Síntesis de nanopartículas de plata y sus aplicaciones en células

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(1)Universidad de Sonora División de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Investigación en Física. Síntesis de Nanopartículas de Plata y sus Aplicaciones en Células TESIS Que para obtener el Grado de: Doctorado en Ciencias (Física) Presenta: Ericka Rodríguez León. Hermosillo, Sonora. Junio de 2013.

(2) Universidad de Sonora Repositorio Institucional UNISON. Excepto si se señala otra cosa, la licencia del ítem se describe como openAccess.

(3) APROBACIÓN DE TESIS. Los miembros del jurado designado para revisar la tesis de doctorado de ERICKA RODRÍGUEZ LEÓN han determinado que el trabajo cumple satisfactoriamente como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en Ciencia de Materiales otorgado por la Universidad de Sonora.. __________________________________ Dr. Amir Maldonado Arce Presidente. __________________________________ Dr. Efraín Urrutia Bañuelos Secretario. __________________________________ Dr. Martín Pedroza Montero Sinodal _________________________________ Dr. Raúl Pérez Salas Sinodal. __________________________________ Dr. César Márquez Beltrán Sinodal Externo.

(4) Dedicatorias A mis hijos Felipe, Alex y Marcos: ustedes son mi inspiración, con su inteligencia y curiosidad iluminan mi vida. A Ramón con quien he compartido momentos extraordinarios. A Gloria Elena León Paz y Enrique Rodríguez Z. mis amados padres, cómplices en la aventura del conocimiento. A mis suegros Magda Irma Palomares Ramírez y Ramón Iñiguez Franco por su apoyo permanente y en especial durante momentos difíciles. A Roberto, Cristina, Liz y Vanesa mis queridos cuñado, hermana y sobrinas. A Jorge, Claudia, Andrea, Agustín, Magda, Agustín, Daniel y Alejandra mis queridos cuñad@s y sobrin@s. A mi abuela Herlinda Zazueta Flores a quien adoro y de quien me siento muy orgullosa. A mis queridas tías María del Carmen Rodríguez Zazueta, Olivia Rodríguez Zazueta, Martha León Paz, Silvia León Paz y Micaela Paz Valencia por su apoyo y amor incondicionales. Algún día quisiera ser como mi maestra Virginia Ramírez Heredia, gracias por su ejemplo. A Clotilde Paz Valencia, Juan José León Gracia, Ignacio Rodríguez Leyva y Ramón Zazueta Fierro forjadores de una gran familia y los arquitectos de la ruta que nosotros alcanzamos gracias a su esfuerzo y a quienes siempre recordaremos..

(5) Agradecimientos Al Dr. Amir Maldonado, mi director de tesis, Dra. Judith Tánori, Dr. Ramón Iñiguez Palomares, Dr. Efraín Urrutia B. mi codirector de tesis, Dra. Rosa Elena Navarro G., Dr. José Ronaldo Herrera Urbina por sus comentarios, observaciones y críticas durante todo el transcurso del desarrollo de este proyecto. Al. Dr. Ramón Enrique Robles Zepeda y a la Dra. Dora Edith Valencia Rivera por su apoyo y asesoría en el estudio de la interacción de nanopartículas de plata en líneas celulares, realizado en el Laboratorio de Productos Naturales del Departamento de Ciencias Químicas de la Universidad de Sonora. Al Dr. Martín Pedroza, Dr. Raúl Pérez Salas y Dr. César Márquez Beltrán por su asesoría como parte del comité de tesis. A todos mis compañeros del Laboratorio de Biofísica del Departamento de Física de la Universidad de Sonora. Gran parte de este trabajo fue realizado con el apoyo del Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Sonora. Al Dr. Felipe Ramos M., Dr. Alvaro Posada, Dr. Mario Flores, Dr. Marcelino Barboza, Dr. Raúl Pérez y Dr. Raúl García Llamas por su apoyo y asesoría en el transcurso de la aprobación de los requisitos académicos necesarios para la obtención del Doctorado, todo ellos maestros del Departamento de Investigación en Física de la Universidad de Sonora. Al M.C. Pedro Sabori del Área de Gestión e Innovación Tecnológica de la Universidad de Sonora por su asesoría y apoyo en el Trámite de Solicitud de dos Patentes.. A la Sra. Sandra León por su amabilidad y eficiencia en su trabajo durante mi estancia en el DIFUS. Al Conacyt por la beca de Doctorado No. de becario 88603. Este trabajo fue financiado parcialmente por los proyectos Conacyt: “Difusión en Membranas Fluidas Heterogéneas” (registro 128192) y “Fabricación de nanomateriales en medios confinados: microemulsiones y espumas” (registro 105236)..

(6) Contenido Dedicatorias -------------------------------------------------------------------------------------------- iv Agradecimientos ---------------------------------------------------------------------------------------- v Lista de Figuras ------------------------------------------------------------------------------------- vi Lista de Tablas -------------------------------------------------------------------------------------- xi Introducción --------------------------------------------------------------------------------------------- 1 Capítulo 1 Moléculas Autoensamblantes y Nanopartículas de Plata ------------------------- 4 1.1 Microemulsiones -------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.1 Solventes polares y solventes no polares ---------------------------------------------------------------------- 6 1.1.2 Los surfactantes --------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 1.1.3 Diagramas de fases------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 1.1.4 Formación de estructuras en microemulsiones -------------------------------------------------------------- 13. 1.2 Estructura y Síntesis de Nanopartículas ------------------------------------------------ 14 1.2.1 Métodos de Preparación----------------------------------------------------------------------------------------- 15. 1.3 Mesofases hexagonales ---------------------------------------------------------------------- 18 1.4 Alineación de nanopartículas en fases hexagonales ----------------------------------- 18 Capítulo 2 Síntesis Verde de Nanopartículas de Plata ------------------------------- 21 2.1 Compuestos utilizados en la síntesis "verde" de nanopartículas ------------------ 21 2.2 Síntesis de nanopartículas de plata usando taninos condensados ------------------ 24 Capítulo 3 Técnicas de Caracterización Microestructural ------------------------------------ 27 3.1 Técnicas de caracterización de microemulsiones ----------------------------- 27 3.1.1 Inspección visual ------------------------------------------------------------------------------------------------- 27 3.1.2 Birrefringencia de las microemulsiones ---------------------------------------------------------------------- 28. ii.

(7) 3.1.4 Mediciones de conductividad eléctrica y de viscosidad --------------------------------------------------- 29 3.1.5 Observación por Microscopía Electrónica mediante Tinción Negativa --------------------------------- 30. 3.2 Técnicas de caracterización de nanopartículas ---------------------------------------- 32 3.2.1 Espectroscopía de Ultravioleta-Visible (UV-Vis) ---------------------------------------------------------- 32 3.2.2 Microscopía Electrónica de Transmisión -------------------------------------------------------------------- 34 3.2.3 Microscopía Electrónica de Transmisión de Alta Resolución -------------------------------------------- 37 3.2.4 Difracción de electrones ---------------------------------------------------------------------------------------- 38 3.2.5 Espectroscopía de Energía Dispersiva de Rayos X (EDS) ------------------------------------------------ 40. Capítulo 4 Aplicaciones de nanopartículas en células ---------------------------------------- 44 4.1 Las líneas celulares --------------------------------------------------------------------------- 44 4.2 Tipos de interacciones entre nanopartículas y moléculas --------------------------- 45 4.3 Mecanismos de interacción entre nanopartículas y células------------------------- 45 4.4 Apoptosis y necrosis ------------------------------------------------------------------------- 48 4.5 Apoptosis generada por nanopartículas de plata -------------------------------------- 50 4.6 La técnica de MTT --------------------------------------------------------------------------- 52 Capítulo 5 Resultados --------------------------------------------------------------------------- 53 5.1 Microemulsiones No Acuosas -------------------------------------------------------- 53 5.1.1 Diagrama de fases ------------------------------------------------------------------------------------------------ 53 5.1.2 Caracterización de la Viscosidad ------------------------------------------------------------------------------ 56 5.1.3 Conductividad eléctrica ----------------------------------------------------------------------------------------- 58 5.1.4 Birrefringencia ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 59. 5.2 Nanopartículas de Plata Síntesis en Microemulsiones ------------------------------- 61 No Acuosas ----------------------------------------------------------------------------------------- 61. iii.

