DE ENSENADA, BAJA CALIFORNIA
Programa de Posgrado en Ciencias
en Acuicultura
Maduración sexual de la trucha de San Pedro Mártir
Oncorhynchus mykiss nelsoni
evaluada mediante un método
no invasivo
Tesis
para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de Maestroen Ciencias en Acuicultura
Presenta:
Paul Alberto Vásquez Gallegos
Tesis defendida por
Paul Alberto Vásquez Gallegos
y aprobada por el siguiente Comité
Dra. Carmen Paniagua Chávez Dr. Gorgonio Ruiz Campos Co-Director del Comité Co-Director del Comité
Dr. Manuel Segovia Quintero Miembro del Comité
Dr. Gustavo Olague Caballero Miembro del Comité
Dr. Benjamín Barón Sevilla Miembro del Comité
Dra. Beatriz Cordero Esquivel Coordinadora del Posgrado en
Ciencias en Acuicultura
Dr. Jesús Favela Vara Director de Estudios de Posgrado
Resumen de la tesis de Paul Alberto Vásquez Gallegos, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura.
Maduración sexual de la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus mykiss nelsoni evaluada mediante un método no invasivo
Resumen aprobado por:
______________________________ Dra. Carmen Paniagua Chávez
Co-Director de Tesis
______________________________ Dr. Gorgonio Ruiz Campos
Co-Director de Tesis
disecciones para corroborar la anatomía de los órganos y la localización de las gónadas. También se definió la configuración de los parámetros del ultrasonido adecuados para esta trucha, tales como frecuencia (9 MHZ), modo de escaneo (B), ganancia (102), imagen dinámica (27), entre otros. Se tomaron ecografías mensuales y se validaron midiendo la concentración de vitelogenina (VTG) o testosterona en el plasma sanguíneo de los organismos y visualizando en fresco el desarrollo de las gónadas. La concentración de VTG o testosterona fueron altos debido al ciclo reproductivo abreviado. La mayor concentración de VTG en hembras fue >106 mg/mL en julio y de 50.3 ng/mL de testosterona en machos durante agosto. Las concentraciones de VTG y testosterona, las imágenes de ultrasonido y los desoves obtenidos coincidieron con los procesos reproductivos observados en los organismos.
Abstract of the thesis presented by Paul Alberto Vasquez Gallegos, as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Aquaculture.
Sexual maturation of the San Pedro Martir trout Oncorhynchus mykiss nelsoni
evaluated using a non-invasive method Abstract approved by:
______________________________ Dra. Carmen Paniagua Chávez
Co-Director de Tesis
______________________________ Dr. Gorgonio Ruiz Campos
Co-Director de Tesis
month and validated by measuring the concentration of vitellogenin (VTG) or testosterone in blood plasma and viewing fresh samples of gonads during the second reproductive cycle. The concentration of VTG or testosterone was high due to the shortening of the reproductive cycle. The highest concentration of VTG in females was > 106 mg/mL in July and of testosterone (50.3 ng/mL) in males during August. Concentration of VTG and testosterone, ultrasound images and spawning coincided with the reproductive processes observed in the trout.
Dedicatoria
Primeramente le doy gracias a Dios por todo.
A mis Padres: Alicia Gallegos Hurtado y Alejandro Vásquez Pila, por su amor, confianza, apoyo y comprensión, que sin su instrucción no sería la persona que soy ahora.
A mis Hermanos: Alejandro y Adrián Vásquez Gallegos, que me dieron fuerzas para seguir adelante y por ser mi inspiración para seguir superándome.
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por haberme brindado el apoyo económico para la realización de mis estudios de maestría.
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE), y al Departamento de Acuicultura por su valioso apoyo en mi formación académica como Maestro en Ciencias en Acuicultura.
A mis Directores de Tesis, Dra. Carmen Paniagua Chávez y Dr. Gorgonio Ruíz Campos, por haberme brindado la oportunidad de ser parte de su grupo de estudiantes, por su paciencia y su valioso aporte de conocimientos en esta formación, son un ejemplo a seguir. Por otorgarme la oportunidad de realizar mi tesis con la trucha de San Pedro Mártir, Muchas Gracias.
A los miembros del comité de tesis, Dr. Manuel Segovia, Dr. Benjamín Barón Sevilla y Dr. Gustavo Olague Caballero por sus valiosas sugerencias, orientaciones y apoyo profesional para la realización del presente trabajo.
A todos los académicos y empleados del Departamento de Acuicultura por compartirme sus conocimientos y anécdotas durante este periodo de formación.
A mis compañeros, amigos y cómplices de generación: Luis Miguel Molina (Luisito papaaa), Jorge Madrid (Jorsh de la selva alias el monote), Pablo Fuentes (El Mae), David Guzmán (Dayvids), Rigoberto Delgado (Jilberto), Roberto Cruz (Mr. bíceps), Omar Montes (…), Raquel Escuredo (Joder tío), Miriam Lecuanda (Chica pulpo), Araceli Cazares (Hija de Bety), una familia que junto con ellos aprendí mucho y me enseñaron de lo que somos capaces de lograr y que esto no termina aquí...
A las generaciones de Acuicultura y de otras áreas que tuve la oportunidad de conocer y pudimos compartir conocimientos y experiencias.
