ESPA ˜NA k 51Int. Cl.7:
C08B 37/10
A61K 31/727
A61P 7/02
k 12SOLICITUD DE PATENTE
A1
k22Fecha de presentaci´on: 23.07.1999 k
71 Solicitante/s: LABORATORIOS
FARMACEUTICOS ROVI, S.A. Juli´an Camarillo, 35
28037 Madrid, ES
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43Fecha de publicaci´on de la solicitud: 01.12.2001 k
72 Inventor/es: Mardiguian, Jean
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43 Fecha de publicaci´on del folleto de la solicitud:
01.12.2001
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74 Agente: D´avila Baz, Angel
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54T´ıtulo: Composiciones de heparinas de muy bajo peso molecular.
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57Resumen:
Composiciones de heparinas de muy bajo peso mole-cular, con la f´ormula I, en la cual, n puede variar entre 1 y 12; R1 = H ´o SO3Na; R2= SO3Na ´o COCH3. Dichas composiciones de heparina est´an compuestas de mezclas de oligosac´aridos o fragmentos de hepa-rina y est´an caracterizadas por tener actividad anti Xa y actividad anti factor IIa y porque son utilizables como medicamentos antitromb´oticos.
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 DESCRIPCION
Composiciones de heparinas de muy bajo peso molecular.
Esta invenci´on se relaciona con nuevas composiciones de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) constituidas por un n´umero limitado de fragmentos de heparina que poseen un grupo 4-enopiranosil uro-nato en su extremo no reductor:
La heparina es un mucopolisac´arido sulfatado de origen animal, estracto de intestino o de pulm´on de mam´ıfero (vaca, cordero, cerdo) y utilizada desde hace tiempo en la terap´eutica humana para la pre-venci´on y el tratamiento de las enfermedades tromboemb´olicas.
Es bien sabido que la utilizaci´on de heparina viene acompa˜nada de efectos hemorr´agicos muy molestos y que la administraci´on diaria, tres inyecciones subcut´aneas o intravenosas, constituye un inconveniente considerable.
A lo largo de los ´ultimos a˜nos se han utilizado diversos m´etodos qu´ımicos para despolimerizar la heparina, como son:
– tratamiento con nitrito s´odico en medio ´acido – tratamiento alcalino de ´esteres
– utilizaci´on de radicales libres generados en presencia de agua oxigenada
– tratamiento de una sal de amonio cuaternario de heparina en medio no acuoso con una base fuerte seg´un un mecanismo de beta-eliminaci´on.
Estos m´etodos permiten obtener con rendimientos variables, mezclas de fragmentos de heparina en los cuales el peso molecular medio y la actividad anticoagulante var´ıan seg´un el procedimiento y las condiciones de la operaci´on. Las heparinas de bajo peso molecular (HBPM) descritas en el estado de la t´ecnica o comercializadas se obtienen seg´un diversos procedimientos de despolimerizaci´on. Su peso molecular medio (Mw) Est´a comprendido entre 4.000 y 6.000 daltons.
Actualmente se admite que la actividad antitromb´otica de las HBPM se debe principalmente a su capacidad de activar la antitrombina III, prote´ına del plasma, potente inhibidor de factor X activado y de la trombina. De forma que es posible medir la actividad antitr´ombotica de la heparina mediante test espec´ıficos de la inhibici´on de estos factores.
Las investigaciones llevadas a cabo por diferentes autores en los ´ultimos a˜nos, muestran que los frag-mentos u oligosac´aridos de heparina constituidos por cadenas cortas de peso molecular medio < 4.800 daltons poseen una acci´on selectiva sobre el factor X activado y tienen poco efecto sobre la coagulaci´on global medida con m´etodos de la farmacopea.
Se ha encontrado que si se desea obtener fragmentos de muy bajo peso molecular y que tengan una fuerte actividad anti Xa es preferible utilizar un m´etodo de despolimerizaci´on selectivo en medio no acuoso, tal como el descrito en la patente USP 4.981.955 que no tiene el riesgo de atacar el lugar de uni´on a la antitrombina III.
