• No se han encontrado resultados

Papel de los dominios adaptadores de c-Src en cáncer de mama

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Papel de los dominios adaptadores de c-Src en cáncer de mama"

Copied!
135
0
0

Texto completo

(1)

Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares

Papel de los dominios adaptadores de c-Src en cáncer de mama

Víctor Mayoral Varo

Madrid, 2019

(2)

Facultad de Medicina

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

Papel de los dominios adaptadores de c-Src en cáncer de mama

Memoria presentada para optar al grado de Doctor por:

Víctor Mayoral Varo Licenciado en Biología

Director de Tesis:

Dr. Jorge Martín Pérez

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS “ALBERTO SOLS”

(3)
(4)

Agradecimientos

(5)

L

os primeros a los que tengo que agradecérselo son a mis padres. Siempre me han brindado su apoyo incondicional, han creído en mí y me han dejado siempre tomar mis propias decisiones. Sin ellos esto no habría sido posible. Os quiero mucho y espero que estéis muy contentos de lo que he conseguido. Por supuesto, a mi hermano Álvaro, que sé que siempre está cuando le necesito. Te quiero enano.

A la chica de mis sueños, que me ha apoyado siempre y ha aguantado fines de semana y festivos en los que he tenido que trabajar en mi Tesis. Sin ti, todo sería más difícil. Te quiero mucho y espero que estés orgullosa de lo que he conseguido.

A la que será mi nueva familia en Julio de 2019: Juan Calos, Chon y Elena, porque para mi son un gran apoyo. A mis amigos Álvaro, Josu, Helena, Víctor, Maca, Ignacio, Jose, Tere, Sergio, Javier, Raúl y algunos más que me dejo en el tintero, a los que he dado la paliza con mi trabajo entre risas y cañas y han conseguido que los fines de semana pensara en otra cosa. Y a todo el resto de mi familia que aunque ninguno tiene afinidad por las ciencias, siempre se han interesado por mi trabajo.

En cuanto a mi trabajo, quiero darle las gracias muy especialmente a Jorge, que dió la oportunidad de hacer el proyecto fin de carrera a un estudiante que, sin obtener las mejores calificaciones, sí tenía muchas ganas de aprender y trabajar. De eso hace ya más de siete años en los que ha buscado financiación y la manera de que pudiera seguir trabajando con él hasta conseguir esta Tesis. Jorge, nunca pensé que podría llegar a este punto en mi carrera y si lo he conseguido, en gran parte, es gracias a ti.

También quiero agradecerle a Pilar que me enseñó, cuando empecé, todo el trabajo de laboratorio y sentó las bases de esta Tesis. A Ana Aranda mi tutora de la Tesis Doctoral por su ayuda y comentarios. Por supuesto, tengo que agradecer a toda la gente que ha pasado durante estos años por el laboratorio que entre risas y mucho esfuerzo han ayudado a completar el trabajo. Con especial cariño a Annarica, que desde Italia sé que siempre puedo contar con ella. A Lara y a Luis, con los que entablé una buena amistad. Y, como no podía ser de otra manera, a Sandra y Lucía, mis compañeras de fatiga en los últimos años con las que la hora de comer era un momento de desahogo.

A María, siempre sonriente y a Juan, inconformista, queriendo solucionar el mundo y poner a cada uno en su sitio.

Del mismo modo, me gustaría agradecer a toda la gente con la que he tenido el placer de colaborar en la elaboración de esta Tesis Doctoral. A Oscar H. Martínez-Costa Pérez y a Juan José Aragón por su imprescindible ayuda en toda la parte de la glicolisis.

A Miguel Fernández Moreno y a Cristina González Páramos por su ayuda en el estudio de la mitocondria y ATP. A Susana Guerra por su colaboración en los ensayos de las proteínas de respuesta a interferón. También a Luis del Peso que nos ayudo con el

(6)

análisis de GSEA y con el que anteriormente colaboramos en el artículo de 2017 “miR205 inhibits stem cell renewal in SUM159PT breast cancer cells”. A Sergio Ciorda del servicio de espectometría de masas del CNB con el que hemos trabajado para la proteómica de esta Tesis y para el artículo publicado en 2015 “Cyr61 as mediator of Src signaling in triple negative breast cancer cells”. Y a David Hardisson por su ayuda con las inmunohitoquímicas.

