diámetro, con un tiempo de contacto de 5 min ... 39
FIGURA 2. Correlación entre concentración de atranol (µg/ml) y la carga bacteriana (log10 de ufc/ml) sobre discos de acero inoxidable de 2 cm de diámetro, con un tiempo de contacto de de 30 min ... 40
FIGURA 3. Correlación entre tiempo de contacto (minutos) y la carga bacteriana (log10 de ufc/ml) en discos de acero inoxidable de 2 cm de diámetro, a concentraciones de atranol de 250 (A), 500 (B), 1000 (C), 2000 (D) y 4000 (E) µg/ml. ... 42
FIGURA 4. Formación de biopelícula en condiciones control a 24 h de incubación, calculada en unidades arbitrarias, al separar los aislados según nivel de susceptibilidad a colistín ... 44
xi ABREVIATURAS
ARDRA Análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado
ATCC American Type Culture Collection (“Colección estadounidense de
cultivos tipo”, cepario de bacterias)
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute (“Instituto de estándares de
laboratorio clínico” de Estados Unidos) CMB Concentración mínima bactericida
CMEB Concentración mínima de erradicación de biopelícula CMI Concentración Mínima Inhibitoria
FDA Food and Drug Administration (“Administración de alimentos y
medicamentos” de Estados Unidos)
GC-MS Cromatografía de gases – espectometría de masa HPLC Cromatografía líquida de alta presión
IAAS Infecciones asociadas a atención en salud
IDSA Infectious Disease Society of America (“Sociedad estadounidense
de enfermedades infecciosas”)
MALDI-TOF Desorción/ionización láser asistida por matriz – tiempo de vuelo MDR Bacteria multirresistente a antibióticos
MLSA Análisis de Secuencias Multilocus OMS Organización Mundial de la Salud PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDR Bacteria panresistente a antibióticos SBF Formación específica de biopelícula THF Tetrahidrofurano
TLC Cromatografía de capa fina
XDR Bacteria extensamente resistente a antibióticos UCI Unidad de Cuidados Intensivos
xii RESUMEN
Las bacterias del grupo ESCAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacteriaceae) constituyen una causa importante de morbilidad y mortalidad intrahospitalaria, por presentar elevada resistencia a antibióticos. De estos micoorganismos, A. baumannii destaca no sólo por presentarse habitualmente con resistencia extensa (sensible sólo a colistín y/o tigeciclina), sino que también por persistir en el ambiente inanimado, principalmente por ser productor de biopelículas. Por esta razón, se hace imprescindible la búsqueda de nuevos compuestos con acción antibiótica, desinfectante de superficie y/o antibiopelícula sobre A. baumannii. En consecuencia, el objetivo de este trabajo de tesis fue buscar en liquenes colectados de Bahía Fildes, Isla Rey Jorge, Antártica, la existencia de un metabolito con estas características.
Como resultado, se obtuvo que el liquen Himantormia lugubris producía un compuesto de la familia de los benzaldehídos llamado atranol, que presentó actividad bactericida sobre aislados extensivamente resistentes (XDR) a antibióticos de A. baumannii, con CMI entre 125 y 250 µg/ml y Concentración Mínima Bactericida (CMB) de 250 a 500 µg/ml. Por otro lado, este compuesto mostró actividad inhibitoria de la formación de biopelícula, presentando un 30% de inhibición de la formación de biopelícula (respecto a la condición control) a concentraciones menores a la CMI. Además, presentó una Concentración Mínima de Erradicación de Biopelícula (CMEB) de entre 1000 y 2000 µg/ml, lo que corresponde a entre 4 y 8 veces la CMI, siendo por tanto muy superior a los comparardores meropenem (>1000 veces) y colistín (8 veces). Destaca además la existencia de una amplia variabilidad en la producción de biopelícula por parte de los aislados de A. baumannii, desde aislados con muy baja producción de biopelícula hasta aquellos con amplia producción de la misma.
No obstante, los resultados anteriores, no se logró demostrar actividad desinfectante de superficie para este compuesto, obteniéndose una diminución de la carga bacteriana
xiii
de un 90% (1 logaritmo) con un tiempo de contacto de 30 minutos y una concentración de 4000 µg/ml, no cumpliendo con el mínimo de 5 logaritmos de descenso de la carga bacteriana para ser considerado un desinfectante eficaz.
Se concluye que el atranol, obtenido del liquen H. lugubris, es capaz de eliminar la presencia de Acinetobacter baumannii tanto en fase planctónica (libre) como formando biopelículas y es por tanto un potencial candidato para prevenir o eliminar colonizaciones en dispositivos médicos, así como un eventual coadyuvante de los compuestos antimicrobianos actualmente en uso.
xiv ABSTRACT
The bacteria of the group ESCAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus,
Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Enterobacteriaceae) are an important cause of intrahospital morbidity and mortality, because of being highly resistant to antibiotics. Of these microorganism, A. baumannii
is remarkable not only for being usually extremely drug resistant (only susceptible to tigecycline or colistin), but also for its ability to persist in unanimated environments, mainly due to its capacity to form biofilms. For this reason, it is extremely important the quest for new compounds with antibiotic, disinfectant and antibiofilm action against A. baumannii. As a consequence, the main objective of this investigation was to search in lichens collected from Fildes Bay, King George Island, Antarctica, a secondary metabolite with these characteristics.
As a result, it was found that the lichen Himantormia lugubris produces a compound of the family of the benzaldehydes called atranol, which presented bactericidal activity against extremely-drug resistant isolates (XDR) of A. baumannii, with Minimal Inhibitory Concentrations (MIC) from 125 to 250 µg/ml and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) from 250 to 500 µg/ml. On the other hand, this compound exhibited inhibitory activity against biofilm formation in several strains of A. baumannii, with an average inhibition of biofilm formation of 30% when compared to the positive control at concentrations below the MIC. Also, it exhibited a Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) between 1000 to 2000 µg/ml, which ranges from 4 to 8 times the MIC, thus being superior than meropenem (>1000 fold) and colistin (8 fold). It is also remarkable that there a great variability in the production of biofilm of the isolates of A. baumannii, form isolates with very low biofilm production to isolates with a very high production of that structure.
Besides the above results, it couldn’t be demonstrated a surface disinfection ability for this compound, obtaining only a 90% (1-log) decrease with a contact time of 30 minutes
xv
and a concentration of 4000 µg/ml, not accomplishing the minimal 5-log decrease (99.999%) in the bacterial load to be considered a successful disinfectant.