(8) 5.2.1 Síntesis en Microemulsiones directas ------------------------------------------------------------------------- 61 5.2.2 Resultados de microscopía electrónica ----------------------------------------------------------------------- 63 5.2.3 Síntesis de Nanopartículas en Microemulsiones inversas ------------------------------------------------- 68 5.2.4 Resultados de microscopía electrónica ----------------------------------------------------------------------- 69 5.2.5 Evolución temporal de la Microemulsión I 4 ----------------------------------------------------------------- 71 5.2.6 Espectroscopía de Energía Dispersiva de Rayos X --------------------------------------------------------- 71 5.2.7 Birrefringencia de Microemulsiones Inversas --------------------------------------------------------------- 73 5.2.8 Cálculo del parámetro de red de la fase hexagonal --------------------------------------------------------- 75 5.2.9 Tinción negativa y nanopartículas alineadas ---------------------------------------------------------------- 77 5.2.10 Variando la concentración de Nitrato de Plata ------------------------------------------------------------- 79. 5. 3 Síntesis de nanopartículas de plata utilizando polifenoles de origen natural -- 83 5.3.1 Espectro Uv-Vis para el extracto Rh -------------------------------------------------------------------------- 84 5.3.2 Control negativo abiótico --------------------------------------------------------------------------------------- 86 5.3.3 Análisis microestructual de la síntesis de nanopartículas ------------------------------------------------- 87 5.3.4 Cinética sin luz --------------------------------------------------------------------------------------------------- 94 5.3.5 Cinética con luz -------------------------------------------------------------------------------------------------- 95 5.3.6 Medición del pH -------------------------------------------------------------------------------------------------- 96 5.3.7 Control negativo suspensión sin Extracto Rh --------------------------------------------------------------- 98 5.3.8 Alta Resolución MET y FFT ----------------------------------------------------------------------------------- 99 5.3.9 Identificación de compuestos en el extracto Rh usando RMN ----------------------------------------- 102. 5.4 Aplicaciones de Nanopartículas en Células ------------------------------------ 107 5.4.1 Sistema para células ------------------------------------------------------------------------------------------- 107 5.4.2 Interacción de Nanopartículas y Células Experimento 1 ------------------------------------------------ 115. iv.

(9) 5.4.3 Interacción de Nanopartículas y Células Experimento 2 ------------------------------------------------ 116 5.4.4 Interacción de Nanopartículas y Células Experimento 3 ------------------------------------------------ 117. Capítulo 6 Conclusiones ----------------------------------------------------------------------- 119 Perspectivas------------------------------------------------------------------------------------- 121 Bibliografía ------------------------------------------------------------------------------------------- 122 Apéndice -------------------------------------------------------------------------------------------- 137 Anexos ------------------------------------------------------------------------------------------------- 138 Artículo publicado ------------------------------------------------------------------------------- 138 Patentes -------------------------------------------------------------------------------------------- 138. v.

(10) Lista de Figuras Figura 1.1. Página Tamaños característicos. de los. agregados. de emulsiones. y. 6. microemulsiones. 1.2. El agua y su estructura polar.. 8. 1.3. Estructura química del etilenglicol.. 9. 1.4. Estructura química del compuesto orgánico isooctano. Las esferas. 9. grises representan átomos de Carbono, mientras que las rojas son átomos de Hidrógeno. 1.5. Clasificación de los surfactantes.. 10. 1.6. Diagrama de fases de un sistema de microemulsiones.. 12. 1.7. Estructura molecular del surfactante. 14. bis-2-etilhexilsulfoccinato de sodio (AOT). 1.8. Diversos tipos de estructuras encontrados en microemulsiones inversas. 15. y directas. 1.9. Mecanismos de síntesis de Nanopartículas.. 17. 1.10. Mecanismos de nucleación y crecimiento de nanopartículas de metales. 18. nobles. 1.11. Ensamblaje de nanopartículas de oro en ADN de virus lambda. 20. 1.12. Alineación de nanopartículas sometidas a proceso de calentamiento.. 20. 1.13. Alineación de nanoestructuras con capas de PVP y PEG.. 21. 1.14. Arreglos en fases lamelares de nanopartículas de Paladio.. 21. 2.1. Principales catequinas en el té verde.. 23. 2.2. Mecanismo de Síntesis de Nanopartículas de Plata en catequinas.. 26. 2.3. Diagrama de la síntesis de nanopartículas de plata usando un polifenol. 27. (pirogallol); de manera interesante, las nanopartículas obtenidas forman arreglos como el de la fotografía de la derecha. 3.1. Birrefringencia entre polarizadores cruzados.. 30. vi.

(11) 3.2. Ejemplo de la observación en un MET de un rotavirus, preparado por. 32. el método de tinción negativa [86]. 3.3. Espectros teóricos de UV-Vis de nanocristales de plata; de extinción. 35. (negro), absorción (rojo) y dispersión (azul) de nanocristales de plata. 3.4. La figura (A) muestra el modo de operación para difracción. 36. proyectándolo sobre la pantalla y la figura (B) el modo de imagen. 3.5. Imágenes de nanopartículas de oro obtenidas con un MET con. 38. histogramas de la distribución de tamaños. 3.6. Difracción de electrones para un material policristalino (izquierda) y. 39. monocristalino (derecha). 3.7. Arreglo experimental difracción de electrones.. 40. 3.8. Arreglo del detector de EDS en el Microscopio Electrónico de. 41. Transmisión. 3.9. Mecanismo de generación de rayos X característicos. Un electrón. 43. incidente genera una vacante en el nivel K, a la cual decae un electrón del nivel L, emitiéndose un fotón. 3.10. Tipos de transiciones.. 43. 3.11. Espectro de EDS característico de una muestra que contiene varios. 44. elementos. 4.1. Mecanismos de Interacción entre nanopartículas y células.. 48. 4.2. Etapa final de una célula apoptótica.. 51. 5.1. El diagrama de fases para el sistema ternario IC-AOT-EG.. 55. 5.2. Puntos del diagrama de fases donde se caracterizaron las. 56. microemulsiones. 5.3. Evolución temporal de la Viscosidad para microemulsiones directas.. 58. 5.4. Comparación entre viscosidades del sistema inverso (rico en IC) y. 58. directo (rico en EG). 5.5. Conductividad de las Microemulsiones inversas.. 59. 5.6. Conductividad de las Microemulsiones directas.. 60. 5.7. Textura de birrefringencia observada por microscopía de luz. 61. polarizada al evaporarse la muestra I4.. vii.

(12) 5.8. Aspecto visual de viales que contienen microemulsiones con nitrato de. 63. plata. 5.9. Espectro de absorción UV-VIS para microemulsiones directas.. 64. 5.10. Microemulsión E2.. 65. 5.11. Fotografía en MET de la microemulsión E3 concentración de nitrato de. 65. plata 200mM. 5.12. Muestra E4 MET y difracción de electrones.. 66. 5.13. Microemulsión E7, dímeros y trímeros.. 66. 5.14. Microemulsión E7 coalescencia entre pequeñas estructuras.. 67. 5.15. Microemulsiones E3 y E7.. 68. 5.16. Inspección Visual de la evolución temporal de la muestra I4.. 69. 5.17. Espectro de absorción UV-Vis para microemulsiones inversas.. 70. 5.18. Análisis microestructural de las Microemulsiones I3, I7.. 71. 5.19. Inspección Visual de la evolución temporal de la muestra I4.. 72. 5.20. Espectroscopía de Energía Dispersiva para I4.. 73. 5.21. Birrefringencia de microemulsiones inversas donde se han sintetizado. 75. nanopartículas de plata. 5.22. Mesofase hexagonal donde l representa la distancia entre los canales y. 77. r el diámetro de ellos. 5.23. Cilindros interconectados con nanopartículas de plata y tinción. 78. negativa de la misma fase sin nanopartículas. 5.24. Canales paralelos con tinción negativa y alineaciónde nanopartículas. 79. de plata en arreglos paralelos. 5.25. Vista panorámica con tinción negativa de la Microemulsión inversa I4.. 79. 5.26. Las fotografías muestran nanopartículas de plata alineadas en distintas. 80. orientaciones. 5.27. Histograma de los arreglos alineados de nanopartículas de plata.. 81. 5.28. Microemulsión Inversa I4 para una concentración de Nitrato de Plata. 82. 60mM. 5.29. Transición en la mesofase y en la formación de nanopartículas de plata. 83. al aumentar la concentración de nitrato de plata a 80mM.. viii.

