“Evaluación del efecto protector de la bacteria probiótica Lactobacillus casei cepa Shirota en ratones infectados con Trypanosoma cruzi”
Registro SIP: 20070662
1. RESUMEN
Se inoculó un grupo de ratones CD1 (G1) con 3 x 105 tripomastigotes sanguíneos de
Trypanosoma cruzi y se siguió la curva de parasitemia mediante el método de Pizzi. Otros
dos grupos (G2 y G3) fueron tratados la bacteria prebiótica Lactobacillus casei cepa Shirota y se les administraron 3 inyecciones intraperitoneales (i.p), con separación de una semana, de 1.8 x 108 unidades de la bacteria viable y muerta respectivamente, previo al reto con Trypanosoma cruzi.
Ambos tratamientos con la bacteria prebiótica, generaron una fuerte resistencia a la infección parasitaria presentando reducción significativa (p<0.05) en la curva de parasitemia. La administración repetida de lactobacilos viables provocó mayor reducción en la parasitemia hasta del 93% en el día 23 post infección.
La administración repetida de lactobacilos viables o muertos antes, del reto parasitario indujo inmunidad inespecífica contra la infección por Trypanosoma cruzi cepa NINOA en ratones CD1.
Palabras clave: Lactobacillus casei, probióticos, Trypanosoma cruzi, Inmunidad inespecífica. 2. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una zoonosis causada por el parásito protozoario
Trypanosoma cruzi, es endémica exclusivamente en el continente americano, afecta al
humano y a una gran variedad de huéspedes reservorios. El parásito fue descrito en 1909 por Carlos Chagas, en Minas Gerais, Brasil; también describió el ciclo de vida, los insectos transmisores, así como los mamíferos que actúan como reservorios en la naturaleza. La enfermedad es crónica debilitante que afecta la salud, el bienestar y la productividad de un gran número de seres humanos y representa un problema da salud pública en América Latina (Guzmán-Marín et al., 1999).
En la naturaleza, T. cruzi se mantiene principalmente en un ciclo selvático que involucra a ciertas especies de triatominos que actúan como transmisores y a varios mamíferos salvajes, como tlacuaches, mapaches y ratas. Sin embargo, la invasión humana de la selva ha facilitado el contacto de las chinches y los animales salvajes infectados con el hombre, generando así un ciclo peri-doméstico. Ciertas especies de triatominos como Triatoma
infestans y Rhodnius prolixus, tienen mayor propensión a invadir las casas y anidar en
hombre. La colonización de hábitats humanos se encuentra frecuentemente ligada a la pobreza rural. En construcciones por debajo de los estándares recomendados, las grietas y hoyos de las paredes sin recubrimiento y los techos de paja, proveen escondite adecuado para las chinches, facilitando la infección del humano.
La infección aguda es común en niños y se presenta antes de los 10 años de edad en el 85% de los casos, mientras que la fase crónica incapacitante se manifiesta fundamentalmente en gente en edad productiva entre los 35 y 45 años.
La prevalencia de la enfermedad en México es muy variable, existen localidades, sobre todo en Oaxaca, Guerrero y Chiapas, en donde se encuentra positividad a T. cruzi hasta en el 29% de la población2, mientras que en otros sitios como Jalisco y Zacatecas la prevalencia es cercana al 1.5%. En términos generales se estima que la prevalencia a nivel nacional es de 1.5 a 1.6% (Trujillo, 1993).
Tripomastigote sanguíneo
En esta fase el parásito se encuentra en la sangre del huésped mamífero mide 20 x 2.5 m, es infectante para el transmisor, puede invadir otras células del huésped. Morfológicamente es flagelado, alargado, con un cinetoplasto grande en el extremo posterior. Se distingue también por su movimiento rápido, propulsivo y giratorio. En este estadio el parásito no se reproduce y puede infectar a mamíferos por transfusión sanguínea (Burleigh y Andrews, 1995).
Amastigote
Mide de 2-4 m, tiene forma esférica u ovalada que carece de flagelo libre y es inmóvil es intracelular y se reproduce en diversos tipos de células del
Manifestaciones clínicas
La enfermedad de Chagas tiene tres etapas: aguda, indeterminada y crónica.