Y a todos aquellos que colaboraron en el desarrollo de este trabajo y a aquellos que me brindaron su amistad…
Contenido
Página
Resumen en español………..………..……...…….……….. i
Resumen en ingles………...………. iii
Dedicatorias………..…...……... v
Agradecimientos………..………... vi
Lista de Figuras……….…..……...…….. xi
Lista de Tablas……….………..…….. xiii
Capítulo 1. Introducción……...…..………...…….. 1
1.1 Introducción………...…….. 1
1.2 Antecedentes……….………...……….. 3
1.2.1 Producción de trucha arcoíris………..……..……..…...……..……….. 3
1.2.2 Generalidades de la trucha arcoíris….………..……..……..……..…… 6
1.2.3 Ecología de la trucha de la Sierra de San Pedro Mártir…….…..……. 7
1.2.4 Reproducción……...……..……..……..……..……..……..……..………. 10
1.2.5 Métodos para evaluar el estado de madurez sexual en truchas……. 12
1.2.5.1 Índice gonadosomático……..……...……..……..……..……..…….. 12
1.2.5.2 Biopsias ováricas………...……..……..……..……..……..……..… 13
1.2.5.3 Histología………..……..……..……..……..……..……..… 14
1.2.5.4 Análisis de la variación hormonal y de vitelogenina en la maduración de la trucha...….……..……..……..……..……..……..……..……….. 15
1.2.5.5 Ultrasonido……..……..……..……..……..……..……..……..……… 16
1.3 Justificación……….………..…….. 19
Capítulo 2. Hipótesis y objetivos………...……... 21
2.1 Hipótesis...….………..……… 21
Contenido
Página2.3 Objetivos particulares………..…….. 21
Capítulo 3. Metodología…...………...……… 22
3.1 Recolección de organismos……….………. 22
3.1.1 Zona de captura………..………...………...…….. 22
3.1.2 Recolección de organismos………... 22
3.1.3 Parámetros ambientales de la zona de captura………. 22
3.2 Acondicionamiento y mantenimiento organismos……….………….…….. 24
3.2.1 Sistema de recirculación acuícola………..…………..……… 24
3.2.2 Registro de los parámetros físico-químicos del sistema de recirculación acuícola……….…………..…………... 24
3.2.3 Régimen alimenticio………..……….. 25
3.2.4 Registros biométricos……….…………..…………..…………..……….. 25
3.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura……….…………..…………..………. 28
3.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo…………..…………..…………..…………. 28
3.3.1.1 Sistema y condiciones de fotoperiodo……….…………..………… 28
3.3.1.2 Régimen de temperatura…….…………..…………..…………..….. 30
3.3.1.3 Alimento para estimular la maduración sexual…………..……….. 30
3.3.1.4 Desoves……….………..…………..…………..…………..… 30
3.3.2 Acortamiento del ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura………... 31
3.3.2.1 Sistema, condiciones de fotoperiodo y régimen de temperatura………..………..………... 31
3.3.2.2 Alimentación………..………. 32
Contenido
Página3.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido…..….………….. 32
3.4.1 Descripción del equipo utilizado……… 32
3.4.2 Estandarización del método………..………. 33
3.4.3 Registro ecográfico de gónadas mediante ultrasonido………. 34
3.5 Evaluación de los cambios de vitelogenina en plasma sanguíneo... 33
3.5.1 Extracción y purificación de vitelogenina………...……….. 36
3.5.2 Determinación de la concentración de vitelogenina en plasma sanguíneo mediante el método ELISA….………..……….. 37
3.6 Evaluación de los cambios de testosterona en plasma sanguíneo……… 37
3.6.1 Extracción y purificación de testosterona……… 37
3.6.2 Medición de la concentración de testosterona en plasma sanguíneo mediante el método ELISA………..………... 38
3.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez sexual………..………..………. 39
Capítulo 4. Resultados………..…... 40
4.1 Recolección de organismos………...…….. 40
4.2 Acondicionamiento y mantenimiento de truchas de SPM……… 40
4.2.1 Parámetros de calidad de agua….……… 42
4.2.2 Registros biométricos……….. 42
4.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura……...………..……... 48
4.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo………….……….. 48
4.3.2 Acortamiento el ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura………...……… 48
4.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido………..…….….. 49
Contenido
Página 4.6 Evaluación de los cambios en la concentración de testosterona en elplasma sanguíneo………..……….…….……… 51
4.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez sexual de la trucha SPM.…...………. 52
Capítulo 5. Discusiones………..…. 59
Conclusiones………..……... 72
Recomendaciones………....……… 73
Referencias bibliográficas……….………...………..…… 74
Lista de figuras
Figura Página
1 Producción acuícola de trucha arcoíris a nivel mundial en toneladas
anuales del 2000 al 2011………..……… 4
2 Producción de trucha arcoíris a nivel nacional en el periodo de
2000 a 2010………...……….. 5
3 Diagrama de flujo de la producción de trucha arcoíris………. 6
4 Imagen ilustrativa de la estructura externa de trucha arcoíris
Oncorhynchus mykiss hembra………. 7
5 Localidades donde se distribuye la trucha de San Pedro Mártir
Oncorhynchus mykiss nelsoni……….. 8
6 Ejemplar de trucha de San Pedro Mártir con un patrón de
coloración típico del medio silvestre……….... 10
7 Evolución del índice gonadosomático y diámetro de ovocitos de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en la granja piscícola de Río
Blanco, Chile (1992-1993)………..……….. 13
8 A) Captura de truchas de San Pedro Mártir con equipo de electropesca y red. B) Preparación las bolsas de plástico con agua
y oxígeno para el transporte de las truchas capturadas……….. 23
9 Ejemplar macho de trucha de San Pedro Mártir colocado en una balanza digital (0.1 g) para su pesaje (A) y en un ictiómetro (0.1
cm) para la medición de su longitud total (B)….……… 27
10 Sistema de iluminación utilizado para modificar el fotoperiodo en el
sistema de recirculación acuícola……… 29
11 Luxómetro utilizado en la medición de luxes en el sistema de iluminación y temporizador utilizado para encender y apagar las
lámparas del sistema de iluminación………..………. 29
12 Equipo de ultrasonido utilizado para el registro del desarrollo gonadal de la trucha de San Pedro Mártir mediante la
Figura Página 13 Estandarización del método del ultrasonido en la trucha de SPM. a)
Trucha de SPM anestesiada con aceite de clavo y colocada en un ictiómetro; b) disección de la parte ventral de la trucha de SPM; c) visualización de los órganos de la trucha de SPM; d) localización de la gónada de la trucha de SPM; e) trucha de SPM disecada cargada con ovocitos maduros; f) ovocitos de trucha de SPM extraídos para su conteo y medición; g) visualización de los
testículos de una trucha macho……… 35
14 Posición de la trucha al momento de manejar la sonda para la toma
de las ecografías de las gónadas………. 36
15 Extracción de sangre de la vena caudal de una trucha……… 37
16 Placa para el desarrollo del ELISA para testosterona de 96 pozos
siendo llenada con la curva de calibración……….…….………... 38
17 Truchas de SPM ya acondicionadas a los tanques de cultivo……… 41
18 Truchas en tratamiento con oxitetraciclina………..………... 41
19 Relación peso-longitud de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un
sistema de recirculación acuícola……… 43
20 Factor de condición de Fulton calculado para las truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de
12 meses, en un sistema de recirculación acuícola..……… 44
21 Factor de condición relativo (Kn) calculado para las truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un
periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola…..… 45
22 Crecimiento en peso de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un
sistema de recirculación acuícola.………... 46
23 Crecimiento en longitud total (LT) de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12
meses, en un sistema de recirculación acuícola.…………..………… 47
Figura Página 25 Captura de imagen de un ovocito de la trucha de SPM mediante
ultrasonido y verificación de su tamaño con el uso de un vernier.…. 50
26 Concentración de vitelogenina (VTG) detectada en el plasma sanguíneo de truchas hembras de SPM, durante el ciclo
reproductivo acortado ………...… 51
27 Concentración de testosterona detectada en el plasma sanguíneo
Lista de tablas
Tabla Página
1 Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis Endógena (estadios I, II y III) de las hembras de
trucha arcoíris……….. 15
2 Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis Exógena (estadios IV, V, VI y VII) de las hembras
de trucha arcoíris…...……….. 15
3 Especies de peces en las que se ha implementado el ultrasonido
en cuestiones reproductivas………... 18
4 Parámetros del equipo de ultrasonido estandarizados para la
observación de las gónadas……….. 34
5 Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez sexual femenina de las truchas de San Pedro Mártir (Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: el tamaño de los ovocitos, la concentración de vitelogenina, descripción de las gónadas en las ecografías y las imágenes de ultrasonido más
representativas de los muestreos realizados……….…… 53
6 Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez sexual masculina de las truchas de San Pedro Mártir (Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: la concentración de testosterona, la descripción del tejido y las imágenes de ultrasonido más representativas de los muestreos
realizados……… 56
7 Comparación de métodos comúnmente utilizados en la evaluación del estado de madurez sexual comparados con el
Capítulo 1. Introducción
La trucha (Oncorhynchus mykiss nelsoni) o trucha de San Pedro Mártir (SPM) es una subespecie de la trucha arcoíris, endémica de la Sierra de San Pedro Mártir, Baja California (Ruiz-Campos y Pister, 1995). Debido a que es una subespecie endémica con una distribución restringida y a la abundancia que presenta en su hábitat natural, tiene un estatus de protección especial por la NOM-ECOL-059 (Semarnat, 2010), que le confiere el estatus de especie protegida y restringe la obtención de ejemplares silvestres para iniciar su cultivo a nivel piloto.