(13) 5.30. Raíz seca y cortada de la planta Rumex hymenosepalus.. 84. 5.31. Evolución temporal de la banda de absorción asociada a los. 85. compuestos polifenólicos del extracto de Rh. 5.32. Extracto Rh irradiado y normal.. 86. 5.33. Muestras preparadas con extracto Rh sin irradiación muestran. 87. 1<UFC en A) para bacterias mesófilas y B)para mohos y levaduras. 5.34. Cultivo para el Extracto Irradiado y Extracto sin irradiar.. 88. 5.35. Inspección Visual para la síntesis de nanopartículas de plata usando. 89. extracto Rh. 5.36. Fotografía MET para un tiempo de reacción de 24 horas.. 90. 5.37. Histogramas para un tiempo de reacción de 24 horas.. 91. 5.38. Cinética para un tiempo de reacción de 24 horas.. 92. 5.39. Fotografía MET para un tiempo de reacción de 96 horas.. 93. 5.40. Histogramas para un tiempo de reacción de 96 horas.. 94. 5.41. Cinética para un tiempo de reacción de 96 horas.. 95. 5.42. Cinética UV-Vis sin control de la luz.. 96. 5.43. Cinética UV-Vis con luz constante.. 97. 5.44. Monitoreo del pH durante 24 horas.. 98. 5.45. Control negativo síntesis de nanopartículas de plata sin extracto Rh.. 99. 5.46. Nanopartícula de Plata con estructura cristalina fcc (cúbica centrada en. 100. las caras). 5.47. Nanopartícula de Plata con estructura cristalina 4H (hexagonal).. 102. 5.48. Estudio estadístico de estructuras fcc y 4H para nanopartículas de. 103. plata. 5.49. Espectro de RMN para la primera fracción del extracto Rh.. 105. 5.50. UV-Vis de nanopartículas de plata centrifugadas para aislar las. 109. nanopartículas del extracto Rh. 5.51. Fotografía placa de MTT.. 110. 5.52. Apoptosis celular por nanopartículas de plata y extracto Rh. 114. concentración de nanopartículas 0.425μg/ml. 5.53. Distintos estadios para las células C3F6.. 115. ix.

(14) 5.54. MET e Histograma con nanopartículas de diámetro promedio. 116. 10.42nm ±0.98nm (Experimento 1). 5.55. Porcentaje de Proliferación celular experimento 1.. 117. 5.56. MET e Histograma con nanopartículas de diámetro promedio. 117. 7.46±4.11nm (Experimento 2) 5.57. Porcentaje de Proliferación Celular para el Experimento 2.. 118. 5.58. MET e histograma con dos poblaciones de nanopartículas de plata. 119. (Experimento 3). 5.59. Porcentaje de Proliferación de Células (Experimento 3).. 119. x.

(15) Lista de Tablas Tabla. Página. 1.1. Razón de las reflexiones de Bragg para distintas estructuras.. 19. 4.1. Diferencias entre Necrosis y Apoptosis.. 50. 5.1. . Composición (% en mol) de las microemulsiones inversas. 56. estudiadas. 5.2. Composición (% en mol) de las microemulsiones directas. 57. estudiadas. 5.3. Composición química de elementos obtenida por EDS para la. 73. microemulsión I4. 5.4. pH para el extracto y para distintas suspensiones de nanopartículas. 98. de plata 5.5. Distancia interplanar para la estructura cristalina fcc.. 101. 5.6. Distancia interplanar para la estructura cristalina 4H.. 101. 5.7. Las señales de los desplazamientos químicos asociadas a los. 107. compuestos polifenólicos en el Extracto Rh. 5.8. Diseño Experimental para la placa de MTT.. 112. 5.9. Diluciones de los tratamientos aplicados a célula en la Técnica de. 113. MTT.. xi.

(16) Introducción Desde el surgimiento de la nanociencia y la nanotecnología hace dos décadas ha provocado un gran interés en los métodos de síntesis de nanopartículas de materiales diversos. Esto es debido a las propiedades diferentes que pueden tener los sistemas en la escala nanométrica, comparadas con las propiedades de los mismos materiales en otras escalas.. Los avances en estas disciplinas han llevado a una proliferación de aplicaciones propuestas o incluso comercializadas de los materiales nanoestructurados. Numerosos productos, desde pinturas y recubrimientos, hasta medicamentos y alimentos, contienen ya nanopartículas cuya función es agregar funcionalidades novedosas. Algunos de estos productos comerciales, como cepillos de dientes, lavadoras, cremas, etc., implican una interacción entre nanopartículas y células humanas; esto ha generado gran incertidumbre pues aún se desconocen las implicaciones en la salud de los seres humanos. Por esta razón, el estudio de la toxicidad de nanopartículas en células es un tema muy popular hoy en día.. Esos hechos tienen relevancia para la investigación contemporánea. Por una parte, sigue siendo necesario estudiar nuevas metodologías para la síntesis de nanopartículas para controlar sus propiedades estructurales (tamaño, forma, polidispersidad) y físicas (ópticas, eléctricas, magnéticas, etc.). Pero por otra parte, es necesario también entender el efecto de nanopartículas sobre células biológicas, ya sea para proponer nuevos medicamentos o tratamientos de enfermedades, o para prevenir riesgos toxicológicos relacionados con la exposición creciente de los seres vivos a productos con nanopartículas.. Nuestro trabajo se inscribe en este contexto: nos hemos propuesto preparar nanopartículas de plata con el objetivo de estudiar su efecto sobre células. Para ello, hemos estudiado dos métodos de síntesis de nanopartículas: el método de microemulsiones y un método “verde”. Además, hemos realizado estudios preliminares del efecto de las partículas preparadas sobre células de la línea C3F6 (linfoma B de ratón).. 1.

(17) En el primer método de síntesis de nanopartículas de plata hemos utilizado microemulsiones como reactores químicos. Una microemulsión es una mezcla de un solvente polar con uno orgánico, estabilizada por la presencia de un surfactante. En nuestro caso, el sistema ternario está compuesto por etilenglicol (solvente polar), isooctano (líquido orgánico) y el surfactante AOT. Hemos caracterizado mediante diferentes técnicas el diagrama de fases del sistema: inspección visual, mediciones de conductividad eléctrica y de viscosidad,. microscopía óptica de luz polarizada y microscopía electrónica de. criofractura. Las nanopartículas se han preparado por reducción de una sal (nitrato de plata) en el componente polar de la microemulsión. Las nanopartículas han sido caracterizadas por espectroscopía UV-Vis, microscopía electrónica de transmisión (MET) convencional y de alta resolución, difracción electrónica y espectroscopía de dispersión de energía de rayos X (EDS). Los resultados muestran que las nanopartículas obtenidas son efectivamente de plata y que tienen diámetros del orden de 5-10 nm. Es de resaltar que cuando la síntesis se hace en una región específica del diagrama de fases, las nanopartículas se alinean en arreglos bien definidos. El segundo método de preparación de nanopartículas es un experimento “verde”, es decir, utilizamos un procedimiento que emplea mayoritariamente componentes naturales para inducir el crecimiento de nanocristales de plata. La razón de realizar una síntesis de esta naturaleza es que el método utilizado juega un papel fundamental en la interacción de las nanopartículas con células in vitro, toda vez que las células son altamente sensibles a las trazas de cualquier solvente que se haya utilizado en el proceso de síntesis. En el caso de las microemulsiones, residuos de etilenglicol y/o de isooctano pueden influir en el comportamiento de las células. Por ello utilizamos un método “verde” que permite obtener nanopartículas sin tener efectos citotóxicos asociados a sustancias residuales. El método desarrollado consiste en utilizar el extracto de una planta regional, Rumex hymenosepalus, como agente reductor para la síntesis de las nanopartículas. Se escogió esta especie vegetal porque contiene una mezcla de polifenoles, moléculas que actúan como antioxidantes. Las nanopartículas obtenidas fueron caracterizadas con las técnicas mencionadas anteriormente. Entre los resultados interesantes obtenidos podemos adelantar que las nanopartículas de. 2.