Fase aguda. Después de la picadura por una chinche infectada, puede aparecer una lesión focal en el sitio de inoculación. Esta lesión recibe el nombre de “chagoma” y consiste en una zona indurada con eritema e hinchazón acompañada de inflamación de los ganglios locales. Cuando la puerta de entrada ha sido la conjuntiva, hay un edema no doloroso de los párpados y de los tejidos aledaños que característicamente es unilateral, lo que se conoce como el signo de Romaña. La fase aguda de la enfermedad es generalmente asintomática, sólo 1-2% de los pacientes presentan síntomas, los cuales se presentan 1-2 semanas después de adquirir la infección. Las manifestaciones clínicas de la fase aguda incluyen fiebre, anorexia, diarrea, inflamación de los ganglios, inflamación del hígado y del bazo y miocarditis. La fase aguda se resuelve espontáneamente en 4-8 semanas. Un pequeño número de pacientes, generalmente niños, desarrollan miocarditis aguda o meningoencefalitis que pueden ser fatales. En individuos que adquirieron la infección por transfusión, particularmente pacientes inmunosuprimidos, la fase aguda puede ser fulminante con daño cardiaco y neurológico. La infección congénita puede producir aborto, muerte intrauterina o enfermedad aguda, la cual puede detectarse al momento de nacer, pero se hace evidente varias semanas después. Se caracteriza por fiebre, ictericia, anemia, crecimiento de bazo e hígado y lesiones cutáneas. La mortalidad es secundaria a miocarditis, neumonitis o encefalitis (Montiel G y Díaz G., 2002).
Fase indeterminada o latente. Empieza 8-10 semanas después de la infección. Durante esta etapa los enfermos no tienen ningún síntoma y son detectados por la presencia de anticuerpos específicos. Generalmente estos pacientes no tienen evidencia de parásitos en la sangre. En estos pacientes, la infección puede ser rápidamente activada durante una enfermedad concomitante severa o en condiciones de inmunosupresión.
Fase crónica. En aproximadamente un 30% de los casos se presentan complicaciones en el corazón y en el tracto digestivo, 10 a 30 años después de la infección inicial. Los problemas
cardiacos son los más serios y se manifiestan principalmente como daño al tejido muscular del corazón y con trastornos de la conducción de la señal eléctrica, lo que produce insuficiencia cardiaca y facilita la producción de tromboembolias. La afectación gastrointestinal consiste en la dilatación del esófago (mega esófago) y del colon (megacolon) y se debe muy probablemente a daño local al sistema neuronal autónomo. El mega esófago se manifiesta como dificultad y dolor al tragar y regurgitaciones. El megacolon se manifiesta con dolor abdominal y estreñimiento crónico; en casos muy severos puede haber obstrucción y perforación. Por razones que se desconocen, la enfermedad chagásica gastrointestinal es común en el sur del Amazonas, pero rara en México y en Centroamérica (Montiel y Díaz, 2002).
Respuesta inmune.
Los mecanismos de patogenicidad de Trypanosoma cruzi actualmente no son bien comprendidos, sólo se sabe que la respuesta inmune humoral juega un papel muy importante en la resistencia y eliminación de los parásitos de circulación y que algunos epítopos del parásito pueden desarrollar una reacción cruzada con antígenos propios, desencadenando un proceso auto inmune. En el huésped infectado la respuesta inmune protectora involucra principalmente la producción de anticuerpos específicos y la activación de células fagocíticas por interferón gama.
La respuesta humoral contra el parásito es generada por una mezcla compleja de antígenos, por lo que no es posible determinar las variaciones de las especificidades de anticuerpos en los diferentes estadios de la enfermedad: aguda, crónica e infección congénita. La producción de anticuerpos contra los diferentes determinantes antigénicos, depende del estado de la infección en que se encuentre el huésped. De hecho los tripomastigotes meta cíclicos poseen invasinas o moléculas de invasión celular, que son específicas, por lo que la inmunidad inducida no neutraliza las invasinas expresadas por la siguiente generación de tripomastigotes.
Una alta respuesta inmune específica mantenida por años, sugiere un estimulo antigénico constante, por persistencia del parásito. Y se sabe que en los humanos la IL-4 induce el cambio de inmunoglobulina IgM a IgG.
Actualmente se sabe que los títulos de los diferentes isotipos de anticuerpos IgG se relacionan con el estadio de la enfermedad y con la patología desarrollada en los pacientes chagásicos (Montiel y Díaz, 2002).
