UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Y
ECOLOGÍA APLICADA
IDENTIFICACIÓN Y PATOGENICIDAD DEL AGENTE
BACTERIANO CAUSAL DE NECROSIS FOLIAR DEL CHAYOTE
(
Sechium edule
Jacq Sw)
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
ELMIRA SAN MARTÍN ROMERO
DIRECTOR
DR. MAURICIO LUNA RODRÍGUEZ
AGRADECIMIENTOS
A mi director de tesis Dr. Mauricio Luna Rodríguez, por todo su apoyo, consejos, paciencia, regaños y asesoría oportuna para llevar acabo este trabajo de investigación. A los miembros del comité tutoral: Dra. Lourdes G. Iglesias Andreu, Dra. Norma Flores Estévez, Dr. Juan Carlos Noa Carrazana, Dr. Francisco Díaz Fleischer por sus comentarios, ánimos y recomendaciones, no solo para llevar acabo esta investigación también por hacer este proceso más agradable.
A los miembros del jurado externo Dra. María de Jesús Mattínez Hernández y Dr. José María Ramos Prado, por sus comentarios atinados en la revisión al documento de tesis. A todos y cada uno de los profesores de INBIOTECA mil gracias por compartir sus conocimientos durante sus cursos: Dr.Lázaro R. Sánchez-Velásquez, Rafael, Dr Juan Carlos Noa-Carrazana, Dr.Angel I. Ortiz-Ceballos, Dra. Lourdes G. Iglesias-Andreu, Dra Norma,.Flores-Estévez, Dr. Francisco Díaz-Fleischer,Dra Diana Folger Pérez-Staples, Dr. Pablo Octavio Aguilar, Dra Ana E. Dorantes Acosta, Dr. Mario A. Arteaga Vázquez. Así como al personal técnico y administrativo, M. en C. Clara Córdova Nieto y Valencia, MGC. Luz Alejandra Valencia.
A mis compañeros y amigos de generación por compartir este camino mis amigas Ceci, Nadia, Thali, Rosario, y amigos Guillermo y Antero, por las preocupaciones y risas compartidas, los quiero.
A mis amigos (as) y compañeros del LATEX, Dr. Ángel Trigos, Paty Alfonseca, Alejandro, Marisol Morales, Margaret Pereda, Janneth Sandoval, Jorge Suárez, Sergio Ventura, Diana Barceló, Edgar Guevara, César Espinoza, Jacel, Margarita, gracias por todo el apoyo y comprensión brindada.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Mauricio Luna Rodríguez director de este trabajo doctoral por sus consejos, asesoría, regaños, paciencia y amistad.
A los miembros del comité tutoral: Dra. Lourdes G. Iglesias Andreu, Dra. Norma Flores Estévez, Dr. Juan Carlos Noa Carrazana y Dr. Francisco Díaz Fleischer, por sus ánimos, observaciones, empuje y sudisposición para hacer este proceso agradable.
A los miembros del jurado externo: Dra. María de Jesús Martínez Hernandéz y Dr. José María Ramos Prado, por sus atinados comentarios y observaciones en la revisión del documento fina
A los Profesores y personal del INBIOTECA por brindarme sus conocimientos, amistad y consejos durante sus cursos: Dr. Lázaro R. Sánchez-Velásquez, Dr. Juan Carlos Noa-Carrazana, Dra. Lourdes G. Iglesias-Andreu, Dr. Francisco, Díaz-Fleischer, Dra Norma Flores-Estévez, Dr Angel I. Ortiz Ceballos,.Dra Diana Folger Pérez-Staples, Dr. Pablo Octavio Aguilar, Dra. Ana E. Dorantes-Acosta, Dr. Mario A. Arteaga-Vázquez, MC Clara Córdova-Nieto, MGC. Valencia, Luz Alejandra.
A los compañeros de doctorado y generación, a mis amigas: Ceci, Nadia, Thalis, Rosario, Jacel, Margarita, y amigos: Guillermo y Antero, Edgar, gracias por los momentos, risas, anécdotas y precupaciones compartidas.
A mis amigos y compañeros del LATEX S.C., Dr. Ángel Trigos Landa, Paty Alfonseca, Alejandro Salinas, Marisol Morales, Janneth Sandoval, Margaret Pereda, Sergio Ventura, César Espinoza, por su apoyo y comprensión.
AGRADECIMIENTOS
A mi madre y mi padre Soledad Romero y Valerio San martín†
por su amor y comprensión en todo momento
A mis hijos Dieguito y Dalí,
por ser la motivación de mi vida, los amo
A mi esposo Alejando Callejas, por tu amor y apoyo en esta etapa
A mis hermanos Pily, Jorge, Mari, David, Pati† y Yeyo,
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA Y ECOLOGIA APLICADA
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
ECOBIOT-17A
AGRADECIMIENTOS Y CRÉDITOS INSTITUCIONALES
El presente trabajo se realizó bajo la dirección del
Dr. Mauricio Luna
Rodríguez
dentro de la(s) Línea de Generación y Aplicación del
Conocimiento: de
Sanidad Vegetal,
pertenecientes a el Cuerpo Académico:
Clave “CA-UVER-234”
Nombre
“Biotecnología Aplicada a la Ecología y
Sanidad Vegetal”
registrados en el
Instituto de Biotecnología y Ecología
Aplicada
de la Universidad Veracruzana en Xalapa, Veracruz.
Se agradece al
Dr.
Ángel Trigos Landa
director del Laboratorio de Alta
Tecnología de Xalapa, S.C. por el apoyo brindado y permitir la elaboración
del trabajo experimental de esta investigación.
Se agradece al programa de posgrado Doctorado en Ciencias en Ecología y
Biotecnología, siendo el Coordinador el
Dr. Francisco Díaz Fleischer
y al
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada siendo director el
Dr.
Juan
Carlos Noa Carrazana.
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN GENERAL 8
CAPITULO I
I INTRODUCCIÓN
1.1.Introducción general. 11
1.2. Marco teórico 14
1.2.1. Sechium edule Jacq Sw: origen y distribución 14
1.2.2. Taxonomia y descripción 15
1.2.3. Usos y valor nutricional y medicinal 17
1.2.4. Diversidad genética 18
1.2.5. Importancia económica 19
1.2.5.1.Producción de chayote en México 19
1.2.6. Problemas fitosanitarios del cultivo 21
1.2.7. Bacterias fitopatógenas 27
1.3. Problema de investigación: La necrosis bacteriana de plantas de Sechium edule Jack
30
1.3.1. Localización de la planta enferma 30
1.3.2. Características de variedades en estudio de patogenicidad 32
1.4. Peguntas de investigación 34
1.5.Hipótesis 34
1.6. Objetivos 34
1.6.1. Objetivo general 34
1.6.2. Objetivos específicos 34
CAPITULO II
A strain of Chryseobacterium sp. isolated from necrotic leaf tissue of chayote
(Sechium edule Jacq) 35
2.1 Abstract 36
2.3. Materials and methods 38
2.3.1. Bacteria isolation 38
2.3.2. Pathogenecity test 39
2.3.3. Morphological, physiological and cultural characterization 40 2.3.4. Amplification and sequencing of 16S rRNA gene 41
2.4. Results 42
2.4.1 Isolation of the bacteria: physiological and cultural characterization 42
2.4.2. Morphology of the bacteria cells 42
2.4.3. Analysis of 16S rRNA gen 43
2.4.4. Pathogenicity tests 45
2.5. Discussion 45
2.6. Conclussion 50
2.7. References 51
CAPITULO III
Patogenicidad de Chryseobacterium sp. en plántulas de pepino y calabaza (Pathogenicity of Chryseobacterium sp. on seedlings cucumber and pumpkin).
