Sa c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e p a r a

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REsumEN

Se evaluaron una cepa de laboratorio (No.1) y dos cepas industriales (No.2 y No.3) de Saccharomyces cerevisiae para la producción de etanol a partir de hidrolizados ácidos de bagazo. Las cepas No.2 y No.3, aisladas de plantas procesadoras de sustratos lignocelulósi-cos, presentaron una alta velocidad de consumo de furfural y de HMF. Aunque las tres cepas pudieron fermentar un hidrolizado detoxificado, para dos de ellas se observó una fuerte inhibición en la fermentación. La cepa No.3, aislada de una planta de producción de etanol a partir de licores al sulfito, presentó una mayor tolerancia a inhibidores que las otras dos. La inhibición del rendi-miento de etanol en la fermentación del hidrolizado no detoxificado fue de sólo 2,3 % con esa cepa, mientras que en las cepas No.1 y No.2 fue de 73,9 y 86,4 %, respectivamente. La alta productividad volumétrica y específica de etanol, mayor velocidad de consumo de glucosa y más rápida conversión del furfural, eviden-cian la superioridad de la cepa No.3, así como su factibilidad para fermentar hidrolizados sin necesidad de que medie una etapa de detoxificación.

INtROduccIóN

Durante los últimos años aumentó el interés por el etanol combustible debido al aumento de los precios del petróleo crudo, la inminencia del agotamiento de ese hidrocarburo y la necesidad de mitigar el efecto invernadero. El etanol se ha convertido en un importante producto en el mer-cado mundial de combustibles. Su comercializa-ción creció de menos de un millardo de litros en 1975 a más de 39 millardos en 2006 y se espera que alcance los 100 millardos en 2015 (Licht, 2006). Los altos costos de las materias primas azu-caradas y amiláceas, así como el debate alimentos

versus combustibles, han motivado el interés por

los materiales lignocelulósicos (MLC) como posi-bles materias primas para la producción de etanol (Hahn-Hägerdal et al., 2006). Se ha afirmado que la producción de etanol combustible podrá per-manecer como una industria importante y como un sistema agrícola auto-sostenible en el siglo xxi

solamente si la utilización de los MLC se convierte en una realidad comercial.

El bagazo de caña de azúcar (Saccharum

offici-narum) es un MLC de gran interés para la

produc-ción de etanol en Cuba sin afectar la producproduc-ción de alimentos. Aunque el bagazo se utiliza como combustible en los ingenios azucareros (Valdés y col., 2000), puede ser considerado una materia prima potencial para la producción de etanol, especialmente si se tiene en cuenta su contenido Palabras Clave: etanol celulósico, hidrolizado de bagazo, detoxificación, S. cerevisiae.

1Departamento de Química e Ingeniería Química, universidad de Matanzas, Matanzas 44740, Cuba. 2School of Engineering, borås university Collage, 50190 borås, Sweden.

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de carbohidratos y su disponibilidad en forma concentrada en los ingenios azucareros.

Los MLC contienen carbohidratos en forma de celulosa y hemicelulosas, los que mediante pro-cesos de hidrólisis generan monosacáridos como, glucosa, xilosa y otros. A continuación, estos azú-cares pueden ser convertidos en etanol por fer-mentación utilizando diferentes microorganismos. La hidrólisis de la celulosa puede ser catalizada por ácidos o por enzimas. Tanto en la hidrólisis ácida como en el pretratamiento para la hidrólisis enzimática ocurre la degradación de los azúcares con formación de subproductos inhibitorios de la fermentación alcohólica, tales como ácidos alifá-ticos, aldehídos furánicos y compuestos fenólicos (Taherzadeh y Karimi, 2007).

Los microorganismos para ser empleados en la fermentación de hidrolizados lignocelulósicos deben producir etanol con un alto rendimiento y productividad y hacer resistencia a los inhibido-res pinhibido-resentes en los hidrolizados (Martín y col., 2002).