Protección contra Trypanosoma cruzi
Actualmente se desarrolla investigación abundante en diferentes países del primer mundo pero sobre todo en países endémicos, se ha planteado la necesidad de desarrollar vacunas contra la enfermedad de Chagas.
Kato et al., 2002. Probaron la eficacia de dos vacunas DNA, el gene que codifica para la dihidroorotato deshidrogena no confirió inmunidad protectora en ninguna de las cepas de ratones congénicos utilizados mientras que la que codifica para la trans-sialidasa (TSSA). Confirió protección en algunas cepas pero no en todas. Con esta vacuna y adyuvantes inmunomoduladores como la IL-12, se ha logrado mejorar la eficacia en protección experimental.
Planelles et al., 2001. Inmunizaron ratones con un plásmido recombinante que codifica y expresa una proteína de choque térmico (HSP70) y un péptido específico del orden Kinetoplastida (KMP11) reportado como un potente inductor de la respuesta inmune celular y que se encuentra localizado en el flagelo. Encontraron que esta inmunización genera respuesta inmune humoral de larga duración (IgG2a) y celular citotóxica (CD8+)
induciendo protección contra la infección pero cuando sólo inmunizaron con KMP11 no hubo inmunidad.
Schnapp et al., 2002. Utilizaron a la cruzipaina (cistein proteinasa) de T. cruzi y encontraron que las células T especificas contra la cruzipaina, produjeron grandes cantidades de IFN- cuando fueron cultivadas con macrófagos infectados con el parásito, disminuyendo la replicación intracelular del parásito. Al inmunizar con una cruzipaina
recombinante junto con IL-12 y un neutralizante de IL-4, se desarrolló una potente memoria Th1 específica contra la cruzipaina. Postulando así a la proteinasa como un candidato para la producción de vacunas contra T. cruzi.
Actualmente la enfermedad de Chagas y otras enfermedades parasitarias son de gran importancia y poco se han relacionado con el estudio de los probióticos en inmunoprofilaxis. Sin embargo, el laboratorio de Inmunoparasitología del Departamento de Parasitología de la ENCB, ya cuenta con algunos datos en modelos experimentales con
Plasmodium chabaudi, Babesia microti y Trichinella spiralis en los que se ve disminuida
la infección por el tratamiento inmunoestimulador con bacterias prebióticas como
Lactobacillus casei ATCC 7469 y Lactobacillus casei cepa Shirota.
Se sabe que las bacterias probióticas tienen los siguientes efectos en el organismo: Prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas
Disminución de los niveles de colesterol. Disminución de diarreas por virus.
Tratamiento de la intolerancia a la lactosa. Exclusión o reducción de la adherencia patógena
Producción de ácidos, peroxido de hidrógeno y bacteriocinas antagonistas al crecimiento patógeno y habilidad de adherirse a las células
Formación de una flora intestinal balanceada. Prevención de manifestaciones alérgicas. Prevención varios tipos de cáncer Estimulación del sistema inmune.
Lactobacillus casei.
Pertenece a la familia Lactobacilaceae y se caracteriza por ser un microorganismo Gram positivo, catalasa negativa, inmóvil, no esporulado. Microscópicamente es un bacilo microaerofílico, crece lentamente en condiciones aeróbicas y produce pequeñas colonias cuya morfología varia dependiendo del medio en que sea sembrado. Es anaerobia pero no sensible al oxígeno por lo que se considera aerotolerante, su temperatura óptima de
crecimiento es de 35°C con capacidad de crecer entre 37 y 45°C. Para que el crecimiento de este microorganismo prospere se requiere de la producción de una cantidad considerable de ácido láctico que disminuye el pH del medio de cultivo (Elmer y Koneman, 1992)
Actividad antitumoral
Kato et al., 1983. Estudiaron el efecto antitumoral que tienen L. casei y L. bulgaricus contra tumores murinos (LC9018), cuando estos microorganismos prebióticos son administrados por vía intraperitoneal ocurre activación de macrófagos con capacidad antitumoral. Cuando los Lactobacilos son administrados por vía oral inducen la liberación de enzimas lisosomales y no lisosomales de macrófagos peritoneales, las cuales están involucradas en la actividad antitumoral.
Hashimoto et al., 1984. Encontraron que dentro de los mecanismos que inhiben el crecimiento de células tumorales, los macrófagos producen y liberan radicales libres de oxigeno y esta actividad se incrementa substancialmente por la administración de L. casei o L. fermentum por vía intravenosa o intraperitoneal.