55
3.1. Resumen 56
3.3. Introducción 57
3.4. Materiales y métodos 59
3.4.1. Procedencia de la bacteria 59
3.4.2. Pruebas de patogenicidad en calabaza y pepino 60
3.5. Resultados y discusión 60
3.6. Referencias 63
CAPITULO IV 65
4.1. Discusión general 66
4.2. Conclusión 76
4.3. Referencias 78
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPITULO I
Figura Descripción Pág.
1 Sechium edule (a) rama con hojas, zarcillos y flores estaminadas y pistiladas; (b) estaminadas flor, (c) Frutos
17
2 Variedades botánicas de Sechium edule (Jacq.) Sw.: nigrum xalapensis (negro xalapa) (A), amarus silvestrys (amargo silvestre) (B), albus levis (amarillo claro) (C1), albus dulcis (cambray) (C2), albus minor (castilla blanco) (C3), nigrum maxima (caldero de sopa) (D), nigrum minor (castilla verde) (E), nigrum levis (castilla negro) (F), virens levis (verde claro) (G), nigrum spinosum (verde espinoso) (H).
19
3 Sandía afectada por Acidovorax avenae pv. citrulli 24 4 Daños en planta de calabaza causadas por Erwinia tracheiphila 24 5 Tallo de una planta de calabacita italiana afectada por
Pectobacterium chrysanthemi.
25
6 Mancha bacteriana causada por Xanthomonas cucurbitae en hojas de calabaza.
26
7 Síntoma de la mancha foliar angular de las cucurbitaceas causada por Pseudomonas syringae patovar lachrymans
26
8 Síntomas de necrosis en hojas de chayote colectadas en los jardines de la USBI.
30
CAPITULO II
Figura Descripción Pág.
1 Morphology of the cells of Chryseobacterium sp. under a scanning electron microscope (Geol JSM-5600). Zoom X 17,000.
42
2 Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences using the Neighbor-Joining method. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches. The tree is drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the Maximum Composite Likelihood method and are in the units of the number of base substitutions per site.
44
3 Principales vías de señalización que se activan en la defensa inducida de las plantas
60
CAPITULO III
Figura Descripción. Pág.
1 Actividad (clorosis y necrosis) de Chryseobacterium sp. en plántulas de a) Cucurbita pepo L. y b) Cucumis sativus L.
61
2 Síntomas presentados en plántulas de calabaza y pepino inoculadas con Chryseobacterium sp.
61
CAPITULO IV
Figura Descripción. Pág.
10 Síntomas de clorosis y necrosis en las cuatro variedades de chayote, a) S. edule var. nigrum spinosum (VE), b) S.edule var. albus spinosum (AE), c) S. edule var. nigrum xalapensis (VO), d) S. edule var. virens levis (VC), a los 7, 14, 21 y 30 días después de inoculados con suspensión bacteriana de Chryseobacterium sp.
11 Árbol consenso de evolución de características morfológicas, estructurales y bioquímicas de S.edule var. nigrum xalapensis, virens levis, nigrum spinosum y albus spinosus
74
12 Resistencia de gen a gen— Esquema de activación de la inmunidad activada por PAMPS y ETI (por efectores), al superar las barreras constitutivas, el patógeno es percibido por los receptores PRR de la planta y activan la inmunidad PTI, patógenos adaptados suprimen esta inmunidad con la liberación de efectores, la planta reconoce los efectores mediante proteína R o NB-LR.
75
ÍNDICE DE TABLAS
CAPITULO I
Tabla Descripción Pág.
1. Producción agrícola en México por cultivo, cíclicos y perennes, modalidad: riego y temporal 2012 (Chayote)
20
2 Producción agrícola por estado, cíclicos y perennes, modalidad: Riego y temporal 2012 (Chayote).
21
3 Producción por municipios del estado de Veracruz, ciclicos y perennes, modalidad: Riego y temporal 2012 (Chayote).
22
4 Enfermedades encontradas en Sechium edule 23
5 Presuntos fitoplasmas encontrados en Sechium edule Jacq Jw en Brasil 24 6 Apariencia y procedencia de los ejemplares de las cuatro variedades de
Sechium edule utilizadas en las pruebas de patogenicidad
CAPITULO II
Tabla Descripción Pág.
1 Differential characteristics for Chryseobacterium sp. (DQ530122.1), C. indologenes (AY050493.1), C. gleum and Chryseobacterium sp. (KC237770, KC247671 and KC309689 associated with necrosis of Sechium edule).
43
2 Nucleotide similarity (%) found among strains of Chryseobacterium sp. (KC237770, KC247671 and KC309689) vs. C. gleum (AB680759.1, EU982470.1 y NR_042506.1) and C. indologenes (AB517708.1 y LMG8337) resulting from the analysis of a 1404 nucleotide sequence of 16S rRNA gene.
22.4. ABREVIATURAS
DNA.- Ácido desoxiribonucleico.
EDTA.- Ácido etilendiaminotetracetico.
IG.- Isla genómica.
KB.- Medio de cultivo B de King.
NBY.- Medio de cultivo de extracto de levadura y
NGA.- Medio de cultivo agar nutritivo.
PCR.- Reacción en cadena de la polimerasa.
RNA.- Ácido ribonucleico
rRNA 16 S.- Subunidad 16 S del gen ribosomal
SDS.- Dodecil sulfato de sodio
YDC.- Medio de extracto de levadura, dextrosa y carbonato de calcio.
RESUMEN GENERAL
días de ser inoculadas. En cuanto a las pruebas en otras cucurbitáceas las plántulas de calabaza de 25 días de germinadas mostraron síntomas (clorosis y necrosis) al segundo día de inoculadas y muerte a los 20 días, las plántulas de pepino se inocularon a los 28 días de germinadas y solo mostraron síntomas las hojas cotiledonales. El género Chryseobacterium sp. se ha encontrado en diferentes ambientes, y afectando tanto
1. Introducción general
Los fitopatógenos son una de las causas más comunes de daños fisiológicos de las plantas y por tanto de la destrucción de cosechas, estos pueden llegar a ser extremadamente destructivos bajo condiciones ambientales favorables. Comúnmente son difíciles de controlar y con frecuencia se requiere de la combinación de varias estrategias, obligando a iniciar, sin lugar a dudas, con la caracterización e identificación precisa y oportuna del organismo causante del daño (Goto 1994, Agrios 2005).
Se ha estimado que a nivel mundial las pérdidas en los cultivos como consecuencia de las enfermedades oscilan entre el 25 y 65 %, lo que representó entre 50 y 100 millones de dólares en el año 2005. A nivel nacional las pérdidas por este factor se encuentran entre el 12 y 38 %, repercutiendo directamente en la economía del sector agrícola, cuya consecuencia lógica se refleja en un mayor gasto tanto para el control de las enfermedades como en resolver la demanda del producto (SAGARPA 2008).
Entre los patógenos que causan mayor daño se encuentran las bacterias, estas ocupan el segundo lugar después de los hongos. En impacto a nivel mundial, las bacterias fitopatógenas están ampliamente distribuidas en las regiones agrícolas del mundo y cuando existen condiciones favorables para su desarrollo y establecimiento, causan grandes pérdidas. En ocasiones son tan graves que llegan a ser catastróficas, representando un factor limitante para la explotación comercial de diversos cultivos de importancia económica (Sosa-Moss y Perdomo 1997, Gatti-Almeida 2005).