La búsqueda de organismos resistentes a los inhibidores se ha convertido en una tarea de máxima prioridad. En este trabajo se investigó la fermentación de hidrolizados ácidos de bagazo con la utilización de dos cepas industriales y una de laboratorio de S. cerevisiae. Las cepas indus-triales fueron aisladas de una planta de fermenta-ción de licores al sulfito y de una planta demostra-tiva de producción de etanol a partir de residuos lignocelulósicos.

mAtERIALEs y métOdOs

Obtención de los hidrolizados

El bagazo de caña de azúcar, donado por el ingenio azucarero Mario Muñoz, de Matanzas, Cuba, fue secado al aire, molido y conservado en bolsas plásticas a temperatura ambiente. Los hidrolizados fueron obtenidos por hidrólisis ácida en dos etapas. En la primera etapa, muestras de bagazo fueron impregnadas con ácido sulfúrico a una concentración final de 0,5 % y una relación de 10 g de sólidos por 100 g de mezcla. El material fue colocado en un reactor presurizado, donde se calentó a 180oC durante 7 minutos para hidrolizar las hemicelulosas. A continuación, el hidrolizado hemicelulósico fue separado del material fibroso por filtración a vacío. En la segunda etapa, la celu-losa contenida en el material fibroso fue hidro-lizada por calentamiento con ácido sulfúrico a 230 oC durante 7 minutos. La concentración de

H2SO4 fue 0,5 % y la carga de sólidos fue 12 g por 100 g de mezcla. Finalmente, el hidrolizado celulósico fue separado por filtración al vacío y se conservó congelado hasta usos posteriores.

Detoxificación de los hidrolizados

Los hidrolizados fueron detoxificados por trata-miento con Ca(OH)2 al 20 % (w/w) hasta pH 10 y se mantuvieron bajo esas condiciones durante una hora. Luego resultaron filtrados, neutralizados a pH 5,5 y filtrados nuevamente.

Cepas

Se utilizaron tres cepas de S. cerevisiae. La cepa No. 1 (CbS 8066) es una cepa de laboratorio que se utilizó como referencia porque ha sido utili-zada previamente en estudios similares (Talebnia y Taherzadeh, 2006). Las cepas No. 2 y No. 3 son cepas industriales. La No. 2 fue aislada de hidroliza-dos fermentahidroliza-dos de astillas de pino en una planta demostrativa de producción de etanol (Domsjö fabriker Ab, Örnsköldsvik, Suecia), mientras que la No. 3 fue aislada de una planta productora de etanol a partir de licores de pulpeo de madera por el proceso al sulfito (Mo Do, Suecia).

Preparación del inóculo

Las tres cepas fueron conservadas en cuñas de YPD-agar (10 g L-1 de extracto de levadura, 20 g L-1 de peptona, 20 g L-1 de glucosa y 20 g L-1 de agar). una asada de la cepa a estudiar fue trans-ferida a 100 mL de medio sintético (20 gL-1 de glucosa, 7,5 gL-1 de (NH

4)2SO4, 3,5 gL-1 de K2HPO4, 0,75 gL-1 de MgSO

4.7H2O, 1 mL de solución de vitaminas, y 1 mL de solución de trazas de meta-les. Esta última solución contiene en gL-1: EDTA, 3; CaCl2.2H2O, 0,9; ZnSO4.7H2O, 0,9; FeSO4.7H2O, 0,6; H3bO3, 0,2; MnCl2.H2O, 0,16; Na2Mo4.2H2O, 0,08; CoCl2.2H2O, 0,06; CuSO4.5H2O, 0,06; KI, 0,02. La solución de vitaminas se preparó en gL-1 con: ácido p-aminobenzoico, 0,2; ácido nicotínico, 1; pantotenato de calcio, 1; pirido-xina, 1; tiamina, 1; biotina, 0,05; m-inositol, 25 (Karimi et al., 2005). El volumen resultante fue incubado en un Erlenmeyer de 300 mL a 300C, 120 rpm hasta alcanzar valores de densidad óptica (DO620) entre 8 y 11.

Fermentación de los hidrolizados

La fermentación anaeróbica se realizó en Erlenmeyers de 300 mL equipados con tapas de goma, dos tubos capilares de cristal y una trampa de CO2. Los capilares fueron usados para la toma de muestras después de 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas y para la inyección de N2 (con menos de 5 ppm