(18) plata presentaron dos tipos de estructura cristalina: cúbica centrada en las caras (fcc, por sus siglas en inglés) y la estructura hexagonal (4H).. El texto de la tesis se ha organizado de la siguiente forma. Los primeros capítulos se dedican a los antecedentes del estudio. En el primero, describimos brevemente las microemulsiones, así como su utilización como reactores para la síntesis de nanopartículas de plata. El segundo capítulo está dedicado a los métodos “verdes” de preparación de nanopartículas. En el siguiente capítulo se describen los métodos de caracterización de microemulsiones y nanopartículas. En el cuarto capítulo se abordan aspectos de la interacción de nanopartículas con células. Finalmente, en el quinto capítulo se presentan y discuten los principales resultados de la tesis. El manuscrito finaliza con las conclusiones y perspectivas del trabajo.. Los resultados de nuestro trabajo de investigación han dado lugar a la preparación de tres artículos, uno de los cuales ya fue aceptado para publicación en una revista internacional (Nanoscale Research Letters). Un segundo artículo ha sido enviado y el tercero está en preparación. Los resultados han sido (o serán próximamente) presentados en congresos locales, nacionales e internacionales. Así mismo, los métodos de preparación de nanopartículas dieron pie a la solicitud de dos patentes, las cuales se encuentran en trámite.. 3.

(19) Capítulo 1 Moléculas Autoensamblantes y Nanopartículas de Plata En este capítulo abordamos conceptos relacionados con el primer método de síntesis de nanopartículas que hemos desarrollado. Para ello describimos brevemente el concepto de microemulsión, haciendo énfasis en las estructuras microscópicas presentes en estos sistemas. Posteriormente, analizamos someramente el método de preparación de nanopartículas metálicas en microemulsiones. El capítulo finaliza con comentarios sobre resultados de la literatura donde se obtiene la alineación de nanopartículas en patrones definidos.. 1.1 Microemulsiones Las microemulsiones acuosas son mezclas macroscópicamente homogéneas de agua, aceite y un surfactante. A un nivel microscópico, las mezclas están estructuradas en agregados o dominios ricos en el solvente mayoritario. Así, se pueden tener microemulsiones de aceite en agua (O/W), de agua en aceite (W/O) o fases bicontinuas, donde los dominios de cada solvente son equiparables en volumen; en cualquier caso, una película anfifílica (surfactante) recubre la interfase agua-aceite [1].. Algunos aspectos estructurales importantes del sistema son: la dimensión de las gotas o agregados, su forma, la polidispersidad de la población, la composición anfifílica en la interfase, etc. Cuando la concentración de uno de los solventes es baja, las gotas de las microemulsiones son esféricas y monodispersas con una monocapa (conocida como interfase) de moléculas de surfactante. Las diámetros de las gotas son del orden de 2 – 50. 4.

(20) nm, mucho menores que la longitud de onda de la luz (400 nm < lluz < 700 nm). Así, las microemulsiones son débiles dispersoras de luz y esto explica su transparencia.. Las microemulsiones presentan propiedades fisicoquímicas que les otorgan ventajas sobre las emulsiones. Por ejemplo, las microemulsiones son termodinámicamente estables y ópticamente transparentes, en tanto que las emulsiones son de apariencia lechosa y después de un tiempo se separan en dos fases. Otro punto muy importante es el tamaño de las estructuras presentes en las microemulsiones (Figura 1.1); como hemos dicho, los tamaños característicos de las gotas o micelas son del orden de 10 nm (0.01 mm) en tanto que el tamaño de los agregados de las emulsiones es del orden de micras (entre 2 y 20 mm), es decir, hay una diferencia de alrededor de 100 órdenes de magnitud. Además, para la formación de emulsiones se requiere energía externa en tanto que las microemulsiones son sistemas autoensamblables (su formación no requiere energía externa).. Figura 1.1 Tamaños característicos de los agregados de emulsiones y microemulsiones.. El autoensamblaje de las moléculas que conforman un sistema de microemulsión se produce cuando el cambio de la energía libre de Gibbs DG tiene signo negativo [2,3], es decir, 5.

(21) DG = gDA – TDS < 0. (1). donde g es la tensión interfacial de la interfase agua-aceite. DA es el cambio de área interfacial y DS es el cambio en la entropía y T es la temperatura. Para que la dispersión sea termodinámicamente estable, DG , debe mostrar un valor mínimo. Así. TDS ñgDA (2). TDS es positiva; de hecho, para microemulsiones este término es del orden de 3Nk BT [4]. donde N es el número de agregados, y kB es la constante de Boltzmann. En ausencia de surfactante, la tensión interfacial entre el agua y el aceite (dos fases espacialmente separadas) es del orden de g ow = 50mN / m ; al momento de formarse las estructuras al agregar un surfactante, dado que un solvente forma agregados dispersos en el otro, el área 4 5 de la interfase agua-aceite se incrementa notablemente (DA es del orden de 10 a 10 ).. Entonces, para que se cumpla la condición de que DG sea negativa se debe cumplir que g -2 -4 sea muy pequeña, es decir, del orden de 10 - 10 mN/m. De hecho, la función del. surfactante es reducir la tensión interfacial y por lo tanto hacer posible la existencia y estabilidad de los agregados.. 1.1.1 Solventes polares y solventes no polares. Las moléculas de los solventes polares se caracterizan principalmente por poseer una carga efectiva o tener un momento dipolar debido a su estructura química o estado de polarización. El agua es una molécula que presenta un momento dipolar y esto hace que algunos sólidos puedan disolverse en ella, por ejemplo, cristales de azúcar o sal. La estructura química del agua es tal que existe un ángulo de 104.5 ° (figura 1.2) entre los segmentos que unen al oxígeno con cada hidrógeno; dado que el oxígeno es un átomo electronegativo, esto crea un desequilibrio entre las cargas positivas y negativas lo que también es conocido como polaridad. La constante dieléctrica de un solvente es un reflejo de la magnitud del momento dipolar de las moléculas que lo conforman. 6.

(22) Figura 1.2 El agua y su estructura polar. El agua y los líquidos con alto grado de polaridad pueden disolver compuestos iónicos, debido a las atracciones electrostáticas que forman enlaces ion-dipolo. Cada ion es rodeado por muchas moléculas del solvente (proceso conocido como solvatación). Un buen solvente debe tener una constante dieléctrica muy grande, es decir, debe comportarse como un buen aislante para disminuir (apantallar) la atracción entre los iones de carga opuesta una vez que se encuentran solvatados [5]. Esto evita que el sólido iónico se vuelva a formar después de haber sido disuelto.. El agua es un solvente polar donde se pueden disolver sustancias iónicas o polares, tales como el cloruro de sodio o el azúcar. Estas sustancias no pueden ser disueltas en compuestos orgánicos (solventes no polares) porque no existen cargas eléctricas que atraigan a las moléculas. En la figura 1.3 se muestra la estructura de la molécula de un solvente polar utilizado en este trabajo: el etilenglicol; esta molécula presenta un dipolo entre los átomos de Carbono e Hidrógeno. El etilenglicol tiene un peso molecular de 62 g/mol y una densidad de 1.115g/ml, su constante dieléctrica es de 37.7 (el agua tiene una constante dieléctrica de 80) y su momento dipolar del EG es de 2.28 D [6].. 7.

(23) Figura 1.3 Estructura química de la molécula de etilenglicol.. Los solventes no polares contienen enlaces entre átomos con electronegatividades similares, tales como el carbono y el hidrógeno; en este caso, los átomos carecen de cargas parciales y las moléculas no tienen momento dipolar. Por ejemplo, el isooctano (solvente no polar que utilizaremos en este trabajo), cuyo peso molecular es 114.23g/mol y cuya densidad es 0.692g/ml, tiene una constante dieléctrica de 1.94 [7]; el momento dipolar de sus moléculas es nulo [8]. En la figura 1.4 se muestra la estructura química del isooctano.. Figura 1.4 Estructura química del compuesto orgánico isooctano. Las esferas grises representan átomos de Carbono, mientras que las rojas son átomos de Hidrógeno.. 1.1.2 Los surfactantes Los surfactantes son moléculas formadas al mismo tiempo por un grupo polar y por una cadena hidrofóbica; cuando estas moléculas se agregan a un sistema líquido con agua y. 8.