Se reconocen alrededor de 60 especies bacterianas comprendidas en 25 géneros con alrededor de 300 patovares, y cada una puede afectar a uno o varios cultivos (Schaad et al. 2001, Whitman 2005). Sin embargo, en años recientes se ha continuado con la identificación de nuevas especies fitopatógenas que no habían sido citadas anteriormente (Palacio-Bielsa 2010). Por ello, una adecuada identificación y caracterización de aislamientos bacterianos que afectan plantas, es tema fundamental para los microbiólogos y los fitopatólogos (Gatti-Almeida 2005).
Dentro de los cultivos básicos de México encontramos al chayote (Sechium edule Jacq. Sw.), hortaliza considerada de origen mesoamericano, específicamente asociada a nuestro país, donde la mayor diversidad se localiza en los estados de Veracruz, Chiapas y Oaxaca (Lira 1996; Cadena-Iñiguez et al. 2007; Avendaño‑Arrazate et al. 2010).
Se estima que el consumo de esta cucurbitácea, es común desde antes de la conquista española, la cual dio lugar a su propagación al resto del continente americano (Newstrom 1991; Lira 1996, Cadena-Iñiguez y Arévalo Galarza 2010). En términos económicos, él chayote cuenta con la preferencia en el mercado nacional debido al arraigo cultural y sus cualidades organolépticas y nutrimentales. Su comercialización, asociada al origen y prácticas tradicionales, así como a la creciente tendencia por el consumo de productos de calidad mínimamente industrializados, le confiere un alto valor en los mercados internacionales con un incremento sostenido en la demanda (SAGARPA 2008).
Como se ha indicado, no se han reportado patologías similares en este cultivo, por lo que se desconoce el agente causal de esta necrosis, así como el comportamiento del mismo, debido a esto, se considera importante llevar a cabo su identificación y ensayos preliminares que permitan sentar las bases para la determinación, si fuera el caso, de una relación hospedero-patógeno entre estas especies, de tal manera que se contribuya a asegurar la sanidad y su vigilancia en los cultivos establecidos en las regiones productoras vecinas.
1.2. Marco teórico
1.2.1. Sechium edule Jacq Sw. origen y distribución.
En México, el chayote (Sechium edule Jacq Sw.) se cultiva desde tiempos pre-colombinos, en cuanto a las referencias lingüísticas, los nombres comunes de origen nativo se concentran principalmente en México y América Central. Las exploraciones concuerdan que la mayor variación de chayote bajo cultivo se localiza entre el sur de México y Guatemala. La distribución geográfica de las especies silvestres de Sechium confirma el origen mesoamericano de este cultivo (Newstrom 1990, Lira 2007).
variación representada en México (Maffioli 1981, Engels 1983, Newstrom 1991, Lira, 1996, Lira 2007).
La distribución de algunos de los tipos salvajes de S. edule fueron registrados y clasificados, como tales, por Cruz-León (1985-86) para el Estado de Veracruz y posteriormente, se publicaron en el Estado de Oaxaca por Newstrom (1985, 1986, 1989, 1990). Ahora se sabe que poblaciones de este tipo se desarrollan en Veracruz, Puebla, Hidalgo y Oaxaca (Lira 1995a, 1995b).
Los hábitats típicos de estas plantas son las zonas húmedas, como barrancos, cascadas y los ríos o arroyos, donde la vegetación es bosque húmedo predominantemente y en las partes bajas de las zonas de bosque perenne o bosque estacional. Actualmente el chayote domesticado se distribuye prácticamente en los cinco continentes, ya que en los últimas dos décadas ésta especie ha prosperado comercialmente de hortaliza de traspatio a producto no tradicional de exportación (Cadena-Iñiguez et al. 2001, 2011).
1.2.2. Taxonomía y descripción
El Chayote se clasifica taxonómicamente dentro de las Embriofitas; Clase Magnoliopsida; Orden Violales; Familia Cucurbitaceae; Género Sechium; Especie S. eduleJacq Sw
inserción del pecíolo (Figura 1), miden de 10 – 30 cm de largo por 5 – 20 cm de ancho, provistas de pelos viscosos; zarcillos de 3 – 5, partidos (Martínez 1959 y León 2000, Lira 2007). Monoica, de flores unisexuales pequeñas, las masculinas agrupadas en racimos con 5 estambres y las femeninas solitarias, ambas asilares en el mismo nudo; las flores femeninas tienen ovario ínfero, estilo que termina en un estigma discorde, al igual que las masculinas poseen 5 sépalos verdosos, 5 pétalos amarillentos y 10 nectarios evidentes a simple vista (Cruz-López 1991, Lira 2007).
Figura 1. Sechium edule (a) rama con hojas, zarcillos y flores estaminadas y pistiladas; (b) estaminadas flor, (c) Frutos (Nee 1993)
1.2.3. Usos y valor nutricional y medicinal.
El chayote es usado principalmente para consumo humano. El fruto, tallos y hojas tiernas, lo mismo que las porciones tuberizadas de las raíces son consumidas como vegetal, tanto solas, hervidas, que como ingredientes de numerosos estofados. Debido a su flexibilidad y fortaleza, los tallos han sido usados en la fabricación artesanal de canastas y sombreros. En la India, el fruto y las raíces no solamente se usan para consumo humano sino también como alimento para el ganado (Madrigal 2000).
particularmente, las semillas, son ricos en aminoácidos (Lira et al.1996). Según Diré et al. (2004), el extracto del fruto reduce la presión diastólica, la glucosa y niveles de globina. Yen et al. (2001) encontraron que el extracto acuoso de chayote tuvo potencial anti-mutagénico en cepas de Salmonella thiphimurium, pero no en los linfocitos, mientras Setzer y Setzer (2003) encontaron que el extracto etanólico del fruto mostró actividades antineoplásicas al inhibir la proliferación del fibrosarcoma de pulmón en ratas.
1.2.4. Diversidad genética.
Pocas especies cultivadas despliegan la gran diversidad de formas, tamaños, ornamentación, armadura, indumento y colores como la que se encuentra en los frutos del chayote (Figura 2). Además de la diversidad morfológica, existen variantes en los períodos de fructificación, donde variantes locales de Oaxaca y Chiapas pueden rendir entre una y cuatro cosechas por año. Este tipo de variación también se ha citado para otras regiones (Cadena-Iñiguez 2008).
planificada en 10 estados de México, Guatemala y Costa Rica, tomando en cuenta las características morfologícas de frutos, espesor y tamaño de espinas, flor, pedúnculos y hojas.
Figura 2. Variedades botánicas de Sechium edule (Jacq.) Sw. nigrum xalapensis (negro xalapa) (A), amarus silvestrys (amargo silvestre) (B), albus levis (amarillo claro) (C1), albus dulcis (cambray) (C2), albus minor (castilla blanco) (C3), nigrum maxima (caldero de sopa) (D), nigrum minor (castilla verde) (E), nigrum levis (castilla negro) (F), virens levis (verde claro) (G), nigrum spinosum (verde espinoso) (H).
1.2.5. Importancia económica
1.2.5.1. Producción de chayote en México.
Tabla 1. Producción agrícola por cultivo, cíclicos y perenes, modalidad: Riego y temporal 2012.
Cultivo Sup. Sembrada (Ha) Sup. Cosechada (Ha) Producción (Ton) Rendimiento (Ton/Ha) PMR ($/Ton) Valor Producción (Miles de Pesos)
Chayote 2,707.62 2,705.62 162,855.06 60.19 2,476.04 403,235.85 (SIAP 2013)
En México, entre los estados productores se encuentran a San Luis Potosí, Guanajuato, Michoacán, Jalisco y Veracruz, siendo este el primer productor a nivel nacional con 131,636.72 mil toneladas anuales generando el 80.83% de la producción total, que se traducen a $ 320,659.32 miles de pesos de valor aproximado (Tabla 2) (SIAP, 2013).