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de O2). El volumen de trabajo fue 100 mL de hidrolizado, los cuales fueron enriquecidos con los mismos componentes del medio sintético usado en la preparación del inóculo y en iguales concentraciones. Se adicionó además 0,1 mL de ergosterol. La fuente de carbono fue la misma que poseían los hidrolizados. Los frascos se inocula-ron con 4 mL de inóculo de una concentración de células igual a 4 gL-1 y se incubaron a 30 0C y 120 rpm durante 24 horas. La referencia se pre-paró con glucosa añadida, en igual concentración que los hidrolizados, como fuente de carbono. Se enriqueció también con las mismas sales y demás componentes utilizados en las muestras de estu-dio. Se realizaron dos réplicas en todos los casos. Como criterio de la fermentabilidad se tomaron: el rendimiento (YE/G), la productividad volumétrica (Q), y la productividad específica (q) de etanol, la velocidad de consumo de glucosa (VCG) y la inhi-bición del rendimiento (IY) y de la productividad volumétrica (IQ). Para calcular el rendimiento en etanol se dividió la concentración de etanol pro-ducido a las 24 h por la concentración de glucosa inicial. La productividad volumétrica (Q) se basó en los gramos de etanol producidos por litro de medio de cultivo por hora durante las primeras 8 h de fermentación y la productividad específica es la relación entre Q y la concentración inicial de célu-las (masa seca). La biomasa seca se determinó cen-trifugando (2 minutos a 4000 rpm) 5 mL de cultivo en un tubo de ensayos previamente pesado. Las células fueron lavadas con agua destilada y centri-fugadas nuevamente. Luego de expulsar el sobre-nadante se secaron a 105 0C durante 48 horas. La velocidad de consumo de glucosa se calculó como la diferencia entre las concentraciones, inicial y luego de 8 h, dividida por 8 h. Por último, la inhi-bición del rendimiento de etanol (IY) se calculó mediante la siguiente expresión:

Donde Yref y Ypreh son los rendimientos en etanol de la referencia y el prehidrolizado, respectiva-mente. De modo similar fue calculada la inhibición de la productividad de etanol.

Análisis

Los hidrolizados y medios de fermentación fueron analizados por HPLC. El efluente fue H2SO4 5 mM a una velocidad de flujo de 0,6 mL/min. Para la separación de glucosa, ácido acético, etanol y glicerol se utilizó una columna Aminex HPX-87H

(bio-Rad, Richmond, CA, EE.uu.) y un detector RI (Jasco International Co., Tokyo, Japón). El furfu-ral y el HMF fueron detectados con un detector uV/VIS a 210 nm. La composición de los hidroliza-dos se muestra en la tabla 1.

REsuLtAdOs y dIscusIóN

Durante la hidrólisis se formaron inhibidores de la fermentación, tales como ácido acético, fur-fural, hidroximetilfurfural y ácido fórmico. La alta concentración de aldehídos furánicos es compara-ble con la encontrada en hidrolizados de bagazo obtenidos por explosión con vapor, asistida con impregnación con ácido sulfúrico (Martín y col., 2002). Los hidrolizados fueron detoxificados con el objetivo de disminuir su toxicidad hacia las levaduras.

El proceso de detoxificación permitió reducir la concentración de los principales inhibidores entre 11,1 y 15,0 % (Tabla 1). No obstante, el contenido de aldehídos furánicos (2,5 g/L) aún se mantuvo a un nivel inhibitorio para las levaduras.

Producción de etanol y consumo de glucosa durante la fermentación.

La alta concentración de aldehídos furánicos exige una alta tolerancia a inhibidores por parte de la cepa de levadura a utilizar en la fermenta-ción. El objetivo del trabajo fue evaluar dos cepas industriales que, por haber sido aisladas de plan-tas procesadoras de sustratos lignocelulósicos, han experimentado una adaptación a los inhibido-res pinhibido-resentes en los hidrolizados. Además, la cepa No. 2 es floculante, lo que facilita su separación por sedimentación y permite ahorrar recursos, ya que se evita el uso de centrífugas (Purwadi et al., 2007).

Para evaluar la capacidad de las cepas de leva-dura se hicieron fermentaciones del hidrolizado sin detoxificar, el hidrolizado detoxificado y una solución de referencia en paralelo para cada cepa. La solución de referencia contenía glucosa en la misma concentración que los hidrolizados, pero no contenía inhibidores.

Yref - Ypreh

IY = x 100 Yref

Tabla No. 1

concentración de los principales componentes detectados en los hidrolizados, g/L.

