Volumen XVIII, N9 3-4
EFECTOS DE
LA
SACAROSA Y
LA SORBITA SOBRE
LA
COMPOSICION Y ACTIVIDAD DE PEROXIDASAS
EN LOS COLEOPTILOS
DE
TRIGO
1POR GLORIA M. DE LUCA d’ORO y CARLOS A. GUZMAN2
ABSTRACT
Peroxidaseactivity andmolecularcomposition variations werestudiedinwheat
coleoptyles which had been treated for twelve hours with different sorbitol and
sucrose concentrations. From 5X 101 M solutions on, changes occurred both in
theelectrophoreticpatterns,withbandsdecreasingin numberand inactivity, which
showed a marked reduction.
It is concluded that, these changes were caused by water potential modifica¬
tions and by sorbitol and sucrose molecular influence.
INTRODUCCION
El propósito de este trabajo fue analizar la manera queun azúcar yunazúcar alcohol exógenos,sacarosaysorbita, respectivamente, influ¬
yen en la composición y actividad de las peroxidasas en un órgano no fotosintetizante, cual es el coleóptilo de trigo.
La sacarosa constituye la
mayor
reserva de carbohidratos de lasplantas superiores y es el más importante dentro de los disacáridos no reductores. La sorbita, que estructuralmente deriva de la reducción de la fructosa,es el alcohol azucarado más comúnmente encontrado en
los vegetales y procede únicamente de las plantas. Los alcoholes de
los azúcaresson muysemejantes en sus solubilidades a los hidratos de carbono, perodesaparecenen ellos todas laspropiedades condicionadas por la presencia
del
grupo
carbonilo, por lo que su estabilidad es mayor y su química más sencilla. (Klages, 1968; Davies, 1969.)1Trabajo realizado en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba.
2 Miembro de la Carrera del Investigador, Consejo Nacional de Investiga¬
102 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979
Las peroxidasas son enzimas ferroporfirínicas que catalizan la
oxidación de una amplia variedad de compuestos para lo cual requie¬
ren un dador deoxígeno y un dador de hidrógeno,mostrando distintas
actividadescon diferentes dadores de hidrógeno. (Mann, 1931.) Las peroxidasas de las plantas están caracterizadas por una
gran
cantidad de formas moleculares (isoenzimas) separables, entre otros
métodos, por electroforesis. El estudio de las isoenzimas ha podido demostrar queexisten bandas comunes a todos los órganos de las plan¬
tas y bandas características, asignándolea estas últimas un papel fisio¬
lógico específico. (Wise y Morrinson, 1971.)
El importante papel que desempeñan las peroxidasas en los pro¬ cesos de oxidación de la$ plantas ha sido ampliamente investigado.
Estudios sobrela ontogenia han podido demostrar una profunda modi¬ ficación enlos modelos electroforéticos y en la actividad deperoxidasas
durante los procesos de diferenciación y desarrollo. (Verma y van Huystee, 1970; Evans y Alldridge, 1965; Shannon, 1968; Siegel y
Gals-ton, 1967; Alvarez, 1968; Conklin y Smith, 1971.) Las mismas varia¬ ciones se han podido comprobar con distintos regímenes hídricos.
(Stafford, 1974.)
MATERIAL Y METODOS
Se usaron cariopses de Triticum aestivum L. cultivar “Oncativo” que, previo lavado, fueron sometidos a imbibición durante 15 min.
La operaciónse realizó en recipientes de plástico sobre una rejilla del
mismo material ycon
agua
destilada. Las semillas germinaron en oscu¬ridad y a 22° C±2o C. Cuando los coleóptilos alcanzaron una longi¬
tud de3 cm fueron cortados y colocados de inmediato en agua desti¬ lada; luego fueron lavados dos veces con
agua
estéril y colocados enfrascos con distintas concentraciones de sorbita y sacarosa; 1X10‘4, 1X10"3,1X10'2, 1X
10"\
5 X101y 1M y utilizando como testigoagua destilada. Estas soluciones fueron previamente esterilizadas du¬
rante 30 min a 120°C. El material fue mantenido en la oscuridad durante 12 hs y posteriormente homogeneizado en un mortero en un baño de hielo con buffer de fosfato 0,067 M, pH 7 y arena lavada. El homogeneizado fue centrifugado a 3.000 X
g
durante 15 min. Conlos sobrenadantes se hicieron diluciones convenientes para la medición de proteínas y actividad enzimática. Para realizar la separación elec-troforética los extractos fueron sembrados sin diluir.
1. Actividad enzimática
Para la determinación de l;j actividad enzimática se midieron los cambios de D. O. durante 2 min a 485 nm en un espectrofotómetro
Beckman modelo DU-2;la mezcla de reacción fue: 2 mi demuestra, 1mi de buffer de fosfato 0,067 M, pH 7, 0,3mi de
agua
bidestilada,Cátodo
14
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4
3
2 2
1 1
f Anodo f
b d b d
a c e g a c e g
SORBITA SACAROSA
Fig. 1.
—
Modelo electroforético de peroxidasas de coleóptilos de trigo tratadoscon distintasconcentracionesde sorbita ysacarosa,a: testigo, b: 1 X104 M;
c: 1X10-3M; d: 1 X10'2M; e: 1X 10’1 M; f: 5'X10"1M; g: 1 M. El revelado de las diferentes formas moleculares se realizó utilizando peróxido de hidrógeno y bencidina como dadores de oxígeno e hidrógeno respectiva¬
mente. Los resultados son el promedio de seis determinaciones de corridas
no simultáneas.
0,1 mi de peróxido de hidrógeno 3X10“3 M y 0,1 mi de
p-fenilen-diamina 1%. (Luck, 1965). La actividad específica se expresó como
absorbenciaXmin'1
X
mg prof1. Las proteínas fueron determinadassegún Kalckar (1947)
.
2. Composición enzimática
En corridas no simultáneas, la separación de isoperoxidasas se
efectuó por electroforesis vertical en soporte de gelde almidón usando
en las cubetas buffer de borato 0,3 M, pH 8,6. Se aplicó al gel una corriente de 18 voltios cm'1 durante 8 hs a 4o C según técnica de Smithies (1955). El revelado de lasisoenzimas deperoxidasas sereali¬ zó sobre las mitades cortadas de los geles, utilizando como mezcla de reacción: 20 mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 4,6; 20 mi de
peróxidodehidrógeno 0,1M y 10mi de bencidina 0,01M en solución hidroalcohólica al 50%. (Isaac y Winch, 1947), utilizando buffer de
104 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979
4
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Sacarosa—
Sorbita•-
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1 -210-A
10"3
10Concentración
en MolesFig. 2.
—
Curva de actividad de peroxidasas en coleóptilos de trigo tratados condistintas concentracionesde sorbita y sacarosa. La mismafue llevada a cabo utilizandop-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno como dadores de hidró¬ geno y oxígeno respectivamente. Los resultados son el promedio de seis
determinaciones.
con
agua
destilada y fijado con una mezcla de: agua-metanol-ácidoacético desnaturalizadoen una proporción de 70:30:5 mi, según técnica de Guzmán et al (1973).
3. Determinación de Peso Seco
El material tratado fue pesado y colocado en una estufa durante 48 hs a 105° C. Posteriormente fue transferido a un desecador durante 12 hs, al cabo de las cuales se pesó nuevamente.
RESULTADOS 1.
Electroforesis
Los
esquemas
de las corridas electroforéticas se muestran en lafig.1,donde las bandas de isoenzimas de peroxidasas se numeraron de
acuerdo a la nomenclatura internacional (IUPAC-IUB, 1972.)
En la sorbita los coleóptilos revelaron 11 formas moleculares: 4 anódicas y 7 catódicas. Desde el
agua
destilada hasta concentracio¬ nes de sorbita de 0,1M el modelo se mantuvo constante con tresban-das anódicas: 1, 3, 4 y siete bandas catódicas: 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11. Enlasconcentracionesde0,5y1 M la banda 1 tuvo una mayor migra¬ ción y aparentemente menor actividad enzimática, apareciendo la ban¬ da 2 como desdoblamiento de la 1. En las formas catódicas desapa¬ reció la banda 9, teniendo las bandas10 y11 una menor migración.
En los coleóptilos colocados en soluciones de sacarosa se observaron 14bandas: 7 anódicasy7 catódicas. Si bienaquí fuemayorel número
de formas de peroxidasas los resultados fueron similares a los de
sor-bita, manteniéndose los modelos electroforéticos constantes con 7 for¬
mas anódicas y 7 catódicas desde el testigo hasta concentraciones
de0,1Myobservándosevariaciones con concentracionesde0,5y1M;
en éstas se notó la desaparición de las bandas 7 y 14, teniendo una
mayor migración la banda>1 y menor movilidad electroforética las
bandas 10,11y12.
2. Actividad enzimática
La actividad enzimática se muestra en las curvas de la fig. 2.
La mismase mantuvo con pocas variaciones en los coleóptilos tratados
con concentraciones bajas de sorbita y sacarosa, disminuyendo leve¬ mente para 0,1M y en forma apreciable en aquellos tratados con con¬ centraciones de 0,5 M y 1 M.
-Se hicieron mediciones en las soluciones de sorbita y
sacarosa
posterior al tratamiento, pudiendo comprobarse la difusión de peroxi¬ dasas a las mismas, siendo su actividad equivalente a la centésima parte de las actividades de las peroxidasas encontradas en los extractos utilizados.3. Determinación de Peso Seco
Los porcentajes de peso seco final en los coleóptilos tratados se
presentan en la tabla 1.
Tabla1. Tablacomparativa del
peso
secofinal
de coleóptilos de trigotratados con distintasconcentracionesde sorbita y
sacarosa.
Losresul¬ tados son el promedio de dos determinaciones.Porcentaje de Peso Seco
Concentración molar
Sorbita
Sacarosa
Agua
1X 10-4
1X 10-3 1 X 10-2 1 X ío-i
5X10-1
4,8 4,8
5,2 4,8
5,5 4,9
5,5 4,9
5,7 5,3
10,1 9,7
13,8
106 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979
DISCUSION Y CONCLUSIONES
En este estudio las observaciones tienen en cuenta la caída de las actividades enzimáticas y las modificaciones de los modelos elec-troforéticos.
Si se considera que la sorbita y la sacarosa modifican el estado
hídrico, de los resultados obtenidos se puede deducir que las leves
disminuciones de la actividad de peroxidasas observadas en las con¬ centraciones hasta 0,1 M, no serían debidas a las mismas, ya que
éstas son prácticamente inapreciables, como puede deducirse de la comparación de los pesos secos (Tabla 1). Sí podríamos pensar que
la caída sostenida dela actividad enzimática y la variación del modelo
electroforético queseobserva enlas concentraciones5X 101M y1M,
podríaserdebidaen parte a modificacionesenelpotencial agua (Todd,
1972; Stafford, 1974), a las cuales se sumaría la influencia de la natu¬
raleza molecular tanto de la sorbita como de la sacarosa.
Al igual que lo observado por van Huystee y Turcon (1973) se comprobó la
difusión
de peroxidasas al medio, pero la cantidad delas mismas no indicaría influencia en la disminución de su actividad, ya que la proporción semantuvo constanteaun para los testigos. Tam¬ bién Guzmán et al. (1975) encontraron que las peroxidasas podían
difundir al exudado
gomoso
de Fagara coco.En cuanto a las formas moleculares (fig. 1), los resultados obte¬
nidos nos muestran cambios en el número de bandas de isoenzimas con actividad de peroxidasas en concentraciones de5X10"1 y 1 M. La disminución de tres bandas nos indicaría la destrucción, la inhibi¬
ción de la síntesis o bien la despolimerización de algunas peroxidasas
como consecuencia de modificaciones del estado hídrico y la influen¬
cia de la naturaleza de las soluciones. Scandalios (1969) sugiere que
la puesta en evidencia de una forma molecular en un momento dado,
puede no estar regulada directamente por el
genoma.
Se observa, además, una reducción en la cantidad absoluta de peroxidasas en las concentraciones 5 X10'1 y 1 M como se infiere de la menor intensidad de la tinción de algunas bandas.
Las diferencias encontradas en los testigos pueden deberse a lige¬ ras variaciones del material, influenciado en parte por las oscilaciones de la temperatura (± 2oC).
AGRADECIMIENTOS
Deseamosagradecer a la Estación Experimental Agrícola de Mar¬ cos
Juárez
(INTA), Prov. de Córdoba, por suministrarnos el materialvegetal, y al Dr. Augusto Arce por la revisión de los manuscritos del presente trabajo.
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