CIVA 2003 (http://www.civa2003.org), 347-357
Efecto de ácidos orgánicos presentes en extractos postincubados
de bacterias lácticas terrestres en el crecimiento poblacional del
rotífero Brachionus plicatilis O.F. Müller
Miquel Planas Oliver, José Antonio Vázquez Álvarez, Juan Marqués Rodríguez Instituto de Investigaciones Marinas (C.S.I.C.), Vigo (España)
Resumen
Se describe el efecto de los ácidos láctico y acético en el crecimiento poblacional del rotífero Brachionus plicatilis, ampliamente utilizado en la alimentación de larvas de peces marinos. Estos ácidos son propios del metabolismo homo y heterofermentativo de bacterias lácticas de origen terrestre. La utilización en este trabajo de distintos niveles de dichos ácidos, como productos comerciales, se debe a resultados obtenidos anteriormente en el laboratorio con extractos de bactericina de postincubados de fermentaciones lácticas y sus respectivos dializados frente a bacterias patógenas. En este trabajo se indican los niveles de seguridad (no tóxicos) para la utilización de ambos ácidos así como las concentraciones más adecuadas para incrementar significativamente la producción del rotífero con respecto a cultivos estándar.
Summary
Effect of organic acids of postincubated extracts from terrestrial lactic bacteria on the growth of the rotifer Brachionus plicatilis O.F. Müller
This work describes the effect of lactic acid and acetic acid on the population growth of the rotifer Brachionus plicatilis, widely used in the feeding of marine fish larvae. These acids are naturally produced in the homo and heterofermentative metabolism of lactic acid bacteria from terrestrial origin. The use in this work of different levels of these acids, as commercial products, were due to previously obtained results in the laboratory with bacteriocin extracts of postincubated lactic fermentations and their respective dialysates against pathogen bacteria. In this work, both the security levels (not toxic) and the most adequate concentrations for lactic and acetic acid are given in order to increase the production of rotifers with respect to standard cultures.
Introducción
El establecimiento inicial de la microflora en los estadios larvarios de peces marinos depende, entre otros factores, de la microbiota asociada al huevo y a la larva recién eclosionada, a las microalgas y presas vivas introducidas en el sistema y al propio medio de cultivo (1, 2 y 3).
En los sistemas de cultivo industrial, las bacterias colonizan el intestino de las larvas desde la apertura de la boca (2), predominando especies que poseen cierto carácter de virulencia (Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Moraxella) (4, 5, 6 y 7). Las presas vivas (rotífero y Artemia) determinan en gran medida la microbiota de las larvas y son responsables, en muchos casos, de mortalidades importantes (4, 8 y 9).
Entre las posibles alternativas al uso de antibióticos (10, 11 y 12) está la utilización de bacterias con potencial probiótico, que pueden ser suministrados directamente en el agua de cultivo larvario (13 y 14) o a través de las presas vivas (15, 16, 17 y 18), lo que dificulta el crecimiento de ciertos patógenos (19, 20 y 21).
En muchos casos se han utilizado bacterias lácticas como probióticos (20 y 22). Sin embargo, existen grandes lagunas en los mecanismos concretos de acción de los probióticos y en la mayoría de los casos, es difícil establecer la participación de cada uno de forma independiente. Entre los mecanismos de acción cabe citar: producción de compuestos inhibitorios (antibióticos, bacteriocinas, ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno), fenómenos de competencia por nutrientes limitantes o energía, competencia por puntos de adherencia a las mucosas, activación de la respuesta inmunitaria, mejora en la calidad del agua, interacción con fitoplancton, contribución enzimática a la digestión de los alimentos o como fuente de macro o micronutrientes.