medio Glucosa acéticoÁcido Furfural HmF

Hidrolizado

detoxificado 11,2 1,7 0,7 1,8

Hidrolizado

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Como era lógico esperar, la fermentación de los hidrolizados estuvo inhibida en comparación con la de la referencia. La inhibición del rendimiento de etanol fue menor que la de la productividad volu-métrica (Fig. 1), lo que se debió a que los inhibi-dores impidieron una producción rápida de etanol durante las primeras horas, pero luego ocurrió un

proceso de adaptación de las cepas, lo que, relativa-mente, llevó a altos rendimientos de etanol al final de la fermentación. Para ilustrar este fenómeno en la figura 2 se muestra la dinámica de formación de etanol y consumo de glucosa en la fermenta-ción de los hidrolizados con la cepa No. 1, la cual fue la más sensible a la inhibición. A pesar de que la remoción de inhibidores durante la detoxificación fue relativamente baja (Tabla 1), el efecto en la fermentabilidad de los hidrolizados detoxificados fue muy marcado. La inhibición de la fermentación fue mucho menor en el hidrolizado detoxi-ficado que en el hidrolizado sin detoxificar (Fig. 2). El rendimiento de etanol en la fer-mentación del hidrolizado detoxificado fue comparable al rendimiento en la referencia (Tabla 2), por lo que la inhibición de ese parámetro fue inferior a 2 % para las tres cepas, e incluso fue nula para la cepa No. 3 (Fig. 1). La velocidad de consumo de glucosa, así como las productividades volumétrica y específica de etanol se incrementaron con la detoxificación, aunque sin llegar a los valores de la referencia.

En lo referente al comportamiento de las distintas cepas, se debe resaltar la alta tole-rancia a inhibidores de la cepa No. 3. Con esa cepa no se observó inhibición del rendi-miento de etanol en la fermentación del hidroli-zado detoxificado, mientras que la inhibición en el hidrolizado sin detoxificar fue mínima y la inhi-bición de la productividad volumétrica fue com-parable para ambos hidrolizados (Fig. 1). La velo-cidad de consumo de glucosa y la productividad

Figura No. 1

Inhibición del rendimiento (barras grises) y la productividad volumétrica de etanol (barras blancas) durante la fermentación de los hidrolizados detoxificados y

sin detoxificar. 0 20 40 60 80 100 Cepa 1

-DetoxificadoDetoxificadoCepa 1-No DetoxificadoCepa 2- DetoxificadoCepa 2-No DetoxificadoCepa 3- DetoxificadoCepa 3-No

Inhi

bición

,

%

específica de etanol también reportaron valores simi-lares para ambos hidrolizados (Tabla 2). La mayor productividad específica en la fermentación del hidrolizado sin detoxificar fue obtenida con la cepa No. 3. Este resultado evidencia la superioridad de esa cepa con respecto a las demás, así como su factibilidad para fermentar hidrolizados sin nece-sidad de que medie una etapa de detoxificación.

Consumo de aldehídos furánicos

Los parámetros del consumo de furfural y de HMF se muestran en la Tabla 3, mientras que la dinámica de la conversión de esos compuestos durante la fermentación con la cepa No. 3, la más

Tabla No. 2

Parámetros de la fermentación

YE/G, rendimiento de etanol por g de glucosa; VCG, velocidad de consumo de glucosa, Q, productividad volumétrica de etanol; q, productividad específica de etanol.

cepa medio YE/G2 g g-1 VCG2 g L-1 h-1 Q2 g L-1 h-1 q2 g g-1 h-1 Hidrolizado detoxificado 0,45 0,94 0,50 1,66 No.1 Hidrolizado no detoxificado 0,12 0,06 0,19 0,63 Referencia 0,46 1,78 1,02 2,92 Hidrolizado detoxificado 0,43 0,86 0,43 1,43 No.2 Hidrolizado no detoxificado 0,06 0,07 0,06 0,30 Referencia 0,44 1,61 0,73 2,43 Hidrolizado detoxificado 0,44 0,93 0,46 1,53 No.3 Hidrolizado no detoxificado 0,43 0,94 0,46 1,53 Referencia 0,44 1,78 0,74 2,47 Figura No. 2

consumo de glucosa (rombos) y formación de etanol (cuadrados) durante la fermentación del hidrolizado detoxificado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin

detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No. 1.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 0 4 8 12 16 20 24 Concentración, g /L Tiempo, h

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demás, mientras que la No. 1 fue inferior. Evidentemente, la alta conversión de los aldehi-dos furánicos por la cepa No. 3 es la causa de la alta capacidad de esa cepa para fermentar los hidrolizados sin detoxificar.

El consumo del furfural se debe a su reducción a alco-hol furfurílico, lo que ha sido demostrado previamente. La capacidad de S. cerevisiae de reducir el furfural fue obser-vada por primera vez por científicos del ICIDCA (Díaz de Villegas y col., 1992). Igualmente, se conoce que el HMF es reducido a alcohol hidroxi-metilfurfurílico. La reducción del furfural y del HMF en fermentaciones de hidrolizados de bagazo ha sido reportada previamente por este colectivo de investigadores (Martín et al., 2002).