La reproducción de esta trucha nativa en cautiverio es una buena opción para producir en forma constante ejemplares sin depender de organismos del medio silvestre. Sin embargo, debido a que se consideran organismos muy preciados, es necesario generar estrategias no invasivas o mortales para el monitoreo de los mismos en condiciones de cautiverio.
En el proceso de reproducción de la trucha, las hembras y los machos no liberan sus gametos de manera espontánea, por lo que para efectuar la fertilización controlada es necesario extraer los óvulos y el semen aplicando presión abdominal; sin embargo, para que este procedimiento sea exitoso, es necesario que los gametos hayan alcanzado su grado de madurez completo (Harvey y Hoar, 1980). Así mismo, si el procedimiento de obtención de gametos no se realiza de modo apropiado en tiempo y forma, el poro urogenital se puede obstruir y ocasionar la muerte de los reproductores o los gametos pueden quedar inviables para su fertilización.
en el vientre y la coloración y dilatación de la papila genital con una irritación de la misma. Por otro lado, la extracción de los gametos es un método muy estresante para los organismos. El análisis histológico es un método de evaluación muy efectivo; sin embargo, esto representa el tener que sacrificar a los organismos, lo cual no es una opción apropiada para la trucha endémica de SPM. Finalmente, la medición de la concentración de hormonas para la evaluación de la madurez sexual es costosa y al igual que el análisis histológico consume tiempo y no brinda la información en el mismo momento.
En los últimos años, la utilización del ultrasonido se ha convertido en una herramienta nueva en el sector acuícola. Esta herramienta presenta un potencial importante para ser utilizado en la evaluación del estado reproductivo de los reproductores de trucha de SPM, siendo además un método no invasivo relativamente sencillo y que proporciona información al instante (Moghim, et al., 2002).
1.2 Antecedentes
1.2.1 Producción de trucha arcoíris
La trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se distribuye de manera natural desde el suroeste de Alaska (Río Kuskokwim) hasta el Río Presidio, México, con registros puntuales en las islas Commander en la península de Kamchatka en Eurasia (Behnke, 2002). Esta trucha ha sido introducida desde 1874 en muchas partes del mundo, especialmente para pesca deportiva y actividades acuiculturales. La pesquería y el cultivo de trucha arcoíris se practica en las cuencas altiplánicas de muchos países tropicales y sub-tropicales de Asia, este de África y Sudamérica, dando como resultado el desarrollo de varios linajes o cepas locales domesticadas, mientras que otras han surgido a través de selección masiva y entrecruzamiento para mejorar la calidad de la producción (FAO, 2009).
El cultivo de la trucha arcoíris se ha venido desarrollando de manera importante desde la década de 1950 con la incorporación de alimento peletizado en los sistemas de cultivo. Actualmente, los sistemas de cultivo se encuentran bien establecidos y muchos aspectos para su cultivo son altamente eficientes. Sin embargo, la investigación y el desarrollo actual continuamente intentan aumentar la eficiencia de la producción y las ventas por medio del aumento de las densidades de cultivo, mejoramiento de la tecnología de los sistemas de cultivo, desarrollo de líneas genéticas para mejorar el crecimiento, el control de la maduración y del género; el mejoramiento de las dietas, reducción de las concentraciones de fósforo en los efluentes y el desarrollo de mejor comercialización (FAO, 2013).
Figura 1. Producción acuícola de trucha arcoíris a nivel mundial en toneladas anuales del 2000 al 2011 (Fuente: FAO, 2013).
El cultivo de trucha arcoíris en México comenzó a finales del siglo XIX con el fin de repoblar cuerpos de agua nacionales, iniciando con la introducción de ejemplares de trucha en Chimela Lerma, Estado de México. En 1937 se formalizó la cría de trucha arcoíris en cautiverio cuando el entonces presidente Lázaro Cárdenas decretó la creación de un centro piscícola en Salazar, Estado de México, que en 1943 se convirtió en el Centro Acuícola El Zarco, que fue el instrumento que facilitó la dispersión del cultivo de la trucha en muchos cuerpos de agua del país (Gómez y Sarmiento, 2011).
Figura 2. Producción de trucha arcoíris a nivel nacional en el periodo de 2000 a 2010 (fuente: Anuarios Estadísticos de Pesca y Acuacultura, CONAPESCA 2010).
Actualmente existen cuatro Centros Acuícolas Federales que producen trucha: Guachochi, en Chihuahua; el Zarco, en Estado de México; Pucuato, en Michoacán; y Apulco en Puebla (CONAPESCA 2011). En estos centros se produce el pie de cría (huevo oculado y crías de trucha) que sustenta la producción nacional; sin embargo, es necesaria la importación de huevo oculado para satisfacer la demanda, que es superior a la producción nacional, así como la importación de producto final de la engorda para satisfacer la demanda de pescado en las temporadas de mayor consumo. Para 2010, se registró la importación de 11,570,000 crías (Fuente: SENASICA, 2011).
El cultivo de la trucha se desarrolla preferentemente en localidades aledañas a ríos o lagos que tienen agua de buena calidad (pureza y oxígeno), en estanques rústicos, estanques rectangulares de concreto, o canales de flujo continuo (raceways) y tanques circulares de concreto o de geomembrana (Figura 3).
Figura 3. Diagrama de flujo de la producción de trucha arcoíris (tomado de FAO, 20014).
1.2.2 Generalidades de la trucha arcoíris
La trucha arcoíris es un pez eurihalino perteneciente a la familia Salmonidae. Esta trucha debe su nombre a la peculiar coloración que presenta, siendo de dorso verdoso con flancos más claros; banda irisada en todo el cuerpo. Presenta numerosas manchas negras en el dorso, flancos y sobre las aletas dorsal, adiposa y caudal (Figura 4). También puede variar según el sexo, grado de madurez, ambiente y tamaño.
Figura 4. Imagen ilustrativa de la estructura externa de una trucha arcoíris hembra (fuente:http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/lesionguide/, modificada).
1.2.3 Ecología de la trucha de la Sierra de San Pedro Mártir
La trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss nelsoni es una subespecie endémica de la pendiente occidental de la Sierra San Pedro Mártir, Baja California, México (Ruiz-Campos y Pister, 1995) que presenta ciertas cualidades biotecnológicas (rápido crecimiento en cautiverio, no migratoria y soporta un amplio intervalo de temperaturas). Es importante mencionar que ya se cuenta con la información biológica y ecológica necesaria para desarrollar su cultivo, y con esto disminuir el riesgo que presenta la introducción de la trucha arcoíris importada de los centros truitícolas del país a los cuerpos de agua del Estado de Baja California.
La trucha de San Pedro Mártir (SPM) se distribuye en los dos ríos principales, el Río Santo Domingo (arroyos San Antonio de Murillos, La Zanja, El Potrero, La Grulla y La Misión) y el Río San Rafael (Arroyo San Rafael), a través de un intervalo de altitud de 540 - 2030 metros sobre el nivel del mar (Figura 5) (Ruiz-Campos y Pister, 1995).
Figura 5. Localidades donde se distribuye la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus
mykiss nelsoni (Fuente: Ruiz-Campos, 1993).