A la vista de los antecedentes y estado de la t´ecnica anteriormente expuestos, la presente solicitud ha desarrollado, usando un procedimiento en medio no acuoso, la despolimerizaci´on controlada de la heparina que permite obtener una nueva familia de HBMP rica en oligosac´aridos de baja masa molecular que exhiben una alta actividad anti Xa y una baja actividad anti IIa, y que responden a la f´ormula general:
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 En donde:
n puede variar entre 1 y 12 R1= H ´o SO3Na
R2= SO3Na o COCH3
Dicha heparina de muy bajo peso molecular, se obtiene por despolimerizaci´on selectiva de la heparina en medio no acuoso seg´un un procedimiento de beta eliminaci´on.
Las composiciones de heparinas de muy bajo peso molecular seg´un esta invenci´on se caracterizan por un peso molecular medio comprendido entre 2.000 y 4.000 daltons, una actividad anti factor Xa por lo menos igual a 100 U.I./mg y contienen una fuerte proporci´on, hasta 75 %, de oligosac´aridos de d´ebil grado de polimerizaci´on que se extiende desde el hexasac´arido (n=1) al dodecasac´arido (n=4).
Estas composiciones son ´utiles en la profilaxis y tratamiento de las trombosis venosa y arterial. Se pueden utilizar como medicamentos antitromb´oticos.
Las HBPM conocidas y explotadas comercialmente contienen peque˜nas proporciones de oligosac´aridos de d´ebil masa molecular, notablemente los oligosac´aridos cuyo grado de polimerizaci´on va del hexasac´arido al dodecasac´arido.
Las composiciones de heparina fruto de la presente invenci´on tienen como caracter´ıstica principal, el contener una fuerte proporci´on, hasta 75 %, de tales oligosac´aridos. Adem´as estos oligosac´aridos tienen una actividad anti Xa elevada, (>100 U.I./mg) lo que les confiere una actividad antitromb´otica alta de larga duraci´on.
Dichas composiciones de heparina tienen una actividad anti Xa comprendida entre 100 y 150 U.I./mg y cuya actividad anti-factor IIa es inferior o igual a 10 U.I./mg.
La masa molecular media en peso de las composiciones de heparina de la presente solicitud, est´an comprendidas entre 2.000 y 4.000 daltons y porque:
– contienen de 25 a 60 % de oligosac´aridos de masa molecular inferior a 2.000 daltons;
– contienen de 40 a 75 % de oligosac´aridos de masa molecular comprendida entre 2.000 y 6.000 daltons; y
– contienen menos de 15 % de oligosac´aridos de masa molecular superior a 6.000 daltons.
Las composiciones de heparina de la presente invenci´on est´an compuestas de mezclas de oligosac´aridos o fragmentos de heparina. El porcentaje de los fragmentos que forman parte de la presente, son los siguientes:
– contiene menos de 10 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 10 y 12; – contiene de 80 a 90 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 1 y 6; y – contiene menos de 15 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 7 y 9.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
La presente invenci´on queda ilustrada por los siguientes ejemplos, sin que dichos ejemplos limiten el alcance de la misma.
La masa molecular (Mw), la distribuci´on molecular, as´ı como las actividades anti factor Xa y anti factor IIa han sido determinadas seg´un las t´ecnicas descritas en la monograf´ıa n◦828 “Heparina de bajo peso molecular” de la 30 Edici´on de la Farmacopea Europea.
Ejemplo 1
Despu´es de disolver 1 kg de heparina s´adica no fraccionada en 7 litros de agua purificada, se a˜naden sobre la soluci´on de heparina y bajo agitaci´on, 4,4 litros de soluci´on de cloruro de benzalconio en agua al 50 % p/v.
Se completa con agua hasta un volumen aproximado de 30 litros y se deja decantar.
A continuaci´on se retira el sobrenadante, se a˜nade agua hasta 30 litros y se deja decantar. Una vez decantado se retira el sobrenadante y se liofiliza el precipitado.
Se obtienen aproximadamente 2.7 kg de sal de benzalconio de heparina (Producto A).
Despu´es de disolver 100 g de producto A en 300 ml de diclorometano, se a˜nade Trit´on B en tres tiempos:
– se a˜naden 25 ml de Trit´on B y se deja 8 h a 25◦C – se a˜naden 25 ml de Trit´on B y se deja 16 h a 25◦C – se a˜naden 25 ml de Trit´on B y se deja 8 h a 25◦C
Se precipita la soluci´on anterior sobre 600 ml de soluci´on de acetato s´odico en metanol al 10 % p/v y se recoge el precipitado por centrifugaci´on lavando con metanol.