Tabla 2. Producción estatal de chayote en México. Ciclicos y perennes, modalidad: Riego y temporal 2012.
CHAYOTE
Ubicación Sup. Sembrada
Sup.
Cosechada Producción Rendimiento PMR
Valor Producción (Ha) (Ha) (Ton) (Ton/Ha) ($/Ton) (Miles de Pesos)
VERACRUZ 2,032.00 2,032.00 131,636.72 64.78 2,435.94 320,659.32
MICHOACAN 244 244 19,402.21 79.52 2,050.19 39,778.15
JALISCO 242 242 9,011.00 37.24 3,661.82 32,996.64
SAN LUIS
POTOSI 75 75 1,125.00 15 2,683.34 3,018.76
MÉXICO 50 50 925 18.5 4,120.00 3,811.00
YUCATAN 24.42 22.42 578.2 25.79 4,119.59 2,381.95
TABASCO 6 6 56.41 9.4 1,724.13 97.26
GUANAJUATO 5 5 50 10 3,500.00 175
MORELOS 4 4 36 9 5,800.00 208.8
PUEBLA 23.7 23.7 20.42 0.86 3,788.98 77.37
NAYARIT 1.5 1.5 14.1 9.4 2,241.14 31.6
En el estado de Veracruz, entre los municipios productores de chayotes sobresalientes encontramos a: Coscomatepec (con la mayor producción estatal 26%), Ixtaczoquitlan (25 %) y Actopan 20% (Tabla 3) (SIAP, 2013).
1.2.6. Problemas fitosanitarios del cultivo.
La mayor parte de las plantas cultivadas pueden ser atacadas por una o varias especies bacterianas y las pérdidas ocasionadas por éstas son muy variables, entre las familias vegetales más representativas encontramos a las solanaceas, fabaceas, crucíferas, rosaceas, cucurbitaceas, entre otras (Domínguez 2004).
Tabla 3. Producción por municipios del estado de Veracruz, ciclicos y perennes. modalidad: Riego y temporal 2012
CHAYOTE
Municipio
Sup. Sembrada
Sup.
Cosechada Producción Rendimiento PMR
Valor Producción (Ha) (Ha) (Ton) (Ton/Ha) ($/Ton) (Miles de
Pesos)
1 COSCOMATEPEC 480 480 34,560.00 72 2,083.33 71,999.88
2 IXTACZOQUITLÁN 543 543 34,209.00 63 2,790.06 95,445.16
3 ACTOPAN 420 420 27,300.00 65 2,645.05 72,209.86
4 IXHUATLÁN DEL
CAFE 100 100 7,100.00 71 2,050.00 14,555.00
5 ALPATLAHUAC 115 115 7,015.00 61 2,054.34 14,411.20
6 CALCAHUALCO 105 105 6,405.00 61 2,045.24 13,099.76
7 CHOCAMÁN 75 75 4,650.00 62 2,520.00 11,718.00
8 FORTIN 68 68 4,080.00 60 2,691.18 10,980.01
9 HUATUSCO 45 45 2,745.00 61 2,111.11 5,795.00
10 RAFAEL
DELGADO 35 35 2,100.00 60 3,000.00 6,300.00 11 EMILIANO
ZAPATA 40 40 1,200.00 30 3,000.00 3,600.00
12 ZONGOLICA 4 4 180.72 45.18 2,000.00 361.44
13 MAGDALENA 2 2 92 46 2,000.00 184
Las enfermedades y plagas en el cultivo del chayote han aumentado con el trancurso del tiempo, por ejemplo, en la década de los 70´s se reportaba a la estrella negra (Venturia cucumerina) y a la arañita roja (Tetranychus urticae) como enfermedades dominantes, para la década de los 90 aparecieron los virus y otras plagas como mosquita blanca y thrips. Actualmente se reportan 31 especies de hongos, una virosis y fitoplasmas, para el caso del mono cultivo del chayote las plagas y enfermedades evolucioan constantemente y cada vez aparecen nuevas enfermedades y plagas que afectan esta cucurbitácea (Gamboa 2005, Lira 1996).
Tabla 4. Principales especies fúngicas que causan enfermedades en S. edule
Nombre común Agente causal Organos afectados Sintomatología
Roña o Sarna Phoma cucurbitacearum Fruto Clorosis y Necrosis
Vejiga Mycovellosiella cucurbiticola, M.lantanae
Fruto Pustulas
Pudrición
chocolate
Colletotrichium sp. Fruto Lesiones con bordes gelatinosos y manchas
naranjas
Estrella negra Venturia cucumeris Hoja Manchas en nervaduras
Mildiu Erysiphe cichoracearum Hoja Manchas
Mancha Cercospora
Cercospora cucurbitae Hoja Manchas
Pudrición de
corona
Asociación de: Ascochyta phaseolorum,
Fusarium sp., Colletotrichiumc sp y
Macrophomina sp.
Fruto Lesion negruzca
Peca blanca Ascochyta phaseolorum Hoja y Fruto Lesión en pedúnculo que avanza al fruto
s.n Helminthosporium sechium/ Pseudomonas sp
Hoja Depresiones blancas y circulares con halo café y verdoso cuando asociado con
Pseudomonas sp.
s.n Fusarium oxysporium Hoja y Tallo Manchas amarillas, decaimiento. Lira 1996
Tabla 5.Presuntos fitoplasmas encontrados en Sechium edule Jacq Jw en Brasil
Sequence similarities among 16S rDNAs from phytoplasmas classified in group 16SrIII
Phytoplasma Mor5 WX CYE-C VGYII
ChWBIII (Ch10) 99.8 98.9 99.0 99.1
ChWBIII (Mor5) 98.7 98.8 99.0
WX
CYE-C
98.6 99.3
98.9
No obstante que no hay reportes de enfermedades bacterianas para S. edule, sí los hay para otras especies de la familia Cucurbitaceae, destacándose las siguientes patologías:
a. Mancha bacteriana del fruto. Afecta principalmente melón y sandia. Es causada por Acidovorax avenae patovar citrulli (Schaad et al. 1978, Flores-Hernández et al. 2006) y
ocasiona pérdidas de producción entre el 70 y el 100%. Produce la putrefacción del fruto (Figura 3), tallos y hojas, y tiene la particularidad de diseminarse por semilla. Ha sido catalogada de importancia cuarentenaria en varios países, entre ellos México (Rueda et al. 2006, Alvarado 2008).
Figura 3. Sandía afectada por Acidovorax avenae pv. citrulli.
b. Marchitez bacteriana. Afecta principalmente al pepino y calabaza. Es causada por Erwinia tracheiphila (Smith 1895). La actividad bacteriana obstruye el sistema vascular
de las plantas afectadas (Figura 4), se marchitan primero las ramas afectadas y avanza hasta la marchites total de la planta. Puede causar pérdidas en la producción entre el 50 a 100%, de acuerdo a APS.
c. Podredumbre blanda. Afecta principalmente a pepino y calabaza. Es causada por Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones 1901) (Syn. Erwinia carotovora subsp. carotovora). La bacteria penetrar por heridas e invade tejidos
medulares, provocando generalmente podredumbres acuosas y blandas (Figura 5), y la muerte de la planta. Tiene gran capacidad saprofítica, por lo que puede sobrevivir en el suelo, agua de riego y raíces de malas hierbas. Las condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad son humedades relativas altas y temperaturas entre 25 y 35 ºC (Hauben et al. 2005). Luna-Rodríguez et al. (2009), encontraron a Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder, McFadden and Dimock 1953) en asociación con P.
carotovorum subsp. carotovorum ocasionando pudriciones blandas en cultivo de
calabacita italiana en la localidad de La Tinaja, Veracruz.