La dinámica de la conversión del furfural explica el comportamiento fermentativo de las cepas. Durante las primeras horas, cuando las concen-traciones de furfural eran altas, las fermentaciones fueron lentas y la productividad de etanol fue baja, pero cuando el furfural fue convertido en el poco tóxico alcohol furfurílico las fermentaciones se activaron, conduciendo a altos rendimientos de etanol (Tabla 2). Por otra parte, las menores inhibiciones se observaron en las fermentaciones en las que se alcanzaron las mayores conversiones del furfural.

Formación de glicerol

El glicerol fue el principal subproducto formado durante la fermentación. La producción de glicerol fue mayor en los hidrolizados detoxificados que en los hidrolizados sin detoxificar (Fig. 4), y fue inferior en los hidrolizados que en las referencias (datos no mostrados). Se observó una estrecha resistente, se ilustran en la Figura 3. En la

fermen-tación con las cepas No. 2 y No. 3 se logró una alta conversión de los inhibidores furánicos, la cual fue mayor en los hidrolizados detoxificados que en los no detoxificados.

Con ambas cepas, en la fermentación de los hidrolizados detoxificados 85 % del furfural fue consumido en 24 h, mientras que con la cepa No. 1 sólo se consumió 52,3 % (Tabla 2). El con-sumo de furfural fue más rápido con la cepa No. 3, la cual logró altas conversiones de furfural incluso

en el hidrolizado sin detoxificar. A las 4 h de fer-mentación, esa cepa ya había consumido tres cuar-tas partes del furfural contenido en el hidrolizado detoxificado y casi la mitad

del contenido en el hidro-lizado no detoxificado, mientras que el porcentaje de furfural consumido al final de la fermentación fue semejante para ambos hidrolizados.

Aunque el consumo de HMF fue inferior, con todas las cepas se observó la misma tendencia que con el consumo de furfural (Tabla 2). La cepa No. 3 fue claramente superior a las

Tabla No. 3

consumo de aldehídos furánicos durante la fermentación, % del contenido inicial

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 0 4 8 12 16 20 24 C oncent ración, g/ L Tiempo, h Figura No. 3

dinámica del consumo de furfural (rombos) e HmF (círculos) durante la fermentación del hidrolizado detoxificado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin

detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No. 3.

Figura No. 4

Producción de glicerol durante la fermentación del hidrolizado detoxificado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin detoxificar (símbolos rellenos) con las cepas No. 1 (A) y

No. 3 (B). 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 A 0 4 8 12 16 20 24 C onc entrac ión , g /L Tiempo, h 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 0 4 8 12 16 20 24 C onc entrac ión , g /L Tiempo, h B

cepa detoxificación Furfural-4h, % Furfural-24h, % HmF-4h,% HmF-4h,%

No. 1 Sí 18,2 52,3 5,9 29,0 No 10,4 16,7 2,7 6,7 No. 2 Sí 23,7 85,5 0,0 58,3 No 0,0 22,7 0,0 7,3 No. 3 Sí 73,5 85,3 8,5 56,5 No 46,8 85,0 5,5 39,0

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correlación entre el consumo de furfural y la for-mación de glicerol. un rápido consumo de furfu-ral, como en la cepa No. 3, conllevó a una mayor formación de glicerol, mientras que un retraso en el consumo de furfural, como en la fermentación del hidrolizado sin detoxificar con la cepa No. 1, condujo a una baja formación de glicerol. Este fenómeno ha sido observado previamente en fer-mentación de hidrolizados de bagazo obtenidos por explosión con vapor seguida de hidrólisis enzimática.

cONcLusIONEs

El empleo de una cepa de Saccharomyces

cerevi-siae aislada de una planta de fermentación de licores

de pulpeo al sulfito permitió fermentar hidrolizados ácidos de bagazo con una inhibición mínima, debido a la alta capacidad de la cepa para convertir los inhi-bidores furánicos en formas menos tóxicas. La cepa aislada puede fermentar hidrolizados sin necesidad de detoxificación, lo que permite disminuir los costos del proceso. La fermentación de hidrolizados de bagazo de caña de azúcar permitiría obtener etanol combustible sin afectar la producción de alimentos.

AGRAdEcImIENtOs

Este trabajo fue posible gracias al apoyo de pro-yectos del Ministerio de Educación Superior de Cuba (contrato No. 6.115) y de la International Founda-tion for Science (contrato No. F/3563-1).

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