A partir de pruebas previas realizadas enfrentando bacteriocinas (procedentes de bacterias lácticas de origen terrestre) con bacterias patógenas Gram negativas (Vibrio algynolyticus,
V. splendidus y Pseudoalteromonas sp.) procedentes de cultivos larvarios de rodaballo
(Scophthalmus maximus) se manifestó la posibilidad de que los ácidos orgánicos láctico y acético, propios del metabolismo homo y heterofermentativo de las bacterias lácticas, pudieran ejercer una inhibición intensa sobre la microflora de los sistemas de cultivos larvarios. Los bioensayos pusieron de manifiesto la inhibición de las bacterias patógenas (23). Los resultados obtenidos con estos extractos y sus correspondientes dializados demostraron que la inhibición era debida a los ácidos láctico y acético, y no a las bacteriocinas, interactuando ambos ácidos de manera aditiva. De ahí surgió la idea de estudiar la utilización de estos ácidos en los sistemas de cultivo como una posible vía para reducir la microflora patógena. Dado que no se conoce el posible efecto tóxico de estos ácidos sobre los organismos de cultivo, se realizó un estudio inicial con rotíferos (Brachionus plicatilis) con el fin de conocer qué concentraciones soportan en presencia de estos ácidos. Esta especie de rotífero constituye la primera presa viva en la cadena alimentaria utilizada en la mayoría de los cultivos larvarios de peces marinos.
Material y métodos
En bioensayos anteriores (23), utilizando postincubados de fermentaciones lácticas en medio MRS, se demostró que los ácidos láctico y acético eran los únicos responsables de la inhibición de bacterias patógenas. Dado que no se requería la utilización de postincubados verdaderos, ya que la presencia de compuestos que no fueran dichos ácidos era innecesaria, todos los experimentos se realizaron con diferentes concentraciones de ácidos comerciales.
Cinco series de cultivos de Brachionus (Experimentos 1 a 5) se sometieron a ensayos dosis-respuesta con ácidos láctico y acético (Sigma) por separado y combinados, a tiempos de exposición de 24 y 48 horas (Tabla I). El rotífero se mantuvo en botellas de 1 litro, en agua de mar con 20 g/l de salinidad, a 23ºC, con aireación suave y fue alimentado con levadura de panificación (Saccharomyces cerevisiae; 1.5 µg/rotífero/día). La concentración inicial de rotíferos fue aproximadamente de 100 rotíferos/ml.
Tabla I
Concentraciones (g/l) utilizadas de ácido láctico (AL) y de ácido acético (AA) en los 5 experimentos (Exp. 1 a 5) realizados y densidad inicial de rotíferos (rotíferos/ml).
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Grupo AL AA AL AA AL AA AL AA AL AA Control - - - 1 0.025 0.05 0.05 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 2 0.1 0.1 0.05 0.025 0.01 0.1 0.025 0.05 3 0.25 0.15 0.05 0.075 0.01 0.025 0.075 0.1 4 0.5 0.05 0.1 0.1 0.025 0.075 0.075 0.5 5 1.0 0.1 0.1 0.025 0.025 1.0 6 0.025 0.15 0.1 0.075 0.025 0.01 7 0.1 0.05 0.15 0.01 0.075 0.05 8 0.25 0.1 0.15 0.025 0.075 0.1 9 0.5 0.15 0.15 0.075 0.075 0.5 10 1.0 1.0
En los experimentos 4 y 5 también se realizó un análisis de la carga bacteriana total (UFC totales). Las muestras de los cultivos se filtraron por malla de 30 µm, separándose el agua de los rotíferos. Seguidamente se realizaron siembras en placa (césped) en medio Agar Marino (Cultimed) y trascurridas 72 horas, a 23ºC, se realizó un recuento del número de colonias (unidades formadoras de colonias).
Tratamiento de los datos
Para la descripción matemática de los resultados de crecimiento poblacional del rotífero (porcentaje respecto al valor inicial), se utilizó el recurso de ajustar a combinaciones lineales de ecuaciones asintóticas (logística Bertalanffy, logística modificada-Gompertz, logística-logística), así como a la ecuación logística generalizada. La decisión de elección entre uno u otros modelos se basó en los criterios que se extraen de los trabajos previos (23 y 24), esto es:
1. El significado físico de los parámetros, y no sólo la capacidad de ajuste de la correspondiente ecuación.
2. La robustez del modelo, en el sentido de minimizar el efecto del error experimental sobre los parámetros de mayor interés práctico (ejemplo: DR50, Ci, Nmáx), lo que favorece a los modelos logísticos.