Figura 5. Tallo de una planta de calabacita italiana afectada por Pectobacterium chrysanthemi. Foto: Luna-Rodríguez 2007.
e. Mancha bacteriana. Afecta a calabazas. Es causada por Xanthomonas cucurbitae (ex Bryan 1926) (Syn. Xanthomonas campestris patovar cucurbitae) que infecta a la planta en el verano y para el invierno hace estallar al fruto; comúnmente ocasiona manchas en las hojas (Figura 6). Esta enfermedad ha sido reportada en Asia, Australia, Europa y Norte América (Babadoost y Zitter 2009).
Figura 6. Mancha bacteriana causada por Xanthomonas cucurbitae en hojas de calabaza. f. Mancha foliar angular de las cucurbitáceas. Se le considera como una seria amenaza
para las cucurbitáceas (melón, sandía y calabaza). Es causada por Pseudomonas syringae patovar lachrymans (Smith y Bryan 1915). Ocasiona grandes pérdidas en la producción. Produce síntomas como manchas necróticas en hojas, frutos y tallos (Figura 7). El patógeno se transmite a través de semilla infectada y es una bacteria persistente en el suelo (Fatmi et al. 2008).
1.2.7. Bacterias Fitopatógenas.
De los géneros que actualmente se reconocen como causantes de enfermedades en vegetales, sobresalen: Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas, Pectobacterium, Erwinia, Brenneria, Ralstonia, Acidovorax, Burkholderia, Clavibacter, Curtobacterium,
Rathayibacter, Arthrobacter, Xylophilus, Xylella, Liberibacter, entre otros (Schaad 2001, Whitman 2005, Hernández 2012).
Algunas de las especies causantes de bacteriosis tienen una fase epífita durante la cual viven asociadas a la planta sin causar daños, y cuando se modifican las condiciones climáticas o de cultivo y se dan los factores favorables para el incremento de la población bacteriana, se observan los síntomas de la enfermedad (Palacio-Bielsa 2010).
Las manisfestaciones observadas en las enfermedades de las plantas se conocen como síntomas, estos son el resultado entre la relación hospedero-patógeno (mecanismos de defensa de la planta y mecanismo de ataque del patógeno) que pueden repercutir en efectos fisiológicos de la planta causando la enfermedad. Las bacterias fitopatógenas ocasionan un gran número de síntomas que dependen de la especie del huésped y del estado fisiológico y fenológico de éste (Palacio-Bielsa 2010).
follaje, de coloración grisácea, blanquecina, rojiza o café; pudrición, donde el tejido muere y adquiere una consistencia humeda, suave o acuosa; cancro, tejido muerto hundido, en troncos y ramas; muerte descendente que se presenta en árboles empezando por ramas terminales hacia el tronco; marchitez, falta de turgencia y eventualmente muerte en ramas y hojas (Agrios 2005, Arauz-Cavallini 2011).
Se encuentran dos tipos de patógenos, los biotrofos y los necrófilos, los primeros están especializados en vivir en los tejidos vivos de las plantas, al contrario de los necrófilos que provocan la muerte de las células vegetales (necrosis), ya que generalmente producen toxinas para alimentarse del tejido vegetal, además de que no dependen de la supervivencia del hospedero, ya que estos pueden sobrevivir como saprofitos (Ojitos-Ramos et al. 2010).
Las toxinas bacterianas son activas a muy bajas concentraciónes y son, generalmente, la causa de la necrosis foliar al presentar acción sobre algunas rutas metabólicas de la planta, evadiendo así los mecanismos de defensa de la misma, este efecto se puede presentar sobre el metabolismo del nitrógeno de la planta hospedadora, inhibiendo enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos (al interior del cloroplasto), por lo que suelen afectar la actividad del mismo (Ojitos-Ramos et al. 2010, Delgado-Cerezo 2012).
irreversiblemente la enzima glutamina sintetasa bajo condiciones de luz, bajando los niveles de glutamina y ocasionando la acumulación de amonio en los tejidos de la planta, causando un desacople de la fotosíntesis y una destrucción selectiva de las membranas tilacoidales. Los síntomas que se observan en la planta son clorosis, necrosis y por consiguiente una reducción de la capacidad de defensa de la planta y la muerte de la misma (Delgado-Cerezo 2012, Rocha-Sosa 2013).
1.3. Problema de investigación: La necrosis bacteriana de plantas de Sechium edule
Jack. Sw.
1.3.1. Localización de plantas de chayote con necrosis foliar.
El proyecto inició con el hallazgo de dos plantas de chayote enfermas (Fig. 8). Las plantas se localizaron en los jardines de la Unidad de Servicios Bibliotecarios y de Información de la Universidad Veracruzana Campus Xalapa (USBI), la cual se encuentra ubicada en la ciudad de Xalapa, Veracruz, en las coordenadas 19°31'55" latitud norte y 96°54'35" longitud oeste (Fig. 9).
Figura 8. Síntomas de necrosis en hojas de chayote colectadas en los jardines de la USBI.
La ciudad de Xalapa, Veracruz, se asienta principalmente en formaciones sedimentarias de origen cuaternario, compuestas de arcilla, arena, grava y aluviones. La altura de la ciudad varía de 1350 msnm en las partes más bajas hacia el sureste, hasta 1550 msnm en la cima del cerro de Macuiltepetl, el área urbana tiene un clima templado, con una temperatura promedio anual de 18° C y una precipitación promedio anual de 1454 mm, con valores máximos en el verano.
vegetación natural del área de Xalapa, que corresponde al bosque mesófilo de montaña, ha quedado confinada a pequeñas áreas de lomeríos, pendientes y cañadas cercanas a la ciudad y en el cerro de Macuiltepetl, dentro del área urbana (Enciclopedia de los Municipios de México 2005).
1.3.2. Características de las variedades de S. edule empleadas para el estudio de
patogenicidad.
Para realizar las pruebas de patogenicidad se emplearon ejemplares de cuatro variedades de S. Edule (Tabla 6).
Tabla 6. Apariencia y procedencia de los ejemplares de las cuatro variedades de Sechium edule utilizadas en las pruebas de patogenicidad.
Chayote Procedencia
S. edule var. nigrum
spinosum (VE)
Actopan, Ver.
19°30' de latitud norte y 96°37' de longitud oeste
S. edule var. albus spinosum (AE)
Vega de Alatorre, Ver.
20° 02’ latitud norte y 96° 57’ longitud oeste, 10 msnm
S. edule var. nigrum
xalapensis (VO)
Actopan, Ver.
S. edule var. virens levis (VC)
Actopan, Ver.
a. S. edule var. nigrum spinosum, presenta fruto piriforme de verde claro a verde oscuro, con dimensiones de 5.8 a 17.1 cm de longitud, de 5.0 a 12.2 cm de ancho y 3.6 a 9.7 cm de grosor, con alta densidad de espinas, cinco costillas no muy marcadas y hendidura basa muy marcada, pubescencia muy baja en el pedúnculo. b. S. edule var. albus spinosum, fruto amarillo de tamaño mediano, piriforme de 5.8 a
17.1 cm de longitud, 5.0 a 12.2 cm de ancho, 3.6 a 9.7 cm de grosor, hendidura basal pronunciada, presencia de espinas en densidad media a baja, sin presencia de costillas en apariencia.
c. S. edule var. nigrum xalapensis, fruto piriforme verde obscuro, de 5.5 a 26.6 cm de longitud, 4.4 a 18 cm de ancho y de 4.0 a 10.7 cm de grosor, que presenta cinco costillas no muy marcadas y hendidura basal muy marcada y pedúnculo medianamente pubescente.
d. S. edule var. virens levis, cuyo fruto va de 9.30 a 18.30 cm de longitud, de 6.0 a 11.40 cm de ancho, y de 5.40 a 9.60 cm de grosor, de forma piriforme verde claro con cinco costillas no muy marcadas, hendidura basal no muy profunda, pedúnculo verde claro con muy baja pubescencia.
1.4. Preguntas de investigación
¿Existen reportes de esta patología para este u otros hospederos? 1.5. Hipótesis
La necrosis foliar del chayote (Sechium edule Jacq Sw.) es causada por una especie bacteriana aun no diagnosticada ni reportada para este hospedero y provoca un efecto patogénico distinto de acuerdo con el tipo de variedad, por lo que es presumible que afecte diferencialmente a otras especies de Cucurbitaceas.
1.6. Objetivos
1.6.1. Objetivo general:
Identificar y evaluar la patogenicidad del agente bacteriano causante de necrosis foliar del chayote (Sechium edule Jacq Sw.)
1.6.2. Objetivos específicos:
1. Evaluar la patogenicidad de la bacteria en cuatro variedades de chayote de mayor importancia económica y arraigo cultural.
2. Evaluar la patogenicidad de la bacteria en dos especies de cucurbitáceas de importancia económica.
3. Describir morfológicamente la célula bacteriana y el crecimiento de la colonia desarrollada en distintos medios generales de aislamiento.
4. Identificar y caracterizar mediante pruebas bioquímicas el aislamiento bacteriano. 5. Caracterizar el aislamiento bacteriano mediante la amplificación y secuenciación
CAPITULO II
A strain of Chryseobacterium sp. isolated from necrotic leaf tissue of chayote
(Sechium edule Jacq)
En este capítulo se presenta la información generada en la identificación y caracterización de la
bacteria causante de necrosis foliar en chayote, así como los resultados de las pruebas de
patogenicidad realizadas en las cuatro variedades de Sechium edule Jacq. Estos resultados forman parte de la propuesta de un artículo científico aceptado para publicación en la revista
International Research Journal of Biological Sciences.
A strain of Chryseobacterium sp. isolated from necrotic leaf tissue of chayote
Elmira San Martín-Romero 1,2, Mauricio Luna-Rodríguez 2*, Francisco Díaz-Fleischer 1
, Lourdes Georgina Iglesias-Andreu 1, Juan Carlos Noa-Carrazana 1, Norma Flores Estévez 1, Diana Barceló-Antemate 3.
1
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Universidad Veracruzana, Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101, Col. Emiliano Zapata, Xalapa, Veracruz, México CP
91090. 2
Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa S.C., Universidad Veracruzana, Médicos No. 5, Unidad del Bosque, Xalapa, Veracruz, México. CP 91010.
3
Facultad de Biología, Universidad Veracruzana, Zona Universitaria s/n, Xalapa, Veracruz, México CP 91000.
*Corresponding author: mluna@uv.mx
2.1. Abstract.
There are few reports of bacterial diseases in chayote because these are usually attributed to other pathogens, mainly fungi. However from two Sechium edule Jaqc Sw plants showing necrosis of the leaves the presumptive pathogen was isolated from symptomatic leaves on yeast-dextrose-calcium carbonate agar yielding yellow-orange color colonies that developed after 36 hours. This study was proposed to identify the microorganism associated with this pathology and to evaluate its aptitude to induce necrotic damage in four varieties in S. edule. The bacterium identification was based on phenotypic, biochemical characters and sequence of the gene fragment coding 16S rRNA. It was found that necrosis leaf of chayote may be caused by Chryseobacterium sp. Similarly, a phylogenetic analysis was performed with 24 species of this genus together with the strain under study, finding more similarity to C. indologenes and C. gleum.Significant differences were found in the expression of the symptoms of chlorosis and necrosis amongst the varieties of chayote constantly appearing throughout our study. Chryseobacterium was described in 2010 for the first time as a pathogen associated with Soft Rot of Calla Lily in Poland. This genus has been found in different environments, so it is considered appropriate to investigate its ecological rôle or some other association with plants.
Keywords: Flavobacteriaceae, Chryseobacterium ecological role, plant-bacterium association, 16S rRNA.
The genus of Chryseobacterium was described by Vandamme et al.1 to classify some of the species that were found within Flavobacterium, due to the heterogenity of the group. The bacteria of this genus are characterized by their bacillary form and by their gram negative type. They form circular colonies, many with a sweet smell, which produce flexirubin, a yellow pigment that is insoluble in water2,3,4.
Herzog et al.5 mention that Chryseobacterium represent one of the genus that has had the highest growth in the number of species registered since 2003. In that year, the species C. defluvii6 and C. joostei7 were described and classified. At the moment, there are some environments and new species proposed for this genus3,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, which proves that the genus comprises a group of organisms ubiquitous in nature5, due to its ample genetic plasticity18.
The majority of the members of this genus are widely distributed in water and soil environments10,15,19,20,21. Other species such as C. gleum, C. meningosepticum and C. hominis, are human and animal pathogens16,22,23; some others are part of the psicrotolerant and proteolitic bacteria community that cause a variety of defects in food industry products5,8,14.
With regards to its interactions in the plant kingdom, Park et al.10 found that strains of Chryseobacterium sp. constitute the second most abundant group of cultivable microorganisms, after Pseudomonas sp. which are found in roots and rhizosphere of two sand-dune plant species found in the coastal areas of Tae-an in Korea. These authors, together with Bernardet et al.24 and McSpadden-Gardener and Weller25, point to the fact that it is not easy to speculate about the ecological significance of the vegetation studied, due to the lack of information about the possible rôle of the bacteria belonging to this genus associated with plants.
Poland. However, based on some physiological tests, they indicated that it is possible that the calla lily was not the primary host and that the infection (or colonization) observed could have happened only occasionally.
Despite the fact that the Chayote (Sechium edule Jacq SW) is affected by various plagues and diseases, the most common and studied reports are mainly focused on fungi and viruses27. However, in 2007, Chayote plants were found in the gardens of the University of Veracruz in Xalapa, Veracruz, México, which had wet spot on the leaves which evolved into necrosis. The bacteria colonies isolated from these caused similar symptoms when they were infiltrated on healthy leaves. Preliminary results indicated that it was a bacterium of the family Flavobacteriaceae, a group not commonly reported as phytopathogenic.
The aims of this study were the identification of the microorganism and the evaluation of its capacity to induction of necrotic damage in four varieties of Sechium edule Jaqc Sw., in order to generate information permitting the determination of the ecological rôle of this bacterial group as its potential activity as a phytopathogen of the Chayote.
2.3. Materials and Methods
2.3.1. Bacteria isolation: The bacterial strain was isolated from leaves showing symptoms of foliar necrosis in two chayote plants (S. edule) which were developed in the gardens of the Library and Information Services Department of the University of Veracruz in Xalapa, Veracruz, México.
were observed after 48 hours. Re-seeding was carried out for every type of colony, until pure cultures were obtained.
