Avances en el conocimiento de la fermentación maloláctica de vinos tintos elaborados en Castilla-La Mancha

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(1)UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos. AVANCES EN EL CONOCIMIENTO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA DE VINOS TINTOS ELABORADOS EN CASTILLA-LA MANCHA. Fátima Pérez Martín. TESIS DOCTORAL Toledo, 2014.

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(3) Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos. Avances en el conocimiento de la fermentación maloláctica de vinos tintos elaborados en Castilla-La Mancha por. Fátima Pérez Martín. Visado en Toledo, 22 de Julio de 2014. Fdo.: Mª de los Llanos Palop Herreros Catedrática del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha. Fdo.: Susana Seseña Prieto Profesora Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha. Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Castilla-La Mancha. Fdo.: Fátima Pérez Martín Licenciada en Ciencias Ambientales.

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(5) Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos. Dª. Juana Rodríguez Flores, Catedrática de Universidad y Secretaría del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha.. CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “Avances en el conocimiento de la fermentación maloláctica de vinos tintos elaborados en Castilla-La Mancha” constituye la Tesis Doctoral que presenta Dña. Fátima Pérez Martín, para aspirar al Grado de Doctor por la Universidad de Castilla-La Mancha, y que ha sido realizada en el Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos, cumpliendo todos los requisitos necesarios, bajo la dirección de la Dra. Dª. Mª de los Llanos Palop Herreros y la Dra. Dª. Susana Seseña Prieto. Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a veintidós de julio de dos mil catorce.. VºBº. Fdo.: Ana Isabel Briones Pérez Directora del Departamento. Fdo.: Juana Rodríguez Flores Secretaria del Departamento.

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(7) ÍNDICE.

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(9) Índice. ÍNDICE INTRODUCCIÓN. 1. 1. EL SECTOR VITIVINÍCOLA EN ESPAÑA. 3. 1.1. EL SECTOR VITIVINÍCOLA EN CASTILLA-LA MANCHA. 6. 2. LA VINIFICACIÓN. 11. 2.1. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. 12. 2.2. FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA. 14. 2.2.1. Microbiología del proceso. 17. 2.2.2. Factores que influyen en el desarrollo de la fermentación maloláctica. 18. 2.2.3. Efectos de la fermentación maloláctica en el vino. 22. 2.2.3.1. Efectos beneficiosos. 22. 2.2.3.2. Efectos perjudiciales. 24. 3. LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO. 27. 3.1. CARACTERÍSTICAS Y CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL. 27. VINO 3.2. CULTIVO DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO. 32. 3.3. IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO. 34. 4. HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DEL PROCESO DE. 47. ELABORACIÓN Y DE LA CALIDAD DEL VINO 47. 4.1. EL AROMA DEL VINO: ENZIMAS DE INTERÉS EN VINIFICACIÓN. 4.2.. 4.1.1. Las glicosidasas. 50. 4.1.2. Las esterasas. 57. ALTERNATIVAS. PARA. EL. DESARROLLO. Y. CONTROL. DE. LA. FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA. I. 61.

(10) Índice. OBJETIVOS. 69. RELACIÓN DE PUBLICACIONES. 75. SECCIÓN I. Caracterización de la microbiota láctica presente en la fermentación. 79. maloláctica espontánea de vinos tintos acogidos a la D.O. Méntrida I.1. Inventory of lactic acid bacteria populations in red wine varieties from. 81. Appellation of Origin Méntrida. Eur. Food Res. Technol.(En revisión) I. 2. Are Enterococcus populations present during malolactic fermentation of. 93. red wine safe? Food Microbiol. 42, 95-101 I. 3. Is the air a tool for unintentional inoculation of fermentation tanks at. 103. wineries? Int. J. Food Microbiol.(En revisión) SECCIÓNII. Determinación de las capacidades enzimáticas de interés de. 119. diferentes aislados de bacterias lácticas para su utilización como herramienta biotecnológica en la mejorade la calidad sensorial de los vinos tintos. II.1. Screening for glycosidase activities of lactic acid bacteria as a. 125. biotechnological tool in oenology. World J. Microbio. Biotechnol. 28, 14231432 II. 2.. Esterase activity of lactic acid bacteria isolated from malolactic. 133. fermentation of red wines. Int. J. Food Microbiol. 163, 153-158 II.3. Aromatic compounds released from natural precursors by selected. 141. Oenococcusoeni strains during malolactic fermentation. Eur. Food Res. Technol. (En revisión) SECCIÓN III. Estudio de alternativas a la FML tradicional que permitan un mejor. 151. control y desarrollo del proceso: co-inoculación versus inoculación secuencial. III. 1. Behaviour during malolactic fermentation of three strains of. 153. Oenococcusoeni used as direct inoculation and acclimatisation cultures. S. Afr. J. Enol. Vitic. 34 (1), 1-9 III. 2. Influence of inoculation time of an autochthonous selected malolactic bacterium on volatile and sensory profile of Tempranillo and Merlot wines.. II. 165.

(11) Índice. Int. J. Food Microbiol. 156, 245-254 III. 3. Sequential inoculation versus co-inoculation in Cabernet Franc wine. 177. fermentation. Food Sci. Technol. Int. DOI: 10.1177/1082013214524585 DISCUSIÓN GENERAL. 189. SECCIÓN I. 191. SECCIÓN II. 200. SECCIÓN III. 205. CONCLUSIONES. 211. BIBLIOGRAFÍA. 215. III.

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(13) INTRODUCCIÓN.

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(15) Introducción general. INTRODUCCIÓN GENERAL. 1. EL SECTOR VITIVINÍCOLA EN ESPAÑA España es uno de los grandes productores mundiales de vino. Es el primer país en términos de superficie plantada, el segundo en términos de producción y volumen exportado y el tercero en términos de valor económico. El sector vitivinícola es de extraordinaria relevancia en nuestro país, no sólo por su importancia económica sino también desde un punto de vista social, medioambiental y, por la imagen que del país transmite al exterior. El viñedo representa en España el tercer cultivo en superficie, tras los cereales y el olivar. La superficie de vid cultivada ha crecido de forma casi continuada, con sólo algunos periodos de recesión debidos, posiblemente, más a reajustes estadísticos que a una realidad, siendo la superficie cultivada de viñedo actualmente de 1,02 millones de hectáreas. España es desde hace tiempo el país con mayor extensión de viñedo de la Unión Europea (UE) y del mundo (Figura 1). Representa un 30% de la superficie total de la UE, seguida por Francia e Italia con aproximadamente un 22% cada una, y un 14% de la superficie mundial (OIV, 2013).. Figura 1. Distribución de la superficie de viñedo en el mundo (Fuente: OIV, 2013).. 3.

(16) Introducción general. En lo que respecta a la producción de vino (Figura 2), tres países, Italia, España y Francia, representan el 47% de la producción mundial de vino, que se situó en torno a los 277 millones de hectolitros (sin contar zumo y mosto), en el año 2013. El primer país productor es Italia, con casi 45 millones de hl (16,3% mundial), seguido por España, con 42,7 millones de hl (15,4% mundial) y Francia, con 42 millones de hl (15,2% mundial).. Figura 2. Distribución de la producción de vino en el mundo (Fuente: OIV, 2013).. En España, existe una cultura del vino que se ha venido desarrollando a lo largo de los siglos y prácticamente todas las regiones españolas son productoras de vino, con una gran riqueza en variedades de uva, tradiciones vinícolas y tipos de elaboración. La elaboración de vino se remonta a la época de los romanos, pero ha sido recientemente cuando la exportación se ha convertido en un hecho masivo y generalizado en el sector. Desde los años sesenta, los métodos de elaboración y crianza han experimentado en todo el mundo una evolución espectacular, como consecuencia de la introducción de una nueva concepción del proceso de elaboración, en el que son necesarios tanto un control efectivo de las vendimias, como la vigilancia de los aromas primarios del fruto o el orden y la higiene en la bodega, lo que ha ocasionado una importante mejora de la calidad de los caldos obtenidos. La implementación y asimilación de estas nuevas metodologías de elaboración en. 4.

(17) Introducción general. España ha sido tal que actualmente muchas de las más modernas bodegas de Europa se encuentran en nuestro país. España cuenta con 85 zonas de producción de vinos con Denominación de Origen Protegida (DOP), de ellas 67 tienen Denominación de Origen, 2 son Denominación de Origen Calificada, 6 son Denominación de Vinos de Calidad con Indicación Geográfica y 10 son Vinos de Pago. Todas ellas siguen el modelo europeo de producción, manteniendo un estricto control de la cantidad producida, las prácticas enológicas y la calidad de los vinos que producen. Las primeras Denominaciones autorizadas datan del año 1932 y fueron Jerez-Xérès-Sherry, Manzanilla de Sanlucar de Barrameda, Málaga, Montilla-Moriles, Rioja, Tarragona, Priorato, Alella, Utiel-Requena, Valencia, Alicante, Ribeiro, Cariñena, Penedés, Condado de Huelva, Valdepeñas, La Mancha, Navarra y Rueda. Del total de la superficie de viñedo en España, el 51,1% produce vinos tintos y rosados y el 48,9%, vinos blancos. En cuanto a las variedades de uva destaca la variedad blanca Airén con el 23,5% de la superficie de viñedo, seguida por la variedad tinta Tempranillo con el 20,9% de la superficie total. Le siguen las variedades tintas Bobal, Garnacha Tinta y Monastrell y las blancas Pardina, Macabeo y Palomino, por orden de importancia en cuanto a superficie cultivada. Junto a ellas también se cultivan otras muchas variedades como Cabernet Sauvignon, Syrah, Merlot, Petit Verdot, Sauvignon Blanc, Chardonnay, Moscatel, Verdejo, Albillo, Malvasia, Pedro Ximénez, Malvar y Torrontés algunas autóctonas y otras importadas (http://www.winesfromspain.com). La situación geográfica, las diferencias climáticas y la variedad de suelos hacen que tanto la Península Ibérica como las islas sean un lugar privilegiado para la producción de vinos de calidad de características muy distintas. Se cultiva viñedo en la totalidad de las 17 Comunidades Autónomas en las que se divide el país, si bien cerca de la mitad de la extensión cultivada se encuentra en Castilla-La Mancha. Le siguen Extremadura, Valencia y Castilla y León (Figura 3a).. 5.

(18) Introducción general. Figura 3. Distribución en porcentaje de la superficie de viñedo en España (a) y en las diferentes provincias de la Comunidad de Castilla-La Mancha (b) (Fuente: ESYRCE, 2013).. 1.1.. EL SECTOR VITIVINÍCOLA EN CASTILLA-LA MANCHA Castilla-La Mancha es la zona geográfica con mayor extensión mundial y. nacional dedicada al cultivo de la vid con un total de 463.639 ha, todas ellas destinadas a la producción de uva de transformación. El sector vitivinícola es uno de los más importantes para la región tanto a nivel social como económico. De las 5 provincias que forman la Comunidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real es la que posee mayor superficie de cultivo, con algo más de 163.000 ha, seguida de Toledo, y Guadalajara la de menor con algo más de 1400 ha (ESYRCE, 2013) (Figura 3b). En Castilla-La Mancha el 53% de las viñas se encuentran acogidas a alguna Denominación de Origen, existiendo un total de 9 Denominaciones (Figura 4), aunque también hay reconocidas otras 9 que son Vinos de Pago. Las D.O. son La Mancha, Méntrida, Mondéjar, Uclés, Valdepeñas, Ribera del Júcar, Manchuela, Almansa y Jumilla, siendo la D.O. La Mancha la que presenta la mayor superficie de cultivo con algo más de 193.000 ha, que se distribuyen en cuatro de las cinco provincias de la región (todas menos Guadalajara).. 6.

(19) Introducción general. Figura 4. Denominaciones de origen en la Comunidad de Castilla-La Mancha.. Los Vinos de Pago ocupan una superficie pequeña que oscila entre 20 y 131 ha y son los siguientes: Casa del Blanco, Calzadilla, Finca Élez, Florentino, Guijoso, La Guardia, El Vicario, Dehesa del Carrizal y Dominio de Valdepusa. Los pagos más antiguos son Dominio de Valdepusa y Finca Élez, ambos del 2002. El Pago del Vicario es el más extenso con 131 ha y el de más reciente autorización. Entre las variedades de uva cultivadas en Castilla-La Mancha, la variedad blanca Airén es la dominante, en especial en las provincias de Ciudad Real y Toledo. A gran distancia está la variedad tinta Bobal, que ocupa superficies de entidad en las provincias de Cuenca y Albacete. Garnacha y Monastrell son importantes en Toledo y Albacete respectivamente, localizándose en los territorios de las D.O. Méntrida y Almansa. La variedad Tempranillo (también conocida como Cencibel) es la tinta más cultivada en las D.O. La Mancha y Valdepeñas. A estas variedades se van incorporando poco a poco algunas otras consideradas “mejorantes” como son Macabeo, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Syrah, Merlot y Chardonnay, fundamentalmente, que están alcanzando cantidades considerables. Algunas de las variedades mencionadas se describen a continuación con más detalle porque sus vinos son materia de estudio de algunos de los trabajos de esta Tesis Doctoral.. 7.

(20) Introducción general. TEMPRANILLO La variedad Tempranillo o Cencibel, además de ser la principal uva tinta en la D.O. La Mancha y Valdepeñas, es, por su calidad, la de mayor prestigio en el ámbito nacional. En otras regiones es conocida con el nombre de “UII de Llebre” (ojo de Liebre), tinto de Toro, tinto fino, tinto del país, Jacibera y Verdiell. Es. una. variedad. de. maduración. temprana, que crece mejor en altitudes relativamente elevadas, pero que también puede tolerar climas mucho más templados. Su racimo es de tamaño medio, forma cilíndrica, compacto y regular (Figura 5). Las uvas tienen la piel media-gruesa y la pulpa blanda, Figura 5. Variedad de uva Tempranillo. produciendo un zumo incoloro. Su carga. polifenólica hace que admita muy bien la madera. Su acidez tiende a ser baja y la elevada concentración de taninos es una de las razones de su buena conservación (Gallego, 2005). Es la variedad más utilizada en La Mancha para elaborar vinos tintos de crianza, en sus versiones de monovarietal o en “coupage” con otras. Su producción es moderada, aunque de una altísima calidad, y se caracteriza por ser de gran finura y muy aromática. Los vinos Tempranillo tienen un intenso color rojo rubí, con aromas de bayas, ciruelo, tabaco, vainilla, cuero y hierba. Poseen un paladar franco, interesante en vino joven, que se vuelve aterciopelado cuando se envejecen. GARNACHA Se caracteriza por su gran productividad y es la segunda variedad más utilizada para la elaboración de tintos en la D.O. La Mancha, después de la Cencibel, siendo también de gran importancia en la D.O. Méntrida. Está presente en casi todas las regiones vinícolas españolas donde es conocida con los nombres de Garnatxa, Aragonés, Giro, Lladoner, tinto de Navalcarnero, tinto Navarro y Gironet. Se dice que es originaria del Valle del Ebro y su nombre, de etimología confusa, podría devenir de grenate, en referencia al color de sus vinos.. 8.

(21) Introducción general. Su. racimo. es. de. tamaño. medio,. compacto, de color negro y forma esferoide, con uvas de piel fina y pulpa jugosa que dan un zumo incoloro (Figura 6). Es una variedad resistente como pocas, capaz de aguantar las condiciones ambientales más adversas, si bien prefiere los climas secos. Se caracteriza por su baja acidez y aporta grado y cuerpo a los vinos,. Figura 6. Variedad de uva Garnacha. lo que hace de esta un complemento ideal para realizar mezclas equilibradas. Es una uva de gran rendimiento que produce vinos muy vigorosos, siendo muy utilizada en la elaboración de rosados. MERLOT Es una variedad tinta procedente de Francia, región Bordelesa, con implantación en todos los países vinícolas del mundo. Es vigorosa y requiere terrenos frescos. Tiene una buena adaptación a la zona de producción de la D.O. La Mancha, aunque se cultiva sobre todo en la Ribera del Duero, Cataluña y Navarra. Su brotación es temprana,. siendo. sensible a las heladas primaverales y al mildiu. Los racimos son cilíndricos, de tamaño mediano, con uvas de color azul negruzco (Figura 7). La piel es espesa y la pulpa jugosa y de. sabor. agradable.. La. producción. es. abundante y constante. Da vinos de cierta fineza y tipicidad, de color rojo rubí bastante. Figura 7. Variedad de uva Merlot. intenso y con un característico sabor ligeramente herbáceo, alcohólico, aromático, con acidez más bien baja, que envejecen muy bien. SYRAH Variedad tinta originaria del Valle del Ródano, que ofrece excelentes resultados en zonas de mucho sol y altas temperaturas. Está muy introducida en Australia y California y se está produciendo una excelente adaptación en la D.O. La. 9.

(22) Introducción general. Mancha y otras Denominaciones de la región. También es conocida como Shiraz, Sirac, Syra, Syrac, Candive Noir, Schiraz, Sérine, Sérdne y Sirah. Tiene un buen comportamiento en climas cálidos, aunque también se adapta a climas fríos, produciendo entonces vinos algo más ligeros. Su racimo es cilíndrico de tamaño mediano con uvas de color azulado (Figura 8). La piel es medianamente espesa y la pulpa es jugosa. Produce vinos opulentos, vigorosos, con Figura 8. Variedad de uva Syrah. cuerpo, con gran cantidad de taninos y materias. colorantes, con un peculiar aroma a violetas y cassis, y con una gran capacidad de envejecimiento. CABERNET SAUVIGNON Es una variedad tinta de procedencia francesa y reina de la viticultura internacional, también conocida como Burdeos tinto, Carbouet, Petit Cabernet, Petit Vidure y Vidure. Tiene un excelente comportamiento agronómico y enológico, es muy selecta y con plena adaptación a la climatología de la región castellanomanchega. Las uvas son pequeñas, esféricas, de piel espesa y dura y su pulpa es firme y crujiente (Figura 9). No ofrece elevados rendimientos y se caracteriza por producir zumos de color intenso y estable, con abundancia de taninos y viva acidez, que proporcionan vinos duros en Figura 9. Variedad de uva Cabernet Sauvignon. su. juventud. con. gran. potencial. de. envejecimiento. Ofrece un magnífico maridaje. en el “coupage” con otras variedades tintas. CABERNET FRANC Esta variedad, también conocida como Bordo, Bouchet, Bouchy, Bretón, Capbretón, Plant Bretón y Verón, procede de Burdeos, al igual que la anterior pero. 10.

(23) Introducción general. sus vinos son algo más suaves, ya que es más pobre en taninos. Es de maduración temprana, con cepas vigorosas y de porte erguido. Se trata de una planta habituada a los climas frescos y a suelos húmedos, siendo sensible al mildiu, al oidio y a los ácaros. Su racimo es de tamaño medianopequeño,. compacto. y. alargado,. proporcionando uvas de color azul negruzco, esféricas, de piel fina y pulpa moderadamente astringente (Figura 10). Proporciona vinos muy aromáticos con poco cuerpo, que resultan ligeros y agradables. A pesar de ello, su capacidad de envejecimiento es elevada y. Figura 10. Variedad de uva Cabernet Franc. muchas veces se utiliza en coupage junto a la Cabernet Sauvignon.. 2. LA VINIFICACIÓN La vinificación se define como el conjunto de operaciones y prácticas que se llevan a cabo para transformar la uva en vino, respetando al máximo las cualidades intrínsecas de la misma, para obtener así el mejor resultado posible (Suárez-Lepe e Íñigo, 1990). En el complejo proceso bioquímico de fermentación del mosto para su transformación en vino, intervienen e interaccionan diversos microorganismos, fundamentalmente levaduras y bacterias, pudiendo producirse de forma espontánea o natural o de forma dirigida o intencionada, mediante la adición de microorganismos seleccionados por su idoneidad para llevar a cabo este proceso. El origen de los microorganismos presentes de forma espontánea en el proceso es muy variado. Cuando el mosto recién extraído es colocado en las cubas, ya contiene una gran variedad de microorganismos (mohos, levaduras y bacterias), provenientes tanto de la uva como de los materiales utilizados en las bodegas, que pueden iniciar el proceso, si bien de forma progresiva, y como consecuencia de los cambios ocurridos en las condiciones del medio y de las interacciones específicas entre ellos, se produce una selección natural de los mismos (Ribéreau-Gayon et al.,. 11.

(24) Introducción general. 2003). Son numerosos los estudios realizados para conocer la dinámica de las poblaciones de microorganismos durante la fermentación espontánea de los mostos (Lafon-Lafourcade et al., 1983b; Fleet et al., 1984; Querol et al., 1994; Egli et al., 1998). En el proceso de elaboración del vino, y en lo que al proceso microbiológico se refiere, se distinguen dos etapas principales: la fermentación alcohólica (FA), que habitualmente sucede en primer lugar, y la fermentación maloláctica (FML) (Figura 11). Fermentación alcohólica. Fermentación maloláctica. 9 8 BACTERIAS LÁCTICAS. Log (CFU/mL). 7 6 5 4 3. LEVADURAS. 2 1 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. Tiempo (días). Figura 11. Evolución de la población de bacterias lácticas durante la vinificación.. 2.1.. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA La FA es la etapa en la que, básicamente, se produce la transformación de. los azúcares del mosto, principalmente glucosa y fructosa, en etanol, produciéndose además calor y dióxido de carbono [Reacción 1].. [Reacción 1]. Este proceso es realizado por levaduras y, aunque no todas se comportan de igual forma, puede establecerse que cada diecisiete gramos de azúcar se produce un grado alcohólico.. 12.

(25) Introducción general. La FA en su conjunto es un proceso mucho más complejo que el mostrado en la Reacción 1, en la que tienen lugar muchos otros procesos bioquímicos, químicos y fisicoquímicos, que hacen posible la transformación del mosto en vino. Así, además del etanol, se producen diferentes productos metabólicos que hacen variar la composición química y la calidad sensorial de los vinos. En las primeras etapas de la FA coexisten bacterias y levaduras si bien el antagonismo entre ellas, producido por los efectos tóxicos de los metabolitos segregados por las levaduras, como el etanol y determinados ácidos grasos (hexanoico, octanoico, decanoico y dodecanoico), hace que habitualmente acabe imponiéndose el desarrollo de estas, dada su mejor adaptación al pH bajo y a la alta concentración de azúcares del mosto (Lonvaud-Funel et al., 1988; Alexandre et al., 2004). Las levaduras responsables de la fermentación alcohólica tienen su origen en el hollejo de la uva, en la maquinaria de la bodega y en la adición de cultivos iniciadores, aunque también se ha descrito que el aire es una posible fuente de levaduras vínicas (Garijo et al., 2008). Durante este proceso, se suceden diferentes especies y cepas de levaduras (Ribéreau-Gayon et al., 1975; Lafon-Lafourcade, 1983). Esta biodiversidad depende de factores tales como la variedad de uva, su estado de maduración, los tratamientos anti-fúngicos, las condiciones climáticas, las prácticas de cultivo, así como el contacto entre las uvas y el mosto durante la recogida de la uva, el transporte y, en particular, las operaciones llevadas a cabo en la bodega (Mortimer y Polsinelli, 1999; Pretorius et al., 1999). En los primeros días de fermentación, los géneros mayoritarios son Hanseniaspora/Kloeckera, Candida y, en menor medida, Hansenula, Pichia, Rhodotorula y Metschnikowia (Querol et al., 1990; Fleet y Heard, 1993). Seguidamente, estos géneros reducen su población y dan paso a otros más tolerantes al etanol como el género Saccharomyces. De hecho, Saccharomyces cerevisiae es considerada la principal especie responsable de la FA del vino (Ribéreau-Gayon, 1985). Diversos estudios (Fleet et al., 1984; Heard y Fleet, 1986) han mostrado que algunas especies no-Saccharomyces, como Kloeckera apiculata, Candida stellata y. 13.

(26) Introducción general. Candida colliculosa, también contribuyen de forma importante a la fermentación, pudiendo. alcanzar. poblaciones. de. 106-107. ufc/ml.. El. crecimiento. cuantitativamente significativo de estas levaduras tiene una gran importancia ya que influye en las características organolépticas del vino y, además, repercute en la cinética de la fermentación y en el comportamiento bioquímico de las Saccharomyces, al producir modificaciones en la composición del mosto. Otras levaduras, como Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces y Brettanomyces/Dekkera pueden también estar presentes durante la FA, influyendo de forma negativa en las características organolépticas de los vinos (Peynaud y Domercq, 1959; Ribéreau-Gayon et al., 2000b), al producir metabolitos secundarios tales como el ácido acético, el acetaldehído, la acetoína, el acetato de etilo, y los vinil y etil fenoles, estos últimos principalmente asociados al desarrollo de Brettanomyces/Dekkera (Chatonnet et al., 1995). No obstante, se ha descrito que la producción de estos compuestos es dependiente de cepa (Lambretchs y Pretorius, 2000). En definitiva, puede afirmarse que la FA es un proceso microbiológico dinámico en el que hay una sucesión de géneros, especies y cepas de levaduras, pero sólo las mejor adaptadas resisten hasta el final del mismo. La disminución de la concentración de azúcares y el aumento del contenido en etanol que ocurren en el medio a medida que avanza la FA, hacen difícil la supervivencia de algunas de ellas, produciéndose su lisis y la consiguiente liberación de sustancias (vitaminas, bases nitrogenadas, péptidos y aminoácidos, etc.) que podrán ser utilizadas como nutrientes por las bacterias allí presentes, lo que estimulará su crecimiento, iniciándose entonces la fermentación maloláctica. 2.2.. FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA La FML es una etapa esencial para la obtención de vinos tintos de calidad,. en especial aquellos que se destinan a crianza en barrica y sufren un posterior envejecimiento en botella. En esta etapa, las bacterias lácticas (BL) transforman el ácido málico en ácido láctico y CO2. Pero el papel de la FML en los vinos es más que la simple desacidificación, ya que el potencial metabólico de las BL participantes es diverso y complejo, produciéndose importantes cambios en las características y en. 14.

(27) Introducción general. la calidad del vino como consecuencia de los procesos bioquímicos que ocurren en la misma, cambios que dependen tanto de las BL participantes como del tipo de vino (Davis et al., 1985; Kunkee, 1991). En la estequiometría de la reacción global de transformación [Reacción 2] 1 g de ácido málico produce 0,67 g de ácido láctico y alrededor de 167 cm3 de CO2.. [Reacción 2]. La reacción así formulada se presenta como una simple descarboxilación del ácido málico, pero el mecanismo de transformación de dicha molécula no es tan simple, habiéndose descrito tres posibles vías según se forme o no un producto intermedio que es el ácido oxalacético. Para Charpentie (1954), el mecanismo más probable es el que muestra la Reacción 3, en el que sucede una primera deshidrogenación, que lleva a la formación de ácido oxalacético, una posterior descarboxilación, que lleva a la formación de ácido pirúvico, y finalmente una reducción de éste hasta ácido láctico, reacción en la que se utiliza el hidrógeno liberado en la primera deshidrogenación y en la que interviene una deshidrogenasa láctica.. [Reacción 3]. Pero la transformación puede también ocurrir por una segunda vía en la que participa la denominada enzima maloláctica (EML). La reacción se lleva a cabo. 15.

(28) Introducción general. en presencia de NAD e iones Mn2+ y en ella tiene lugar un proceso redox, en el que en una etapa intermedia se forma ácido pirúvico (Reacción 4).. [Reacción 4]. La enzima maloláctica participante en esta reacción está muy extendida en la naturaleza y ha sido localizada en vísceras de animales, tejidos de plantas superiores y en diversas bacterias como Escherichia coli y algunas BL. La presencia de la enzima maloláctica fue puesta de manifiesto por vez primera por Radler et al. (1970) en Lactobacillus (L.) plantarum y posteriormente Spettoli et al. (1984) la aislaron en Oenococcus (O.) oeni, demostrando que en esta especie tenía un carácter constitutivo, a diferencia de lo que sucedía en L. plantarum, en la que es inducible. Más tarde, se ha comprobado que esta es constitutiva en el 60% de las BL heterofermentadoras. En la tercera vía posible actúa una enzima maloláctica que transforma directamente el ácido L (-) málico en ácido L (+) láctico (Reacción 5). En este proceso el transporte del L-malato al interior celular limita la tasa de conversión de la enzima, pudiendo actuar como inhibidores competitivos algunos ácidos como el tartárico, el succínico e incluso el láctico.. [Reacción 5]. Los tres mecanismos son igualmente probables en el vino, ya que las BL allí presentes poseen todas las enzimas necesarias para llevarlos a cabo. Sin embargo,. 16.

(29) Introducción general. de las tres posibles vías, esta última es, para algunos investigadores (LafonLafourcade, 1983), la predominante en el vino. Independientemente de cual sea la vía utilizada para la transformación del ácido málico, lo que es cierto es que durante la FML se produce 1) un importante incremento de la población de BL, alcanzándose valores entre 106 y 108 ufc/ml, 2) una disminución de la acidez del vino, que se refleja en un incremento del pH de entre 0,1 y 0,3 unidades, y 3) una abundante liberación de gas.. 2.2.1. Microbiología del proceso Generalmente, tras la FA tiene lugar un crecimiento vigoroso exponencial de las bacterias lácticas y acéticas supervivientes de la etapa anterior, hasta alcanzar una población de 107-108 ufc/ml, iniciándose entonces la FML (LonvaudFunel, 1999; Ribéreau-Gayon et al., 2003). Tras este crecimiento exponencial, la población alcanza una fase estacionaria que puede ser más o menos larga y que continuará con una fase de declive, en la que se observa una caída de la población. El sulfitado que se realiza habitualmente en este momento hace caer, casi en su totalidad, la población de bacterias (≤1-10 ufc/ml) que, de otra forma, podrían metabolizar diversos compuestos, como por ejemplo el ácido cítrico, produciendo un efecto perjudicial desde el punto de vista organoléptico (Beneduce et al., 2004). Existe una clara diferencia entre ambas poblaciones de bacterias, ya que la presencia de las bacterias acéticas va a producir un efecto negativo al alterar las características organolépticas del vino por la producción de ácido acético, acetaldehído y acetato de etilo (Du Toit y Pretorius, 2002) pudiendo provocar, en algunos casos, un enlentecimiento de la FML. Por el contrario, las BL son los verdaderos artífices de la FML, contribuyendo positivamente a la calidad de los vinos. La procedencia de estas bacterias es variable, pudiendo tener su origen en la uva, la maquinaria, las instalaciones de la bodega e incluso el aire (Garijo et al., 2008) o, por el contrario, pueden tener un origen exógeno, si son añadidas al vino de forma intencionada como cultivo iniciador. Tradicionalmente la FML se ha dejado en manos de las BL procedentes de la microbiota indígena, y aún hoy se procede de esta forma en muchas bodegas. Las BL que con mayor frecuencia se aíslan en estas FML espontáneas pertenecen a los. 17.

(30) Introducción general. géneros Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc, siendo O. oeni la especie más abundante (Lafon-Lafourcade et al., 1983b; Wibowo et al., 1985; Van Vuuren y Dicks, 1993).. 2.2.2. Factores que influyen en el desarrollo de la fermentación maloláctica Existen varios factores que pueden afectar al crecimiento de las BL en el vino y/o a su metabolismo y, por consiguiente, al desarrollo de la FML. Entre estos destacan: Presencia y disponibilidad de nutrientes La presencia y disponibilidad de nutrientes es crucial para que las BL lleven a cabo con éxito la FML. Como ya se ha indicado en esta introducción, las BL han sido descritas como microorganismos “fastidiosos” en lo que a los requerimientos nutricionales se refiere, ya que presentan capacidades biosintéticas limitadas (Fugelsang y Edwards, 1997; Matthews et al., 2004; Théodore et al., 2005; Terrade et al., 2009). Así por ejemplo, la presencia de aminoácidos en el medio es esencial para su supervivencia ya que no son capaces de sintetizarlos. No obstante, se ha descrito que estas poseen sistemas de liberación de aminoácidos, vía hidrólisis de proteínas, bien desarrollados. Otros compuestos que también son esenciales para su crecimiento son aquellos utilizables como fuente de carbono, los fosfatos y el manganeso (Terrade y Mira de Orduña, 2009). La autolisis de las levaduras que ocurre al final de la fermentación alcohólica pone a disposición de estas bacterias muchos de los nutrientes necesarios para su crecimiento, por lo que no es frecuente que ocurran problemas por este motivo. Factores físico-químicos Son factores a tener en consideración ya que podrían inhibir el crecimiento de las BL y paralizar la fermentación. Entre los más importantes están el pH, la temperatura y el contenido en etanol y SO2. El pH es uno de los factores fundamentales para la estabilidad biológica, llegando a ser selectivo para las especies que conforman la microbiota del vino (Wibowo et al., 1985; Suárez-Lepe e Íñigo, 2004). También determina la tasa de 18.

(31) Introducción general. crecimiento, la actividad maloláctica y la naturaleza de los sustratos transformados. Cada especie de BL presenta un pH mínimo de crecimiento por encima del cual puede crecer, y se puede afirmar que ninguna BL lo hace a pH<3. Por ello, los vinos extremadamente ácidos (pH<3,3), requieren de la adición de agentes desacidificantes, como el carbonato cálcico, para favorecer el inicio de la FML y, por el contrario, aquellos con un pH relativamente elevado, que presentan una microbiota no solamente más abundante sino también más variada, tienen el riesgo de sufrir importantes alteraciones. Los valores de pH comprendidos en el intervalo de 3,5 a 3,7 son considerados óptimos para la correcta evolución de la FML (Liu y Gallander, 1983). Es importante indicar que el pH puede influir en el estado de ionización de algunos componentes del vino que, en forma protonada, van a aumentar su poder bactericida, pudiendo frenar el crecimiento de las BL y el correcto desarrollo de la FML (Flanzy, 2000). La temperatura es también un parámetro importante a la hora de llevar a cabo la FML, no sólo por su influencia en la velocidad de crecimiento de las bacterias y en la duración del periodo de latencia (Bauer y Dicks, 2004), sino también porque acentúa el efecto tóxico del SO2 y del etanol. La temperatura óptima para que tenga lugar la FML sería aquella de la cepa o cepas participantes en el proceso, pero en la práctica, suele utilizarse una temperatura en torno a los 25ºC (Henick-Kling, 1993). Temperaturas inferiores a 15ºC o superiores a 30ºC hacen que la FML se ralentice, alargando el proceso. El etanol inhibe el crecimiento de las bacterias entre otras razones por su interacción con los lípidos de la membrana, siendo muy tóxico para todos los microorganismos. Por sí solo, puede ejercer un efecto estimulante o inhibidor del crecimiento según la concentración y así, concentraciones de etanol inferiores al 4% (v/v) favorecen el crecimiento mientras que éste se ve fuertemente inhibido cuando se alcanzan valores de etanol entre el 13 y el 14% (v/v) (Boulton et al., 1996; Flanzy, 1998; Suárez-Lepe e Íñigo, 2004). No obstante, este efecto parece tener carácter inter e intraespecífico ya que algunos autores (Kalmar, 1995) han descrito la presencia de cepas de L. fructivorans, L. brevis y L. hilgardii en vinos con. 19.

(32) Introducción general. un contenido en etanol entre el 16 y el 20 % (v/v). En definitiva, el efecto del etanol es variable dependiendo de la cepa, de la temperatura, del pH y de la composición química del vino (Bauer y Dicks, 2004), pero cuando varios de estos factores (pH ácido, SO2 y elevado grado alcohólico) coexisten, el crecimiento bacteriano se ve fuertemente inhibido y la FML se retrasa (Lonvaud- Funel, 1995). El dióxido de azufre (SO2) es un importante agente antimicrobiano y un eficaz instrumento para inhibir el desarrollo de las BL ya que, en su forma libre y al pH intracelular, reacciona con diversos constituyentes celulares provocando la inhibición del crecimiento e incluso la muerte bacteriana (Carrete et al., 2002). En el vino se encuentra tanto en forma libre como en forma combinada, encontrándose ambas formas en equilibrio. Los microorganismos presentan distinta sensibilidad a este antiséptico y se ha visto que las BL son mucho más sensibles que las levaduras y que entre las bacterias, la especie O. oeni es más sensible que las especies de los géneros Pediococcus y Lactobacillus (Davis et al., 1986b; Du Toit et al., 2005; Rojo-Bezares et al., 2007). Normalmente, concentraciones superiores a 10 mg/l de SO2 libre son suficientes para impedir el desarrollo de las BL en el vino. El SO2 combinado, formado al reaccionar el SO2 libre con diversos compuestos orgánicos que tienen funciones aldehído o cetona (compuestos carbonílicos), ejerce también un efecto inhibidor del crecimiento, aunque éste es entre 5 y 10 veces menos activo que el SO2 libre (Lafon-Lafourcade y Peynaud, 1974). Las BL son capaces de metabolizar la fracción aldehído de la forma combinada, produciéndose la forma libre. Otros compuestos presentes en el vino que puede ejercer un efecto inhibidor del crecimiento de las BL son los polifenoles procedentes de la uva y los ácidos grasos generados por las levaduras, especialmente el decanoico. No obstante, su acción es mucho menos importante que la del SO2 porque las concentraciones necesarias para ejercer un efecto inhibidor, 500 mg/l y 30 mg/l respectivamente, son superiores a las habitualmente encontradas en el vino (Edwards y Beelman, 1987; Stead, 1993; Vivas et al., 1997; Flanzy, 1998; Alberto et. 20.

(33) Introducción general. al., 2001). Interacciones entre microorganismos Pueden distinguirse 3 tipos de interacciones: 1. Interacciones entre levaduras y BL: Las levaduras ejercen fundamentalmente un efecto inhibidor del crecimiento de las BL ya que compiten por los nutrientes básicos del mosto (azúcares y moléculas nitrogenadas), y producen metabolitos que poseen un efecto tóxico sobre las BL (SO2, CO2, etanol, ácidos grasos de cadena media, ácidos orgánicos, etc.). Sin embargo, según avanza la FA, las levaduras también pueden ejercer un efecto activador del crecimiento de las BL al ser capaces de eliminar residuos de pesticidas que pudieran estar en el mosto, o de reducir la concentración de ácidos grasos por procesos de adsorción en las paredes celulares de las células muertas. Asimismo, las levaduras muertas, las denominadas lías del vino, son una fuente de nutrientes, básicamente moléculas nitrogenadas y vitaminas, para las BL (Alexandre et al., 2004). 2. Interacciones entre BL: Las BL pueden sintetizar y liberar al medio sustancias con actividad antimicrobiana como el peróxido de hidrógeno, los ácidos orgánicos o el acetaldehído. Además, algunas son capaces de producir sustancias de naturaleza peptídica denominadas bacteriocinas (Navarro et al., 2000; Bauer et al., 2003; Calvo de la Banda et al., 2003; Rojo-Bezares et al., 2007) a las que son inmunes y que tienen poder antimicrobiano frente a otras bacterias en ocasiones, filogenéticamente emparentadas, que compiten por el mismo medio. La producción de bacteriocinas supone por tanto, un método para eliminar competidores y de conquista del medio frente a otros microorganismos. 3. Interacciones con otros microorganismos como las bacterias acéticas, los hongos y los bacteriófagos cuya presencia puede dificultar el crecimiento de las BL e incluso provocar su muerte. Según Sozzi et al. (1976, 1982) el ataque fágico puede destruir la población total de O. oeni y provocar la parada de la FML, mientras que otros autores no encuentran relación entre la presencia de fagos y los incidentes en la FML ya que estos virus se inactivan por el bajo pH y la presencia de SO2 (Davis et al., 1985).. 21.

(34) Introducción general. Factores tecnológicos Los procedimientos de vinificación también influyen en el desarrollo de la FML. Así por ejemplo, en la elaboración por maceración carbónica, el metabolismo anaerobio que se produce en las uvas enteras genera un medio muy enriquecido en nutrientes, lo que unido a las bajas concentraciones de SO2 utilizadas, hacen que se vea favorecido el crecimiento de las BL y, por consiguiente, la FML. Otro factor tecnológico influyente son los descubes precoces que eliminan la microbiota que, como las BL, se sitúa en la superficie del vino, empobreciendo éste tanto en microorganismos como en vitaminas y sustancias nitrogenadas que proceden de la autolisis de las levaduras. Por el contrario, maceraciones prolongadas crean un entorno favorable para las BL (Delteil, 2004). La aireación es otro factor a tener en cuenta, ya que en general favorece el desarrollo bacteriano (Ribéreau-Gayon et al., 2003) y unido a una ligera presión de CO2 activa el crecimiento de las BL. Por último, es importante la agitación de las lías que se depositan en el fondo de los tanques para asegurar que las bacterias y los nutrientes queden en suspensión (Delteil, 2005).. 2.2.3. Efectos de la fermentación maloláctica en el vino Los efectos que la FML produce en los vinos son, en su mayoría, beneficiosos si bien también pueden suceder procesos y reacciones de efectos indeseables. A continuación se describen algunos de los efectos más importantes.. 2.2.3.1. Efectos beneficiosos Disminución de la acidez La disminución de la acidez ocurre como consecuencia de la desaparición total o parcial del ácido málico, lo que ocasiona un cambio en las sensaciones gustativas que pasan de ásperas y astringentes a suaves y de gusto más vinoso (Peynaud, 1993; Liu, 2002). Se admite que la fermentación de 1 g/l de ácido málico disminuye la acidez total en 0,4 g/l en H2SO4 ó 0,6 g/l en ácido tartárico.. 22.

(35) Introducción general. Mejora del perfil organoléptico La FML provoca cambios en el perfil aromático del vino debido principalmente al aumento de la concentración de algunos alcoholes superiores (isobutanol, 1-propanol, 1-butanol, alcohol isoamílico, etc.), ésteres (lactato de etilo, caproato de etilo, acetato isoamílico, etc.), ácidos (ácido acético, ácidos grasos, etc.) y otros compuestos como el diacetilo o el 2,3-butanodiol. Como consecuencia se produce una reducción de los aromas herbáceos y la mejora de las propiedades sensoriales y de la calidad de los vinos (Lonvaud-Funel, 1999; Ugliano et al., 2003; Pripis-Nicolau et al., 2004). Algunos estudios sensoriales demuestran que los compuestos aromáticos producidos por las BL confieren propiedades “reconocibles” a las características aromáticas del vino (Laurent et al., 1994). También se ha observado que, por lo general, los vinos producidos con BL seleccionadas tienen mejor calidad que aquellos que realizan una FML espontánea, por lo que el uso de cultivos iniciadores es cada vez más frecuente. La FML también produce un aumento de la redondez en boca y una suavización de la astringencia. Este efecto beneficioso en la calidad gustativa de los vinos se debe a los polisacáridos producidos por las BL y a la presencia de otras moléculas como las manoproteínas procedentes de la autolisis de las levaduras, cuyo estudio es actualmente un importante campo de investigación (Cavin et al., 2000; Hidalgo, 2003; Dols-Lafargue et al., 2007). La formación de lactato de etilo durante la FML, también contribuye a la mejora de la sensación de volumen en boca del vino. Estabilidad microbiológica Los vinos que experimentan la FML son, en sentido microbiológico, más estables que aquellos que no la realizan. Esta estabilidad es consecuencia del empobrecimiento en nutrientes y factores de crecimiento, y de la mayor presencia en el medio de inhibidores microbianos como las bacteriocinas y los ácidos orgánicos (Leisner et al., 1996; Stiles y Holzapfel, 1997), que transmiten al vino cierta inmunidad frente a alteraciones producidas por otros microorganismos (Lonvaud-Funel, 1995).. 23.

(36) Introducción general. Mejora de la estabilidad del color En el transcurso de la FML ocurren reacciones de condensación taninosantocianos, que producen una modificación y estabilización del color, contribuyendo asimismo a la disminución de la astringencia (Vivas et al., 1997). Además, se produce una mejora en algunos aspectos relacionados con la composición fenólica de los vinos (Suárez-Lepe e Íñigo, 2004; Costello, 2005), entre ellos el incremento en los compuestos fenólicos libres como los ácidos hidroxicinámicos y sus derivados, compuestos antioxidantes que pueden actuar como copigmentos de los antocianos y que ayudan a estabilizar o aumentar el color del vino tinto (Hernández et al., 2006, 2007; Cabrita et al., 2008).. 2.2.3.2. Efectos perjudiciales Aumento de la acidez volátil El aumento de la acidez volátil se debe fundamentalmente a la degradación del ácido cítrico que se produce en la etapa final de la FML, cuando el ácido málico ha desaparecido casi por completo (Ribéreau-Gayon et al., 2003) y, en menor medida, a la degradación de los azúcares residuales por parte de las BL que produce una alteración conocida como picado láctico caracterizada por un incremento significativo de la concentración de ácido láctico y, en algunos casos, de ácido acético. Pérdida de la intensidad del color En los vinos tintos, esta pérdida del color es producida por la decoloración de las antocianinas, que a su vez es producida por el aumento del pH, por la hidrólisis del enlace glicosídico de los antocianos glicosilados por la acción enzimática de las BL, y/o por procesos de precipitación y copigmentación (Lonvaud-Funel, 1999; Suárez-Lepe e Íñigo, 2004). Desacidificación excesiva de vinos poco ácidos Durante la FML se produce un aumento del pH que en los vinos poco ácidos suele ser incluso mayor que en los de mayor acidez, lo que da lugar a vinos “sin carácter” (Davis et al., 1985; Bartowsky et al., 2004). Esta desacidificación. 24.

(37) Introducción general. adicional puede tener un efecto colateral al permitir el crecimiento de especies microbianas que pueden resultar perjudiciales. Este problema se puede evitar manteniendo los niveles de SO2 libre por encima de 25 mg/l al acabar la FA, o almacenando los vinos a baja temperatura. Enfermedad del agridulce o vuelta manítica Se produce como consecuencia del ataque de las BL, fundamentalmente heterofermentativas, a los azúcares del vino, formándose cantidades importantes de manitol a partir de la fructosa, que dan un intenso sabor a fruta “pasada”. Estos problemas de degradación de azúcares son más probables cuanto más alto es el pH del vino y pueden ser controlados principalmente mediante el uso de cultivos iniciadores para inducir la FML (Bordons, 1997). Enfermedad del amargor Es debida a la degradación del glicerol y a la producción de ácido acético y acroleína, una sustancia que al combinarse con los polifenoles del vino da lugar a compuestos con un intenso sabor amargo. Esta enfermedad es común en vinos con un pH elevado y también en aquéllos que contienen una elevada carga microbiana, siendo el género Lactobacillus su principal responsable (Sauvageot et al., 2000). Enfermedad de la vuelta tartárica Se produce como consecuencia de la degradación del ácido tartárico que lleva a la formación de ácido acético, ácido láctico, CO2 y compuestos nada deseables como la tetrahidropiridina. Como resultado se producen vinos sin carácter y avinagrados, además de turbios. Las principales especies responsables son L. plantarum, L. brevis y Pediococcus (Henick-Kling, 1993), si bien se ha descrito que la capacidad para degradar este ácido es dependiente de la cepa (Radler y Yannissis, 1972; Pardo, 2003). Degradación de otros ácidos orgánicos: cítrico y sórbico El ácido cítrico puede ser degradado por las BL dando lugar a compuestos acetoínicos como el diacetilo. Este compuesto es beneficioso para el aroma en pequeñas concentraciones, si bien cuando su concentración supera los 8-9 mg/l, se. 25.

(38) Introducción general. van a originar aromas lácteos desagradables como el aroma a mantequilla (Martineau y Henick-Kling, 1995). Por otro lado, el ácido sórbico, que se añade en algunos vinos como antimicrobiano, puede ser reducido hasta sorbitol por algunas BL, lo que confiere un desagradable aroma a geranio. La presencia de sorbitol es además detectable a muy bajas concentraciones (0,1 µg/l), de ahí su importancia. La capacidad de O. oeni para llevar a cabo dicha reducción, así como la incapacidad de algunas cepas de Pediococcus y Lactobacillus, fue descrita por Edinger y Splittoesser (1986). Enfermedad del ahilado o de la grasa Se produce por la formación de exopolisacáridos por parte de ciertas especies de BL como P. damnosus, Ln. mesenteroides y L. brevis, productos que confieren un aspecto denso y viscoso a los vinos (Ribéreau-Gayon, 2000). Suele producirse en vinos con azúcares residuales, con pHs relativamente elevados y con alta graduación alcohólica y cuando las temperaturas son elevadas. Producción de compuestos tóxicos Entre los posibles compuestos tóxicos para el hombre atribuibles al metabolismo de las BL se encuentran las aminas biógenas y el carbamato de etilo (Lerm et al., 2010). Las aminas biógenas se producen por descarboxilación de los aminoácidos. Las principales aminas biógenas asociadas con el vino son la putrescina, la histamina, la tiramina y la cadaverina, seguidas de la feniletilamina y de la agmatina (Ten Brink et al., 1990; Lonvaud-Funel, 2001). El gran interés suscitado por estos compuestos, proviene del hecho de que algunas aminas biógenas pueden ser tóxicas incluso ingeridas en bajas concentraciones. De todas ellas, la más importante desde el punto de vista toxicológico es la histamina, ya que puede provocar síntomas patológicos serios como trastornos cardíacos (Coton et al., 1998; Landete et al., 2002). Por ello, es necesario controlar las concentraciones de aminas biógenas presentes en vino, teniendo en cuenta además que el efecto tóxico de algunas de ellas puede verse amplificado por la presencia de etanol, SO2 y de otras aminas (Fernandes y Ferreira, 2000; Volschenk et al., 2006). Los límites. 26.

(39) Introducción general. legales de aminas biógenas en vino son muy restrictivos, y su presencia en concentraciones que superen esos límites, supone además un grave problema para la exportación, con las consiguientes pérdidas económicas que eso conlleva. El carbamato de etilo es un compuesto considerado un potencial cancerígeno que se forma como consecuencia de la reacción química del etanol con algún precursor como la citrulina, la urea o el carbamil fosfato, producidos por las levaduras o las BL durante el catabolismo de la arginina (Ough y Amerine, 1988). Algunas cepas de O. oeni, L. buchneri y L. hilgardii han sido descritas como potenciales productoras de carbamato de etilo en el vino (Liu et al., 1994; Mira de Orduña et al., 2000, 2001; Uthurry et al., 2006; Romero et al., 2009).. 3. LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO 3.1. CARACTERÍSTICAS Y CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO Bajo la denominación de bacterias lácticas, se ha incluido tradicionalmente a un grupo de bacterias con una gran diversidad morfológica y fisiológica, cuya característica principal es la de ser capaces de producir ácido láctico como metabolito único o mayoritario de la fermentación de los hidratos de carbono (Sharpe, 1979). Kandler y Weiss en 1986 las definen como “bacterias Gram positivas, no esporuladas, catalasa negativo, inmóviles, de morfología cocoide o bacilar, con la característica principal de ser estrictamente fermentativas y producir como compuesto final de la fermentación ácido láctico como producto único o mayoritario. Son microaerófilas o anaerobias facultativas, incapaces de sintetizar citocromos, acidodúricas o acidófilas y no reducen los nitratos”. Poseen además una gran especificidad fisiológica y sus requerimientos nutricionales son complejos, motivo por el que en la naturaleza se encuentran asociadas a hábitats ricos en nutrientes, como algunos alimentos (vino, leche, carnes y vegetales) y algunas partes del cuerpo humano (boca, intestino, vagina, etc.), en los que son consideradas “inquilinos” habituales. Las BL pertenecen a dos fila distintos, el filum Firmicutes y el Actinobacteria (Liu et al., 2014). Dentro del filum Firmicutes, las BL pertenecen al orden Lactobacillales que incluye los siguientes géneros: Lactobacillus, Leuconostoc, 27.

(40) Introducción general. Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus,. Oenococcus,. Weissella,. Tetragenococcus,. Alloiococcus. y. Symbiobacterium, todos ellos con un bajo contenido de G+C (31-49%) (Horvath et al., 2009). Existe otro género de este filum, denominado Fructobacillus, que fue descrito por Endo y Okada (2008) en base a los estudios del gen ARNr 16S, la región del espacio intergénico ARNr 16S–23S (ITS) y las secuencias de los genes rpoC y recA, y que incluye algunas especies que hasta el momento pertenecían al género Leuconostoc. Las. BL. del. filum. Actinobacteria. incluyen. especies. del. género. Bifidobacterium y presentan un alto contenido de G+C (>50%). Respecto a este género conviene indicar que hay cierta controversia en si considerarlo o no perteneciente al grupo de las BL, pero dado que comparten muchas de las características propias de las BL, algunos autores sí las consideran miembros de dicho grupo (Stolaki et al., 2012). De todos los géneros mencionados, aquellos cuya presencia ha sido descrita en vinos son: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus (Wibowo et al., 1985; Ribéreau-Gayon et al., 2000a; Liu, 2002) (Figura 12).. Figura 12. Géneros de bacterias lácticas presentes en el vino.. 28.

(41) Introducción general. Merece la pena destacar que también ha sido descrita la presencia en muestras de mosto y vino de aislados pertenecientes al género Enterococcus, en concreto a la especie Enterococcus faecium (Marcobal et al., 2004; Coton et al., 2010; Capozzi et al., 2011), lo que ha despertado un gran interés por tratarse de una especie potencialmente productora de aminas biógenas, además de ser portadora de genes de virulencia y de resistencia a antibióticos. Los enterococos son considerados microorganismos ubicuos encontrándose en una gran variedad de hábitats como el suelo, las plantas, el agua, el tracto gastrointestinal de humanos y animales y también los alimentos, lo que es debido a su persistencia y resistencia a factores inhibidores del crecimiento como la acidez, las altas concentraciones de sal, la desecación, el calor y los agentes químicos desinfectantes (Holzapfel et al., 2002). Su presencia y función en los alimentos es también motivo de controversia y mientras algunos autores afirman que juegan un papel beneficioso en la producción de algunos alimentos fermentados tradicionales como los quesos, las salchichas y las aceitunas (de Castro et al., 2002; Foulquié-Moreno et al., 2006; Franz et al., 2003), y por ello recomiendan su utilización como cultivos iniciadores e incluso como probióticos, otros asocian su presencia con el deterioro de los alimentos, especialmente carnes (Giraffa, 2002), y con enfermedades como las infecciones nosocomiales (Franz et al., 2003). Por otro lado, se ha descrito que algunas cepas de este género son portadoras de genes de virulencia y de resistencia a antibióticos, siendo responsables de su diseminación a través de la cadena alimentaria (Kojima et al., 2010). Si a esto unimos la capacidad de producir aminas biógenas, compuestos considerados una amenaza para la salud si se ingieren en ciertas cantidades con los alimentos, es por lo que son considerados microorganismos potencialmente peligrosos. No obstante, se ha demostrado que muchas de estas características tienen un carácter intraespecífico, es decir, dependiente de la cepa. Entre los géneros de BL, existen notables diferencias, más allá de la diferente morfología celular, que son importantes en su clasificación, como es su carácter homo o heterofermentador. Las bacterias homofermentadoras producen casi exclusivamente ácido láctico a partir de la glucosa por la vía glicolítica de Embden-Meyerhof, mientras que las heterofermentadoras, al carecer de las 29.

(42) Introducción general. enzimas aldolasa y triosafosfato-deshidrogenasa, metabolizan la glucosa siguiendo la vía de Warburg-Dickens, originando dióxido de carbono, etanol y ácido acético además de ácido láctico (Suárez-Lepe e Íñigo, 1988; Ribéreau-Gayon et al., 2000a; Suárez-Lepe e Íñigo, 2004). De los géneros presentes en vino, Pediococcus y Enterococcus son homofermentadores, mientras que los géneros Leuconostoc y Oenococcus son heterofermentadores. Las especies del género Lactobacillus pueden presentar los dos comportamientos y atendiendo a esta característica se dividen en tres grupos (Ribéreau-Gayon et al., 2000a): homofermentadoras estrictas (Grupo I), heterofermentadoras facultativas (Grupo II) y heterofermentadoras estrictas (Grupo III). El carácter homo o heterofermentador influirá notablemente en la actividad enológica. Hasta el momento no se han identificado especies homofermentadoras estrictas del grupo I en vino. En la Tabla 1 se resumen las principales características de los cinco géneros de BL encontrados con mayor frecuencia en el vino. Tabla 1. Características de los géneros de BL encontrados en el vino (Dicks, 1995; Schleifer et al., 1995; Stiles y Holzapfel, 1997; Ribéreau-Gayon et al., 2003; Díaz et al., 2010).. 30.

(43) Introducción general. En lo que a especies de BL se refiere se ha descrito una sucesión de las mismas durante la vinificación. Así, en el mosto y en los primeros momentos de la FA frecuentemente se encuentran Ln. mesenteroides y L. plantarum y, en menor proporción, L. bobalius, L. casei, L. brevis, L. hilgardii, L. confusus, L. uvarum y Ln. paramesenteroides (Chalfan et al., 1977; Lafon-Lafourcade et al., 1983b; Rodas et al., 2003, 2005; Mañes-Lázaro et al., 2008a, 2008b). A medida que la fermentación avanza, estas especies dejan paso a otras tales como L. brevis, L. hilgardii, L. fructivorans, L. fermentum y a cocos, tales como P. parvulus, P. damnosus, P. pentosaceus y O. oeni (Pan et al., 1982; Davis et al., 1986a, Pardo y Zúñiga, 1992). La especie aislada con mayor frecuencia en los vinos acabados es O. oeni, que es considerada la principal responsable de la FML, aunque en algunos casos se ha descrito la presencia de algunas cepas de L. plantarum y de Pediococcus (Chalfan et al, 1977; Pan et al., 1982; Costello et al., 1983; Davis et al., 1986a, 1986b). La Tabla 2 resume las principales especies cuya presencia ha sido descrita durante la vinificación.. 31.

(44) Introducción general. Tabla 2. Principales especies de bacterias lácticas asociadas con la uva, el mosto y el vino (Adaptado de Du Toit et al., 2011).. 3.2. CULTIVO DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO El aislamiento de las BL a partir de muestras de vino puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos microbiológicos habituales, que Wibowo et al. (1985) resumen en los siguientes:. 32.

(45) Introducción general. Enriquecimiento en medios de cultivo líquidos previo a la siembra en medio sólido, técnica que sólo se usa con carácter cualitativo. Siembra directa sobre medios de cultivo sólidos, método que, a diferencia del anterior, sí permite conocer el número de BL en el vino. Si el número esperable de células vivas es menor de 10 ufc/ml, será necesario concentrarlas por centrifugación, para aumentar así el límite de detección. Filtración del vino a través de filtros de membrana que luego se incuban sobre medios de cultivo sólidos. Esta técnica se usa cuando el número de células vivas es muy bajo. Con respecto a los medios de cultivo utilizables es posible afirmar que no hay un único medio recomendable para el crecimiento de todas las especies de BL posibles en el vino. Los medios de cultivo utilizados son diversos, existiendo medios generales que permiten el crecimiento de prácticamente “todas” las BL, y otros más específicos para los diferentes géneros. Entre los generales, uno de los más utilizados es el medio de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (De Man et al., 1960), un medio muy nutritivo, y disponible comercialmente, al que se le suele añadir cicloheximida y azida sódica para inhibir el crecimiento de levaduras y bacterias acéticas, respectivamente. Algunas modificaciones de este medio incorporan zumo de tomate, cisteína, zumo de uvas y ácido málico además de distintos azúcares. Otro de los medios es el agar zumo de tomate, un medio muy rico que incorpora zumo de tomate que contiene compuestos que estimulan el crecimiento de las BL del vino. La combinación del medio MRS con zumo de tomate junto con la incubación en atmósfera enriquecida con CO2 a una temperatura de entre 28ºC y 37ºC es quizás una de las mejores alternativas para el cultivo de estas BL (Wibowo et al., 1985). Entre los medios específicos, se puede destacar el medio MLO (Medio de Leuconostoc oenos) al que también se le añade zumo de tomate, utilizado para el crecimiento y mantenimiento de O. oeni, y el medio m-Enterococcus utilizado para el cultivo de especies del género Enterococcus. Para especies del género Pediococcus suele utilizarse el medio MRS y para las de los géneros Lactobacillus y. 33.

(46) Introducción general. Leuconostoc, además del MRS, se utilizan el agar Rogosa y el agar MSE (agar Mayeux, Sandine y Elliker), respectivamente. 3.3. IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO Los métodos clásicos de identificación microbiana se basan en el estudio de características fenotípicas, tales como la morfología celular y colonial, las propiedades fisiológicas, bioquímicas e inmunológicas y/o en el estudio de la composición de ciertos constituyentes celulares. Estas pruebas aunque presentan algunos inconvenientes, como su escaso poder discriminante (Kandler y Weiss, 1986) o el que son muy laboriosas y en ocasiones económicamente costosas, son todavía utilizadas, aunque en ningún caso como único criterio de identificación. El espectacular avance de las técnicas moleculares ha hecho posible que la identificación microbiana sea hoy más precisa y fiable, tanto a nivel de género y especie como incluso entre cepas de una misma especie (Ribéreau-Gayon et al., 2000a). Estas técnicas han permitido la incorporación de nuevos criterios de clasificación basados en el análisis del genoma de los microorganismos. La identificación de las BL puede llevarse a cabo utilizando tanto métodos fenotípicos, que analizan características expresadas por las mismas como métodos físico-químicos, que estudian determinados componentes celulares (lípidos, azúcares o proteínas) y/o moleculares, que analizan su genoma. Además, con frecuencia, se combina más de uno de estos para alcanzar un mayor conocimiento de la bacteria en estudio. La Figura 13 muestra a modo de resumen las técnicas fenotípicas, físicoquímicas y moleculares potencialmente utilizables en estudios taxonómicos de bacterias, indicándose en cada caso el nivel de resolución.. 34.

(47) Introducción general. Figura 13. Nivel de resolución de las técnicas comúnmente utilizadas en el análisis taxonómico de bacterias (Vandamme et al., 1996). PFGE: Electroforesis de campo pulsado; PCR: Reacción en cadena de la polimerasa; AFLP: Fragmentos amplificados de tamaño polimórfico; AP-PCR: PCR con oligonucleótidos arbitrarios; rep-PCR: PCR de elementos repetitivos; DAF: Huellas dactilares por amplificación de ADN; RAPD: ADN polimórfico amplificado al azar; ARDRA: Análisis de restricción del ADN ribosómico amplificado por PCR.. A continuación se resumen aquéllas descritas en la bibliografía para la identificación y genotipado de BL del vino, describiéndose con más detalle aquellas utilizadas en esta Tesis Doctoral. Los métodos fenotípicos han sido ampliamente utilizados para la identificación de las BL del vino. Estos asignan los microorganismos a un taxón determinado por comparación de sus características (morfológicas, bioquímicas o fisiológicas) con las de los diferentes taxones de la clasificación. De entre estos. 35.

(48) Introducción general. destacan los sistemas comerciales miniaturizados como las tiras API (BioMérieux, Francia) y en especial las API 50 CH (Lafon-Lafourcade y Joyeux, 1979; Costello et al., 1983; Wibowo et al., 1985; Tracey y Britz, 1987; Davis et al., 1988; Dicks y Van Vuuren, 1988; Milliére et al., 1989; Ruiz et al., 2008; Izquierdo et al., 2009). Permiten una rápida determinación de la especie, si bien hay que tener precaución en la interpretación de los resultados ya que especies diferentes pueden presentar el mismo perfil fermentativo y pueden por tanto producirse identificaciones incorrectas (Ribéreau-Gayon et al., 2000a). Esto puede ocurrir por ejemplo con especies de crecimiento lento y difícil como es O. oeni que son muy poco reactivas cuando se utilizan estos sistemas y los perfiles fermentativos que muestran difieren de los obtenidos con sistemas no miniaturizados (Pardo et al., 1988; Jensen y Edwards, 1991), por lo que este método no es muy utilizado para aislados de este género. Otros ensayos fenotípicos que se han utilizado con frecuencia para la identificación de BL es el estudio de sus características fisiológicas. Así, algunos autores han realizado ensayos de tolerancia a diferentes concentraciones de etanol, pH y SO2 y ensayos de fermentación de diferentes carbohidratos para diferenciar cepas de O. oeni procedentes de vino (Tracey y Britz, 1987; Farrow et al., 1989; Granchi et al., 1990; Edwards et al., 1991; Guerzoni et al., 1995). Tracey y Britz (1987) aplicaron además métodos de taxonomía numérica para la identificación de las BL del vino, en los que se analizan un gran número de características fenotípicas y se generan grandes bases de datos, con ayuda de sistemas estadísticos, que permiten agrupar en “clusters”, también llamados unidades taxonómicas operacionales (OTU’s), a los microorganismos, de acuerdo con los caracteres fenotípicos o genotípicos que comparten. Algunos de los métodos físico-químicos que se han utilizado para la identificación de BL del vino, como O. oeni, son 1) el análisis del perfil de proteínas celulares totales, que puede considerarse como una “huella dactilar” (fingerprint) del microorganismo que está siendo analizado (Garvie, 1980; Dicks y Van Vuuren, 1990; Dicks, 1995; Du Plessis et al., 2004) 2) la determinación de las peptidoglucano-hidrolasas (Kandler, 1970), que son enzimas endógenas de la pared celular bacteriana muy bien conservadas a nivel de especie, pudiendo 36.