Kato et al., 1994. Encontraron que la administración de L. casei muerto por calor, reduce el desarrollo de tumores inducidos experimantalmente, incrementa significativamente la supervivencia del huésped y las células inmunocompetentes mostran su efecto potenciado. También se demostró que cuando se administra la bacteria viva por vía intravenosa, el efecto antitumoral se hace patente.
En humanos se ha comprobado el efecto antitumoral, ya que en estudios realizados con
Lactobacillus casei cepa Shirota (LcS) se observó una disminución en la recurrencia del
cáncer superficial de vejiga (Aso et al., 1992). Otros estudios con esta bacteria, muestran que además tiene propiedades antimetastásicas, este efecto se observó experimentalmente haciendo transplante de células tumorales e induciendo inmunosupresión en ratones tratados con la bacteria probiótica por vía oral (Kato et al., 1994). Por otro lado, la administración intrapleural de LcS en ratones que padecen tumores, inhibe el crecimiento de células tumorales en la cavidad torácica, prolongando significativamente el tiempo de
sobrevivencia, e induciendo la producción de IFN-γ, TNF-α e IL-1 (Matzusaki et al., 1998).
Actividad antibacteriana
Sato K. en 1984, observó el efecto protector de los lactobacilos sobre una infección producida por Listeria monocytogenes en ratones, encontrando que la protección frente a
Listeria incrementa el periodo de sobrevivencia de los ratones previamente tratados con L. casei. Además indica que el aumento en la resistencia de la infección por Listeria monocytogenes podría estar mediada por la migración de macrófagos desde el torrente
sanguíneo hacia el sistema retículo endotelial, en respuesta a la administración del L. casei antes o después de la infección con la bacteria patógena.
Nomoto et al., 1985. Estudiaron el efecto protector que presenta L casei YIT9018 muerta por calor, en contra de una infección por Pseudomonas aeruginosa en ratón. La bacteria prebiótica administrada por vía intraperitoneal aumentó la actividad de macrófagos y así la actividad protectora contra P. aeruginosa, lo que sugiere que la inducción de macrófagos activados por lactobacilos es el principal mecanismo involucrado en la inmunidad protectora.
En 1991 Perdigón et al., estudiaron el efecto que tiene L. casei al ser administrado en diferentes dosis por vía oral, sobre la respuesta secretota de IgA específica y la capacidad protectora de este microorganismo en la prevención de infecciones intestinales, previniendo la colonización por Salmonella typhimurium y Escherichia coli. La administración de una dosis adecuada, produce un incremento en la inmunidad en mucosas para prevenir infecciones entéricas. La administración de estos microorganismos puede ser usada como una estrategia inmunológica para el control de desordenes entéricos.
Ogawa et al., 2001. Observarón la inhibición del crecimiento in vitro de Escherichia coli productora de Toxina Shiaga (STEC) por parte de varias cepas de Lactobacillus. Los datos sugieren que el efecto bactericida de Lactobacillus sobre STEC se basa en la capacidad de
la bacteria probiótica de producir ácido láctico, y que esto a su vez disminuye el pH del medio donde han crecido los dos microorganismos.
Actividad antiparasitaria.
Bautista et al., 2002, mostraron que L. casei induce una respuesta protectora inespecífica contra la infección experimental por Trichinella spiralis al ser administrada viva, por vía intraperitoneal, siete días antes de la infección con larvas infectantes del parásito.
Bautista et al., 2004, evaluaron a L. casei vivo como adyuvante con antígenos de
Trichinella spiralis, administrado por vía intraperitoneal, esto se comparó utilizando el
adyuvante completo e incompleto de Freund y después se les retó con larvas musculares de
T. spiralis. Encontraron que la reducción de gusanos adultos en el intestino fue de 87.26%
cuando se uso L. casei como adyuvante, 26.7% cuando se uso adyuvante incompleto de Freund y 86.7% cuando se uso adyuvante completo de Freund; por lo tanto se concluye que
L.casei viable funciona como adyuvante cuando se administra a ratones con antígenos de Trichinella spiralis.
En un estudio realizado por este mismo grupo de investigadores, trataron a ratones con L.
casei para después retarlos con una dosis infectiva del parasito intracelular Babesia microti.