2.3.2. Pathogenecity Test: Stage one: From the observation of the most common colonies produced, suspensions of bacteria (150 x 106 CFU.ml-1)were prepared. Approximately 100 µL of this suspension was infiltrated with a 500 µL syringe on the second leaf of every Sechium edule var. virens levis plant (fruit light green unarmed) which was 25 days old (plants with 6 to 7 leaves), with the aim of inducing the symptoms originally observed. 15 chayote plants were inoculated with the bacterial solution and 10 plants with sterilized distilled water as the control sample. The plants were sown in sterilized soil at 121ºC/15 pounds of pressure/20 min in plastic pots with 2 kg capacity. Every plant inoculated was labeled with information of the infiltrated bacteria. The inoculated plants were maintained under nursery conditions during the months of June to July of 2008, with a daytime temperature that oscillated around an average of 22 ± 2 °C and with a relative humidity of 74 %. The plants were irrigated with drinking water every three days.
pronounced basal cleavage, the presence of spines of medium to low density, without the presence of ribs in appearance.
For the development of the plants healthy fruit were grown in sterilized soil at 121 ° C/15 pounds pressure for 20 min in 2 kg capacity plastic pots. To perform the test, 40 plants of each variety were used with a measure range average of 150 cm in length, with 6 to 7 developed leaves. Each plant was injected on the foliar lamina of the second basal leaf with 500 µL of an acuous suspension of Chryseobacterium sp. of 150x106 CFU.ml-1. As control, 10 samples of each variety of chayote were inoculated with 500 µL of sterilized destilled water.The samples were maintained at an average relative humidity of 87% and a temperature of 22°C. They were watered every other day. 7, 14, 21 and 30 days after inoculation the foliar area showing chlorosis and necrosis were measured and photographed.
The plants of chayote were accommodated in random blocks. Every plant of every variety was considered to be an experimental unit. The percentage of the area with chlorosis and necrosis in the inoculated leaf was determinate. For the analysis, data were transformed to arch bosom square root of x+129. It was used a multiple analysis of variance (MANOVA) for a split-plot design (range = large plot, days = small plot), followed by univariate analysis (ANOVA). Comparisons were performed by Tukey-Kramer paired to determine the differences among the varieties of chayote.
bacteria cell is determined using a scanning electron microscope (Geol JSM-5600) from the Institute of Ecology in Xalapa, Veracruz, Mexico.
2.3.4. Amplification and sequencing of 16S rRNA gene: The molecular characterization of the strain was performed by PCR: 16S rRNA (sub-unit 16S of the ribosomal RNA gene). Genomic DNA was isolated by the method described by Madigan and Martinko33 using buffer lysis (Tris-HCl 10 mM, pH 8; EDTA 1 mM, SDS 1%) reported by Flamm et al.34. The integrity of the genomic DNA obtained was detected by electrophoresis in 0.9 % agarose gel stained with ethidium bromide. The 16S rRNA region was amplified with 8f
(5’-CACGGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG-3’) and 1512r
(5’-GTGAAGCTTACGGYTAGCTTGTTACGACTT-3’) bacterial universal primer pairs34. The reaction mixture for PCR amplification was prepared according to Luna et al.36. The amplifications were performed in a Master-cycler personal Eppendorf thermo-cycler. The PCR reaction details were as follows: an initial denaturing at 94 ºC for 2 min; 35 cycles of denaturing, annealing and elongation of 94 ºC for 10 seg, 59 ºC for 20 seg, 72 ºC for 2 min and a final elongation at 72 ºC for 4 min.
The amplified product of 16S rRNA gene was purified using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) and sequencing of the 16S rRNA gene was carried out by Macrogen USA Corp. using 8f, 1512r and 968f (5´-AACGCGAAGAACCTTAC-3´) primers. The sequences were analyzed with the BioEdit version 7.0.0 (Isis Pharmaceuticals, Inc.) and they were blasted with database from the GenBank of the NCBI (National Center for Biotechnology Information). Sequences of representative Chryseobacterium species were searched in the GenBank database. MEGA 5.0 software programme which were started with a set of aligned sequences using Clustal W, and searches for phylogenetic trees according to Neighbor Joining (NJ) and Maximum Parsimony (MP) algorithms37,38,39. Subsequently, the sequences were discharged in the GenBank and the accession numbers were assigned.
2.4. Results
Of all the different types of bacteria developed and inoculated for Koch's postulates, only one produced the symptoms observed in the field. The bacteria in question presented an adequate colonial development in the mediums of YDC, NGA and NBY, with the following characteristics: Yellow-orange color, shiny, convex, circular, with a smooth and complete border, of a semi-mucoid consistency, of 1 mm of diameter after 36 hours of incubation at 27ºC ± 2, and 2 mm after 48 h. In KB the lowest colonies showed a less intense yellow color with semi-translucent borders.
The results of the physiological tests of the strain under study are summarized in Table 1. Additionally, it showed positive results to the tolerance to 3% NaCl and production of flexirubin; so much that they were negative for the production of a fluorescent pigment diffusible in the KB medium and did not have a pectolytic capacity, as they did not degrade tissue of the tubers of the potato nor did they produce holes when cultivated in the CVP medium (Crystal violet polipectate).
2.4.1. Morphology of the bacteria cells
The bacteria cell showed a short form of bacillus (1 µm long) (Figure 1). These did not develop spores and were determined to belong to Gram-negative type.
Table 1- Differential characteristics for Chryseobacterium sp. (DQ530122.1), C. indologenes (AY050493.1), C. gleum and Chryseobacterium sp. (KC237770, KC247671 and KC309689 associated with necrosis of Sechium edule).
Test Chryseobacterium sp
(KC237770, KC247671 and KC309689)
Chryseobacterium sp (DQ530122.1)
C. indologenes
(AY050493.1)
C. gleum
(AB680759.1)
Habitat Me, S Me, S S, P
Color of the
colony yellow/orange yellow/orange orange yellow/orange
Type of
respiration A A A A
HR tobacco (+) ( - ) ( - )
Motility (-) ( - ) ( - ) D
Catalase (+) (+) (+) (+)
Oxidase (+) (+) (+) (+)
Levan ( - ) ( - ) ( - )
Indole ( - ) (+) (+)
Hydrolysis of
lipids (+) (+) (+)
Liquifiying of
jelly (+) (+) (+) (+)
Pectolysis of the
potato ( - ) (+) (+)
Starch
degradation ( + ) D (+) (+)
Growth at 25º C ( + ) (+) (+) (+)
Growth at 37º C (+) (+) (+)
Growth at 41 °C ( - ) ( - ) ( - ) ( - )
Me: of free life associated to plants; S: soil; P: animal pathogens; (+): positive; (-): negative; A: aerobic; D: weak
2.4.3. Analysis of 16S rRNA gen
with the aforementioned species (Figure 2). The species of Flavobacterium employed as an external group were grouped in an independent clade.
Figure 2- Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences using the Neighbor-Joining method. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches. The tree is drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the Maximum Composite Likelihood method and are in the units of the number of base substitutions per site.