El producto obtenido se disuelve en 500 ml de agua, se neutraliza con HCl 0.1N, se le a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 10 % p/v y se precipita por adici´on de 1.25 litros de metanol.
A continuaci´on se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 350 obteni´endose 33 g de Producto B, que se disuelven en agua a 10 % p/v. Se atempera a 25◦C y se a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 10 % p/v. Se precipita por adici´on de 2.5 vol´umenes de meta-nol. A continuaci´on se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C obteni´endose 26 g de Producto Purificado que se disuelven en agua al 5 % p/v.
Se ajusta el pH a 6.6 con HCl 0.1 N y se a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 5 % p/v. Se precipita por adici´on de 0.8 vol´umenes de metanol.
Despu´es de recoger el precipitado por filtraci´on lavando con metanol, se seca a vac´ıo a 35◦C. El sobrenadante se precipita con 1.6 vol´umenes de metanol.
Se recoge dicho precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C. Finalmente se obtienen 22 g de Producto.
Ejemplo 2
Se repite la obtenci´on del Producto B del ejemplo 1.
Se disuelven 20 g del producto B en 150 ml de agua y se a˜nade sobre ellos 100 ml de soluci´on de cloruro de benzalconio en agua al 50 % p/v.
A continuaci´on se completa con agua hasta un volumen aproximado de 500 ml y se deja decantar. Una vez decantado se retira el sobrenadante, se a˜nade agua hasta 500 ml y se deja decantar.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Despu´es de retirar el sobrenadante, se liofiliza el precipitado obteni´endose 50 g de sal de benzalconio. Se disuelven 20 g de la sal obtenida en 60 ml de diclorometano.
Se a˜naden 5 ml de Trit´on B y se deja 8 horas a 35◦C.
A continuaci´on se precipita la soluci´on anterior sobre 120 ml de soluci´on de acetato s´odico en metanol al 10 % p/v y se recoge el precipitado por centrifugaci´on lavando con metanol.
El producto obtenido se disuelve en 100 ml de agua, se neutraliza con HCl 0.1N, se le a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 10 % p/v y se precipita por adici´on de 250 ml de metanol.
Se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C. Finalmente se obtienen 6.3 g de Producto.
Ejemplo 3
Inicialmente se disuelven 5 g del producto obtenido en el ejemplo 2, en agua al 5 % p/v.
Se ajusta el pH a 6.6 con HCl 0.1 N y se a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 5 % p/v. Se precipita por adici´on de 1.5 vol´umenes de metanol.
A continuaci´on se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C. Finalmente se obtienen 3 g de Producto.
Ejemplo 4
Se repite la obtenci´on del producto B del ejemplo 1.
20 g del producto B se disuelven en 150 ml de agua y se a˜nade sobre ellos 100 ml de soluci´on de cloruro de benzalconio en agua al 50 % p/v.
A continuaci´on se completa con agua hasta un volumen aproximado de 500 ml. Despu´es de retirar el sobrenadante, se a˜nade agua hasta 500 ml y se deja decantar. Se retira el sobrenadante, se a˜nade agua hasta 500 ml y se deja decantar.
Se vuelve a retirar el sobrenadante y se liofiliza el precipitado obteni´endose 50 g de sal de benzalconio. Despu´es de disolver 20 g de la sal obtenida anteriormente en 60 ml de diclorometano, se a˜nade Trit´on B en dos tiempos:
– se a˜naden 5 ml de Trit´on B y se deja 8 h a 35◦C. – se a˜naden 5 ml de Trit´on B y se deja 16 h a 35◦C.
Se precipita la soluci´on anterior sobre 120 ml de soluci´on de acetato s´odico en metanol al 10 % p/v y se recoge el precipitado por centrifugaci´on lavando con metanol.
El producto obtenido se disuelve en 100 ml de agua, se neutraliza con HCl 0.1 N, se le a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 10 % p/v y se precipita por adici´on de 250 ml de metanol.
A continuaci´on se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C. Finalmente se obtienen 8.7 g de producto.
Ejemplo 5
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Se ajusta el pH a 6.6 con HCl 0.1N y se a˜nade cloruro s´odico hasta una concentraci´on del 5 % p/v. A continuaci´on se precipita por adici´on de 0.93 vol´umenes de metanol.