La densidad de truchas por unidad de área reportada para el Arroyo San Rafael es de 0.023 a 0.088 truchas/m2. Esta densidad puede ser afectada por catástrofes naturales, tales como incendios y sequías. A pesar de esto, se encontró que esta trucha es capaz de recuperarse tiempo después de suceder la catástrofe (Ruiz-Campos, 1989). La densidad poblacional de esta trucha también se ve afectada por la hidrología del arroyo, así como por las características hidrológicas que influyen en la cantidad del alimento y en la calidad del sustrato (en este caso sustrato arenoso) (Ruiz-Campos, 1990). Las truchas adultas prefieren pozas cuya profundidad oscila entre 30 y 150 cm. Entre los depredadores naturales de la trucha de SPM destacan el mapache Procyon lotor, la garza azul Ardea herodias, el martín pescador Megaceryle alcyon y la culebra acuática de dos rayas Thamnophis hammondii (Ruiz-Campos, 1993).
La trucha de SPM tiene una tasa de crecimiento baja en su medio natural, la cual puede deberse a varios factores, tales como la baja disponibilidad de alimento, alta temperatura del agua y a la variación de las características geomorfológicas y de flujo de los arroyos. La tasa de crecimiento somático de esta subespecie en términos de longitud es mayor durante el primer año de vida, al igual que ocurre con otras especies de trucha en el medio natural (Ruiz-Campos, 1993).
Esta trucha en su ambiente natural tiene un tamaño pequeño comparado con la trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss, ya que alcanza una longitud patrón de hasta 220 mm y su crecimiento que es de tipo alométrico (las proporciones somáticas cambian en función de la talla), y tiene una longevidad menor a cinco años (Ruiz-Campos, et. al., 1997).
La coloración de este organismo depende del sustrato en que se encuentra. Esta coloración exhibe dos fases: una clara, característica de zonas con corriente rápida y la otra oscura, típica de zonas de remanso (Figura 6) (Ruiz-Campos, 1993).
Figura 6. Ejemplar de trucha de San Pedro Mártir con un patrón de coloración típico del medio silvestre.
1.2.4 Reproducción
En general, la reproducción de la trucha arcoíris se da una vez al año durante los meses de octubre a marzo. El desove lo hacen sobre arena o grava en aguas con temperaturas de 8 a 13 °C (CONAPESCA, 2009).
En el caso de la trucha de SPM, la madurez gonadal ocurre a partir del primer año de edad cuando tienen entre 103 y 112 mm longitud patrón (LP); sin embargo, es a partir del intervalo de 123-132 mm LP cuando el 100% de las truchas están maduras (Ruiz-Campos, 1993). Los machos maduran a los 15-18 meses, mientras que las hembras después de los dos años. El ciclo reproductivo de esta trucha se inicia con el incremento de la actividad hormonal y desarrollo de ovocitos que ocurre 12 meses antes de la ovulación.
el fotoperiodo y la temperatura. La manipulación de estas variables ha sido utilizada con éxito en el cultivo de salmónidos para adelantar, retrasar o inhibir la maduración.
Debido a que el fotoperiodo y la temperatura son los principales factores ambientales que inciden sobre el sistema nervioso central y en particular, sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada de los peces, varios autores han modificado el fotoperiodo de la trucha arcoíris para adelantar o atrasar los desoves (Bromage et al., 1984; Bon et al., 1997; Elliot et al., 1984; Scott et al., 1984; Bonnet et al., 2007; Klempau, 2008; Wilkinson et al., 2010).
Scott et al. (1984) y Elliot et al. (1984), adelantaron los desoves de trucha arcoíris hasta seis meses antes de la temporada normal de reproducción. Juárez-Aguilar (2011) realizó la inducción a la madurez sexual de machos de la trucha de SPM en un sistema de recirculación con fotoperiodo artificial y control de la temperatura.
La técnica más común de fertilizar los óvulos de las truchas que se mantienen en cautiverio es el método en seco (Leitritz, 1963). Esta técnica consiste en seleccionar los reproductores que están listos para desovar luego de ser anestesiados, las hembras son sujetadas por la aleta caudal y en una posición en la que la cabeza quede en un nivel superior al de la aleta caudal, ya en esta posición, se procede a secar completamente al organismo para después realizar un masaje abdominal que, cuando las hembras han ovulado y están listas para desovar, hacen que los huevos fluyan fácilmente hasta el recipiente de recolección.
Para la extracción del esperma se procede con un manejo similar al descrito para las hembras. Se recibe directamente sobre la masa de huevos e inmediatamente se sigue con la mezcla de ambos gametos utilizando para su efecto una pluma de ave, un accesorio plástico o la mano.
Posteriormente los huevos son colocados en las incubadoras que pueden ser verticales a contraflujo u horizontales con flujo ascendente, en donde tardarán aproximadamente 30 días en eclosionar. La alimentación de los alevines inicia cuando terminan de absorber su saco vitelino para proceder a su engorda (FAO, 2014).
1.2.5 Métodos para evaluar el estado de madurez sexual en truchas
Evaluar el estado de madurez sexual sin lastimar o estresar a los reproductores es una tarea difícil. Esta actividad debe realizarse a intervalos regulares para evitar el riesgo de perder puestas por efectos de sobremaduración, ya que la utilización de huevos con algún grado de sobremaduración tiene un efecto negativo sobre las tasas de fertilización globales, las cuales disminuyen conforme transcurre el tiempo contado a partir de la ovulación (Daza, et.al., 2005).
Hay una gran variedad de técnicas para evaluar la madurez. Se han desarrollado y estandarizado índices gonadosomáticos para determinar el tiempo en que los reproductores están listos para desovar, análisis histológicos de las gónadas y pruebas para la detección y evaluación de esteroides sexuales que permiten observar los cambios hormonales y determinar el estado de madurez sexual. Recientemente, el empleo del equipo de ultrasonido ha permitido la observación indirecta de las gónadas, sin la necesidad de utilizar métodos invasivos como la canulación o la extracción de las gónadas para análisis histológico y ha sido de gran utilidad práctica (Novelo y Tiersch, 2012).
1.2.5.1 Índice gonadosomático
Para el cálculo del índice gonadosomático (IGS) es necesario extraer las gónadas de una cierta cantidad de reproductores para estimar el estado de madurez sexual de todos los reproductores.
gráfica que muestre la tendencia que tiene este índice a través del tiempo y así determinar la temporada de desove. Paralelamente a la evolución del IGS, los ovocitos tienen un desarrollo continuo que conduce a su maduración. Esto se traduce en una serie de cambios a nivel hormonal y celular, los cuales se ven reflejados en el aumento de tamaño, mismos que se utilizan para definir estados de maduración ovocitaria (Figura 7) (Toledo et.al., 1994).
Figura 7. Evolución del índice gonadosomático y diámetro de ovocitos de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en la granja piscícola de Río Blanco, Chile (1992-1993)
(fuente: Toledo et al., 1994).
1.2.5.2 Biopsias ováricas
para facilitar la expulsión de los huevos. Estos procedimientos pueden ser traumáticos para la hembra, pero permiten observar los ovocitos en fresco. En el caso de la trucha arcoíris se considera que los ovocitos con un diámetro mayor a 3.2 mm están maduros y listos para ser ovulados y fertilizados (Bromage y Cumaranatunga, 1988).