3. La correlación entre valores esperados y observados, que hace del modelo logística-logística preferible al resto.
Así, el modelo elegido para el ajuste de los datos experimentales es la sustracción algebraica de dos ecuaciones logísticas:
) C ' m (' r ) C m ( r 1 e ' K e 1 K N − − + − + = [1]
N: Número de rotíferos/ml, como % de la población inicial C: Concentración de ácido láctico o acético (g/l)
K, K’: Parámetros de ajuste numérico (dimensiones de N)
r, r’: Tasas específicas de respuesta en los dos tramos (unidades de C-1) m, m’: Parámetros de ajuste numérico (unidades de C)
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos en cuanto a crecimiento poblacional del rotífero se recogen en la Figura 1. El experimento 1 puso de manifiesto la mortalidad total de los rotíferos con el empleo de concentraciones de ácidos superiores a 0.1 g/l. Por contra, niveles iguales o inferiores a esta concentración mejoraron el crecimiento de la población, particularmente a las 24 horas del inicio del experimento.
Seguidamente se procedió a establecer distintas combinaciones de ácidos (Experimento 2), con concentraciones de cada ácido que oscilaron entre 0.05 y 0.15 g/l. Nuevamente se observó una mortalidad total en las concentraciones globales superiores a 0.15 g/l y un aumento de la población para la concentración de 0.1 g/l. En un tercer experimento se utilizaron concentraciones globales dentro del rango 0.02 a 0.15 g/l, rango que podríamos considerar como zona de seguridad.
En todos los casos, excepto en la concentración mayor (0.15 g/l) y menor (0.02 g/l), la adición de ácidos mejoró el crecimiento poblacional con respecto al control. Esta mejoría
fue notablemente superior a los dos días del inicio del experimento. En los experimentos 4 y 5 se obtuvieron resultados muy semejantes a los obtenidos en los anteriores, con un notable aumento del crecimiento poblacional al utilizar concentraciones inferiores a 0.15 g/l.
Figura 1
Evolución de la densidad de rotíferos (en porcentaje relativo respecto al inóculo inicial) a las 24 y 48 horas de tratamiento en los experimentos 1 a 5 (Ver Tabla I para explicaciones sobre la leyenda).
0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 0 50 100 150 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % 24 H 48 H EXPERIMENTO 1 0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EXPERIMENTO 2 EXPERIMENTO 4 0 50 100 150 200 250 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EXPERIMENTO 3 0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EXPERIMENTO 5 0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 0 50 100 150 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % 24 H 48 H EXPERIMENTO 1 0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EXPERIMENTO 2 EXPERIMENTO 4 0 50 100 150 200 250 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EXPERIMENTO 3 0 50 100 150 200 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EXPERIMENTO 5
Tal como se aprecia en la Figura 2 (ajuste a la ecuación [1]), los perfiles de la respuesta presentan un primer tramo en el que la población del rotífero aumenta, para caer luego asintóticamente a partir de concentraciones de ácido láctico o acético de alrededor de 0.1 g/l. Así, teniendo en cuenta los parámetros de la ecuación [1], que presentan un significado biológico claro (obsérvese su análisis dimensional), y realizando el correspondiente análisis matemático (véase apéndice), la constante de mayor interés en este tipo de ensayos es precisamente la concentración de ácido (Ci) que maximiza la población (Nmáx), para la cual (véase apéndice) la ecuación iterativa [1.7] proporciona los valores que se muestran en la Tabla II.
Tabla II
Valores obtenidos al aplicar la ecuación iterativa [1.7].
24 horas 48 horas
Acido N máxima (%) Ci para Nmáx (g/l) N máxima (%) Ci para Nmáx (g/l)
Láctico 108 0,056 163 0,077
Figura 2
Efectos de los ácidos láctico y acético en el crecimiento poblacional de Brachionus plicatilis.
Líneas: ajustes a la ecuación [1].
Gráficas inferiores: correlaciones esperados-observados de las gráficas superiores, variando éstas entre r2= 0.972-0.986.
0 50 100 150 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Láctico (g/l) 0 50 100 150 200 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Láctico (g/l) 0 50 100 150 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Acético (g/l) 0 50 100 150 200 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Acético (g/l) 24 horas 48 horas 0 50 100 150 0 50 100 150 valores esperados 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 valores esperados 0 50 100 150 0 50 100 150 valores esperados 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 valores esperados
Esto supone un crecimiento poblacional máximo del 168% en 48 horas, con unas concentraciones de 0.077 y 0.074 g/l de ácido láctico y acético, respectivamente.
Como normal general para todos los experimentos se puede indicar que las concentraciones de ácidos más interesantes para aumentar el crecimiento poblacional de rotíferos se sitúan dentro del rango 0.05-0.1 g/l. Dentro de este rango, que es aplicable tanto si se utilizan los dos ácidos combinados como de modo independiente, los mejores resultados, tanto por su efecto potenciador de la reproducción como por la ausencia de toxicidad, se obtuvieron con concentraciones cercanas a 0.1 g/l. Esta última concentración establece el límite superior de tolerancia para el rotífero así como para otros organismos cultivables, concretamente en Artemia y en larvas de rodaballo (Scophthalmus maximus) (datos sin publicar). Algunos estudios han puesto de manifiesto que la presencia de agentes quelantes, particularmente EDTA (aminoácido sintético que contiene ácido acético), pueden prolongar la vida de algunos invertebrados de agua dulce (25). Sin embargo, otros compuestos, como el calcio, reducen la vida media del rotífero de agua dulce Mytilina
brevispina (26). La presencia de EDTA reduciría la concentración de calcio en los rotíferos,
aumentando su vida media.
En cuanto a la respuesta conjunta de los dos ácidos láctico y acético (experimentos 2 a 4), ambos en el intervalo de 0.025 a 0.1 g/l, y teniendo en cuenta los resultados del trabajo precedente (27) acerca de la ecuación [1] así como los criterios descritos por Murado y cols. (24) para sistematizar las modificaciones de la respuesta debidos a los efectos de potenciadores y antagonistas sobre un receptor celular u organismo (Tabla III), el conjunto de los resultados experimentales que se representa en la Figura 2 sugiere una descripción en los términos de la ecuación [2], en la que se eliminan los posibles efectos autoinhibitorios sobre los parámetros r, m y K de cada efector, ya que no parecen pertinentes a la vista de los propios resultados:
− − ρ + γ + + β + = A L 1 m L 1 r exp 1 1 ) L 1 ( K N L A L A L A AL + − δ + χ + + µ + A L 1 ´ m L 1 ´ r exp 1 1 ) L 1 ( ´ K L A L A L A − ρ + γ + + α + L A 1 m A 1 r exp 1 1 ) A 1 ( K A L A L A L − δ + χ + + ε + − L A 1 ´ m A 1 ´ r exp 1 1 ) A 1 ( ´ K A L A L A L [2] Tabla III
Sistemática de las variaciones de la respuesta debidas a un modificador con efectos específicos sobre los parámetros del modelo logístico.
Efecto sobre el parámetro disminuye el parámetro aumenta K : eficiencia del efector
(potenciadores o antagonistas) R = φ (K/Bk; m; r) R = φ (KBk; m; r)
r : susceptibilidad del receptor
(excitadores o inhibidores) R = φ (K; m; r/Br) R = φ (K; m; rBr)
m : afinidad entre receptor y efector R = φ (K; m/Bm; r) R = φ (K; mBm; r) Los subíndices del término B indican el parámetro logístico afectado por la acción del modificador (24).
Aunque un modelo con 24 parámetros resulta un tanto excesivo y requiere para el cálculo un número elevado de valores experimentales (en este caso disponemos de 7×7=49, número ampliamente suficiente), no aumenta la probabilidad del error de tipo II, ya que sólo implica dos variables independientes (láctico y acético), y no existe riesgo de irrelevancia para ninguna de ellas.
En la Figura 3 se representa la superficie de respuesta (experimentos 2 a 4) junto con los correspondientes puntos experimentales, así como la correlación entre valores esperados y observados (r2=0.866). Asimismo, a modo de ejemplo, en la Tabla IV se recogen los valores
paramétricos obtenidos del ajuste a la ecuación [2].
Figura 3
Efecto conjunto de los ácidos láctico y acético en el crecimiento poblacional de Brachionus plicatilis a 48 horas de cultivo. Superficie de respuesta: ajustes a la ecuación [2].
Tabla IV
Parámetros del modelo [2] para la descripción del efecto conjunto (experimentos 2 a 4) de los ácidos láctico y acético sobre el crecimiento poblacional de Brachionus plicatilis.
Efecto del acético Efecto del láctico
Efecto del láctico sobre el acético
Efecto del acético sobre el láctico KA= 898.53 K´A= 828.42 KL= 262.01 K´L= 214.07 βL= 30.79 µL= 18.15 αA= 0.19 εA= 8.58 rA= 30.04 r´A= 40.75 rL= 15.79 r´L= 236.72 γL= -2.79 χL= 1.14 γA= 43.28 χA= -6.49 mA= 0.12 m´A= 0.11 mL= 0.06 m´L= 0.10 ρL= 37.61 δL= 11.57 ρA= 11.55 δA= 2.32 -50 0 50 100 150 200 250 -50 0 50 100 150 200 250 valores esperados 0,05 0,15 0,00 0,05 0,15 250 200 150 100 50 0 Láctico (g/l) Acético (g/l)
El análisis de estos valores numéricos revela el siguiente panorama:
1. Efecto del ácido láctico sobre el ácido acético: las variables βL y µL (del láctico)
reducen la eficiencia del acético sobre rotífero (KA, K´A); la variable χL reduce la
susceptibilidad del rotífero al ácido acético en el tramo descendente de la cinética (r´A), mientras que γL aumenta esta susceptibilidad en el tramo ascendente (rA).
Finalmente ρL y δL reducen la afinidad (mA, m´A) entre el organismo receptor (rotífero)
y el efector (acético).
2. Efecto del ácido acético sobre el ácido láctico: las variables αA y εA (del acético)
reducen la eficiencia del láctico sobre rotífero (KL, K´L); la variable χA aumenta la
susceptibilidad del rotífero al ácido láctico en el tramo descendente de la cinética (r´L),
mientras que γA reduce esta susceptibilidad en el tramo ascendente (rL). Finalmente ρA
y δA reducen la afinidad (mL, m´L) entre el rotífero y el ácido láctico.
En lo que concierne a la microbiología (Figura 4), los resultados de la carga bacteriana no láctica obtenidos en los experimentos 4 y 5 indican que es posible reducir notoriamente (1 log) la carga bacteriana del sistema. El efecto más notable se obtuvo con la utilización de ácido láctico y con concentraciones de 0.05-0.1 g/l. Aunque este resultado (tentativo) sugiere que la causa de la mejora está en la inhibición de la microbiota oportunista o patógena, lo cierto es que tampoco puede descartarse un efecto directo de los ácidos sobre el crecimiento del rotífero, debido a la posible estimulación de sistemas enzimáticos implicados en la regulación de la economía energética o el ciclo biológico. De hecho, datos no aportados en este trabajo ponen de manifiesto que el número de hembras ovígeras aumenta más que la población total de rotíferos, hipótesis que, naturalmente, requeriría una confirmación específica. En todo caso, es posible que ambos ácidos actúen de una manera semejante. El ácido láctico, además de ejercer un efecto antimicrobiano debido a un posible descenso de pH, también permeabiliza la membrana externa de bacterias Gram-negativas, pudiendo actuar como potenciador de otras sustancias antimicrobianas (28).
Figura 4
Número total de bacterias (UFC) en los experimentos 4 (agua y rotíferos; 24 y 48 horas) y 5 (agua; 48 horas).
1 10 100 1000 10000 C 1 2 3 4 EXP. 4 - UFC/ml 24 H 48 H 1 10 100 C 1 2 3 4 EXP. 4 - UFC/Rotifero 1 10 100 1000 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EXP. 5 - UFC/ml 48 H
Así pues, se puede concluir que la adición de ácido acético y fundamentalmente de ácido láctico permite aumentar la producción de rotíferos a corto plazo reduciendo al mismo tiempo la microflora total tanto en el rotífero como en el medio de cultivo. Las concentraciones más efectivas se sitúan entre 0.5 y 1.0 g/l.
Agradecimentos
Para Alicia Abalo y Montserrat Martínez por su trabajo como técnicos de laboratorio. El trabajo fue financiado por los Proyectos Producción y aplicación de probióticos a la mejora de la supervivencia de cultivos larvarios de peces marinos (1FD97-0044-C03-01/02; CICYT/FEDER) e Improved procedures for flatfish larval rearing through the use of probiotic
bacteria (Q5RS-2000-31457; V Programa Marco UE).
Apéndice: Ecuación ‘logística+logística’
) C ´ m ´( r ) C m ( r 1 e ´ K e 1 K N − − + − + = [1.1] Determinación de C0 y C∞: ´ m ´ r rm 0 t 0 e 1 ´ K e 1 K lim C + − + = → , ∀r, m, r’, m’ [1.2] ´ K K e 1 ´ K e 1 K e 1 ´ K e 1 K lim C r(m ) r´(m´ ) t + − + = + − + = − = −∞ −∞ −∞ −∞ ∞ → ∞ , ∀r, m, r’, m’ > 0 [1.3]
Para la búsqueda del máximo se procede de la siguiente manera:
(
) (
1 e)
0 e ´ r ´ K e 1 Kre dt dC 2 ) C ´ m ´( r ) C ´ m ´( r 2 ) C m ( r ) C m ( r = + − + = − − − −(
) (
r´(m´ C))
2 ) C ´ m ´( r 2 ) C m ( r ) C m ( r e 1 e ´ r ´ K e 1 Kre − − − − + = +lo que produce de nuevo una ecuación trascendente, que permite cuatro posibles formas de despejar t y calcularlo mediante iteración numérica hasta que Ci= Ci-1.
i)
(
)
(
)
+ + − = − − − − − − 2 ) C ´ m ´( r 2 ) C m ( r ) C ´ m ´( r i 1 i 1 i 1 i e 1 Kr e 1 e ´ r ´ K ln r 1 m C [1.4] ii)(
)
(
)
+ + − = − − − − − − 2 ) C m ( r 2 ) C ´ m ´( r ) C m ( r i 1 i 1 i 1 i e 1 ´ r ´ K e 1 Kre ln ´ r 1 ´ m C [1.5]iii)
(
)
− + − = − − − − − − 1 e ´ r ´ K e 1 Kre ln r 1 m C r´(m´ C ) 2 ) C ´ m ´( r ) C m ( r i i1 1 i 1 i [1.6] iv)(
)
− + − = − − − − − − 1 Kre e 1 e ´ r ´ K ln ´ r 1 ´ m C r(m C ) 2 ) C m ( r ) C ´ m ´( r i i1 1 i 1 i [1.7]donde, como en el caso precedente, la realidad experimental aconseja la vía iv. Haciendo Ci=Cmáx y sustituyendo este valor Cmáx en N(t), obtenemos Cmáx, comprobándose que: para C<Cmáx → f´(C,t) 0 dt dC > = , la función es creciente para C>Cmáx → f´(C,t) 0 dt dC < = , la función es decreciente y, utilizando la segunda derivada:
Cmáx → f´´(C,t) 0 dt C d 2 2 <
= , por lo que Cmáx es, definitivamente, un máximo.
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