Ellos inocularon ratones con la bacteria viva por vía oral e intraperitoneal, y 7 días después los retaron con una dosis infectiva de B. microti, en este experimento encontraron una reducción significativa en el porcentaje de eritrocitos parasitados (GRP) comparado con aquellos que no fueron tratados con L. casei. Además al hacer un estudio inoculando a la bacteria viva y muerta y comparándola con el efecto que tiene el Adyuvante completo de Freund, también se observó una disminución en el % de GRP después de la infección con
B. microti.
Además encontraron que L casei aumenta la resistencia no específica hacía Plasmodium
chabaudi, reduce el poder infectivo del parásito a nivel del bazo y eleva la concentración de
oxido nítrico en el suero en ratones estimulados con la bacteria (Martínez-Gómez, et al., 2006).
JUSTIFICACIÓN
La enfermedad de Chagas es un problema de salud pública en el continente americano, es por ello que la prevención es de suma importancia, ya que en la actualidad no se cuenta con un tratamiento efectivo contra la enfermedad. Por lo que resulta interesante evaluar el efecto de los probióticos sobre el desarrollo de esta parasitosis en un modelo experimental.
Objetivo general
Evaluar el efecto protector de Lactobacillus casei Shirota viable y muerto, administrado a ratones vía intraperitoneal, sobre los niveles de parasitemia de Trypanosoma cruzi cepa NINOA.
Particulares:
a) Inmunoestimular por vía intraperitoneal ratones de la cepa CD1 con tres dosis de
Lactobacillus casei Shirota (LcS) vivo y muerto, con separación de una semana.
b) Evaluar la carga parasitaria de tripomastigotes sanguíneos en ratones infectados con la cepa NINOA de T. cruzi e inmunoestimulados con LcS vivo o muerto
HIPÓTESIS
Dado que Lactobacillus casei tiene la capacidad de estimular la actividad de macrófagos, y la respuesta Th1 (producción de IFN- , IL-12 y TNF-α) y por ser ésta, una línea importante de defensa contra la infección por Trypanosoma cruzi, se afectará la parasitemia, en ratones inmunoestimulados previamente con la bacteria.
3. MATERIAL Y MÉTODOS Ratones
Se usaron ratones hembra sanos, de la cepa CD1 de 6-8 semanas de edad. Se revisaron para detección de parásitos intestinales no deseados mediante la técnica de concentración de sulfato de zinc. Los casos positivos fueron tratados durante una semana con albendazol-mebendazol.
Parásito
Se uso la cepa NINOA de Trypanosoma cruzi. Esta fue conservada en nitrógeno líquido y mediante pases seriados en ratones CD1. La dosis infectiva usada fue de 300,000 Tripomastigotes sanguíneos diluidos en solución salina fisiológica e inoculados por vía intraperitoneal (i.p) en cada ratón.
Bacteria viva
Se usó la cepa Lactobacillus casei Shirota que se ha conservado en nitrógeno líquido Se resuspendió el contenido de un criovial en un volumen conocido y se sembró en un matraz con 150 ml de medio de cultivo Mann-Rogosa-Sharpe (MRS)
Se incubó a 37oC por 18 horas, se cosecharon las células y se lavaron 2 veces por centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos, con PBS pH 7.2, estéril
Se resuspendió el botón de células en solución de PBS pH 7.2, estéril Se hizo cuenta viable de la bacteria de la siguiente manera:
Se hicieron diluciones decimales de la bacteria en PBS hasta 10-10
Se sembró por duplicado, 1 mL de las diluciones 10-5-10-10 en agar MRS, mediante la técnica de vaciado en placa, se verificó la pureza bacteriana por morfología colonial y pruebas bioquímicas
Nuevamente, se incubó a 37oC por 48 horas
Se calcularon las UFC/mL obtenidas y se ajustaron a 1.8x109 UFC/mL. Se conservaron en alícuotas de 1 mL a -20ºC, hasta su uso.
La cepa se conservó en nitrógeno líquido
Se inoculó por vía i.p, una dosis de 1.8x108 UFC a cada ratón. (Bautista 2002; Martínez-Gómez et al., 2005)
Bacteria muerta
El concentrado con 1.8 x109 UFC se sometió a ebullición en baño maría durante 30 minutos. Se comprobó la muerte de la bacteria sembrando en agar MRS. (Bautista et al., 2002)
Evaluación de la parasitemia
Se hizo por cuenta directa del parásito por el método de Pizzi modificado:
Se obtuvieron 10 l de sangre de la vena caudal de cada ratón y se realizó una dilución 1:5 con cloruro de amonio 0.9%.