(NR_042507.1) C. indologenes LMG 8337
(AY468481.1) C. indologenes LMG 12856
(AB517708.1) C. indologenes NBRC 14944
(EU982470.1) C. gleum 2-1-9-a-2
(AB680759.1) C. gleum NBRC 15054
(NR_042506.1) C. gleum CCUG 14555
(KC247671) Chryseobacterium sp. UV-B2
(KC237770) Chryseobacterium sp. UV-B1
(KC309689) Chryseobacterium sp. UV-B3
(NR_042503.1) C. ureilyticum F-Fue-04IIIaaa
(EF204451.2) C. oranimense H8
(NR_025386.1) C. shigense GUM-Kaji
(AB682422.1) C. jejuense NBRC 106406
(EF644913.1) C. aquifrigidense CW9
(AY050493.1) C. indologenes SB1
(NR_042345.1) C. taichungense CC-TWGS1-8
(AB681952.1) C. marinum NBRC 103143
(NR_025386.1) C. scophthalmum LMG 13028
(AY315443.2) C. formosense CC-H3-2
(DQ336714.1) C. caeni N4
(AM232809.1) C. pallidum 26-3St2bT
(EF204447.1) C. bovis H10
(EF204450.1) C. haifense H38
(AM982793.1) C. anthropi CCUG 15260
(NR_042647.1) C. gregarium LMG 24052
(AB681270.1) C. soldanellicola NBRC 100864
(AB681150.1) Flavobacterium columnare NBRC 100251
2.4.4. Pathogenicity tests
At 30 days after inoculation, the leaves of the plants of the variety nigrum xalapensis (VO) showed 25% chlorosis and 21% necrosis, while the plants of the variety virens levis (VC) showed 59% chlorosis and 49% necrosis. None of these varieties showed dead guides. Conversely, plants of varieties nigrum spinosum (VE) developed 79% chlorosis and 60% necrosis and death in one guide. In particular, the albus spinosum variety plants (AE) were the most affected, the chlorosis symptoms starting from the fifth day after inoculation, so that by day 30, it was found that all plants were affected by both chlorosis and necrosis; 12 plants had dead guides and the leaves inoculated of the rest of plants evaluated showed up to 72% necrosis and later withered. In all inoculated plants of both varieties where death appeared guides (nigrum spinosum and albus spinosum), symptoms of chlorosis and necrosis first appeared on the lower leaves and later in higher with regards to the inoculated leaf. None of the control plants from different varieties developed symptoms.
Differences were encountered (Lambda of Wilks = 0.396, DF= 6, 280; P < 0.0001) in the expression of chlorosis and necrosis symptoms amongst the varieties of chayote in a constant manner over time. Here, the differences increased gradually in proportion throughout the treatment (Lambda of Wilks = 0.219, DF= 6, 834; P < 0.0001).
The variety albus spinosum (AE) differed significantly in chlorosis and necrosis of the remaining varieties 7 days after inoculation, whilst at 14 days all varieties showed differences. Finally, after 30 days the albus spinosum (AE) and nigrum spinosum (VE) varieties did not present any significant difference in the case of chlorosis and all varieties were significantly different in the case of necrosis (figure 3).
2.5. Discussion
established by Vandamme et al.1 to reclassify some of the species that were previously found within the genus Flavobacterium, due to the heterogeneity of the group.
Chryseobacterium represents one of the genus that have had the highest growth with respect to the number of species reported, as it includes group organisms ubiquitous in nature 5. The majority of the members of the genus are found amply distributed in soil environments as well as water environments10,14,17,19,20,21. There are reports that species of this genus are pathogens in humans and animals, including C. gleum and C. indologenes that can cause hospital infections in humans and have also been found in diseased fish and frogs 40,41.
Its association with vegetable species is not clear due to the lack of information about the possible roles that some bacteria belonging to this genus have in ecosystems10,24,25. Mikincinski et al.26 proposed for the first time the strains of this genus as pathogens associated with soft rot of Calla Lily (Zantedeschia spp.) in Poland. Soft rot is related to the activity of pectolytic enzymes of the bacteria that cause it. In this case, the authors found that the strains of Chryseobacterium (Chryseobacterium sp. DQ530122.1 and C. indologenes AY050493.1) showed such capacity. Our study shows that the strains of Chryseobacterium sp. did not have this property, highlighting the fact that the pathogens of the case study were different, which at the beginning led us to formulate a proposal that was not about strains of the same species. Additionally, the induction of a reaction of the hyper-sensibility to tobacco (Table 1) showed opposite results to those observed by Mikicinski et al.26.
ranges from 1.1 to 2 and the observed only among C. indologenes and C. gleum is 1.6 to 1.7, leaving little margin to conclude that in the case of some of these species.
a)
b)
Table 2 Nucleotide similarity (%) found among strains of Chryseobacterium sp. (KC237770, KC247671 and KC309689) vs. C. gleum (AB680759.1, EU982470.1 y NR_042506.1) and C. indologenes (AB517708.1 y LMG8337) resulting from the analysis of a 1404 nucleotide sequence of 16S rRNA gene.
It proved interesting to observe a difference of the isolations of bacteria obtained in this work with the species C. indologenes and C. gleum, which, like the majority of the species of this genus, synthesize indole from tryptophan, which our isolations did not do. Currently, only the C. scophthalmum species13 and C. indologenes isolated from soft rot of the calla Lily are reported as negative for this test. However, the phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences grouped this species in a clade completely different from our strain in study.
However, the data produced from the pathogenicity tests on the different varieties of S. edule allow us to boldly put forward the proposal that it is possible to establish a pathogenic host relationship amongst these species and that the amount of damage found depends on the variety of S. edule in question. Nevertheless, we cannot overlook the fact that the method of inoculation employed facilitated entrance of bacteria into the vegetative tissue overcoming the plants’ structural defenses against pathogens, such as, for example, the thickness of the cuticle and the amount of wax present within it, the trichomes and estomes whose function has been demonstrated in several studies42. On the other hand, the differences in the degree of pathogenicity of Chryseobacterium sp. found in the different varieties of chayote could possibly be attributed to differences in defense elements of a chemical nature, such as the cucurbitacins terpens of the cucurbitaceae species 43.
The wild varieties of S. edule (with dark green bitter fruits) characteristically have a greater concentration of cucurbitacins, while the yellow or ¨albus¨ varieties have a lesser quantity of these terpens as well as chlorophyll a and chlorophyll b, but have a greater quantity of carotenoids43 which has been attributed to a possible adjustment in the route of the mevalonic acid (AMV)44.
propose another hypothesis which involves the presence of spines on the fruits as an informative characteristic of their sensitivity.
According to studies of morphological and biochemical similarity and the migratory routes of S. edule, the varieties albus spinosum and nigrum spinosum are more remote from their wild ancestor when compared with virens levis and nigrum xalapensis43,45. Contrary to what one would assume, the presence of spines in the varieties of S. edule does not necessarily constitute a distinctive characteristic of the wild examples, but these are the result of an adaptive clinal variation within the adaptive characters of the species Sechium sp. and can be related to environmental gradients and manipulation for domestication46. This represents an additional element in explaining the greater damage observed in the varieties albus spinosum and nigrum spinosum. Several authors have shown evidence that the wild examples of a taxon show greater tolerance or resistance to phyto-pathogens since the wild patho-system is much more flexible and possess a greater genetic variability and their populations respond to the pressures of selection47,48.
We consider It essential to continue investigating the ecological role of the species of the genus Chrysobacterium, whether as a pathogen or regarding any other type of association they may have with plants or other organisms, since Chryseobacterum is a widely extensive group10,15,17,19,20,21, and which, among other aspects has been proposed as plant growth promoting rhizobacteria49,50.
2.6. Conclussion
plasticity that this bacteria presents and that S. edule is not a primary host of Chryseobacterium sp.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Rafael Lira Saade and Dr. Jorge Cadena Iñiguez for the information provided regarding the varieties of S. edule and Dr. Pablo Octavio Aguilar by observations to work.
2.7. References
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![CARACTERIZACIÓN NUMÉRICA in situ DE GERMOPLASMA DE CHAYOTE [Sechium edule (JACQ.) SWARTZ], COMUNIDAD EL CASTILLITO, LAS SABANAS, MADRIZ](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)