(24) aceite, los grupos polares del surfactante son atraídos, es decir, orientados hacia el agua y los grupos no polares hacia el aceite.. Los surfactantes pueden clasificarse como catiónicos, aniónicos, no iónicos, y zwitteriónicos, en base a la carga eléctrica de la cabeza polar (Figura 1.5). En nuestro trabajo utilizaremos el surfactante bis-2-etilhexilsulfoccinato de sodio también llamado AOT. Se trata de un surfactante aniónico de peso molecular 444.56g/mol y una densidad de 1.1g/ml.. Figura 1.5 Clasificación de los surfactantes.. 1.1.3 Diagramas de fases. En general las microemulsiones son formadas por un surfactante y dos solventes, uno polar y otro no polar; algunas de las microemulsiones usan además un cosurfactante (un alcohol de cadena corta) para lograr el autoensamblado que da lugar a su estructura microscópica. En el caso del surfactante que utilizamos en este trabajo, el AOT, no se requiere de un cosurfactante para formar microemulsiones [2]. Por ello podemos representar al sistema en un diagrama de fases ternario donde cada uno de los vértices de un triángulo (Figura 1.6) representa las componentes en estado puro de la microemulsión. Por ejemplo, el vértice señalado como “surfactante” representa una muestra donde el 100% de. 9.

(25) contenido es surfactante (la representación se realiza en por ciento molar, o por ciento en masa). El diagrama de fases permite localizar rápidamente las diferentes microestructuras de la microemulsión en términos de la concentración relativa de las componentes en general, tendremos micelas o micelas inversas, pero a medida que se incrementa la relación w=agua/surfactante se transforman las estructuras y el número de interfases. En un diagrama de fase podemos encontrar estructuras muy diversas como se muestran en el diagrama clásico de abajo, donde vemos micelas, estructuras lamelares (dos membranas plano paralelas), esponjas (estructuras donde juega vital importancia la geometría), también túbulos de diversos tamaños y formas [9] en el diagrama de abajo se muestran los distintos tipos de estructuras que podemos encontrar en un sistema ternario. El estudio del diagrama de fase nos permite identificar en primer lugar las características físicas por inspección visual así como determinar el número de fases del sistema. Después el análisis del sistema entre polarizadores cruzados nos permite determinar si tenemos fases cristales líquidos (muestras birrefringentes) o sistemas isotrópicos. El diagrama de fases es la representación esquemática de la conformación de diversas estructuras, se requieren de un gran número de muestras para definir de manera precisa las fronteras [10]. Uno de los métodos que permite delinear la conformación de estructuras y fases es el método de gota a gota donde se inicia por la conformación de un sistema binario que va generando todo la gráfica al agregar el tercer componente gota a gota de forma tal que se permita barrer todo el campo.. De acuerdo a la clasificación de Winsor tenemos cuatro tipos de sistemas de microemulsión: Winsor I, II, III y IV. [3]. En el caso I tenemos dos fases donde el medio de dispersión es el agua aquí las estructuras son micelas y para el caso II con dos fases las micelas son inversas pues el medio dispersor es el aceite, abajo se muestran las fases y sus estructuras. Para III tenemos los casos de o/w y w/o que están presentes simultáneamente (sistema bicontinuo) con tres fases. En IV con una sola fase agua, aceite y surfactante homogéneamente mezclado [9]. Así las estructuras presentes van desde micelas, micelas inversas, fases bicontinuas hasta fases lamelares (cristales líquidos o mesofases). Abajo se 10.

(26) muestran el tipo de estructuras y la conformación de las fases según la clasificación de Winsor.. Figura 1.6 Diagrama de fases de un sistema de microemulsiones [11]. Las variaciones en la temperatura pueden ser representadas por capas sobrepuestas y paralelas al triángulo formando un prisma triangular. La formación espontánea de una microemulsión con un decrecimiento en la energía libre es posible si la tensión interfacial es menor que la energía libre que permanece en la interfase es sobrecompensada por la entropía de dispersión de las gotas en el medio. Los surfactantes bajan la tensión superficial, pero en la mayoría de los casos la concentración micelar crítica (CMC) o el límite de solubilidad se alcanza antes de que la tensión interfacial este cercana a cero [12].. 11.

(27) Iones metálicos son introducidos en el sistema como sales metálicas disueltas en las micelas acuosas o por funcionalización de la cabeza de surfactante de AOT donde los iones de sodio son intercambiados por un ion metálico. El propósito del segundo método es eliminar la presencia de sales aniónicas de micelas inversas. El tamaño y número de micelas inversas las cuales son dispersadas en el fluido depende de las concentraciones de agua y surfactante, es decir, su razón molar. La razón de las moléculas de agua para moléculas de surfactante es usada para describir el contenido de agua de las micelas inversas y usualmente se denomina como W donde ሾு ைሿ. మ . ܹ ൌ ‫ڿ‬ௌ௨௥௙௔௖௧௔௡௧௘‫ۀ‬. El contenido de agua W, está directamente relacionado al tamaño de las micelas inversas de AOT por una simple relación R(nm)=0.18W, donde R es el radio hidrodinámico de las micelas inversas de AOT. Una micela inversa de AOT típicamente existe con un W en el rango de 0 a 100 (dependiendo del solvente, temperatura, etc.) resultando en una alberca de agua que puede variar de 0 a 30 nanómetros en diámetro.. La concentración de surfactante requerido para formar micelas inversas esféricas esta determinada por la concentración micelar crítica, CMC, lo cual es la concentración mínima de surfactante necesaria para formar micelas. La CMC es afectada por varias propiedades del sistema de micelas inversas, tales como interacciones del solvente entre las colas del surfactante y el bulto del solvente orgánico, la geometría del surfactante, la adhesión de los cosolventes o sales y temperatura.. Las micelas inversas actúan como un nanoreactor para reacciones de fase acuosa dispersada dentro de una fase de bulto. AOT ha sido extensivamente usado en la formación de sistemas micelares inversas, principalmente debido al hecho de la geometría de cono invertido permite la formación de dispersiones uniformes, termodinámicamente estables, micelas esféricas inversas.. 12.

(28) Figura 1.7 Estructura molecular del surfactante bis-2-etilhexilsulfoccinato de sodio (AOT). En la figura 1.7 se presenta la estructura con forma de cono de la doble cola del surfactante. 1.1.4 Formación de estructuras en microemulsiones Las microemulsiones presentan diversas estructuras dependiendo de la relación entre el surfactante y los solventes polares y no polares del sistema. Estas estructuras pueden ser inversas en el caso en que el solvente mayoritario sea no polar. También pueden ser directas en el caso contrario, el solvente mayoritario es el polar. Los tipos de estructura que es posible encontrar en un sistema de microemulsión común es la que se presenta en la Figura 1.8.. 13.

(29) Figura 1.8 Diversos tipos de estructuras encontrados en microemulsiones inversas y directas [11].. 1.2 Estructura y Síntesis de Nanopartículas Las interacciones entre nanopartículas sintetizadas en una fase fluida surgen de las fuerzas electrostáticas o de Van der Waals. En el caso de nanopartículas metálicas, la estabilización entrópica de las partículas por una capa de surfactante se utiliza para prevenir la degradación, oxidación y aglomeración. Los surfactantes han mostrado actuar como dispersantes para estabilizar partículas a través de repulsión electrostática o estérica.. Las nanopartículas metálicas han encontrado aplicaciones en electrónica, materiales magnéticos, sensores, explosivos, catálisis, farmaceúticos, metalurgia, películas delgadas y recubrimientos. Las nanopartículas metálicas han sido producida en una gran variedad de morfologías (esferas, cilindros, cubos, fibras y cubos huecos) y diferentes composiciones (metálica, intermetálica, organometálica, aleaciones y compositos). Algunas de las más populares técnicas de síntesis son acuosa, no-acuosa, precursor organometálica, deposición de vapor químico, geles y métodos de microemulsión. 14.