Por otro lado, recientemente se ha venido utilizando otro método de selección de reproductores basado en el factor de condición somático relativo (Kn o índice de robustez) de los individuos, el cual se obtiene mediante el cociente del peso total registrado y el peso teórico esperado (Pt/Pe) de cada individuo (Arias-Castellanos et. al., 2002). Este índice ha sido correlacionado con el ciclo de desarrollo gonadal en
peces. Este método disminuye la manipulación excesiva de los individuos mejorando el bienestar de los mismos (Senhorini y Landines-Parra, 2004).
1.2.5.3 Histología
Tabla 1. Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis Endógena (estadios I, II y III) de las hembras de trucha arcoíris (Daza-Ardila y Bejarano-Montero, 1996).
CARACTERÍSTICAS DESCRIPCIÓN
Diámetro en micras Mayores de 20 y menores de 400 Relación del núcleo con H&E Débilmente basofílico
Forma del núcleo Circular prominente
Nucléolos En promedio 20
Reacción del citoplasma con H&E Desde basofílico a débilmente acidofílico
Organización de citoplasma Homogéneo
Presencia de zona radiata No
Presencia de capa folicular Si
Presencia de teca SI, (excepto en el ovocito I)
Tabla 2. Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis Exógena (estadios IV, V, VI y VII) de las hembras de trucha arcoíris (Daza-Ardila y Bejarano-Montero, 1996).
CARACTERÍSTICAS DESCRIPCIÓN
Diámetro en micras Mayores de 400 y menores de 2500 Reacción del núcleo con H&E Débilmente basofílico
Forma del núcleo Ovalado con contornos irregulares
Nucléolos En promedio 20
Reacción del citoplasma con H&E Acidofílico
Organización del citoplasma Desde vesículas hasta lamina de vitelo
Presencia de zona radiata Si
Estrías en la zona radiata Si, perpendiculares al ovocito
1.2.5.4 Análisis de la variación hormonal y de vitelogenina en la maduración de la trucha
Debido a la necesidad de desarrollar una técnica de medición directa de vitelogenina se han generado técnicas como la difusión radial, aglutinación, o inmuno-electroforésis, que a pesar de ser específicos no son muy precisos. De esta manera se desarrollaron radio-inmunoensayos (RIA), que son más sensibles pero que requieren de equipo caro y sofisticado. Otro método importante es el ensayo inmuno-absorbente ligado a enzimas (ELISA) que cubre las desventajas de las otras técnicas de inmunodetección, además de ser rápido y muy sensible (Bonnet et al., 1997); sin embargo, este último método sigue siendo costoso.
Actualmente se cuentan con un procedimiento de diagnóstico ELISA para medir hormonas en trucha. En el caso de los machos, el andrógeno que habitualmente se considera para evaluar características sexuales es la testosterona y más específicamente la 11-ketotestosterona (11-KT), que se aisló primeramente de incubaciones de salmón del Atlántico (Idler y MacNab, 1967). Desde entonces se ha identificado en el plasma de los machos de numerosos teleósteos, y está involucrado en la espermatogénesis, en el desarrollo de características sexuales secundarias y en el comportamiento reproductivo (Shultz, et.al., 2005).
Existen además en el mercado paquetes de diagnóstico desarrollados para medir fácilmente la vitelogenina y/o la testosterona en el plasma de peces, y mejor aún específicos para salmónidos como la trucha arcoíris.
1.2.5.5 Ultrasonido
Novelo y Tiersch (2012) utilizaron el método de ultrasonido como una herramienta para identificar el sexo en los peces y sugieren procedimientos para estandarizar índices cualitativos y cuantitativos para estimar el grado de madurez en especies acuáticas, mediante la evaluación del tamaño de las gónadas y del tamaño de los ovocitos. Otra forma de diferenciar los cambios en las gónadas es la densidad del tejido al observarlos en las ecografías, dependiendo de los tonos de grises, los tejidos se clasifican en: Anecoico: ausencia de señal de sonido (Negro); Hiperecoico: señales de mayor intensidad de sonido (blanco); Hipoecoico: señal de menor intensidad (más negro que gris); Isoecoico: señal de intensidad intermedia (tonalidad de grises) (Moghim et al., 2002).
El uso de ecografías para la identificación del sexo y del estadio de madurez en las hembras ha resultado ser un método de fácil aplicación, rápido y no invasivo (Evans et al., 2004). La identificación del sexo es directa en los individuos adultos, las gónadas en
Tabla 3. Especies de peces en las que se ha implementado el ultrasonido en cuestiones reproductivas (Novelo y Tiersch, 2012, modificada).
Especie Referencia
Peces de agua dulce
Esturión estrellado Acipenser stellatus Moghim et al. (2002) Esturión nariz de pala Scaphirhynchus platorynchus Colombo et al. (2004)
Esturión nariz de pala y esturión pálido S. albus Wildhaber et al. (2005)
Esturión nariz de pala Wildhaber et al. (2007) Esturión nariz de pala y esturión pálido Bryan et al. (2007)
Noturus placidus Bryan et al. (2005)
Bacalao Maccullochella peelii Newman et al. (2008)
Peces marinos y anádromos
Arenque del pacífico Clupea pallasii Bonar et al. (1989)
Bacalao del atlántico Gadus morhua Karlsen and Holm (1994), Davie et al. (2003) y McEvoy et al. (2009)
Platija Verasper moseri Matsubara et al. (1999) Halibut Hippoglossus hippoglossus Shields et al. (1993) Halibut del atlántico, lenguado Pseudopleuronectes
americanus, platika aleta amarilla Limanda
ferruginea y el eglefino Melanogrammus aeglefinus.
Martin-Robichaud and Rommens (2001)
Salmon del atlántico Salmo salar Mattson (1991) Salmon coho Oncorhynchus kisutch Martin et al. (1983)
Trucha arcoiris O. mykiss Evans et al. (2004), Evans et al. (2004) Robalo Morone saxatilis Will et al. (2002), Blythe et al. (1994) y
Jennings et al. (2005) Tiburón nodriza Jennings et al. (2005) Carrier et al. (2003) Tiburon gato Scyliorhinus canicula y raya Raja
clavata
1.3 Justificación
Entre las diferentes especies de truchas nativas que se encuentran en México, la trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss nelsoni presenta un gran potencial para ser cultivada, ya que puede tener una alta tasa de crecimiento en condiciones favorables, es una especie no migratoria y además, soporta variaciones amplias de flujo y temperatura en su medio natural. Sin embargo, son pocos los esfuerzos que se han realizado por desarrollar la técnica de su cultivo.
Para desarrollar la técnica de cultivo es necesario contar con la información básica de la biología y ecología de la especie. Actualmente se cuenta con información suficiente sobre la biología y ecología de esta trucha, que favorece el desarrollo de su cultivo. En Baja California, se mantuvo a la trucha de SPM en condiciones de laboratorio con fines reproductivos en la Universidad Autónoma de Baja California (UABC), lográndose la reproducción ex situ y la descripción del desarrollo ontogénico (Ruiz-Campos, 1994).
Garduño-Franco (1995) llevó a cabo la fertilización e incubación ex situ de manera simultánea de la trucha de SPM y de la trucha arcoíris (importada de la piscifactoría de El Zarco, Estado de México) y evaluó de modo comparativo la tasa de fertilización, supervivencia, y crecimiento somático hasta la fase de juvenil.
Aguilar-Juárez (2010), mantuvo ejemplares de la trucha de SPM en condiciones de laboratorio, utilizando un sistema de fotoperiodo artificial y un sistema cerrado de recirculación que permitió desarrollar metodologías de conservación de los espermatozoides a corto y largo plazo. Sin embargo, tuvo problemas con la maduración de las hembras, por lo que falta afinar la técnica de maduración de esta trucha con el control del fotoperiodo y la temperatura.
alimentos, la contribución a los medios de subsistencia y la generación de ingresos para los diferentes sectores interesados en la actividad acuícola de esta especie. Si esta actividad se adopta, las comunidades locales se verán beneficiadas con una nueva alternativa de subsistencia aumentando su nivel económico. Este cultivo también puede ser una alternativa para reforzar a corto plazo la población natural mediante el suministro de semilla al medio en caso de que el número de truchas de SPM se vea drásticamente reducida.
Capítulo 2. Hipótesis y Objetivos
2.1 Hipótesis
El uso del ultrasonido es una técnica rápida y no invasiva para la determinación del sexo y el estado de desarrollo gonádico de la trucha de San Pedro Mártir, Oncorhynchus mykiss nelsoni.
2.2 Objetivo General
Desarrollar un protocolo para la determinación del sexo y la evaluación de madurez sexual de la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus mykiss nelsoni utilizando el ultrasonido.
2.3 Objetivos particulares
1. Acondicionar y mantener ejemplares de la trucha de SPM silvestres en un sistema de recirculación acuícola.
2. Madurar sexualmente a la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura en un sistema de recirculación acuícola.
3. Estandarizar la técnica del ultrasonido para la determinación del sexo y la evaluación del estado de desarrollo gonádico de la trucha de SPM.
Capítulo 3. Metodología
3.1 Recolección de organismos 3.1.1 Zona de captura
Las truchas fueron recolectadas en el Arroyo San Rafael en el sitio conocido como Rancho Mike´s Sky, en la región noroeste de la Sierra de San Pedro Mártir, Baja California (coordenadas geográficas: 31°05´49.7´´ N y 115°37´18.4´´ W; Figura 5). Este arroyo se encuentra a una altura de 1,233 metros sobre el nivel del mar (msnm) y se caracteriza por ser estrecho (5.58 m) y poco profundo (0.34 m).
3.1.2 Recolección de organismos
El día 28 de Septiembre de 2012, un total de 69 truchas fueron capturadas con un equipo de electropesca (AC Smith-Root 15-B POW, Vancouver, Washington, USA) utilizando un potencia de descarga entre 400 y 600 volts en un tramo del arroyo de 500 metros. Las truchas inmovilizadas y atraídas hacia el ánodo del equipo de electropesca fueron capturadas con una red de mano e inmediatamente colocadas en cubetas con agua del arroyo, y de ahí transferidas a una jaula colocada en el mismo arroyo (Figura 8A).
Posteriormente, los organismos capturados fueron colocados en bolsas de plástico con agua del arroyo y suplementadas con oxígeno para mantener las condiciones de concentración a saturación. Las bolsas debidamente selladas fueron colocadas en hieleras con hielo para su transporte al laboratorio húmedo del Departamento de Acuicultura del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, B. C. (CICESE), en donde fueron colocadas en un sistema de recirculación acuícola (SRA) (Figura 8B).
3.1.3 Parámetros ambientales de la zona de captura
Figura 8. A) Captura de truchas de San Pedro Mártir en el Arroyo San Rafael (Rancho Mike´s Sky) con equipo de electropesca y red de mano. B) Preparación las bolsas de
plástico con agua y oxígeno para el transporte de las truchas capturadas.
A
3.2 Acondicionamiento y mantenimiento de organismos 3.2.1 Sistema de recirculación acuícola
Una vez en el laboratorio húmedo, las bolsas con las truchas (n= 69) se colocaron en los tanques de cultivo del sistema de recirculación acuícola (SRA) y se liberaron cuando que la temperatura del agua de la bolsa y el agua de los tanques fue igualada.
El SRA consistió en cuatro tanques de fibra de vidrio de 540 litros de color azul de fondo plano conectados a un mismo drenaje que lleva el agua a un tanque de compensación de 300 litros. El agua era circulada por una bomba magnética de 1/12 hp (3MD-SC) hacia un biofiltro de medio granular de cuentas plásticas de 0.026 m3 de capacidad (BBF1, Aquatic Ecosystem) con el fin de remover compuestos nitrogenados y capturar sólidos. El agua pasaba por una bomba de calor de ½ caballo de fuerza (Aqualogic, 4x) a fin de mantener la temperatura. La aireación se suministró en forma constante utilizando las líneas de aire del departamento de Acuicultura.
El mantenimiento del SRA se realizó diariamente con recambios de agua del 10% después de haber proporcionado la segunda ración alimenticia. Debido a que el agua utilizada en los recambios provenía del sistema de agua municipal, ésta se mantenía en otro tanque con aireación constante por 24 horas para eliminar el cloro (ver anexo 1 para leer acerca del procedimiento operacional para el mantenimiento de los ejemplares).
3.2.2 Registro de los parámetros físico-químicos del sistema de recirculación acuícola
se midieron por el método de diasociación de Griess y Llosvay (1989), donde el ácido nitroso se convierte en un compuesto rosado cuya absorbancia es proporcional a la cantidad de nitritos inicialmente presente. La alcalinidad (mg de CaCO3/L) se midió mediante titulación con una solución de ácido sulfúrico de normalidad conocida y utilizando fenolftaleína y verde de bromocresol como indicadores. Todos los parámetros determinados semanalmente se hicieron de acuerdo al manual de Standards Methods (Dean-Adams, 1990).
3.2.3 Régimen alimenticio
Las truchas fueron alimentadas los primeros días ad libitum con mísidos congelados (Mysis relicta, Aquatic Ecosystem). Después de tres semanas las truchas se alimentaron con una mezcla de mísidos descongelados y alimento extruido a saciedad aparente. Una semana después se proporcionó el alimento con una tasa de alimentación del 2% de su peso corporal húmedo en una proporción 1:1 (mísidos:pelet). La proporción de alimento extruido se fue modificando gradualmente hasta que las truchas aceptaron el alimento balanceado (aproximadamente dos meses) (para ver el acondicionamiento de las truchas a alimento comercial revisar Anexo 2).
3.2.4 Registros biométricos
Las truchas fueron anestesiadas con aceite de clavo antes de realizar las biometrías para evitar estrés. En una cubeta de 5 litros se agregaron aproximadamente 3 litros de agua de los tanques de cultivo a la cual se le agregaron 0.1 mL de aceite de clavo grado reactivo (95% Sigma-Aldrich). Una vez preparada la solución anestésica las truchas se colocaron de manera individual en la cubeta (1 minuto aproximadamente) hasta que éstas quedaron adormecidas y se podían manipular fácilmente para registrar el peso (g) y la longitud total (mm) (Figura 9).
registro biométrico se realizó al mismo tiempoque los muestreos de ultrasonido y de los niveles de vitelogenina y testosterona en el plasma sanguíneo.
Una vez que se tuvieron todos los datos de peso y longitud se determinó la relación peso-longitud mediante la ecuación: W = a Lb, con el programa FISHPARM (Saila et al., 1988); donde W = peso calculado (g), L = longitud total (mm), “a” y “b” son constantes obtenidas a partir de los datos de peso y longitud observados. Para determinar si el crecimiento es de tipo isométrico (b = 3.0) o alométrico (b > 3.0 o b < 3.0), se utilizó una prueba t Student (Sokal y Rohlf, 1981).