Se tomó una muestra de 5 l de la dilución anterior y se colocó en un portaobjetos limpio y desengrasado
Se cubrió con un cubreobjetos de 18 x 18 mm, del Nº 1
Se observó al microscopio óptico a seco fuerte (objetivo de 20 X) y se contaron los tripomastigotes sanguíneos presentes en 50 campos.
Se hizo el cálculo aritmético para obtener el número de Tripomastigotes sanguíneos por mililitro de sangre (Brener, 1962)
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Se partió de 3 tres grupos de 6 ratones CD1. El primer grupo fue el testigo de la infección parasitaria y no recibió tratamiento con la bacteria prebiótica (Grupo 1), el segundo grupo fue tratado con la bacteria viva (Grupo 2), y el tercer grupo fue tratado con la bacteria muerta (Grupo 3). Todos los grupos fueron retados con 3 x 105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma cruzi.
Esquema de inmunoestimulación con Lactobacillus casei Shirota.
El Grupo 1 se inoculó con 100 l de solución de PBS estéril, cada semana durante tres semanas.
El Grupo 2 recibió por vía i.p una dosis de 1.8x108 UFC/ml de Lactobacillus casei Shirota viva, cada semana durante tres semanas.
El Grupo 3 recibió por vía i.p una dosis de 1.8x108 UFC/ml de Lactobacillus casei Shirota muerta, cada semana durante tres semanas.
Reto
Cinco días después de la última inmunoestimulación:
Se inocularon por vía i.p, los tres grupos, con una dosis infectiva de 3 x 105 tripomastigotes sanguíneos.
Cinco días después post-infección se tomaron muestras de sangre de la vena caudal de cada ratón y se evaluó la parasitemia, como se describió en los métodos. La revisión se realizó cada dos días durante cinco semanas.
DIAGRAMA DE FLUJO
Aislamiento y purificación de la cepa de Lactobacillus casei Shirota en medio MRS
Conservación de Trypanosoma cruzi cepa NINOA mediante pase, en ratones ♀ CD1
Ajustar la cepa pura a una concentración de 1.8 x 109 en solución de PBS pH 7.2 estéril
A partir de la suspensión de LcS ajustada, someter a baño de agua en ebullición durante 30 min.
Confirmar la muerte celular por resiembra en medio MRS Preparación de las cepas
Tinción Giemsa Tinción Gram y pruebas
Testigo (Grupo 1) 6 ratones CD1 ♀ de 6-8 semanas de edad Problema Grupo 2 6 ratones CD1 ♀ de 6-8 semanas de edad Problema Grupo 3 6 ratones CD1 ♀ de 6-8 semanas de edad
Lactobacillus casei Shirota
viva, 1.8 x 108 UFC, en solución de PBS pH 7.2 estéril
3 dosis cada 7 días, vía ip.
Lactobacillus casei Shirota
muerta por calor, 1.8 x 108 UFC/mL en solución de PBS pH
7.2 estéril
3 dosis cada 7 días, vía ip.
3 dosis cada 7 días, vía ip.
Solución de PBS estéril, pH 7.2
Inmunoestimulación
Reto
5. RESULTADOS
En la tabla 5.1 se muestran el promedio de la parasitemia de Trypanosoma cruzi cepa NINOA, registradas en la sangre de seis ratones por grupo experimental, a lo largo de 49 días, tiempo que dura la fase aguda de la infección.
Estos datos fueron analizados estadísticamente con la prueba de Distribución-t, * p<0.05. con 95% de confiabilidad.
El análisis estadístico mostró diferencia significativa en el día máximo de parasitemia, cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota viable y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 2) con respecto al grupo testigo (Grupo 1).
Así mismo se encontró diferencia estadística significativa en el día máximo de parasitemia, cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 3) con respecto al grupo testigo.