(30) Las propiedades de los nanomateriales están influenciados por la presencia de un número significativo de átomos de superficie y por el efecto de confinamiento cuántico de los estados electrónicos. [12]. En el caso de nanopartículas de plata el pico del plasmón aparece a una longitud de onda alrededor de los 400 nm y su posición exacta depende del diámetro, de la forma y de la distribución de tamaños de las nanopartículas [4,12,13]. Bajo ciertas condiciones, se consiguen oscilaciones colectivas de plasmones, los cuales llevan asociados energías discretas de manera tal que las transiciones electrónicas entre las mismas dan lugar a la extinción (absorción + difusión) de una parte de la luz incidente. Estas oscilaciones colectivas de electrones se denominan plasmón y su existencia da lugar al efecto de coloración en los sistemas de síntesis de nano-partículas, este color dependerá de la naturaleza del metal, del tamaño y morfología de la partícula, y de su concentración [3]. Siendo este fenómeno la una primera técnica utilizada para verificar si realmente se logró la síntesis adecuada de las nano-partículas [14]. Una misma solución de alguna sal metálica puede producir un gran número de diferentes arquitecturas en las nano-partículas, tomando distintas geometrías: de barra, rectangular, hexagonal, cúbica, triangular o estrelladas, todo esto a una temperatura ambiente en presencia de un solo tensioactivador en solución acuosa.. 1.2.1 Métodos de Preparación Entre los distintos métodos de preparación podemos mencionar: Reacción espejo de plata, proceso de polyol, sol-gel, micelas inversas, reducción fotoquímica, electroforesis, deposición química, rutas electroquímicas, ablación láser [15].. 15.

(31) Figura 1.9 Mecanismos de síntesis de Nanopartículas [16]. La preparación de nanopartículas se obtiene usando sales de metales de transición, el mecanismo de formación de las nanopartículas se basa en la reducción de la sal metálica del átomo cero valente. La principal ventaja de este método es la reproducibilidad del mismo así como la obtención de coloides monodispersos [17].. Una vez que se obtiene la plata metálica la nucleación para la formación de nanopartículas se genera con la formación de dímeros y tetrámeros hasta alcanzar un punto de equilibrio donde obtenemos la nanopartícula en su forma y tamaño final (Figura 1.9). Después de la formación de tetrámeros el crecimiento de los agregados no ha sido aún bien entendida. En la figura 1.10 observamos una propuesta de la ruta de síntesis de nanopartículas con distintas morfología y tamaños a partir de un precursor metálico, del proceso inicial de nucleación dependerá el resultado final.. 16.

(32) Figura 1.10 Mecanismos de nucleación y crecimiento de nanopartículas en metales nobles [18].. 17.

(33) 1.3 Mesofases hexagonales Una mesofase hexagonal está compuesta por un denso empaquetamiento de micelas cilíndricas, arregladas sobre una red hexagonal 2D. Este tipo de mesofases liotrópicas (las cuales se caracterizan por ser sistemas autoensamblantes formadas por una solución polar, un surfactante y una solución no polar).. El espectro de dispersión de rayos x a ángulos pequeños (SAXS por sus siglas en inglés) permite la caracterización de las estructuras en mesofases y la gráfica está determinada por la posición de los picos expresados como la razón q/q* de las reflexiones de Bragg para varias estructuras (tabla 1.1) [19,20].. Estructuras Lamelar Hexagonal (p6mm) BCC (lm૜m) FCC (Fm3m) Gyr (la3d). Razón q/q+ 1,2,3,4,5,6….. 1,ξ૜ , √4 , √7 , √9 , √12.. . 1, √2 , √3 , √4 , √5 , √6 … 1, √4/3 , √8/3 , √11/3 , √12/3 , √16/3 …. 1, √4/3 , √7/3 , √8/3 , √10/3 , √11/3….. Tabla 1.1 Razón de las reflexiones de Bragg para distintas estructuras.. 1.4 Alineación de nanopartículas en fases hexagonales En la bibliografía encontramos una amplia selección de artículos sobre el arreglo de nanopartículas de diversos materiales (Figura 1.11) en arreglos 1D [21-24], 2D [23] y 3D [23]. Para ello se utilizan diversas técnicas tales como sputtering, calentamiento, (Figura 1.12) etc.. Entre las aplicaciones de nanopartículas en sistemas ordenados esta la técnica de resonancia de plasmones de superficie (LSPR por sus siglas en inglés), este método es de bajo costo, permite la detección de moléculas pequeñas y proteínas. Esta técnica tiene una resolución 100 veces mayor que el espectro UV visible. El límite de detección de esta técnica es de 1000 moléculas, o 100 zeptomoles [25-27].. 18.

(34) Figura 1.11 Ensamblaje de nanopartículas de oro en adn de virus lambda [22]. Figura 1.12 Alineación de nanopartículas sometidas a proceso de calentamiento [23].. 19.

(35) Figura 1.13 Alineación de nanoestructuras con capas de PVP y PEG [24].. La alineación de nanopartículas tiene entre otros objetivos su uso en dispositivos electrónicos. El ADN se ha utilizado recientemente para el arreglo de patrones de nanopartículas en 1D y 2D para aplicaciones [22]. El uso de capas de PVP y PEG sobre nanopartículas para alineación también es una técnica común (Figura 1.13)[24]. Otra técnica utilizada es la fabricación de nanopartículas en microemulsiones, seguido por un tratamiento como evaporación del solvente y formación de moldes [28]. Se ha utilizado el copolímero triblock para la fabricación de estructuras cúbicas y hexagonales que puedan servir como molde para el arreglo de nanopartículas en sistemas alineados [29]. La deposición electroquímica de nanopartículas permite el arreglo de nanoestructuras para ser utilizadas con la técnica de plasmones de superficie para obtener nanofotosensores de gran precisión [30]. Para obtener el arreglo de la figura 1.14 vapor de paladio fue expuesto a una película de polímero en una atmósfera de nitrógeno a 1800C por 2 horas [31].. Figura 1.14 Arreglos en fases lamelares de nanopartículas de Paladio [ 31].. 20.

(36) Capítulo 2 Síntesis Verde de Nanopartículas de Plata En este capítulo ofrecemos algunos antecedentes a nuestro segundo procedimiento de preparación de nanopartículas: el método “verde”. En primera instancia comentamos brevemente sobre las moléculas presentes en especies vegetales, los antioxidantes, que pueden utilizarse como agentes reductores para la síntesis de nanopartículas. En segunda instancia discutimos someramente el mecanismo de la reacción para el caso de la plata.. 2.1 Compuestos nanopartículas. utilizados. en. la. síntesis. "verde". de. Actualmente existe una vertiente de la química llamada “química verde”, la cual hace énfasis en implementar reactivos y controlar reacciones que generen productos de bajo impacto ambiental. En este contexto, en los últimos años se ha explorado la posibilidad de sintetizar nanomateriales empleando como agentes reductores moléculas orgánicas de extractos naturales “amigables” al medio ambiente. En muchos casos esta “síntesis verde” da lugar a nanopartículas funcionalizadas o biocompatibles, como en el caso de las nanopartículas de plata que al entrar en interacción con sistemas biológicos no producen efectos citotóxicos en células sanas [32].. En la literatura existe una amplia variedad de referencias sobre métodos de síntesis verde de nanopartículas [33-42]; la investigación se se ha enfocado especialmente hacia métodos que involucren extractos naturales que contengan moléculas orgánicas polifenólicas. Los polifenoles, en general, tienen la propiedad de ser buenos reductores en las reacciones de óxido reducción (son buenos antioxidantes); en nuestro caso, esta propiedad reductiva se requiere para inducir la formación de las nanopartículas a partir de los iones Ag+.. 21.

(37) Una molécula de polifenol contiene al menos un anillo fenólico. En la figura 2.1 se muestran algunas estructuras de moléculas presentes en el té verde (Camellia sinensis), y semejantes a la que utilizamos en nuestro estudio. Existen diferentes tipos de polifenoles; entre ellos, la familia de los flavonoides es la más grande y la más estudiada hasta el momento. Dos de los flavonoides más comunes en vegetales son la catequina y la epicatequina. De hecho, estas moléculas son en parte responsables del efecto benéfico del té verde. Combinados con el ácido gálico, compuesto presente en las plantas, producen moléculas como la (-)-epigalocatequina-3-galato y (-)-epicatequina-3-galato. Estas moléculas se conocen también con el nombre genérico de "taninos condensados".. En nuestro caso, la fuente natural de polifenoles para el método "verde" de síntesis de nanopartículas de plata es la planta regional "cañagria" (Rumex hymenosepalus). Nuestros análisis muestran que tal especie contiene algunos de los antioxidantes mencionados, moléculas que utilizamos para favorecer el crecimiento de nanocristales de plata.. Figura 2.1 Principales polifenoles presentes en el té verde. 22.