Figura 9. Ejemplar macho de trucha de San Pedro Mártir colocado en una balanza digital (0.1 g) para su pesaje (A) y en un ictiómetro (0.1 cm) para la medición de su longitud total
(B).
A
3.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura
3.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo
Las truchas capturadas ya habían iniciado su proceso de maduración sexual natural, por lo que se les dieron las condiciones necesarias de fotoperiodo y temperatura para que continuaran con su ciclo reproductivo en un SRA.
3.3.1.1 Sistema y condiciones de fotoperiodo
Para inducir a los organismos a la maduración sexual se diseñó y construyó un sistema de iluminación, el cual constó de lámparas de luz blanca y luz blanca cálida (25 y 20 watts, respectivamente) conectadas a un temporizador (marca Brinks) atornilladas a una base de metal (Figura 10). El cuarto donde se encontraban los tanques fue aislado de la entrada de luz natural. Las lámparas se colocaron por encima del centro de los tanques a una distancia de 1 m sobre la superficie del agua, de tal forma que los tanques recibían de 500 a 1000 luxes de iluminación. Los luxes fueron medidos con un luxómetro (Tradecable®, Cotrol Company) cada 15 días para reacomodar las lámparas en el sistema de iluminación (Figura 11).
Figura 10. Sistema de iluminación utilizado para modificar el fotoperiodo en el sistema de recirculación acuícola.
Figura 11. Luxómetro utilizado en la medición de luxes en el sistema de iluminación (izquierda) y temporizador utilizado para encender y apagar las lámparas del sistema de
3.3.1.2 Régimen de temperatura
La temperatura que se utilizó para estimular el desarrollo gonádico fue de 17°C durante la temporada de otoño y de 11°C durante la temporada de invierno. La temperatura se controló con ayuda de una bomba de calor de ½ caballo de fuerza (Aqualogic, 4x). Este régimen de temperatura fue basado en las temperaturas promedio registradas estacionalmente y en ciclos de 24 horas en el Arroyo San Rafael de la Sierra San Pedro Mártir (Ruiz-Campos, 1993, 1994).
3.3.1.3 Alimento para estimular la maduración sexual
La alimentación se proporcionó diariamente ad libitum dos veces al día: una por la mañana y otra por la tarde. El alimento suministrado a las truchas fue el salmonado extruido flotante de 4.8 mm con 42% de proteína y 10% de grasa, de la marca NUTRIPEC (Purina México).
3.3.1.4 Desoves
3.3.2 Acortamiento del ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura
Una vez probado el SRA y las condiciones de fotoperiodo y de temperatura se procedió a acortar el ciclo reproductivo de las truchas de SPM para realizar la estandarización del ultrasonido y evaluar el estado de madurez sexual de estas truchas desde el inicio del ciclo reproductivo. La maduración sexual se monitoreó mensualmente mediante la visualización de los órganos sexuales de las truchas utilizando el ultrasonido y se corroboró el estado de madurez sexual con la medición de testosterona en machos y vitelogenina en hembras.
3.3.2.1 Sistema, condiciones de fotoperiodo y régimen de temperatura
Después del primer desove, las truchas fueron marcadas con elastómeros en el párpado adiposo para diferenciar el sexo y redistribuidas en los cuatro tanques de cultivo a una misma biomasa (966.75 g/tanque).
3.3.2.2 Alimentación
El alimento se proporcionó diariamente a saciedad aparente dividida en dos raciones: una por la mañana y otra por la tarde. El alimento utilizado para la maduración de las truchas fue extrusado flotante de tamaño 4.8 mm con una composición proximal de 42% de proteína y 10% de grasa (NUTRIPEC, Purina México).
3.3.2.3 Desoves
Del 25 al 28 de octubre de 2013 se realizaron los desoves de las truchas y se fertilizaron mediante el método en seco descrito previamente. Los huevos obtenidos de cada trucha hembra fueron estimados mediante la relación entre el número de huevos por gramo multiplicado por el peso total de los huevos. Los huevos producidos por las hembras confinadas en un tanque se colocaron en una charola de incubación. Una vez cuantificados los huevos, se determinó la fecundidad relativa de las truchas en función del peso y la longitud total.
3.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido 3.4.1 Descripción del equipo utilizado
Figura 12. Equipo de ultrasonido utilizado para el registro del desarrollo gonadal de la trucha de San Pedro Mártir mediante la interpretación de ecografías.
3.4.2 Estandarización del método
Para configurar el equipo de ultrasonido y así optimizar la resolución y facilitar la visualización de los órganos y localizar la región de las gónadas, se disecaron tres truchas hembras en diferentes meses (Figura 13a-f). Los ovocitos de las hembras en diferentes etapas de maduración fueron medidos directamente con el ultrasonido y extraídos para corroborar el tamaño con un vernier. En el caso de los machos, se disecaron dos ejemplares para observar la forma, tamaño y ubicación de los testículos (Figura 13g).
Tabla 4. Parámetros del equipo de ultrasonido estandarizados para la observación de las gónadas.
Parámetros: valor
Frecuencia (MHz): 9 MHz Correlación del marco (FC): 75%
Ganancia: 102 Procesamiento de imagen (IP): 2
Cercanía (Near): -16 IE: 0
Lejanía (Far): 08 ZOOM: *2.4 y 3
Imagen dinámica (Dyn): 27 Modo de escaneo: Modo-B Enfoque (Focus): 1
3.4.3 Registro ecográfico de gónadas mediante ultrasonido
Una vez estandarizado el método de ultrasonido, las truchas anestesiadas se colocaron en un recipiente con agua en posición dorsal (con el vientre hacia arriba) para capturar las imágenes de las gónadas en posición transversal, utilizando la sonda a 9 MHz (Figura 14). Con movimientos anteriores y posteriores de la sonda se visualizaron los ovocitos o los testículos en hembras y machos, respectivamente.
Figura 13. Estandarización del método del ultrasonido en la trucha de SPM. a) Trucha de SPM anestesiada con aceite de clavo y colocada en un ictiómetro; b) disección de la parte ventral de la trucha de SPM; c) visualización de los órganos de la trucha de SPM; d)
localización de la gónada de la trucha de SPM; e) trucha de SPM disecada cargada con ovocitos maduros; f) ovocitos de trucha de SPM extraídos para su conteo y medición; g)
Figura 14. Posición de la trucha al momento de manejar la sonda para la toma de las ecografías de las gónadas.
3.5 Evaluación de los cambios de vitelogenina en plasma sanguíneo 3.5.1 Extracción y purificación de vitelogenina
Figura 15. Extracción de sangre de la vena caudal de una trucha.
3.5.2 Determinación de la concentración de vitelogenina en plasma sanguíneo mediante el método ELISA
La concentración de vitelogenina sérica se determinó mediante el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo a la metodología descrita por el proveedor (Biosense, Laboratories). La lectura de la reacción ELISA se realizó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Las concentraciones de vitelogenina fueron calculadas a partir de una curva de calibración y expresadas en mg/mL.
3.6 Evaluación de los cambios de testosterona en plasma sanguíneo 3.6.1 Extracción y purificación de testosterona
3.6.2 Medición de la concentración de testosterona en plasma sanguíneo mediante el método ELISA
Se determinó la concentración de testosterona mediante el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo a la metodología descrita por el proveedor (ABRAXIS) (Figura 16). La lectura de la reacción ELISA se realizó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Las concentraciones de testosterona fueron calculadas a partir de la curva de calibración promedio y expresadas en pg/mL.
3.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez sexual
Capítulo 4. Resultados
4.1 Recolección de organismos
Todos los ejemplares de trucha transportados llegaron de manera exitosa al laboratorio del Departamento de Acuicultura de CICESE para su consecuente aclimatación en los tanques de cultivo. Los valores promedio de los parámetros físico-químicos registrados durante la captura fueron: temperatura de 21.5°C, pH 9.75 y conductividad de 0.321 mS/cm (en el Anexo 1 se resume el procedimiento operacional para el mantenimiento de las truchas).
4.2 Acondicionamiento y mantenimiento de truchas de SPM
La aclimatación de las truchas a las condiciones del sistema de recirculación acuícola (SRA) duró aproximadamente media hora. Después de ser colocadas en el sistema, las truchas estuvieron estresadas un par de días, lo cual fue notorio debido a la coloración oscura que presentaron, para posteriormente regresar a su coloración normal característica de esta subespecie. Después de este tiempo las truchas se habituaron al tamaño y forma de los tanques de cultivo, ya que no se observaron inquietas.
La adaptación de los individuos silvestres a las condiciones de cautiverio se vio reflejada en una alimentación activa. Una vez que las truchas aceptaron el alimento comercial (dos meses aproximadamente) éstas se acercaban a la superficie cuando notaban la presencia de alguien ya que lo relacionaron con la alimentación (Figura 17).
Figura 17. Truchas de SPM ya acondicionadas a los tanques de cultivo.
La supervivencia final de las truchas de SPM fue de 63.8%. Esta supervivencia se debió a que saltaron fuera de los tanques. Las truchas muertas fueron disecadas para hacer la verificación de los órganos con respecto a su disposición y contrastar con las imágenes del ultrasonido. No se encontraron mortalidades asociadas a enfermedades o mala calidad del agua en el SRA.
4.2.1 Parámetros de calidad de agua
Durante el periodo de doce meses que duraron las truchas en cautiverio en el SRA (septiembre de 2012 a septiembre de 2013), los parámetros de la calidad del agua fueron los siguientes: 0.086 ± 0.056mg/L de NAT, 0.099 ± 0.089 mg/L para nitritos y 53 ± 18.77 mg/L para nitratos. Los valores de alcalinidad y pH fueron 135.29 ± 4.10 mg CaCO3/L y 7.56 ± 0.19 respectivamente. En cuanto a la concentración de oxígeno, esta se mantuvo en 6.39 ± 0.18 mg/L (las fluctuaciones de los parámetros de calidad de agua se pueden ver en el Anexo 7).
4.2.2 Registros biométricos
La ecuación de la relación peso-longitud, para los organismos mantenidos en cautiverio durante 13 meses fue: W = 0.000005052 LT3.136 (r2 = 0.964) (Figura 19). El factor de condición de Fulton promedio encontrado en estas truchas fue de 1.04 ± 0.14 (Figura 20). El factor de condición relativo (Kn) para las truchas mantenidas en estas condiciones registró un promedio de 1.01 ± 0.14 (Figura 21), siendo similar al factor de condición de Fulton.
El factor de condición relativo fue utilizado debido a que esta trucha exhibe un crecimiento de tipo alométrico (b diferente de 3.0), tanto en el medio silvestre como en condiciones de cautiverio (b = 3.136 > 3.0; Prueba t = 4.37, p < 0.005). Valores ≥ 1.0 representan condiciones fisiológicas y ecológicas óptimas para los individuos (Ruiz-Campos et al., 1997), por lo que los valores promedio registrados en este trabajo estuvieron en el óptimo indicando la buena salud de los organismos.
peso de las truchas disminuyó en esta misma fecha, que coincidió con la expulsión de los gametos (óvulos y esperma), mientras que la longitud aumentó.
Al momento de la captura, las truchas pesaron en promedio 37.5 ± 15 g (intervalo de 16 a 88 g) y midieron 149 ± 18.8 mm (intervalo de 121 a 206 mm) en longitud total. Después de 12 meses en condiciones de cautiverio, los organismos alcanzaron un peso de 203.4 ± 11.7 g (intervalo de 191.5 a 215.6 g) y midieron 267 ± 12 mm (intervalo de 255 a 284 mm) en longitud total (Figuras 22 y 23). La tasa de crecimiento en peso fue de 0.46 g/día y en longitud de 0.3 mm/día. El crecimiento somático en peso y longitud de las truchas se incrementó notablemente a partir del octavo de mes en condiciones de cautiverio.
El aceite de clavo resultó ser un anestésico eficaz y seguro para esta trucha. La recuperación de las truchas en un tanque de recuperación fue rápida (~5 minutos) y total en todaslas truchas.
Figura 19. Relación peso-longitud de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. Los puntos negros indican los valores observados y los puntos blancos indican los valores
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha 0.7
0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3
KLT
Figura 20. Factor de condición de Fulton calculado para las truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. El símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha 0.65
0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20
Kn
Figura 21. Factor de condición relativo (Kn) calculado para las truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. El símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha 20
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
P
e
so
(
g
)
Figura 22. Crecimiento en peso de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. El
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha 120
140 160 180 200 220 240 260 280
LT
(
mm)
Figura 23. Crecimiento en longitud total (LT) de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación
4.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura
4.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo
Se logró continuar con el ciclo natural de maduración sexual de la trucha mediante las condiciones mantenidas en el SRA. El 79.2% de las hembras maduraron y la fecundidad promedio de éstas fue de 2.1 huevos por cada gramo de peso corporal. La fecundidad absoluta promedio alcanzada fue de 163 ± 55 huevos. Los huevos maduros expulsados presentaron un promedio de 4.1 mm de diámetro. El 78.9%, de los machos liberaron esperma al momento de aplicar una presión abdominal. El volumen de esperma obtenido por macho osciló entre 0.12 y 0.45 mL. Se logró realizar la fertilización de los huevos de trucha de SPM y se produjeron 49 alevines de esta trucha en cautiverio con el fotoperiodo natural.
4.3.2 Acortamiento el ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura.
Figura 24. Jeringas con esperma y ovocitos de la trucha de SPM obtenidos de los desoves.
4.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido
En todas las hembras disecadas se observaron ovocitos. De acuerdo al grado de madurez sexual se encontraron ovocitos de diferentes tamaños. Fue posible realizar una identificación del sexo (hembras: dos tejidos con forma granular; y machos: dos tejidos con forma lobular, posicionados entre el estómago y el riñón de la trucha en ambos casos) y determinar su desarrollo de madurez midiendo los ovocitos con el ultrasonido y comparando dichas mediciones con los mismos ovocitos medidos con el vernier. En general, las mediciones realizadas a los ovocitos con el ultrasonido coincidieron con las mediciones realizadas con el vernier a los ovocitos extraídos (Figura 25).
En los machos la evaluación del estado de madurez sexual fue difícil ya que en las ecografías no se mostró una diferencia progresiva en el color de la imagen debido a la densidad del tejido; sin embargo, al final de los muestreos cuando las truchas se encontraban maduras, fue posible observar los testículos como una imagen más clara y con apariencia estriada.
Figura 25. Captura de imagen de un ovocito de la trucha de SPM mediante ultrasonido y verificación de su tamaño con el uso de un vernier.
4.5 Evaluación de los cambios en la concentración de vitelogenina en el plasma sanguíneo