Por otro lado no se encontró diferencia significativa en el día máximo de parasitemia, cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 3) con respecto al grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota vivo y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa
Tabla 5. 1 N° promedio de parásitos en sangre registrado del día 5 al 49 en los tres grupos experimentales
Día pos-infección
Tripomastigotes sanguíneos /mm3
Grupo 2 Grupo 3 Grupo Testigo
5 0 0 21416.66 7 0 4766.66 7866.66 9 0 18000 10516.66 11 3766.66 21416.66 16250 13 4233.33 7866.66 24366.66 15 4750 10516.66 32083.33 17 6750 17216.66 67333.33 19 8866.66 85333.33 109500 21 10633.33 103333.33 144833.33 23 45666.66 164166.66 652500 25 62833.3 136500 471166.66 27 69166.66 95500 285600 29 58000 78333.33 88750 31 62333.33 112166.66 72250 33 55166.66 57500 59000 35 41666.66 67000 47000 37 4033.33 37000 9825 39 1750 32750 6900 41 0 14766.66 5250 43 0 7083.33 3650 45 0 4133.33 2950 47 0 0 2417.5 49 0 0 1225
En el grupo testigo que fue inoculado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos mostraron un
pico máximo de 6.5x105 tripomastigotes sanguíneos por mm3 en el día 23 post-infección. En ratones que fueron inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota viable y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA, mostraron un pico máximo de parasitemia de 6x104
fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus
casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA se muestra un pico máximo de parasitemia en el día 23 post-infección
con 1.6x105 tripomastigotes sanguíneos por mm3 (Figura 5.1).
PARASITEMIA EN RATONES TRATADOS CON L. CASEI
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
DÍAS POST INFECCIÓN
TR IP O M A S TI G O TE S / L
G1: TESTIGO G2: Lc-VIABLE+ T. cruzi G3: Lc-MUERTO+T. cruzi
Figura 5.1. Parasitemia promedio en ratones CDI (n=6), sin tratamiento con Lactobacillus casei (G1), tratados con Lactobacillus casei viable (G2) y con Lactobacillus casei muerto (G3). Los tres grupos inoculados con 3 x 105 tripomastigotes de Trypanosoma cruzi cepa NINOA
Tabla 5.2. Identificación del día de inicio de las parasitemias en los diferentes grupos con respecto al Testigo.
Grupo tratado Día de inicio
de parasitemia No de parásitos/ mm
3
Grupo 2 11 3.7 x103
Grupo 3 7 4.1 x103
Tabla 5.3. Identificación del día en donde se encontró mayor número de parásitos
Tabla 5.4. Identificación del día de término de la parasitemia
Grupo tratado Día de término
de parasitemia No de parásitos/ mm
3
Grupo 2 39 1.7 x103
Grupo 3 45 4.1x103
Grupo Testigo 49 1.2x103
En la Figura 5.2, se muestra el porcentaje de reducción de parasitemia con especial atención en el día 11, tomado como referencia por ser éste en el cual, todos los grupos presentan indicios de parasitemia, pudiendo observar que en este día encontramos un 76.82% y 45% de reducción para los Grupos 2 y 3 respectivamente. Para el día 23 el porcentaje de reducción de parasitemia es de 93% y 74% para los Grupos 2 y 3 respectivamente, este día fue tomado por ser en donde se presenta el pico máximo de parasitemia. Finalmente encontramos que en el día 39 (día en el cual aun se presenta parasitemia en todos los grupos), se registró 74.63% y 2.6% de reducción para los Grupos 2 y 3 respectivamente. Todos los datos se registraron en comparación con el Testigo (Grupo 1).
Grupo tratado Día de Pico
de parasitemia No de parásitos/ mm
3
Grupo 2 27 6.9 x104
Grupo 3 23 16 x105
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
DÍAS POST INFECCIÓN
% R E D U C C IÓ N
G1: TESTIGO G2: Lc VIABLE+T.cruzi G3: Lc-MUERTO+T.cruzi
Figura 5.2. Porcentaje de reducción en la parasitemia registrada en los ratones CD1, tratados con lactobacilos viables (G2), muertos (G3) respecto al grupo testigo (G1).
6. Impacto
Los resultados sugieren que el cambio en la parasitemia podría estar determinado por la estimulación directa del lactobacilo en la respuesta Th1 a la cual es susceptible
Trypanosoma cruzi, originando resistencia a la infección y controlando de esta manera la
fase aguda, la cual se vio reducida de manera significativa. Es importante resaltar el alto potencial protector generado con la bacteria probiótica administrada de manera repetida (3 ocasiones) ante el reto de un parásito hemático y tisular con un alto poder patogénico como es Trypanosoma cruzi. Por lo que resulta conveniente continuar esta línea de investigación con otros parásitos hemáticos y tisulares para poder en seguida evaluar los cambios generados por la bacteria probiótica en la respuesta inmunológica.