Muchas gracias a todos. Estos años han sido muy duros, pero vosotros habéis contribuido de una u otra manera a que pudiera completar mi Tesis Doctoral.

(7)

Resumen / Abstract

(8)

c-Src es el prototipo de la familia de proteínas tirosinas quinasas no receptoras Src. Su sobreexpresión e hiperactivación se ha asociado a múltiples tipos de tumores. En cáncer de mama se ha descrito el papel de su actividad quinasa en la progresión tumoral. Sin embargo, c-Src también posee los dominios adaptadores SH2 y SH3, que son muy importantes en la interacción con otras proteínas para regular procesos como la migración.

Esta Tesis Doctoral se centra en el estudio de estos dominios en el cáncer mamario humano, con el fin de conocer el papel que juegan en diferentes procesos tumorales.

Para ello se han expresado de manera condicional diferentes mutantes de c-Src en células de cáncer de mama humano. En células MCF-7 se ha comprobado que la expresión de SrcDN, mutante de c-Src sin actividad quinasa y con los dominios adaptadores siempre expuestos, reduce su tumorigénicidad in vivo, afectando a la capacidad de autorrenovación de sus células troncales tumorales (CSCs), las responsables de la tumorigénesis. Esto se debe, al menos en parte, a la reducción de la glicólisis anaeróbica o fenotipo Warburg producido por la expresión de SrcDN en sus CSCs.

En células de cáncer mamario triple negativo (TNBC) MDA-MB-231 y SUM159PT, procedentes de tumores humanos muy agresivos, la expresión de SrcDN también redujo la capacidad de autorrenovación de CSCs. La expresión de mutantes sin funcionalidad en alguno o en ambos dominios adaptadores disminuyó igualmente la capacidad de autorrenovación de CSCs, poniendo de manifiesto la importancia de los dominios adaptadores SH2 y SH3 de c-Src en la carcinogénesis mamaria. Además, el estudio de otros procesos asociados a la tumorigénesis como el crecimiento independiente de anclaje, proliferación, migración e invasividad, mostraron que el dominio adaptador SH2 juega un papel muy importante en todos ellos. Por tanto, el dominio SH2 de c-Src puede ser una buena diana terapéutica, que en combinación con inhibidores de la actividad quinasa de c-Src produzcan mejores resultados curativos en pacientes con TNBC, para los que actualmente el pronóstico es muy negativo.

(9)

c-Src is the prototype of the family of non-receptor protein tyrosine kinases Src. Its overexpression and hyperactivation has been associated with multiple types of tumours.

In breast cancer, the role of its kinase activity in tumour progression has been described.

However, c-Src also has the adapter domains SH2 and SH3, which are very important for the interaction with other cellular proteins to regulate processes such as migration.

This Doctoral Thesis focuses on the study of these domains in human breast cancer, in order to understand the role they play in different tumour processes. For this reason, different mutants of c-Src have been conditionally expressed in human breast cancer cells. In MCF-7 cells, expression of SrcDN, a mutant of c-Src without kinase activity and with the adapter domains always exposed, reduces its tumorigenicity in vivo, affecting the self-renewal capacity of its tumour stem cells (CSCs), responsible for tumorigenesis. This is due, at least in part, to the reduction of anaerobic glycolysis or Warburg phenotype produced by the expression of SrcDN in their CSCs.

In the triple negative breast cancer (TNBC) cells MDA-MB-231 and SUM159PT, from very aggressive human tumours, the expression of SrcDN also reduced the self- renewal capacity of CSCs. The expression of mutants without functionality in either or both of the adapter domains also decreased the self-renewal capacity of CSCs, demonstrating the importance of the SH2 and SH3 adapter domains of c-Src in mammary gland carcinogenesis. In addition, the study of other processes associated with tumorigenesis such as anchorage independent growth, proliferation, migration and invasiveness, showed that the SH2 adapter domain of c-Src plays a very important role in all of them. Therefore, the SH2 domain of c-Src can be a good therapeutic target, which in combination with inhibitors of c-Src kinase activity produce better curative results in patients with TNBC, for which the prognosis is currently very negative.

(10)

Índice

(11)

Agradecimientos ... 9

Resumen / Abstract ... 13

Abreviaturas ... 21

Introducción ... 25

Cáncer ... 27

Desarrollo de la glándula mamaria ... 27

Tipos de tumores mamarios ... 28

Estructura y función de c-Src ... 30

c-Src en cáncer ... 32

c-Src en proliferación ... 34

c-Src y ROS ... 35

c-Src en migración e invasividad ... 35

c-Src y CSC ... 36

c-Src en glicólisis ... 36

Mutantes de c-Src ... 38

Efecto de la expresión de SrcDN en las células MCF-7 ... 38

Objetivos ... 41

Material y métodos ... 45

Reactivos ... 47

Líneas celulares ... 48

Cultivo celular ... 49

Obtención de proteínas de extracto total ... 49

Inmunotransferencia ... 50

Aislamiento de células ESA⁺-CD44⁺-CD24ˉ/baja (CD24ˉ) y ESA⁺-CD44⁺-CD24⁺ (CD24⁺) y cultivo ... 50

Ensayo tumorigenicidad in vivo ... 51

Inmunohistoquímica de xenoinjertos ... 51

Proteómica cuantitativa ... 52

Eficiencia de formación de tumoresferas ... 52

Medida de producción de lactato y consumo de glucosa ... 53

Valoración de actividad de enzimas glucolíticas ... 53

Consumo de oxígeno ... 54

Medida de ATP ... 55

Crecimiento independiente de anclaje ... 55

Ensayos de proliferación y actividad metabólica ... 55

Estrés oxidativo ... 56

Migración celular ... 56

(12)

Adhesión celular ... 57

Invasividad ... 58

Inmunofluorescencia ... 58

Preparación de ARN para qRT-PCR ... 59

Procesamiento informático de los resultados ... 59

Análisis estadístico ... 59

Resultados ... 61

Tumorigenicidad in vivo de células CD24ˉ de MCF-7-Tet-On-SrcDN ... 63

Eficiencia de formación de esferas en MCF-7-Tet-On-SrcDN ... 66

Proteómica cuantitativa de CSC de MCF-7-Tet-On-SrcDN ... 67

Consumo de glucosa y producción de lactato ... 69

Actividad enzimas glucolíticas ... 70

Función mitocondrial ... 71

Proteínas de respuesta a interferón ... 73

Eficiencia de formación de esferas de las células de cáncer mamario triple negativo ... 74

Crecimiento independiente de anclaje ... 78

Proliferación de las células SUM159PT ... 79

Estrés oxidativo ... 82

Adhesión celular ... 83

Migración celular ... 84

Invasividad ... 93

Discusión ... 95

Conclusiones ... 107

Bibliografía ... 111

Artículos publicados durante la tesis no relacionados con esta ... 123

“Cyr61 as mediator of Src signaling in triple negative breast cancer cells” ... 125

“miR205 inhibits stem cell renewal in SUM159PT breast cancer cells” ... 145

(13)

Abreviaturas

(14)

CSC Células troncales tumorales CSK Quinasa carboxilo terminal de Src Doxy Doxiciclina

EGFR Receptor del factor de crecimiento epidérmico EMT Transición epitelio mesénquima

ENO Enolasa

ER Receptor de estrógenos ESA Antígeno epitelial específico

FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia FAK Quinasa de adhesión focal

FBA Fructosa-bisfosfato aldolasa

FCCP Carbonil cianuro p—(trifluorometoxi)—fenilhidrazona GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

GSEA Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes HER2 Receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano HK Hexoquinasa

IFN-β Interferón beta

LDHA Lactato deshidrogenasa A LDH Lactato deshidrogenasa LPP “lipoma preferred partner”

MMP Matriz metaloproteasas

MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio NSCLC Células de carcinoma pulmonar no microcítico

OMS Organización mundial de la salud PDH Piruvato deshidrogenasa

PFK1 Fosfofructoquinasa PGI Fosfoglucosa isomerasa PGK1 Fosfoglicerato quinasa PGM Fosfoglicerato mutasa PK Piruvato quinasa

(15)

PKC Proteína quinasa C PKM2 Piruvato quinasa

PR Receptor de progesterona RB Retinoblastoma

ROS Especies reactivas de oxígeno RTK Receptor de tirosina quinasa SFE Eficiencia Formación Esferas SFKs Familia quinasas Src

TetR Represor de tetraciclina THF Tetrahidrofolato

TNA Triple negativo

TNBC Cáncer de Mama Triple Negativo TPI Triosafosfato isomerasa

*Las abreviaturas son las usadas típicamente en textos en inglés aunque se refieran a términos en castellano, para facilitar su lectura.

(16)

Introducción

(17)

Cáncer

El cáncer es un conjunto de enfermedades producidas por una proliferación descontrolada de las células de un tejido. Esto puede llevar a la perdida de función del tejido u órgano en el cual proliferan las células tumorales. Además, estas pueden invadir otros tejidos afectando también su correcto funcionamiento.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) el cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, cada año fallecen 8,2 millones de personas. Hay más de 14 millones de nuevos casos al año, cifra que prevén que se incrementará en un 70 % en los próximos 20 años (datos OMS). El cáncer de mama es el segundo más diagnosticado en todo el mundo, y el primero en mujeres. Además, es el tipo de cáncer con mayor mortalidad y prevalencia en mujeres (datos OMS).

Desarrollo de la glándula mamaria

La glándula mamaria diferencia a los mamíferos de otros animales, siendo la única estructura anatómica que secreta leche para alimentar al recién nacido. Este complejo órgano secretor se compone de diferentes tipos celulares: células epiteliales, mioepiteliales, adipocitos, células endoteliales vasculares, fibroblastos, y células del sistema inmune.1

La glándula mamaria en humanos y otros animales es un órgano dinámico, que se desarrolla principalmente en tres etapas: embrionaria, puberal, y reproductiva. En humanos, el epitelio mamario consiste en una red de conductos que se ramifican e invaden el tejido adiposo mamario antes de nacer. Los conductos están formados por una capa basal de células mioepiteliales contráctiles y una capa luminal de células epiteliales ductales y alveolares.2 Durante la pubertad, el crecimiento ductal aumenta rápidamente bajo estimulación hormonal, lo que resulta en una ramificación lateral. La etapa final de diferenciación se produce durante la gestación y la lactancia, cuando numerosas estructuras lóbulo-acinares que contienen las células alveolares secretoras de leche se forman tras una etapa de proliferación extensa, seguida de una diferenciación terminal. La interrupción de la lactancia después del destete se acompaña de apoptosis masiva y remodelación tisular, y la glándula mamaria vuelve a una estructura similar a la pregestacional.3

Durante el desarrollo tienen lugar procesos de crecimiento, diferenciación y apoptosis.

Estos procesos implican interacciones entre el epitelio y el estroma, y son regulados por hormonas, factores de crecimiento, interacciones célula-matriz y célula-célula. La desregulación de estos procesos por mutaciones heredadas o adquiridas da lugar al desarrollo de cáncer de mama.3 La capacidad del epitelio mamario en todas las especies para someterse a varias rondas de proliferación, diferenciación y apoptosis, llevó a confirmar

(18)

la existencia de una población de células troncales.4, 5 Diversos estudios apoyan el papel de las células troncales en el desarrollo de la mama y en la carcinogénesis.3, 6-8

Figura 1. A) Sección sagital de mama con ampliación de lobulo. Modificado de © 2012 Terese Winslow LLC.

B) Esquema de los diferentes tipos célulares en lobulillo de mama. Modificado de.9

Tipos de tumores mamarios

El cáncer de mama es una enfermedad compleja que muestra un amplio grado de heterogeneidad inter e intratumoral.10 Esto se debe a la plasticidad de la glándula mamaria y a los diferentes tipos celulares que en ella encontramos. Aproximadamente del 80 % de los tumores mamarios son de origen ductal;11 y mientras que el 90 % de los tumores son de origen esporádico, el resto son hereditarios y en este grupo predominan los tumores con mutaciones en BRCA1/2.12 La clasificación de los distintos tipos de tumores mamarios es muy importante en clínica para seleccionar un tratamiento y predecir la prognosis de la paciente.13 El cáncer de mama se clasifica en función de sus características morfológicas, moleculares, y expresión génica.13, 14 Además, durante la progresión de la enfermedad las características, y, por tanto, el tipo de tumor pueden cambiar.13 Los diferentes tipos se clasifican principalmente según dos aspectos importantes, la expresión de receptores hormonales [receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR)], el receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), y los genes que regulan.14 Atendiendo a estos criterios se identifican cinco tipos: luminal A, luminal B,

(19)

HER2-positivo (HER2⁺), basal o triple negativo (TN), y normal.14 Este quinto tipo, conocido como “normal”, presenta heterogeneidad incluyendo células del estroma, linfocitos, y células epiteliales normales contaminadas con células tumorales de baja malignidad.14

El cáncer de mama de tipo luminal es el más frecuente. Presenta un patrón de expresión génica similar al del epitelio luminal normal de la mama. Este tumor se caracteriza por la expresión de ER y PR y sus genes asociados, así como por la expresión de las citoqueratinas luminales 8 y 18.14 Las células luminales son las células más diferenciadas, y con menos propensión a la migración, debido a las uniones estrechas entre células.15 Las células luminales A, como las MCF-7, expresan bajos niveles de HER2 y de genes asociados a proliferación como Ki67.14 Las luminales B muestran una tasa de proliferación elevada, tienden a tener mutado P53, y generalmente muestran bajos niveles de ER y los genes que regula.14 Por tanto, las células que producen este tipo de tumor son más invasivas y agresivas que las luminales A.15 El tipo HER2⁺ es poco frecuente, en torno al 10 %. No todos los tumores incluidos en este grupo muestran amplificación y sobreexpresión de HER2, pero si correlacionan con otras características del tipo. Los tumores HER2⁺ que presentan alta expresión de genes luminales entran en el grupo de luminales B, porque los clasificados como HER2⁺ tienen una baja expresión de estos genes, así como de genes regulados por hormonas y de genes de células basales, y alta expresión de genes implicados en proliferación.14 Por último, los tumores triples negativos (TN) no expresan ER y PR, y no sobreexpresan HER2, aunque esta característica no se observa siempre, pues aproximadamente en 25 % de los tumores basales no son TN. El tipo TN también se caracteriza por una baja expresión de genes luminales, y de genes asociados al tipo HER2⁺, y una alta expresión del grupo de genes del tipo basal. Este grupo de genes incluye citoqueratinas propias de células epiteliales basales, así como, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), caveolina-1, etc.14 Además, los tumores basales presentan una alta tasa de mutación en P53, perdida de función de retinoblastoma (RB1), y consecuentemente una alta tasa proliferativa.

Dentro de los tumores TN se ha descrito un subtipo denominado bajo en claudinas.

Este subtipo se caracteriza por una baja expresión de genes implicados en uniones estrechas como las claudinas, y una alta expresión de genes mesenquimales como Vimentina o Twist1.14 Las células de tumores bajos en claudinas, como MDA-MB-231 y SUM159PT, sobreexpresan proteínas que juegan un papel importante en la remodelación de la matriz extracelular, lo que es importante para la migración y la invasividad.15 También sobreexpresan marcadores de células troncales tumorales (CSC), haciendo de este tipo de tumor el más agresivo y con peor pronóstico.14 Además, los tumores producidos por la mutación en BRCA1 en un 80 % de los casos son TN, mientras que los tumores TN normalmente son esporádicos y tanto el gen como la proteína de BRCA1 aparecen intactos en estos tumores.14

(20)

Estructura y función de c-Src

La proteína c-Src es el prototipo de la familia de las proteínas tirosina-quinasas citoplasmáticas no receptoras (SFKs) que se compone de nueve miembros: Src, Fyn, Yes, Blk, Yrk, Fgr, Hck, Lck y Lyn. Esta familia de proteínas juega un papel importante en una gran variedad de rutas de transducción de señalización celular involucradas en proliferación, motilidad, adhesión, angiogénesis, invasividad y supervivencia.16 SFKs transduce señales desde el medio extracelular a vías bioquímicas intracelulares que pueden activar factores nucleares produciendo respuestas transcripcionales, o bien componentes citoplásmicos implicados en la reorganización del citoesqueleto, o pueden activar otras proteínas con diversos resultados en la célula.16 Src, Yes y Fyn son los tres miembros de la familia que se expresan de manera ubicua en todas las células.17 La mutación de estos tres miembros en embriones de ratón produce graves defectos en el desarrollo y son letales en E9.5.18 Mientras que la mutación en c-Src produce osteopetrosis pero no es letal, lo que demuestra que Yes y Fyn compensarían parte de la señalización de Src.19

SH2

KD

Y416

Y416 R175/L* o T125/W*

K295/M*

W118/A* o D99/N*

Csk

Translocación a membran a

Tirosina fosfatasas Mutación Y527F Deleción de Y527

Activo Inactivo

SH3

SH3 U

U

P

P

KD

SH2

KD

Y527/F*

Y527 Linker

Miristoilación/

Palmitoilación

*Mutaciones Inactivadoras

*Mutaciones Activadoras

Figura 2. Estructura de c-Src. A la izquierda, la conformación abierta, activa, de la proteína, y a la derecha la conformación cerrada, inactiva. Modificado de.16

La proteína c-Src se activa mediante la estimulación de receptores de membrana, incluyendo receptores para factores de crecimiento, de citoquinas, integrinas, etc., y es indispensable para la homeostasis celular.16 Es por ello que c-Src es una proteína esencial para las células, su desregulación está asociada a diversos procesos tumorales. La

(21)

mayor actividad enzimática de c-Src es un fenómeno frecuente en muchos tipos de tumores humanos tanto epiteliales, como no-epiteliales, tales como tumores mamarios y colorectales, y algo menor en melanomas, tumores de ovario, pancreáticos, gástricos, de cuello y cabeza, de pulmón, cerebro y neoplasias hematológicas.20 Hay evidencias del papel destacado de c-Src en la invasión, y en otros eventos relacionados con la progresión tumoral, tales como la transición epitelio-mesénquima (EMT) y el desarrollo de metástasis.16

Src es una proteína de 60 kDa compuesta por varios dominios funcionales como se observa en la Figura 2:21, 22

Un dominio N-terminal que se asocia a un residuo de ácido mirístico esencial para la localización en la cara interna de la membrana celular.

Un dominio único que aporta la especificidad a cada miembro de la familia Src.

Un dominio SH3 capaz de unirse a proteínas con secuencias ricas en residuos prolina para mediar las interacciones intra- e inter-moleculares.

Un dominio SH2 que puede unirse a secuencias que contienen residuos de tirosina fosforilados, de la propia molécula o de otras proteínas.

Una secuencia de enlace (“linker”) que contiene un residuo de prolina involucrado en la unión intramolecular con el dominio SH3.

Un dominio catalítico compuesto de dos lóbulos separados por la horquilla catalítica en la que el ATP y los sitios de unión al sustrato interaccionan, y ocurre la fosfotransferencia. En este dominio hay una zona reguladora que contiene el residuo Y419 (en humanos), importante para conseguir la máxima actividad quinasa al ser fosforilado.

El dominio C-terminal contiene un residuo de tirosina, Y530 (en humanos), que cuando es fosforilado puede unirse al dominio SH2, dando una conformación inactiva.

Los cambios conformacionales que regulan el grado de activación de la SFKs están asociados a procesos de fosforilación. La conformación inactiva se produce cuando las tirosina-quinasas de la familia CSK (Quinasa carboxilo terminal de Src) fosforilan el residuo Y530, y este interacciona intramolecularmente con el dominio SH2;

el dominio SH3 estabiliza esta conformación inactiva por unión al residuo de prolina de la secuencia de enlace, que se posiciona junto con el dominio SH2, en la parte posterior del dominio catalítico. En esta conformación, el bucle de activación adopta una estructura compacta que, por un lado, tapa la hendidura catalítica, lo que impide el acceso de

(22)

ATP y sus sustratos, y por el otro, cubre el residuo Y419, evitando su autofosforilación activadora. Cuando se pierden las interacciones intramoleculares mediadas por los dominios SH2/SH3, c-Src puede adoptar la conformación abierta y, por tanto, activarse por la fosforilación de Y419.23

La localización subcelular de Src, y su colocalización con otras proteínas, y con sustratos potenciales, es un importante mecanismo de regulación de la función de c-Src.

Src se asocia con ácidos grasos de la membrana plasmática, y también con los de las membranas perinuclear y endosomal, debido a que la metionina N-terminal se corta y la Glicina en posición 2 se acila, lo que requiere una secuencia mínima de acilación.24 Cuando se encuentra en su forma inactiva, su localización es perinuclear. Tras una estimulación, el dominio SH3 se asocia con filamentos de actina, y c-Src se transloca a la membrana plasmática en las regiones de interacción célula-célula o célula-matriz extracelular, donde transmite señales procedentes de receptores tirosina quinasas (RTK), citoquinas, etc., o señales procedentes de receptores de adhesión.23 La activación de c-Src es un evento transitorio asociado a la desfosforilación de la Y530 de la cola C-terminal, o a la interacción con ligandos a SH2/SH3 de alta afinidad que desestabilizan la configuración cerrada/inactiva, y favorecen la configuración abierta/activa;

consecuentemente Y419 en el bucle de activación se fosforila, lo que conduce a la máxima activación de la quinasa.23

c-Src en cáncer

La sobreexpresión y/o activación de c-Src, y de otros miembros de SFKs se han asociado a diferentes tumores sólidos. En cáncer de próstata se han observado niveles elevados de c-Src, Lyn, y Fgr. El tratamiento con inhibidores de Lyn reduce la proliferación, la migración, y el potencial invasivo in vitro; el uso de inhibidores de c-Src in vivo reduce el crecimiento del tumor, y la metástasis.25 La expresión de c-Src en pólipos premalignos de colon es entre 5 y 8 veces mayor que en la mucosa normal. Estos niveles no están solo asociados con el estadío del tumor, el tamaño, y el potencial metastásico, sino también con la supervivencia y la recidiva.25 c-Src y Fgr juegan un papel importante en el crecimiento del cáncer de ovario.26 Además, c-Src se ha relacionado con la endometriosis asociada al cáncer de ovario,27 y a la transición epitelio-mesénquima en este mismo tipo tumoral.28 En cáncer de pulmón la inhibición de c-Src en células de carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) dependientes de EGFR reduce el crecimiento del tumor e induce apoptosis.25 La sobreexpresión de distintos miembros de SFKs, y su señalización a través de STAT3 y STAT5, favorecen el crecimiento en líneas celulares derivadas de cáncer de cabeza y cuello.25 Al igual que en los tumores anteriores, en cáncer de páncreas, y en neuroblastoma, se observan niveles elevados de c-Src con respecto al tejido normal.25

(23)

En cáncer de mama, la expresión y actividad de c-Src es crítica para la progresión tumoral, y la metástasis a hueso.29 Src mediante la fosforilación de “lipoma preferred partner” (LPP) regula la formación de invadopodios, así como la invasividad y metástasis a pulmón de células de cáncer de mama HER2⁺.30 En este mismo tipo de tumores se ha asociado la activación de c-Src con la resistencia a trastuzumab y lapatinib, que se emplean para tratar tumores HER2⁺.31, 32 En las células que presentan receptores de membrana como ER o HER2, su estimulación incrementa la actividad de c-Src, y sus rutas de señalización.25 El bloqueo de estos receptores reduce la señalización intracelular de c-Src, pero en TNBCs al no presentar receptores ER, PR y no sobreexpresar HER-2, el bloqueo de la actividad de c-Src es inferior.25 Sin embargo, Sánchez-Bailón y cols.

