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PRÁCTICO N 4. Análisis de fertilidad del suelo

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Academic year: 2021

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(1)

PRÁCTICO N° 4

Análisis de fertilidad del

suelo

(2)

OBJETIVOS

Conocer las técnicas actuales de recuento de microorganismos.

Conocer la importancia del monitoreo de abundancia, actividad y

diversidad de los microorganismos edáficos.

Obtener dominio en el análisis de grupos funcionales microbianos que

intervienen en la fertilidad del suelo.

Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de

microorganismos.

Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para

(3)

Técnicas mas utilizadas para estimar la abundancia

microbiana

Recuento de células totales (células vivas y muertas).

Recuento de células viables (células que aún presentan

(4)

Método directo (Cámara de Petroff

Hausser)

Técnicas para determinar abundancia de microorganismos

Número x mm2

Númerox mm3

Número x cm3o /mL

Forma de calcular el número de células por mL de muestra

Sitio donde se coloca la muestra. Espacio entre cubre y porta 0,02 mm (1/50 mm). La rejilla tiene 25 cuadrados grandes, un área de 1 mm2y un volumen total de 0,02

mm3

Observación microscópica: todas las células son contadas dentro de un cuadrado grande (16 cuadrados

pequeños). Ej. 12 células

12 células x 25 cuadrados x 50 x 103

(5)

Luz incidente

Filtro (filtra diferentes longitudes de onda)

Muestra con células Luz no dispersada

Fotocélula (mide la luz no dispersada)

(6)

Recuento de células viables

Recuento en medio sólido

a) Siembra por inmersión o embebido

b) Siembra en superficie

UFC/mL o UFC/g = colonias contadas x (1/factor de dilución) x (1/volumen de inóculo)

El inóculo es pipeteado dentro

de una placa estéril

Medio estéril es adicionado y mezclado con el inóculo

Solidificación e incubación

Colonias creciendo en superficie

Colonias creciendo embebidas en el agar

Se coloca una alícuota (0,1 mL) sobre la superficie del

agar

Se esparce el inóculo con espátula de Drigalsky

Colonias creciendo en superficie

(7)

Recuento en medio líquido

Método del número más probable (NMP)

Batería de tres tubos Diluciones seriadas

Suspensión o inóculo a sembrar

(8)

Tabla de Mc. Grady

Nº Característico NMP Nº Característico NMP Nº Característico NMP

000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5 001 0.3 112 1.5 223 4.2 002 0.6 113 1.9 230 2.9 003 0.9 120 1.1 231 3.6 010 0.3 121 1.5 232 4.4 011 0.61 122 2.0 233 5.3 012 0.92 123 2.4 300 2.3 013 1.2 130 1.6 301 3.9 020 0.62 131 2.0 302 6.4 021 0.93 132 2.4 303 9.5 022 1.2 133 2.9 310 4.3 023 1.6 200 0.91 311 7.5 030 0.94 201 1.4 312 12 031 1.3 202 2.0 313 16 032 1.6 203 2.6 320 9.3 033 1.9 210 1.5 321 15 100 0.36 211 2.0 322 21 101 0.72 212 2.7 323 29 102 1.1 213 3.4 330 24 103 1.5 220 2.1 331 46 110 0.73 221 2.8 332 110

(9)

Grupo funcional: conjunto de microorganismos que realizan procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía.

Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales 1) Suspensión y dilución de suelo

2) Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos 3) Determinación del crecimiento (lectura)

(10)

Análisis de grupos funcionales

Recuento en medio sólido (Embebido)

Recuento en medio líquido (NMP)

10-1

Agitar 2 o 3 minutos

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores

Xg suelo XmL de solución salina estéril en LECTURA ESTUFA Suspensión/dilución

(11)

Material de trabajo

Agregar 10 g de suelo en 90 ml de solución salina estéril

Tapar y agitar durante tres minutos

Suspensión y dilución del suelo

Suspensión y dilución del suelo

(12)

Extraer una pipeta estéril Flamear un porta-pipeta

Preparación de las diluciones

Extraer 1ml de la suspensión de suelo

(13)

Poner el ml en el tubo 10-2

Mezclar y extraer 1 ml

Poner el ml en el tubo 10-3

Continuar igual con todos los tubos

(14)

2 3 4 5 6 7 8 9

1

Siembra en medios específicos:

Amonificadores

Diluciones: -9, -8, -7

Siembrar en medio con asparagina Incubación 28-30°C, 7días

(15)

Siembra en medios selectivos:

Celulolíticos

2 3 4 5 6 7 8 9

1

Sembrar en medio líquido con papel de filtro

Incubación 28-30°C, 15 días Diluciones: -6,-5,-4

(16)

Dilución: -4

Siembra en medios selectivos:

Fijadores

2 3 4 5 6 7 8 9

1

Sembrar en medio sólido sin N Incubación 28-30°C, 5 días

(17)

Siembra en medios selectivos:

Nitrificadores

2 3 4 5 6 7 8 9

1

Dilución: -4,-3,-2

Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio

(18)

Siembra de grupos funcionales

Batería de grupos funcionales

• Suspensión/dilución de suelo • gradilla de diluciones • gradilla de nitrificadores • gradilla de celulolíticos • gradilla de amonificadores • caja de fijadores de N Estufa de incubación

(19)

Agregar reactivo Nessler

El color ocre detecta presencia de amonio

Lectura:

Amonificadores

(ejemplo)

+ + + + + -

- - +

Número característico 3 2 1

Contar los tubos positivos

Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número Mas Probable (NMP) = 15

(20)

Lectura:

Celulolíticos

(ejemplo)

Observar alteración del papel

Número característico 3 2 1

+ + + + + -

+

-Número Mas Probable (NMP) = 15

Tipos de alteración del papel

(21)

Lectura:

Fijadores

(ejemplo)

Contar colonias (entre 30-300)

Número de colonias (UFC) = 120

(22)

Lectura:

Nitrificadores

(ejemplo)

Agregar H2SO4 más difenilamida El color azul detecta presencia de nitrato

Contar los tubos positivos

Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número característico 3 2 1 Número Mas Probable (NMP) = 15

+ + + + - + - - +

(23)

Actividades

1.

Siembra

de

grupos

funcionales:

nitrificadores,

celulolíticos, amonificadores y fijadores de N

2.

2.

Recuento de grupos funcionales

Referencias

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