(38) Los polifenoles por sí mismos han sido ampliamente estudiados por la comunidad científica; en especial dos tipos principales han concentrado la atención: los. taninos. condensados (tal es el caso de los taninos encontrados en el té verde) y los estilbenos (como lo es el resveratrol) [43-62]. Su uso ha marcado la investigación en el área de la oncología en los últimos 20 años.. Los polifenoles son sustancias presentes en la dieta; se encuentran en frutas, vegetales, té, chocolate, vino. El total de polifenoles consumidos en la dieta diaria es de aproximadamente 1000 mg. Por ejemplo, una taza de té verde aporta entre 200 y 300mg de epigallocatequina galato (EGCG) [49] Los polifenoles como antioxidantes protegen a las células contra los daños oxidativos y además interfieren con las funciones celulares básicas (apoptosis, ciclo celular, angiogénesis, invasión y metástasis) [43,61]. Los polifenoles tienen la habilidad de actuar como quelantes de los cationes divalentes y reducen a los radicales libres; estas propiedades le confieren una actividad quimiopreventiva [63-66].. Como hemos dicho, el té verde contiene principalmente varios polifenoles, entre ellos la epigallocatequina gallato (EGCG); esta catequina es un poderoso antioxidante mejor que el ácido ascórbico (vitamina C) y que el α-tocoferol (vitamina E), antioxidantes naturales conocidos. La EGCG tiene la habilidad de ser quelante y formar complejos, sobre todo con metales de transición (entre los que se encuentran el oro y la plata). Además, su afinidad por la bicapa lipídicas permite que la molécula penetre el núcleo de la células [48,49]. Otras catequinas importantes presentes en el té verde son (-)-epicatequina-3-galato (ECG), (-)-epigalocatequina (EGC) y (-)-epicatequina (EC). La EGCG en el té verde se encuentra en una proporción entre el 50 y 80 % respecto al total de las catequinas presentes en el té verde [44]. La relación entre la estructura química de estas moléculas y su actividad anticancerígena fue evaluada; se observó que la esterificación con ácido gálico (GA) de algunas catequinas, incrementó significativamente sus efectos antiproliferativos [45-46,50, 54-55]. De hecho, la EGCG se ha utilizado en combinación con medicamentos contra el cáncer de mama y se ha demostrado que mejora la citotoxicidad sobre células cancerosas. 23.

(39) [51]. El uso de las catequinas presentes en el té verde (Camellia sinensis) se ha ampliado a diversas enfermedades como Alzheimer, Parkinson, Diabetes, etc., obteniéndose en cada caso buenos resultados [52-53,56]. Cabe añadir que los polifenoles están también presentes en algunas frutas como la uva [67].. Existe otro tipo de polifenoles denominados "estilbenos", tal como el resveratrol. Esta molécula aparece en la uva (50 - 100 μg/g), en el vino tinto (0.1-14.3 mg/L), en los cacahuates (0.02 - 1.92μg/g) y en las moras (0.07 - 5.8 μg/g) [68]. El resveratrol tiene propiedades antioxidantes; de hecho, se ha demostrado que es un buen inhibidor del cáncer in vitro y que detiene el desarrollo de tumores en ratones. El resveratrol además previene las enfermedades cardiovasculares y la lesión isquémica. La principal característica del resveratrol al interaccionar con células cancerosas es provocar apoptosis [57-59,61]. Estudios recientes han mostrados que algunos productos naturales como los mencionados pueden alterar la expresión de microARN específico, el cual incrementa la sensilidad de células cancerosas a los agentes anticancerígenos, lo cual inhibe el crecimiento de los tumores [59-60].. El resveratrol y sus derivados sintéticos prometen mejorar el aspecto terapéutico de medicamentos anticancerígenos y existe un enorme potencial para aplicarlo en procedimientos médicos [60]. Esta molécula actúa sobre los radicales libres transfiriendo el protón de sus grupos fenólicos, lo cual le confiere sus propiedades antioxidantes. El mecanismo molecular de acción de los polifenoles depende de su estructura así como también de su interacción con las membranas lipídicas [62].. 2.2 Síntesis de condensados. nanopartículas. de. plata. usando. taninos. Es posible aprovechar las propiedades antioxidantes de los polifenoles para sintetizar nanopartículas de plata. Si la síntesis se realiza a partir de una sal como el nitrato. 24.

(40) de plata, el mecanismo de la reacción pasa por una etapa intermedia donde se forma un complejo tanino-Ag+.. En la figura 2.2 se describe el modelo de reacción en el caso de la reducción de nitrato de plata usando otra molécula polifenólica. De nuevo, la plata metálica se forma a través de un producto intermedio (complejo polifenol-Ag+); la oxidación del polifenol a través de esta reacción rompe la estructura del complejo. Los iones Ag+ se convierten en átomos de plata, los cuales se agregan para iniciar el crecimiento de la nanopartícula (nucleación). Se ha reportado que las moléculas polifenólicas recubren en cierto grado a los átomos de plata, lo cual tiene repercusiones en el control de la morfología y topología de las partículas obtenidas [69-72].. . 2Ag+ + H2 ՜ 2Ag + 2H+ Figura 2.2 Mecanismo de Síntesis de Nanopartículas de Plata en catequinas.. 25.

(41) La oxidación de la molécula polifenólica a través de esta reacción rompe la estructura del complejo; de esta forma, los iones de plata (Ag+) se convierten en átomos, los cuales empiezan a coalescer, formando agregados (dímeros, tetrámeros, etc.), los polifenoles están parcialmente oxidados y de la reacción se desprenden además dos electrones y dos protones por cada anillo fenólico del reductor.. Figura 2.3 Diagrama de la síntesis de nanopartículas de plata usando un polifenol (pirogallol); de manera interesante, las nanopartículas obtenidas forman arreglos como el de la fotografía de la derecha [67]. Los átomos de plata son estabilizados por las moléculas polifenólicas que forman un recubrimiento en las nanopartículas; como observamos en la fotografía de la figura 2.3, las nanopartículas forman un arreglo donde no existe coalescencia debido a la presencia de los polifenoles en la superficie de las nanopartículas.. En el capítulo 5 reportaremos resultados propios de la síntesis de nanopartículas de plata por el método "verde" que utiliza polifenoles de Rumex hymenosepalus como agente reductor. Los mecanismos de la reacción son similares a los descritos en este capítulo.. 26.

(42) Capítulo 3 Técnicas de Caracterización Microestructural En este capítulo describiremos brevemente algunas de las técnicas experimentales utilizadas en nuestro trabajo para caracterizar la estructura tanto de las microemulsiones utilizadas en el primer método de síntesis de nanopartículas como de las propias nanopartículas obtenidas. El capítulo se divide en dos grande secciones dedicadas a dichos sistemas.. 3.1 Técnicas de caracterización de microemulsiones En este apartado mencionaremos las técnicas que hemos utilizado en esta tesis para caracterizar el diagrama de fases del sistema escogido para preparar las microemulsiones: etilenglicol-AOT-isooctano. La idea general es preparar muestras con diferentes concentraciones de las componentes mencionadas (para estudiar una zona grande del diagrama de fases) y entonces determinar la mayor cantidad posible de propiedades físicas de cada muestra. Analizando los datos en su conjunto, es posible determinar el tipo de estructura microscópica que presenta la microemulsión en cada zona del diagrama de fases.. 3.1.1 Inspección visual Aunque pudiera parecer trivial, la técnica más sencilla e insustituible que se emplea en primera instancia es la inspección visual de las muestras. La información que se obtiene es cualitativa pero importante. Por ejemplo, mediante inspección visual se pueden identificar las muestras monofásicas, bifásicas (separación de dos líquidos), trifásicas (tres líquidos), etc. Esto permite encontrar las regiones donde la microemulsión es estable (zona monofásica). Al mismo tiempo, la inspección da una idea de propiedades como la transparencia o la viscosidad de las muestras; estos parámetros están relacionados con el. 27.