As conclusion atranol, obtained from the lichen H. lugubris, is capable of eliminate the presence of A. baumannii both in planktonic and biofilm forms. For this reason, atranol is a potential candidate for a compound to avoid or eliminate bacterial colonization of medical devices, and also a potential adjuvant of currently available antimicrobial compounds.
1 INTRODUCCIÓN
1.1. La resistencia a antibióticos: una emergencia sanitaria mundial
Actualmente la resistencia a antibióticos es un problema de gran magnitud a nivel mundial, sobre todo a nivel de centros de atención en salud (Labarca y Araos, 2009). En estos últimos, la aparición de Infecciones Asociadas a Atención en Salud (IAAS) produce prolongación de las hospitalizaciones, aumento de la morbi-mortalidad y aumento de los costos en atención a los pacientes (Klevens et al., 2002; Ehrenkranz
et al., 2011; Zimlichman et al., 2013). Estas infecciones se han asociado a la emergencia cada vez mayor de cepas multiresistentes (MDR), extensivamente resistentes (XDR) y panresistentes (PDR) a antibióticos (Magiorakos et al., 2012).
Entre las causas de la emergencia de las infecciones intrahospitalarias causadas por bacterias resistentes a antibióticos se cuentan el aumento de la presión selectiva por el uso indiscriminado de antibióticos, la instrumentalización de pacientes, la hospitalización de pacientes inmunosuprimidos y el rompimiento de las precauciones estándar a la hora de atender pacientes, permitiendo esta última situación la propagación de brotes de bacterias hospitalarias (Hedrick y Sawyer, 2005). A pesar de que es técnicamente imposible reducir el riesgo a cero, se ha intentado una serie de estrategias para la disminución de la emergencia de IAAS y de cepas con resistencia aumentada a antimicrobianos. Entre estas estrategias se cuentan:
Racionalización del uso de antibióticos
Generación de protocolos y guías clínicas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, asociado a la implementación de sistemas de vigilancia de uso de antibióticos (uso de receta visada por médico infectólogo) y sustitución de antimicrobianos con mayor impacto sobre la microbiota del paciente, lo que se resume en el concepto de “Antimicrobial Stewardship”, el cual presenta una amplia bibliografía que sustenta su utilidad (Bauer et al., 2010; Nicolau, 2011).
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Dentro de esta estrategia se incluye también la implementación de métodos rápidos de detección de cepas resistentes, con objeto de ajustar de forma más rápida y adecuada el tratamiento antibiótico. Respecto de esto último, destaca la emergencia de los métodos de biología molecular basados en PCR convencional y en tiempo real (Altun et al., 2013), el uso de MALDI-TOF (Espinal et al., 2012) y la aparición de los “Carba test” (Nordmann et al., 2012), que disminuyen en al menos 1 día la detección de carabapenemasas y otros mecanismos de resistencia de importancia clínica.
Reforzamiento de las precauciones estándar:
Desde que Semmelweis descubriera, en la segunda mitad del siglo XIX, la importancia del lavado clínico de manos para reducir la morbi-mortalidad de la atención médica (Semmelweiss, 1861; Kirkland et al., 2012), esta medida se ha transformado en pilar fundamental para evitar la emergencia y propagación de brotes infecciosos intrahospitalarios (Allegranzi y Pittet, 2009); sin embargo, el bajo cumplimiento de la misma conspira contra su efectividad (Kampf et al., 2009). La implementación del correcto lavado de manos va aparejada de otras medidas como el uso de una distancia adecuada entre camas hospitalarias, medidas de aislamiento físico (uso de mascarilla y guantes, entre otros) dependiendo de la situación clínica y optimización de los procedimientos invasivos a pacientes hospitalizados (Siegel et al., 2007; Yokoe et al., 2008; Kampf et al., 2009).
Implementación de protocolos de desinfección:
Algunas bacterias como Pseudomonas spp. y Acinetobacter spp. sobreviven por tiempo prolongado en el ambiente (Kerr y Snelling, 2009; Peleg, 2008), por lo que en algunos centros hospitalarios se ha tenido éxito moderado en disminuir los brotes de estas bacterias aplicando esquemas agresivos de desinfección de superficies e implementos hospitalarios (Barbolla et al., 2008, Apisarnthanarak et al., 2008).
3
No obstante, lo anteriormente señalado, el problema no ha hecho más que aumentar, situación que se agrava por el hecho de que desde el fin de la “Edad de Oro” de los antibióticos ha disminuido progresivamente la invención o descubrimiento de moléculas antimicrobianas, a tal punto que en la última década (2000-2010) sólo se lanzaron al mercado 3 grupos nuevos de antimicrobianos (Boucher et al., 2013), siendo los demás compuestos aprobados sólo variaciones de antimicrobianos ya existentes. Es por este motivo que la IDSA (Infectious Disease Society of America) lanzó la iniciativa “10 x ’20, Bad Bugs Need Drugs” con el objetivo de sintetizar un antibiótico
nuevo por año y obtener 10 antibióticos nuevos durante la década 2010-2020 (IDSA, 2010). Por desgracia, no se podrá lograr este objetivo ya que desde el 2010 sólo se han aprobado las cefalosporinas de 5ª generación ceftobiprol (Chahine et al., 2011) y ceftarolina (Poon et al., 2012), estando aún en estudio otros compuestos como los inhibidores reversibles de betalactamasas del grupo de los diazabiciclooctanos, dentro de los que destaca avibactam (Sader et al., 2014; Boucher et al., 2013). Peor aún, ya existen reportes de emergencia de aislados resistentes a algunos de estos antibióticos (Humphries et al., 2015).
Otro problema asociado a la falta de desarrollo de nuevas moléculas antibacterianas es que la mayoría de los antibióticos desarrollados en las últimas 2 décadas, así como los nuevos en desarrollo, tienen efecto fundamentalmente contra bacterias Gram positivas, lo que deja una cantidad importante de bacterias Gram negativas MDR con pocas o ninguna alternativa terapeutica (Boucher et al., 2013).
La gran mayoría de las infecciones por bacterias multiresistentes son debidas a un grupo determinado de bacterias hospitalarias, en su mayoría Gram negativas, las que han sido agrupadas bajo el acrónimo ESCAPE (Peterson, 2009). Este grupo de bacterias se considera de especial relevancia no sólo por su elevada resistencia, sino también por la mortalidad que generan; entre las que destacan:
4 Enterococcus faecium
Staphylococcus aureus
Clostridium difficile
Acinetobacter baumannii
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacteriaceae (donde se incluye Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp. y Proteus spp.)
Dentro del grupo de bacterias anteriormente mencionado, nos centraremos en la especie A. baumannii, por ser una bacteria que no sólo ha generado brotes importantes en Unidades de Cuidados Intensivos (UCI), asociados a gran mortalidad, sino que es bastante difícil de eliminar tanto de pacientes como de superficies clínicas; más aún, se describen algunas cepas panresistentes (PRD), es decir, resistentes a todos los antibióticos conocidos, de uso clínico (Göttig et al., 2014). Este problema podría agravarse en los próximos años, puesto que si bien hasta ahora las cepas PDR reportadas habían presentado mecanismos no transmisibles de resistencia a colistín (la última alternativa de tratamiento disponible para la gran mayoría de aislados clínicos de A. baumannii), el año 2015 se descubrió la existencia de un plásmido conjugativo portador del gen mcr-1, el que confiere resistencia a colistín por adición de fosfoetanolamina al lípido A. Este plásmido, originalmente descrito en aislados de
Escherichia coli hallados en criaderos de cerdos en China (Liu et al., 2016), ha sido encontrado posteriormente en bacterias procedentes de lugares tan distantes como Dinamarca (Hasman et al., 2015) y Estados Unidos (McGann et al., 2016), situación que nos pone directamente a las puertas de la era post-antibiótica, la que se describe como el periodo en el que no existirán antibióticos efectivos para combatir infecciones producidas por bacterias (Organización Mundial de la Salud (OMS), 2014). El hallazgo de McGann et al., (2016) es especialmente grave, ya que no fue hallado en animales de granja, si no que causando infección en un paciente.
5
1.2. Características de Acinetobacter baumannii
Para comprender mejor este problema es necesario describir esta bacteria, haciendo hincapié en los factores de virulencia y de sobrevivencia que posee. A. baumannii. Esta bacteria corresponde a un cocobacilo Gram negativo, inmóvil (de donde deriva su nombre, ya que akinetos significa “sin movimiento”), no fermentador de glucosa y
no productor de oxidasa. El género Acinetobacter fue definido por primera vez en 1954 y agrupa una gran cantidad de genoespecies bacterianas (43 a fecha del 13/08/2016, según “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature”), las que se definen como aquellos grupos de bacterias dentro de un género (en este caso, Acinetobacter) compuestos por individuos que presentan entre sí una hibridación ADN-ADN mayor al 70% (Wayne et al., 1987). Estas genoespecies son en su mayoría de origen ambiental, las que además son difíciles de distinguir entre sí por sus características fenotípicas (Dijkshoorn et al., 2007). Por lo anterior, las genoespecies de Acinetobacter se dividen en grupos de compatibilidad basados en su similitud fenotípica, siendo el más importante del punto de vista clínico el “complejo A. baumannii”, que incluye las
especies A. baumannii, A. pitti y A. nosocomialis (Higgins et al., 2007; McConnell et al., 2012), debido a la frecuente presencia del mismo en infecciones que afectan a pacientes de UCI, su fuerte presencia y sobrevida en medios abióticos intrahospitalarios, y a la elevada mortalidad asociada (Dijkshoorn et al., 2007; McConnell et al., 2012). Respecto al “complejo A. baumannii” es importante recalcar
algunas observaciones:
Los métodos fenotípicos de identificación actualmente en uso a nivel de Laboratorio Clínico no permiten identificar la especie con precisión, por lo que en estricto rigor las bacterias identificadas como “A. baumannii” por métodos
fenotípicos comerciales (API 20NE y VITEK 2, entre otros) sólo debieran informarse como “Complejo A. baumannii - A. calcoaceticus” (Higgins et al., 2007). Debido a lo anterior, se ha propuesto una serie de métodos basados en biología molecular para identificar las bacterias del género Acinetobacter a nivel de
6
especie, dentro de los que destacan la identificación por PCR usando los genes
gyrB (Higgins et al., 2007), rpoB (Nemec et al., 2011) o las regiones variables del ARN 16s, así como el uso de MLSA (Multilocus Sequence Analysis) (Nemec et al., 2011). De estos, rpoB es el que ha demostrado mejor discriminación entre las especies del complejo (Nemec et al., 2011). Últimamente, ha surgido como alternativa a la secuenciación un PCR múltiple propuesto por Lee et al. (2013), el cual amplifica la región intergénica 16S-23S y que presenta una alta sensibilidad y especificidad.
A pesar de lo anterior, habitualmente se informa en los cultivos de origen hospitalario como “A. baumannii” el hallazgo de bacterias del complejo antes
señalado (Dijkshoorn et al., 2007). Esto se debe a que la inmensa mayoría de las infecciones por este género corresponden a la especie antes señalada (Dijkshoorn et al., 2007). Sin embargo, un reporte de Schleicher et al. (2013) sugiere que esto no necesariamente es así, y que A. pitti pudiera ser en ocasiones la especie más prevalente. Esto es relevante, ya que la mayoría de los trabajos publicados sugieren que A. pitti y A. nosocomialis tienden a ser más sensibles a los antibióticos que A. baumannii (Chuang et al., 2011).
Aunque el resto de las bacterias de este complejo han sido descritas en el medioambiente, A. baumannii ha sido descrita casi exclusivamente en el ambiente hospitalario, existiendo aún poca claridad de cómo surgió dicha bacteria en los centros clínicos (McConnell et al., 2012). Una excepción a lo anteriormente dicho fueron los reportes de A. baumannii en infecciones asociadas a trauma bélico en la Segunda Guerra del Golfo Pérsico (2003), razón por lo cual dicho fenómeno se conoció coloquialmente como “Irakibacter”; sin embargo, al menos un estudio afirma que la infección por “Irakibacter” fue adquirida en los Hospitales Militares y no en el campo de batalla (Scott et al., 2007).
7
Por otra parte, Wilharm y colaboradores (2015) han descrito la existencia de aislados de A. baumannii en nidos de aves en la región occidental de Polonia, los que presentan características muy distintas a las bacterias de la misma especie en ambientes hospitalarios, lo que incluye la ausencia en estos aislados ambientales de beta-lactamasas clase D del grupo OXA 51-like, las que son intrínsecas de los aislados obtenidos de ambientes clínicos. Por otro lado, Eveillard et al. (2013) recopilan una serie de reservorios extrahospitalarios descritos para A. baumannii, entre los cuales se describe el suelo de distintas áreas de la ciudad de Hong Kong (Houang et al., 2001) y heces de cerdos en Reino Unido (Byrne-Bailey et al., 2009). La identificación de las especies de
Acinetobacter se realizó en el primero de los estudios usando análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado (amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA) y en el segundo de éstos secuenciando un fragmento de 800 pb del ARNr 16S.
Hoy en día, aún existe controversia en cuanto a si A. baumannii es sólo un marcador de la gravedad del paciente de UCI o bien causa mortalidad per se
(Blot et al., 2003; Falagas et al., 2006, 2007). Lo que sí está claro es que las personas que presentan infección por esta bacteria tienen una alta mortalidad (mayor a la que tendrían de no tener dicha infección) que de acuerdo a algunas publicaciones puede llegar al 70% (McConnell et al., 2012).
La infección más frecuente causada por A. baumannii es la neumonía asociada a ventilador mecánico, seguida de la bacteriemia y la infección de partes blandas (incluyendo quemadura infectada) (McConnell et al., 2012).
Dentro las características que permiten el éxito de esta bacteria se incluyen su gran capacidad para colonizar ambientes clínicos. Reyes (2013) estudió la presencia de A. baumannii en distintas superficies de la UCI del Hospital Herminda Martín de Chillán, encontrando una alta colonización de lugares como las llaves de 3 pasos, los catéteres
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de aspiración de secreciones respiratorias y las camas de los pacientes. Interesantemente, en dicho estudio estableció que 2 pacientes que hubiesen ocupado la misma cama de forma sucesiva podían presentar el mismo aislado de A. baumannii, lo que habla del potencial de resistencia de la bacteria.
La situación anterior, descrita también en otros trabajos (Garnacho-Montero et al., 2015, Doi et al., 2015), estaría dada entre otros factores por la capacidad de formar biopelículas y la gran resistencia a desinfectantes (debido principalmente a la presencia de bombas de expulsión, destacando las del grupo RND, del inglés
resistance-nodulation-cell division) (Coyne et al., 2011). De hecho, un estudio realizado por Espinal et al. (2012) demuestra diferencias significativas en la resistencia a la desecación de cepas de A. baumannii productoras y no productoras de biopelícula, con mayor sobrevida de las primeras.
Otro problema aparejado a lo anterior es la elevada resistencia a antimicrobianos, que en nuestro medio incluye resistencia a carbapenémicos (Cifuentes et al., 2014). Esto último ha obligado al uso de medicamentos de última línea (tigeciclina, colistín) para tratar a estas infecciones (Garnacho-Montero et al., 2015, Doi et al., 2015), registrándose ya casos en que se presenta resistencia a estos antibióticos (Navon-Venezia et al., 2007, Hornsey et al., 2010, Qureshi et al., 2015). Otro problema añadido es que en el caso de tigeciclina no hay puntos de corte aceptados por el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), ya que su uso sobre A. baumannii no está aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA, 2016). Esta resistencia a antibióticos está ocasionada por 4 factores: bajo número de porinas, presencia de bombas de expulsión, presencia de β-lactamasas principalmente del grupo D de Ambler (tipo oxacilinasas) y modificación del sitio blanco por mutaciones puntuales en gyrA y parC, confiriendo esta última situación resistencia a quinolonas (Singh et al., 2013).
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Es por lo anteriormente señalado que la desinfección de superficies clínicas, así como el correcto lavado de manos, se constituyen en elementos clave a la hora de reducir el impacto clínico de Acinetobacter baumannii en el ambiente hospitalario, ya que sería más efectivo evitar las infecciones por esta bacteria que combatir las infecciones una vez que ya se producen (Kollef y Niederman, 2015). En este sentido, Apisarnthanarak
et al. (2008) logran reducir la incidencia de A. baumannii pan-resistente en pacientes de UCI usando desinfección con hipoclorito al 1% y reforzamiento del lavado clínico de manos.
1.3. Virulencia de Acinetobacter baumannii
Una controversia importante que se presentó por mucho tiempo en torno a A. baumannii es si éste presenta o no factores de virulencia. Sin embargo, se ha visto la existencia de una isla de resistencia de 86 kb denominada AbaR1 en aquellas cepas (cepas AYE) asociadas a mayor morbi-mortalidad, y que además se asociaban a presencia abundante de genes de resistencia a antibióticos, en su gran mayoría provenientes de otras bacterias no relacionadas y obtenidos por transferencia horizontal de genes; más aún, se ha visto que las primeras cepas descritas de A. baumannii (incluyendo la cepa de referencia ATCC 19606) son susceptibles a la gran mayoría o a todos los antibióticos, lo que necesariamente implica plasticidad génica, ya sea por rearreglos del cromosoma y/o captación de genes de resistencia foráneos (Fournier et al., 2006). Por otro lado, se ha visto que la proteína OmpA no sólo es importante para la adhesión de A. baumannii a superficies biológicas como el epitelio traqueal, si no que actúa induciendo la apoptosis de células del huésped vía destrucción mitocondrial.
1.4. Persistencia y capacidad de formación de biopelículas en A. baumannii
Como se mencionaba anteriormente, la formación de biopelículas por parte de A. baumannii forma parte importante de su capacidad de persistir en el ambiente
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hospitalario. En este sentido, A. baumannii ha demostrado tener capacidad para formar biopelículas tanto en superficies inanimadas (Vidal et al., 1997) como en epitelio vesical y traqueal (Sepúlveda et al., 1998; Ruiz et al., 1998), otorgándole por tanto la capacidad de colonizar e infectar el tracto urinario y la vía respiratoria de pacientes en cuidados intensivos, además de resistencia aumentada a antibióticos (Vidal et al., 1997).
El principal componente de la biopelícula de A. baumannii es un exopolisacárido denominado poli-beta-(1–6)-N-acetilglucosamina, el cual forma una matriz extracelular que permite la adhesión de las bacterias entre sí (De Gregorio et al., 2015).
Sin embargo, las proteínas de superficie de la bacteria también juegan un rol en la formación de la biopelícula, funtamentalmente en la adhesión a superficies bióticas y abióticas. Además de la ya mencionada OmpA, otra proteína que cumple un rol clave es la proteína Bap-like, llamada así por su similitud a la “Biofilm Associated Protein” de
S. aureus y que es importante tanto en la adhesión intercelular de A. baumannii como en la adherencia a superficies abióticas como vidrio o plástico. Esta proteína posee estructura similar a las inmunoglobulinas y, si bien no es imprescindible para la formación inicial de la biopelícula, es fundamental para su incremento en biomasa y maduración (De Gregorio et al., 2015). Respecto de este último punto, también tiene un rol en la adherencia a superficies inanimadas el pili tipo “chaperon-usher” CsuA/BABCDE (McConnell et al., 2012), el cual es importante para la adherencia inicial a este tipo de superficies.
Además de lo anteriormente señalado, un rol clave en la virulencia y formación de biopelículas de A. baumannii lo cumplen los sideróforos, compuestos que permiten la captación de iones de hierro en el torrente sanguíneo humano, para los que se ha demostrado que su inhibición permitiría dispersar biopelículas de A. baumannii (Gentile
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En la formación de biopelículas, forma un rol clave el sistema de quorum sensing
AbaI/AbaR, un sistema dependiente de acil-homoseril-lactonas (AHL) que usa varios mediadores, los que presentan un rango de largos de cadena de entre 10 y 16 carbonos (Bhargava et al., 2010).
Respecto a la correlación entre multirresistencia, virulencia y capacidad de formación de biopelícula, existe evidencia conflictiva al respecto. Por un lado, algunos autores proponen que estos 3 elementos van de la mano, sugiriéndose incluso la relación entre la presencia de la betalactamasa de espectro extendido PER-1 (Sechi et al., 2004) y una mayor formación de biopelícula, lo que también es planteado por Lee et al., (2008), quien encontró una correlación positiva entre el nivel de expresión de blaPER-1 y la formación biopelícula. Sin embargo, Rao et al. (2008) reporta que de 11 aislados con PER-1, sólo 2 forman una biopelícula fuerte al ser comparados con aislados carentes de PER-1.
Por otro lado, algunos autores han encontrado una correlación inversa entre resistencia extrema o panrresistencia y la capacidad de formación de biopelícula y/o la virulencia, como reportan Dafopoulou et al. (2016) respecto a la correlación inversa existente entre la resistencia a colistín y la capacidad de formación de biopelícula. Una situación similar es reportada por Yoon et al. (2015), quienes observaron que la sobreexpresión de bombas de expulsión del tipo RND incrementaba la resistencia a múltiples antibióticos, pero disminuiría la formación de biopelícula. Esto último implicaría que la adquisición de multirresistencia tendría un costo biológico para la bacteria.
Si lo último mencionado es verdadero, ¿cómo persisten las bacterias extensivamente resistentes en los ambientes clínicos? La explicación estaría dada en la condición polimicrobiana de las biopelículas (Hu et al., 2015): las cepas más productoras de biopelícula, pero al mismo tiempo más sensibles a antibióticos, formarían un reservorio para las cepas menos productoras, pero más resistentes a antibióticos. Luego, la
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presión selectiva generada por el uso indiscriminado de antibióticos favorecería a las cepas más resistentes para colonizar e infectar a los pacientes hospitalizados. Esta situación se ha visto por ejemplo en los catéteres urinarios, donde la asociación de
Pseudomonas aeruginosa y A. baumannii genera biopelículas que permiten la persistencia de otras bacterias como Klebsiella pneumoniae (Djeribi et al., 2012). Por otro lado, se ha visto que la biopelícula per se contribuye a la resistencia a antibióticos y desinfectantes, al disminuir la penetración de los mismo hacia las bacterias de la biopelícula (Wang et al., 2015).
1.5. Realidad de Acinetobacter baumannii en Chile
Una de las características más llamativas de las cepas de A. baumannii presentes en hospitales chilenos ha sido su transición de aislados multisensibles (Bello et al., 2000; Morales et al., 2012) a presentar un patrón MDR o XDR (Diomedi, 2005; Cifuentes et al., 2014). Según los últimos datos recopilados por el Grupo Colaborativo de Resistencia Bacteriana de Chile (Cifuentes et al., 2014), la susceptibilidad a carbapenémicos de A. baumannii causante de infecciones en pacientes adultos (tanto en UCI como fuera de ellas) es menor a 30%, presentando además porcentajes de resistencia mayores a un 50% a casi todos los antibióticos excepto colistín (al que presenta un 98% de susceptibilidad). Es por esto último que colistín, tanto solo como asociado, se posiciona como el tratamiento de elección para pacientes que adquieren una infección por esta bacteria.
En este contexto, el reporte en algunos hospitales chilenos de la emergencia de aislados resistentes a colistín (Opazo, 2015) es una situación preocupante, ya que no existen tratamientos alternativos a colistín que sean eficaces contra las infecciones causadas por A. baumannii, puesto que el uso de tigeciclina muestra evidencia contradictoria que, si bien sugiere su eventual utilidad, no es del todo concluyente (Chuang et al., 2014, Lee et al., 2013, Garnacho-Montero et al., 2015).
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Interesantemente, la distribución de A. baumannii no es homogénea entre hospitales chilenos, puesto que algunos de estos no presentan infecciones por esta bacteria mientras que en otros se da una situación de endemia (Rivera et al., 2016). Esta situación tendría que ver con el hecho de que, tal como se mencionó anteriormente, la calidad de la desinfección juega un rol clave en la prevalencia de esta bacteria en los entornos clínicos (Manian et al., 2011). Respecto a esto último, las normas de desinfección de superficies clínicas en hospitales chilenos, si bien son bastante similares entre un centro y otro, presentan sutiles diferencias que pudieran influir en el éxito a la hora de erradicar A. baumannii. Por ejemplo, todos los hospitales emplean hipoclorito de sodio cada 8 h para la desinfección de superficies (con el fin de eliminar esporas de Clostridium difficile), pero la concentración usada varía de un hospital a otro. Así, la norma interna del Hospital Regional de Concepción “Dr. Guillermo Grant B.”, indica el uso de NaClO al 0,1%, mientras que en otros hospitales se sugiere soluciones al 0,5%. Por otro lado, existen diferencias dentro de los mismos hospitales en cuanto a la metodología de desinfección. Nuevamente citando el ejemplo de Concepción, el aseo del baño de los pacientes (externalizado a una empresa privada) no emplea NaClO para su desinfección, si no que compuestos de amonio cuaternario.
1.6. Alternativas para el control de cepas resistentes de Acinetobacter baumannii
En relación al preocupante panorama respecto a la discrepancia entre incremento de la resistencia bacteriana y la disminución de aparición de nuevas moléculas antimicrobianas, ha habido esfuerzos por analizar organismos vivos de ambientes extremos en busca de nuevos metabolitos que puedan tener efecto contra microorganismos de interés humano. En este sentido, los liquenes constituyen un muy buen candidato para buscar nuevos compuestos de utilidad.
Los liquenes corresponden a una simbiosis mutualista entre una microalga o una cianobacteria (fotobionte) y un hongo (micobionte) que están ampliamente
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diseminados en distintos ambientes a nivel mundial, incluso ambientes extremos como la Antártica (Shrestha et al., 2013). Existe una gran variedad de los mismos, habiendo una gran selectividad en la predilección de un hongo en particular por un determinado fotobionte (Stenroos et al., 2006). Una de las propiedades interesantes de los mismos es la gran cantidad de metabolitos secundarios que producen, los que son siempre sintetizados por el micobionte. A este respecto, es importante señalar que muchos de los metabolitos se producen solamente si el micobionte está “liquenizado” (Huneck, 1999). Los liquenes son organismos sésiles de crecimiento lento, por lo que estos metabolitos secundarios serían importantes para cumplir diversas funciones como captación de iones metálicos, protección contra radiación UV y defensa contra bacterias y depredadores (Huneck, 1999).
Los metabolitos secundarios de liquenes vienen siendo estudiados desde inicios del siglo XX y se ha visto en múltiples ocasiones que poseen un aceptable efecto antimicrobiano (Shrestha et al., 2013), destacando algunos compuestos como el ácido úsnico (Ingólfsdóttir, 2002). Este último, así como muchos de los metabolitos secundarios de liquenes, es un compuesto fenólico, por lo que es mayormente soluble en solventes orgánicos, pero presenta baja solubilidad en agua. Esto, asociado al hecho de que estos metabolitos están en baja concentración, genera algunas dificultades en la obtención de los mismos. Estas características de los metabolitos secundarios de liquenes vienen dadas por el hecho de que son sintetizados por vías metabólicas de gran complejidad, las que son divididas en tres (Huneck, 1999):
1) La vía del acetil-polimalonil, que produce la gran mayoría de los metabolitos secundarios de liquenes, dentro de los que se incluyen dépsidos, depsidonas y derivados del ácido úsnico, entre otros.
2) La vía del ácido mevalónico, responsable de la producción de esteroides, terpenos y carotenoides, y
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3) La vía del ácido shikímico, responsable de la producción de derivados del ácido pulvínico.
A pesar de la gran cantidad de publicaciones de efectos antibacterianos de metabolitos liquénicos, pocos hallazgos se han hecho en cuanto al mecanismo de acción de los mismos, destacando en el último tiempo una publicación que muestra el efecto de ácido úsnico en la inhibición de la síntesis de ADN (Maciazg-Dorszynska et al., 2014) y el descubrimiento usando una biblioteca de compuestos antimicrobianos del efecto de ácido anziaico de Hypotrachyna sp. en la inhibición de la topoisomerasa IV bacteriana (Cheng et al., 2013).
1.7. La Antártica como fuente de metabolitos antibacterianos
Los ambientes extremos, por su carencia de recursos, obligan a los liquenes a competir de forma exitosa en el ambiente, teniendo los metabolitos secundarios un rol a este respecto. Esto se ve avalado por la literatura, que registra el hallazgo de liquenes que poseen metabolitos con actividad antimicrobiana (Paudel et al., 2008).
Es importante mencionar que existen pocos estudios que ensayen el efecto de extractos liquénicos sobre A. baumannii, existiendo un estudio de Sökmen et al. (2012) que muestra resultados prometedores. En este último trabajo, se informa la acción del extracto total de los liquenes Pseudevernia furfuracea y Evernia prunastri sobre cepas de Staphylococcus calmii, Bacillus pumilis, B. megaterium, A. baumannii y
Enterococcus faecium, la que se midió por el método de difusión en agar y de microdilución en caldo (este último para obtener la CMI). Algo a considerar en este trabajo, es que sólo se ensayó el extracto total, sin identificar ni evaluar algún metabolito particular de los liquenes en cuestión.
Otro hallazgo interesante, respecto al efecto de compuestos liquénicos sobre A.
baumannii, fue lo investigado por Porcile (2014), quien mostró el efecto de diversos extractos totales sobre la inhibición del Quorum sensing, mecanismo que, como se
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mencionó anteriormente, tiene un rol relevante en la formación de biopelículas por A. baumannii (Bhargava et al., 2010).
Teniendo en cuenta los antecedentes antes mencionados, se plantea la necesidad de explorar los metabolitos de liquenes u otros compuestos de origen natural para encontrar sustancias con efecto sobre A. baumannii. La obtención de un metabolito activo podría llevar al desarrollo de nuevos antibióticos de uso clínico, o bien a un desinfectante más efectivo que permita una disminución de la colonización de A. baumannii sobre las superficies de elementos de las unidades de paciente crítico. Respecto de este último punto, se ha demostrado que la aplicación de procesos de desinfección profunda destinados a eliminar esta especie bacteriana de superficies de salas de hospitalización reduce la recurrencia de brotes de esta bacteria, habiendo mostrado efectividad los compuestos de amonio cuaternario (Manian et al., 2011) y peróxido de hidrógeno vaporizado (Ray et al., 2010); sin embargo, el disponer de un nuevo desinfectante que disminuya la carga de A. baumannii sobre las superficies clínicas ayudaría a ampliar el set de herramientas disponibles para combatir este microorganismo, más aún si se logra demostrar su acción sobre biopelículas. Por otro lado, el disponer de un nuevo desinfectante disminuiría la presión selectiva ejercida por los compuestos actualmente en uso, ya que se ha observado una selección creciente de cepas resistentes a estos compuestos, así como una correlación positiva entre el nivel de resistencia antibiótica y la susceptibilidad disminuida a desinfectantes (Koljalg et al., 2002; Chen et al., 2009). Esto último sería atribuible a mecanismos comunes de resistencia, por ejemplo, bombas de expulsión multidroga (Opazo et al., 2009; Rajamohan et al., 2010).
Uno de los problemas a la hora de evaluar la efectividad de los desinfectantes y antisépticos es que existe una gran cantidad de protocolos diferentes, la mayoría sólo de alcance nacional y de pobre reproducibilidad. Es por esto que en 1993 el Comité Europeo de Estandarización (CEN/TC 216) propuso la realización de una evaluación en 2 etapas. La primera consiste en un ensayo de suspensión en fase líquida (también
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llamado ensayo de dilución-neutralización) (Bloomfield et al., 1991) y la segunda consiste en un ensayo de descontaminación de superficie en discos de acero inoxidable de 2 cm de diámetro (ver en Metodología) con objeto de simular las condiciones con las que se enfrentaría el desinfectante en la vida real (Bloomfield et al., 1993, 1994). Este protocolo europeo, con actualizaciones, es hoy por hoy uno de los más aceptados y hay estudios que demuestran su utilidad, por lo que será la base de esta tesis de magíster.
Por lo anterior, en esta tesis se plantean las siguientes preguntas de investigación:
¿Existen liquenes antárticos cuyo extracto total posea actividad inhibitoria contra A. baumannii?
En los liquenes antárticos con actividad inhibitoria contra A. baumannii, ¿existe al
menos un metabolito secundario que posea actividad antimicrobiana y/o capacidad biocida sobre A. baumannii?
De existir, ¿tiene(n) este(os) metabolito(s) secundario(s) capacidad de desagregar la biopelícula de A. baumannii?
La Hipótesis que se ha planteado en esta tesis es la siguiente:
“Existe al menos un extracto total de liquen antártico que posee actividad
inhibitoria sobre Acinetobacter baumannii y que contiene al menos un compuesto puro con actividad biocida y/o desagregante de la biopelícula formada por esta bacteria”
1.8. Objetivo General
Evaluar la actividad antibacteriana y antibiopelícula de extractos totales y derivados de liquenes antárticos sobre Acinetobacter baumannii multirresistentes a los antibióticos.
18 1.9. Objetivos Específicos
Determinar los extractos totales de liquenes antárticos con actividad antimicrobiana sobre cepas clínicas de A. baumannii.
Identificar las fracciones de extractos totales de liquenes antárticos responsables de la actividad antibacteriana sobre cepas clínicas de A. baumannii
multirresistentes a los antibióticos.
Cuantificar la actividad antibacteriana de compuestos puros obtenidos de las fracciones antes mencionada sobre cepas clínicas de A. baumannii.
Determinar la efectividad como desinfectante de compuestos puros sobre superficies abióticas, contaminadas con cepas clínicas de A. baumannii
multirresistentes a los antibióticos.
Determinar la capacidad de los metabolitos para desagregar la biopelícula formada por cepas clínicas de A. baumannii multirresistentes a los antibióticos.
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2. MATERIALES Y MÉTODO
2.1. Cepas sobre las que se ensayó la actividad antibacteriana y anti-biopelícula de los extractos totales y compuestos puros derivados de liquenes
Se trabajó con 26 cepas multiresistentes de A. baumannii aisladas en hospitales chilenos entre 2008 y 2012, clasificadas según su susceptibilidad o resistencia a colistín (Tabla 1).
Adicionalmente, se ensayó la actividad sobre 2 cepas controles: Kocuria rhizophila
ATCC 9341 (cepa hipersensible) y Acinetobacter baumannii ATCC 19606 (cepa de colección que es susceptible).
2.2. Líquenes que se estudiaron en esta investigación
En este trabajo se estudió la actividad antimicrobiana de los extractos y metabolitos puros obtenidos de los siguientes liquenes obtenidos de Territorio Antártico Chileno:
1. Himantormia lugubris (Hue) I.M. Lamb 1964, 2. Stereocaulon alpinum Laurer 1827,
3. Usnea aurantiacoatra (Jacq.) Bory 1826, 4. Usnea antarctica Du Rietz 1926,
5. Ramalina terebrata Hook. f. & Taylor 1844, 6. Sphaerophorus globosus (Huds.) Vain. 1903 7. Umbilicaria antarctica Frey & I.M. Lamb 1939.
Para obtener el extracto total de los liquenes antes mencionados, se realizó una extracción metanólica seguida de destilación en vacío con rotavapor, con objeto de
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separar los compuestos orgánicos (solubles en solventes apolares) del agua (Karakus, 2009). El extracto crudo obtenido de esta manera se usó en posteriores estudios.
2.3. Determinación de actividad antibacteriana de extractos totales de liquenes antárticos sobre cepas clínicas de A. baumannii por ensayo de difusión en agar
La actividad antibacteriana de los extractos totales de liquenes antárticos se evaluó mediante el método de difusión en agar (Bauer et al., 1966; Srivastava et al., 2013). En primer lugar, estos extractos se adicionaron disueltos en tetrahidrofurano (THF) en discos estériles de papel filtro a volumen de 90 µL y concentración de 50 mg/mL por disco (4,5 mg de extracto por disco), los que se secaron toda la noche en estufa a 37°C para eliminar el exceso de THF. Al día siguiente, estos discos se depositaron en placas de agar Müller-Hinton inoculadas con una suspensión bacteriana 0,5 McFarland (equivalente a 1x108 ufc/mL) de A. baumannii por un periodo de 20-24 h a 37°C, siguiendo las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) para ensayo de difusión en agar (2012). Cumplido el periodo anterior, se procedió a medir el halo de inhibición alrededor de los discos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
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Tabla 1. Características de las cepas de Acinetobacter baumannii de origen hospitalario utilizadas en el estudio
CEPA PROCEDENCIA AÑO DE AISLAMIENTO
MUESTRA CLÍNICA COMPORTAMIENTO A COL*
A527 HP-Temuco 2012 Herida (UCI Adultos) CEPAS
SUSCEPTIBLES
A368 CP-Santiago 2007 Aspirado Bronquial
A378 HP-Santiago 2007 Orina (Cirugía)
A396 CP-Santiago 2008 Neumonía
A442 HP-Santiago 2012 Expectoración (Medicina Hombres)
A370 CP-Santiago 2007 Punta Catéter
A380 HP-Santiago 2007 Abdomen (Urgencia)
A397 CP-Santiago 2008 UCI
A444 HP-Santiago 2012 Orina (Quemados)
A446 HP-Santiago 2012 Sangre (Quemados)
A387 HP-Santiago 2007 Sangre (UTI)
A450 HP-Santiago 2012 Tejido Brazo Derecho (Quemados)
A496 HP-Temuco 2012 Tejido Tobillo (Cirugía) CEPAS
RESISTENTES
A523 CP-Santiago 2012 Aspirado Endotraqueal (Intermedio)
A417 HP-Santiago 2012 Aspirado Endotraqueal (UCI)
A500 HP-Temuco 2012 Herida Operatoria (Cirugía)
A439 HP-Santiago 2012 Herida Muslo Izqdo. (Cirugía Hombres)
A507 HP-Temuco 2011 LCR (UTI Adulto)
A490 HP-Temuco 2012 LCR (UCI Adulto)
A440 HP-Santiago 2012 Aspirado Endotraqueal (Quemados)
A530 CP-Santiago 2012 Orina (Medicina)
A419 HP-Santiago 2012 Aspirado Endotraqueal (Quemados)
A430 HP-Temuco 2012 Aspirado Endotraqueal (UCI)
A503 HP-Temuco 2012 Sangre (UCI Adulto)
A512 CP-Santiago 2011 Secreción Herida (UCI Adulto)
A511 CP-Santiago 2012 Secreción Bronquial (Unidad Coronaria)
*Susceptibilidad determinada anteriormente en tesis de Magíster de Alexis Opazo (2014); HP = Hospital Público, CP = Clínica Privada; *COL: colistín. Fuente: elaboración propia.
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2.4. Identificación de fracción con actividad antibacteriana del extracto total liquénico
Para identificar la porción del extracto total responsable de la actividad antimicrobiana, se procedió a separar el mismo en fracciones mediantes cromatografía líquida por adsorción en fase normal, usando como separador una columna de sílice y usando como eluyentes acetona y metanol (Sergio Triviño, Químico proyecto FONDEF IDeA CA12i10224). Una vez separadas las fracciones, se ensayaron contra las cepas bacterianas mediante el método de difusión en agar usando como vehículo discos de papel filtro, según la metodología descrita anteriormente (Bauer et al., 1966; Srivastava
et al., 2013).
2.5. Obtención de compuestos de las fracciones liquénicas
Una vez determinadas las fracciones que presentan actividad sobre A. baumannii, se procedió a identificar los compuestos presentes en la misma mediante cromatografía de gases-espectometría de masa (GC-MS) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés; Lumbsch, 2002), para lo cual se compararon las señales obtenidas de las fracciones liquénicas con una base de datos de perfiles de HPLC proporcionada por el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas de la Universidad de Concepción.
Luego de determinados los compuestos presentes en las fracciones liquénicas, se procedió a separarlos mediante cromatografía en columna de sílica gel por gradiente de polaridad, usando como solvente inicial hexano adicionando concentraciones progresivamente mayores de acetato de etilo en hexano, finalizando con acetato de etilo al 100%. Para establecer a que compuesto correspondía cada fracción de la columna, se analizaron las fracciones usando placas de cromatografía de capa fina (TLC, Merck Milipore) y comparándose su patrón de desplazamiento contra muestras
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de compuestos conocidos, los que habían sido identificados previamente por Cabrera (2015) usando Resonancia Nuclear Magnética (RNM).
Uno de estos compuestos, rotulado como CI-05 por Cabrera (2015), resultó ser el más abundante de la fracción metanólica de Himantormia lugubris y se purificó mediante precipitación por solvente, para lo cual se ocupó una mezcla 1:1 dietiléter/metanol.
Cabe mencionar que buena parte de esta actividad pudo desarrollarse gracias a la inestimable ayuda del Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Valparaíso, liderado por el Dr. Mauricio Cuéllar Fritis.
Una vez obtenido un compuesto puro, se procedió a determinar su actividad biológica.
2.6. Determinación de CMI y CMB por microdilución en caldo
La CMI del extracto puro fue determinada por el método de dilución seriada en caldo usando microplacas de 96 pocillos.
Para determinar la CMI usando inóculo estándar (esto es, 5 x 105 ufc/ml), se siguió el método propuesto por Michels et al. (2015) para compuestos obtenidos de productos naturales, modificado de la siguiente manera: se prepararon diluciones seriadas de cada compuesto puro (disuelto en metanol puro 99,7%) desde 1000 a 7,8 µg/mL en caldo Müller-Hinton (MHB, por sus siglas en inglés). Las placas de microtitulación fueron inoculadas con 260 µL de MHB, 30 µL del compuesto puro y 10 µL de suspensión bacteriana con una concentración de 106 ufc/mL. En cada placa se utilizó tres controles diferentes: control de referencia del medio de cultivo (290 µL medio de cultivo + 10 µL inóculo bacteriano), control de referencia del solvente utilizado (260 µL medio de cultivo + 30 µL metanol + 10 µL inóculo bacteriano) y un control de referencia del extracto preparado (270 µL medio de cultivo + 30 µL extracto puro).
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Para determinar la CMI usando inóculo aumentado (esto es, 108 y 109 ufc/ml), se empleó el método descrito por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), pero con algunas modificaciones. Brevemente, se obtuvo un inóculo de 4 McFarland (equivalente a 1,2 x 109 ufc/ml), parte del cual fue concentrado por centrifugación para obtener un inóculo de 1,2 x 1010 ufc/ml. Luego, se tomó 10 µL de ambos inóculos, los que se sembraron en los correspondientes pocillos de la microplaca de 96 pocillos, que contenían 100 µL de MHB con la concentración deseada del compuesto.
Para ambas situaciones antes descritas, las placas de microtitulación fueron incubadas a 37°C por 20 - 24 h. La CMI se determinó mediante el establecimiento del crecimiento visible de los microorganismos. Se definió como CMI la menor concentración del compuesto a la que no se observó turbidez. En caso de que la coloración del compuesto en MHB no permita discriminar turbidez, se empleó MTT (sal de tetrazolio) al 1% en PBS (buffer fosfato salino), según protocolo modificado de Tan et al. (2008). Brevemente, a los pocillos en los que se incubó la bacteria con compuesto se añadió 15 µL de MTT disuelto en PSB para luego incubarse a 37°C por 1 hora. Los pocillos con desarrollo bacteriano fueron aquellos que presentaron cambio de coloración a azul.
Se determinó la Concentración Mínima Bactericida (CMB) siguiendo un protocolo similar al propuesto por Guerra et al. (2013) tomando una muestra de 100 µL de todos los pocillos sin crecimiento visible, los que se diluyeron en 5 mL de MHB, para evitar el carry over del compuesto, y se incubaron por 20 - 24 h a 37°C. La CMB fue la menor concentración del metabolito liquénico a la que se registró ausencia de desarrollo bacteriano.
Es necesario comentar que los experimentos mencionados en este acápite fueron realizados por triplicado.