Despu´es de recoger el precipitado por filtraci´on, lavando con metanol, se seca a vac´ıo a 35◦C. El sobrenadante se precipita con 2 vol´umenes de metanol.
Se recoge el precipitado por filtraci´on lavando con metanol y se seca a vac´ıo a 35◦C. Finalmente se obtienen 4 g de producto.
An´alisis de los productos
Actividad anticoagulante (U.I./mg) anti Xa anti IIa Producto del ejemplo n◦ 1 120 8 Producto del ejemplo n◦ 2 105 3 Producto del ejemplo n◦ 3 110 6 Producto del ejemplo n◦ 4 100 4 Producto del ejemplo n◦ 5 100 2
Masa Distribuci´on molecular molecular ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗
Mw <2.000 2.000-6.000 >6.000 Producto del ejemplo n◦ 1 3.650 25 70 5 Producto del ejemplo n◦ 2 3.195 35 55 11 Producto del ejemplo n◦ 3 3.616 24 63 13 Producto del ejemplo n◦ 4 2.777 42 52 7 Producto del ejemplo n◦ 5 2.161 57 41 2
∗ % de oligosac´aridos de masa molecular inferior a 2.000 daltons.
∗∗ % de oligosac´aridos de masa molecular comprendida entre 2.000 y 6.000 daltons.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 REIVINDICACIONES
1. Composiciones de heparinacaracterizada por ser de muy bajo peso molecular, con la formula general siguiente:
en la cual:
n puede variar entre 1 y 12 R1= H ´o SO3Na
R2= SO3Na ´o COCH3
2. Composiciones de heparina seg´un la reivindicaci´on 1,caracterizadapor estar compuesta de mez-clas de oligosac´aridos u fragmentos de heparina.
3. Composiciones de heparina seg´un las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadopor contener menos de 10 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 10 y 12; de 80 a 90 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 1 y 6; menos de 15 % de fragmentos en los cuales n est´a comprendido entre 7 y 9.
4. Composiciones de heparina seg´un las reivindicaciones 1 y 2,caracterizadoporque la masa mo-lecular media en peso (Mw) est´a comprendida entre 2000 y 4000 daltons y porque contienen de 25 a 60 % de oligosac´aridos de masa molecular inferior a 2000 daltons, de 40 a 75 % de oligosac´aridos de masa molecular comprendida entre 2000 y 6000 daltons y menos de 15 % de oligosac´aridos de masa molecular superior a 6000 daltons.
5. Composiciones de heparina seg´un las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadoporque la actividad anti Xa est´a comprendida entre 100 y 150 U.I./mg y cuya actividad anti-factor IIa es inferior o igual a 10 U.I./mg.
6. Composiciones de heparina seg´un las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadoporque son utilizables como medicamentos antitromb´oticos.
ESPA ˜NA k
22 Fecha de presentaci´on de la solicitud: 23.07.1999
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32 Fecha de prioridad:
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
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51 Int. Cl.7: C08B 37/10, A61K 31/727, A61P 7/02
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categor´ıa Documentos citados Reivindicaciones
afectadas
X CMOAY, J. et al. ”Structural Studies on a Biologically Active 1-4,6 Hexa saccharides obtained from Heparin”, ANNALS NEW YORK ACADEMY
OF SCIENCES, 1981, Vol. 370, p´aginas 644-649, todo el documento.
X US 4981955 A (LOPEZ) 01.01.1991, todo el documento. 1-4,6
X US 5576304 A (KAKKAR et al.) 19.11.1996, todo el documento. 1-4,6 X WO 9855515 A (HAMILTON CIVIC HOSPITALS RESEARCH DEVELOPMENT INC.) 1-4,6
10.12.1998, todo el documento.
X ES 2003197 A6 (LABORATORIOS FARMACEUTICOS ROVI, S.A.) 16.10.1988, 1-4,6 todo el documento.
Categor´ıa de los documentos citados
X: Y: A:
de particular relevancia
de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor´ıa
refleja el estado de la t´ecnica
O: P: E:
referido a divulgaci´on no escrita
publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´on de la solicitud
documento anterior, pero publicado despu´es de la fecha de presentaci´on de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
× para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n◦:
