Efectos de la sacarosa y la sorbita sobre la composición y actividad de peroxidasas en los coleóptilos de trigo - Sociedad Argentina de Botánica

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(1)

Volumen XVIII, N9 3-4

EFECTOS DE

LA

SACAROSA Y

LA SORBITA SOBRE

LA

COMPOSICION Y ACTIVIDAD DE PEROXIDASAS

EN LOS COLEOPTILOS

DE

TRIGO

1

POR GLORIA M. DE LUCA d’ORO y CARLOS A. GUZMAN2

ABSTRACT

Peroxidaseactivity andmolecularcomposition variations werestudiedinwheat

coleoptyles which had been treated for twelve hours with different sorbitol and

sucrose concentrations. From 5X 101 M solutions on, changes occurred both in

theelectrophoreticpatterns,withbandsdecreasingin numberand inactivity, which

showed a marked reduction.

It is concluded that, these changes were caused by water potential modifica¬

tions and by sorbitol and sucrose molecular influence.

INTRODUCCION

El propósito de este trabajo fue analizar la manera queun azúcar yunazúcar alcohol exógenos,sacarosaysorbita, respectivamente, influ¬

yen en la composición y actividad de las peroxidasas en un órgano no fotosintetizante, cual es el coleóptilo de trigo.

La sacarosa constituye la

mayor

reserva de carbohidratos de las

plantas superiores y es el más importante dentro de los disacáridos no reductores. La sorbita, que estructuralmente deriva de la reducción de la fructosa,es el alcohol azucarado más comúnmente encontrado en

los vegetales y procede únicamente de las plantas. Los alcoholes de

los azúcaresson muysemejantes en sus solubilidades a los hidratos de carbono, perodesaparecenen ellos todas laspropiedades condicionadas por la presencia

del

grupo

carbonilo, por lo que su estabilidad es mayor y su química más sencilla. (Klages, 1968; Davies, 1969.)

1Trabajo realizado en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba.

2 Miembro de la Carrera del Investigador, Consejo Nacional de Investiga¬

(2)

102 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979

Las peroxidasas son enzimas ferroporfirínicas que catalizan la

oxidación de una amplia variedad de compuestos para lo cual requie¬

ren un dador deoxígeno y un dador de hidrógeno,mostrando distintas

actividadescon diferentes dadores de hidrógeno. (Mann, 1931.) Las peroxidasas de las plantas están caracterizadas por una

gran

cantidad de formas moleculares (isoenzimas) separables, entre otros

métodos, por electroforesis. El estudio de las isoenzimas ha podido demostrar queexisten bandas comunes a todos los órganos de las plan¬

tas y bandas características, asignándolea estas últimas un papel fisio¬

lógico específico. (Wise y Morrinson, 1971.)

El importante papel que desempeñan las peroxidasas en los pro¬ cesos de oxidación de la$ plantas ha sido ampliamente investigado.

Estudios sobrela ontogenia han podido demostrar una profunda modi¬ ficación enlos modelos electroforéticos y en la actividad deperoxidasas

durante los procesos de diferenciación y desarrollo. (Verma y van Huystee, 1970; Evans y Alldridge, 1965; Shannon, 1968; Siegel y

Gals-ton, 1967; Alvarez, 1968; Conklin y Smith, 1971.) Las mismas varia¬ ciones se han podido comprobar con distintos regímenes hídricos.

(Stafford, 1974.)

MATERIAL Y METODOS

Se usaron cariopses de Triticum aestivum L. cultivar “Oncativo” que, previo lavado, fueron sometidos a imbibición durante 15 min.

La operaciónse realizó en recipientes de plástico sobre una rejilla del

mismo material ycon

agua

destilada. Las semillas germinaron en oscu¬

ridad y a 22° C±2o C. Cuando los coleóptilos alcanzaron una longi¬

tud de3 cm fueron cortados y colocados de inmediato en agua desti¬ lada; luego fueron lavados dos veces con

agua

estéril y colocados en

frascos con distintas concentraciones de sorbita y sacarosa; 1X10‘4, 1X10"3,1X10'2, 1X

10"\

5 X101y 1M y utilizando como testigo

agua destilada. Estas soluciones fueron previamente esterilizadas du¬

rante 30 min a 120°C. El material fue mantenido en la oscuridad durante 12 hs y posteriormente homogeneizado en un mortero en un baño de hielo con buffer de fosfato 0,067 M, pH 7 y arena lavada. El homogeneizado fue centrifugado a 3.000 X

g

durante 15 min. Con

los sobrenadantes se hicieron diluciones convenientes para la medición de proteínas y actividad enzimática. Para realizar la separación elec-troforética los extractos fueron sembrados sin diluir.

1. Actividad enzimática

Para la determinación de l;j actividad enzimática se midieron los cambios de D. O. durante 2 min a 485 nm en un espectrofotómetro

Beckman modelo DU-2;la mezcla de reacción fue: 2 mi demuestra, 1mi de buffer de fosfato 0,067 M, pH 7, 0,3mi de

agua

bidestilada,

(3)

Cátodo

14

11 13

10

12

_

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ÍBÉS8 EKSSSSJ K-ÿea

EL-J rna r„a o» sua tía rrzj crrj r~".j r~~7 nrza czn m

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5

3

4

3

2 2

1 1

f Anodo f

b d b d

a c e g a c e g

SORBITA SACAROSA

Fig. 1.

Modelo electroforético de peroxidasas de coleóptilos de trigo tratados

con distintasconcentracionesde sorbita ysacarosa,a: testigo, b: 1 X104 M;

c: 1X10-3M; d: 1 X10'2M; e: 1X 10’1 M; f: 5'X10"1M; g: 1 M. El revelado de las diferentes formas moleculares se realizó utilizando peróxido de hidrógeno y bencidina como dadores de oxígeno e hidrógeno respectiva¬

mente. Los resultados son el promedio de seis determinaciones de corridas

no simultáneas.

0,1 mi de peróxido de hidrógeno 3X10“3 M y 0,1 mi de

p-fenilen-diamina 1%. (Luck, 1965). La actividad específica se expresó como

absorbenciaXmin'1

X

mg prof1. Las proteínas fueron determinadas

según Kalckar (1947)

.

2. Composición enzimática

En corridas no simultáneas, la separación de isoperoxidasas se

efectuó por electroforesis vertical en soporte de gelde almidón usando

en las cubetas buffer de borato 0,3 M, pH 8,6. Se aplicó al gel una corriente de 18 voltios cm'1 durante 8 hs a 4o C según técnica de Smithies (1955). El revelado de lasisoenzimas deperoxidasas sereali¬ zó sobre las mitades cortadas de los geles, utilizando como mezcla de reacción: 20 mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 4,6; 20 mi de

peróxidodehidrógeno 0,1M y 10mi de bencidina 0,01M en solución hidroalcohólica al 50%. (Isaac y Winch, 1947), utilizando buffer de

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104 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979

4

--

Sacarosa

Sorbita

•-

-o

te 3.5

o

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1

0

ID"1

5xlD"1

1 -2

10-A

10"3

10

Concentración

en Moles

Fig. 2.

Curva de actividad de peroxidasas en coleóptilos de trigo tratados con

distintas concentracionesde sorbita y sacarosa. La mismafue llevada a cabo utilizandop-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno como dadores de hidró¬ geno y oxígeno respectivamente. Los resultados son el promedio de seis

determinaciones.

con

agua

destilada y fijado con una mezcla de: agua-metanol-ácido

acético desnaturalizadoen una proporción de 70:30:5 mi, según técnica de Guzmán et al (1973).

3. Determinación de Peso Seco

El material tratado fue pesado y colocado en una estufa durante 48 hs a 105° C. Posteriormente fue transferido a un desecador durante 12 hs, al cabo de las cuales se pesó nuevamente.

RESULTADOS 1.

Electroforesis

Los

esquemas

de las corridas electroforéticas se muestran en la

fig.1,donde las bandas de isoenzimas de peroxidasas se numeraron de

acuerdo a la nomenclatura internacional (IUPAC-IUB, 1972.)

En la sorbita los coleóptilos revelaron 11 formas moleculares: 4 anódicas y 7 catódicas. Desde el

agua

destilada hasta concentracio¬ nes de sorbita de 0,1M el modelo se mantuvo constante con tres

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ban-das anódicas: 1, 3, 4 y siete bandas catódicas: 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11. Enlasconcentracionesde0,5y1 M la banda 1 tuvo una mayor migra¬ ción y aparentemente menor actividad enzimática, apareciendo la ban¬ da 2 como desdoblamiento de la 1. En las formas catódicas desapa¬ reció la banda 9, teniendo las bandas10 y11 una menor migración.

En los coleóptilos colocados en soluciones de sacarosa se observaron 14bandas: 7 anódicasy7 catódicas. Si bienaquí fuemayorel número

de formas de peroxidasas los resultados fueron similares a los de

sor-bita, manteniéndose los modelos electroforéticos constantes con 7 for¬

mas anódicas y 7 catódicas desde el testigo hasta concentraciones

de0,1Myobservándosevariaciones con concentracionesde0,5y1M;

en éstas se notó la desaparición de las bandas 7 y 14, teniendo una

mayor migración la banda>1 y menor movilidad electroforética las

bandas 10,11y12.

2. Actividad enzimática

La actividad enzimática se muestra en las curvas de la fig. 2.

La mismase mantuvo con pocas variaciones en los coleóptilos tratados

con concentraciones bajas de sorbita y sacarosa, disminuyendo leve¬ mente para 0,1M y en forma apreciable en aquellos tratados con con¬ centraciones de 0,5 M y 1 M.

-Se hicieron mediciones en las soluciones de sorbita y

sacarosa

posterior al tratamiento, pudiendo comprobarse la difusión de peroxi¬ dasas a las mismas, siendo su actividad equivalente a la centésima parte de las actividades de las peroxidasas encontradas en los extractos utilizados.

3. Determinación de Peso Seco

Los porcentajes de peso seco final en los coleóptilos tratados se

presentan en la tabla 1.

Tabla1. Tablacomparativa del

peso

seco

final

de coleóptilos de trigo

tratados con distintasconcentracionesde sorbita y

sacarosa.

Losresul¬ tados son el promedio de dos determinaciones.

Porcentaje de Peso Seco

Concentración molar

Sorbita

Sacarosa

Agua

1X 10-4

1X 10-3 1 X 10-2 1 X ío-i

5X10-1

4,8 4,8

5,2 4,8

5,5 4,9

5,5 4,9

5,7 5,3

10,1 9,7

13,8

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106 BOLETíN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BOTáNICA, XVIII (3-4), 1979

DISCUSION Y CONCLUSIONES

En este estudio las observaciones tienen en cuenta la caída de las actividades enzimáticas y las modificaciones de los modelos elec-troforéticos.

Si se considera que la sorbita y la sacarosa modifican el estado

hídrico, de los resultados obtenidos se puede deducir que las leves

disminuciones de la actividad de peroxidasas observadas en las con¬ centraciones hasta 0,1 M, no serían debidas a las mismas, ya que

éstas son prácticamente inapreciables, como puede deducirse de la comparación de los pesos secos (Tabla 1). Sí podríamos pensar que

la caída sostenida dela actividad enzimática y la variación del modelo

electroforético queseobserva enlas concentraciones5X 101M y1M,

podríaserdebidaen parte a modificacionesenelpotencial agua (Todd,

1972; Stafford, 1974), a las cuales se sumaría la influencia de la natu¬

raleza molecular tanto de la sorbita como de la sacarosa.

Al igual que lo observado por van Huystee y Turcon (1973) se comprobó la

difusión

de peroxidasas al medio, pero la cantidad de

las mismas no indicaría influencia en la disminución de su actividad, ya que la proporción semantuvo constanteaun para los testigos. Tam¬ bién Guzmán et al. (1975) encontraron que las peroxidasas podían

difundir al exudado

gomoso

de Fagara coco.

En cuanto a las formas moleculares (fig. 1), los resultados obte¬

nidos nos muestran cambios en el número de bandas de isoenzimas con actividad de peroxidasas en concentraciones de5X10"1 y 1 M. La disminución de tres bandas nos indicaría la destrucción, la inhibi¬

ción de la síntesis o bien la despolimerización de algunas peroxidasas

como consecuencia de modificaciones del estado hídrico y la influen¬

cia de la naturaleza de las soluciones. Scandalios (1969) sugiere que

la puesta en evidencia de una forma molecular en un momento dado,

puede no estar regulada directamente por el

genoma.

Se observa, además, una reducción en la cantidad absoluta de peroxidasas en las concentraciones 5 X10'1 y 1 M como se infiere de la menor intensidad de la tinción de algunas bandas.

Las diferencias encontradas en los testigos pueden deberse a lige¬ ras variaciones del material, influenciado en parte por las oscilaciones de la temperatura (± 2oC).

AGRADECIMIENTOS

Deseamosagradecer a la Estación Experimental Agrícola de Mar¬ cos

Juárez

(INTA), Prov. de Córdoba, por suministrarnos el material

vegetal, y al Dr. Augusto Arce por la revisión de los manuscritos del presente trabajo.

(7)

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