(43) tamaño de los agregados y con su forma. Finalmente, si la observación se realiza entre un par de polarizadores cruzados, se puede determinar si las muestras son isotrópicas o birrefringentes, lo cual reduce el número de posibles estructuras microscópicas. Abundaremos en este punto en la sección siguiente. El conjunto de observaciones descritas permite delimitar regiones del diagrama de fases que luego se estudian con otras técnicas para obtener información cuantitativa.. 3.1.2 Birrefringencia de las microemulsiones La velocidad con la que la luz se propaga a través de materiales transparentes con estructuras isotrópicas está determinada por el índice de refracción n. La luz viaja más lentamente a través de materiales con más alto índice de refracción, mientras que los materiales con bajo índice n permiten que la luz viaje más rápidamente. Sin embargo, los materiales que poseen estructura molecular anisotrópica tienen también un índice de refracción anisotrópico. La luz viaja a través de ellos a diferentes velocidades, según la orientación en el medio; estos sistemas se conocen como birrefringentes. La birrefringencia o doble refracción ocurre naturalmente en muchos materiales como la calcita, el ácido ascórbico y es también una propiedad de los cristales líquidos.. Los materiales birrefringentes pueden tener diferentes índices de refracción no solamente en diferentes direcciones sino también en función del estado de polarización de la luz.. Las microemulsiones pueden tener estructuras microscópicas anisotrópicas, lo cual hace que la muestra presente birrefringencia. Algunas de las fases birrefringentes son: fases hexagonales, lamelares, esméticas, entre otras. De hecho, al tratarse de fases en estado líquido que presentan periodicidad, estos sistemas caen dentro de la definición de cristales líquidos. Los cristales líquidos son clasificados en distintos tipos de mesofases dependiendo del grado de orientación y el orden de posición que ellos poseen. Algunos cristales líquidos pueden mostrar solamente un solo tipo de mesofases, mientras que otros pueden transformarse en distintas fases para diferentes temperaturas [73]. La observación de las. 28.

(44) muestras entre polarizadores cruzados permite entonces identificar las fases birrefringentes del sistema de microemulsiones cuando usamos un arreglo como el de la figura 3.1 y reducir las posibilidades estructurales a fases hexagonales, lamelares, esmécticas, etc.. Figura 3.1 Birrefringencia entre polarizadores cruzados [73].. 3.1.4 Mediciones de conductividad eléctrica y de viscosidad La viscosidad y la conductividad eléctrica son propiedades de transporte y por lo tanto están relacionadas con la estructura microscópica de la muestra de microemulsión.. La viscosidad representa la fluidez del sistema, la cual es influida por las interacciones entre los agregados. Por lo tanto, microemulsiones con diferentes microestructuras presentan diferentes valores de viscosidad. La viscosidad permite determinar cambios microestructurales a medida que se modifica la concentración del sistema. Por ejemplo, una muestra a baja concentración, con agregados independientes, tiene una viscosidad relativamente baja comparada con una muestra a mayor concentración. De igual forma, una muestra donde las gotas son esféricas presenta menor viscosidad que otra donde los agregados son cilindros largos que se enmarañan que se entrecruzan.. 29.

(45) Por su parte, la conductividad eléctrica está relacionada con la movilidad los iones en el solvente polar y/o con la movilidad de las moléculas de surfactante iónico. Ambas movilidades dependen de la estructura microscópica del sistema: forma y tamaño de agregados, grado de conectividad entre ellos, etc. Además, la movilidad de los iones depende de la viscosidad local o de la microviscosidad alrededor de los portadores de carga [74]. Las mediciones de conductividad eléctrica también brindan información sobre la microestructura de las muestras. Por ejemplo, un incremento sustancial en este parámetro puede ser un indicativo de la percolación de agregados inicialmente separados.. En nuestro caso, la conductividad de las microemulsiones se midió usando un equipo Radiometer Analytical, modelo CDM210, conectado a una computadora; el instrumento permite medir la conductividad en función de la concentración y del tiempo. La calibración del equipo se realiza usando una solución de cloruro de potasio, con la cual se obtiene la constante de celda. En nuestro caso, se utilizó un volumen de 4 ml para las mediciones, teniendo especial cuidado en que los electrodos no toquen las paredes del tubo que contiene la muestra.. La viscosidad de nuestro sistema se midió utilizando un reómetro Rheometer Physica MCR300 Acoplado a un peltier Geometría Coutte Universite du Paris Sud, con control de temperatura (T = 25oC). Este instrumento se utilizó para caracterizar las microemulsiones directas (el solvente polar es mayoritario) pues presentan viscosidades muy por encima de la viscosidad del agua (h >> 1 cp). En el caso de las microemulsiones inversas (el solvente orgánico es mayoritario) se utilizó un viscosímetro de Ubbelohde de marca Cole-Parmer, el cual permite medir viscosidades cuya magnitud es cercana a la viscosidad del agua (h ≈ 1 cp).. 3.1.5 Observación por Microscopía Electrónica mediante Tinción Negativa Para poder visualizar la microestructura de microemulsiones en un microscopio electrónico de transmisión (MET) existen varias técnicas: la criofractura, la observación criogénica y la tinción negativa. La técnica de tinción negativa [75-77] consiste en marcar. 30.

(46) los agregados de la microemulsión con un material que ofrezca alto contraste en microscopía electrónica (como un metal pesado); la muestra entonces se deposita en una rejilla y se deja secar para que los agregados marcados sedimenten. Entonces se observa la muestra así preparada en el MET, en la figura 3.2 observamos un rotavirus usando MET al que se le ha aplicado la técnica de tinción negativa. Los átomos pesados se agregan en forma de soluciones; ejemplos de materiales utilizados son el acetato de uranilo, el molibdato de amonio y el ácido fosfotúngstico. En el experimento se agregan 10 μl de la solución de metal pesado a la muestra depositada en la rejilla de MET; se deja secar por 5 minutos y se retira el exceso de solvente con papel secante, después de una hora es posible realizar la observación bajo el MET. En nuestro caso, las soluciones de ácido fosfotúngstico se prepararon en una concentración entre 1 y 3 %, usando hidróxido de sodio para regular el pH en su valor neutro (pH = 7).. Figura 3.2 Ejemplo de la observación en un MET de un rotavirus, preparado por el método de tinción negativa [77].. 31.

(47) 3.2 Técnicas de caracterización de nanopartículas En esta sección describiremos las técnicas que utilizamos para caracterizar las nanopartículas de plata. Se trata de la espectroscopía de Ultravioleta-Visible, así como de la Microscopía electrónica de transmisión.. 3.2.1 Espectroscopía de Ultravioleta-Visible (UV-Vis) La espectroscopía UV-Vis permite seguir el crecimiento de nanopartículas en solución. Esto es debido a que las propiedades electrónicas cambian drásticamente como una consecuencia de la reducción del tamaño y las dimensiones del material, puesto que la densidad de estados y la longitud espacial son reducidas. Los eigenestados de energía están ahora determinados por las fronteras y los efectos de superficie cobran mayor relevancia [78].. Las resonancias de los plasmones de superficie, en la aproximación dipolar, son independientes del tamaño de la partícula, sin embargo, experimentalmente se ha observado que para partículas menores a 10 nm existe una fuerte dependencia con el tamaño de la banda. En esta situación, la resonancia plasmónica está fuertemente amortiguada por las partículas pequeñas y desaparece completamente cuando las nanopartículas tienen diámetros menores que 2 nm.. La interacción de un campo electromagnético con nanopartículas de metales nobles (cobre, oro y plata). genera una oscilación coherente de la banda de conducción de. electrones. Esta resonancia es conocida como plasmones de superficie. La resonancia de estos plasmones de superficie en el caso de las nanopartículas de metales nobles muy intensa y ocurre en la parte visible del espectro electromagnético. Esto hace posible detectarlas con ayuda de un espectrofotómetro.. La resonancia de los plasmones de superficie es una propiedad óptica importante de las nanopartículas; está relacionada con las fluctuaciones coherentes en la densidad de electrones en la interface metal (electrones libres)/ dieléctrico. La absorción de los. 32.