mostraron que la inhibición de la actividad catalítica de SFKs, así como la supresión de c-Src, reduce migración, proliferación e invasividad en TNBC.33, 34 Además, han descrito que c-Src en TNBC regula la secreción de proteínas en exosomas, que favorecen la generación del nicho premetastásico, además de la invasividad y migración.34, 35

Src FAK

Integrina RTK

RhoGAPp190 Paxilina p130 Shc CAS

Grb2/SOS

Ras

Raf

MEK 1/2

Erk 1/2

JNK RhoA

c-Jun

MLCK Miosina

PI3K

Akt

IKK

NFKB

VEGF

Caspasa 9

STAT3

P38 MAPK

IL-8

Supervivencia Angiogenesis Proliferación Motilidad/Migración/Invasividad

Figura 3. Esquema de los sustratos efectores de c-Src y sus efectos en la célula. Modificado de.25

(24)

El silenciamiento de c-Src por microARNs como miR-34a y miR-205 reduce la proliferación, migración e invasividad de TNBCs.36, 37 En el caso de miR205, se ha descrito también que reduce la capacidad de autorrenovación de células troncales, y el crecimiento independiente de anclaje, en TNBCs al reducir la expresión de Fyn y de Lyn.38

c-Src no solo juega un papel relevante en tumores sólidos. También se ha observado que la inhibición de c-Src/ABL en células de leucemia linfoblástica aguda induce muerte celular.39 Además, se ha demostrado el papel de c-Src en otras enfermedades como la hipertrofia cardiaca,40 trombocitopenia, mielofibrosis, sangrado, patologías de hueso,41 Alzheimer,42 etc. Todos estos estudios demuestran la importancia del estudio de c-Src en diferentes patologías.

c-Src en proliferación

La proliferación es uno de los procesos celulares que se encuentra desregularizado en las células tumorales. La actividad quinasa de c-Src induce la síntesis de ADN, y la progresión del ciclo celular mediada por receptores como EGF, PDGF y CSF-1.17 Además, se ha descrito ampliamente que c-Src incrementa la expresión de Myc a nivel de transcripción, tras su activación por PDGF-β.17, 43 Estudios recientes mostraron que c-Src promueve la proliferación en células de cáncer de mama ER⁺ estimuladas con estrógenos, mediante la estabilización del ARNm de Myc, y la inhibición de p53.44 También, la activación por prolactina de la ruta de c-Src/PI3K/AKT induce la expresión de c-Myc, y la supervivencia celular en células linfoides W53.45 Thomas y Brugge recopilaron diferentes trabajos que indicaban que c-Src participa en diferentes rutas mediadas por receptores que estimulan la síntesis de ADN a través de diferentes mecanismos en los que se incluye, la activación y fosforilación de RPTKs, la fosforilación de Shc que activa a la ruta de MAP quinasas, y la activación de PI3K.17 El complejo c-Src-FAK también participa en la regulación de la expresión de Myc y de ciclina D1 a través de las cascadas de señales que implican PI3K/AKT y MEK1-2/ERK1-2.16 Entre las integrinas activadoras de c-Src se encuentran la integrina β3, cuya interacción con el dominio SH3 de c-Src subyace a la estimulación de señales de STAT3 y FAK para promover el crecimiento del tumor.23

c-Src también está implicado en la transición de la fase G2/M. La fosforilación de c-Src por la quinasa Cdc2 en varios residuos de serina y treonina del dominio único, produce la activación de c-Src durante la mitosis.17 La inhibición de c-Src en fibroblastos de ratón en fase G2 bloquea la división celular.46 Este resultado sugiere que c-Src juega un papel importante en el paso de la fase G2 a la división celular. Por otro lado, también se ha descrito que la activación de c-Src por ER o RTKs fosforila p27 en Y-74 y Y-88.

(25)

La fosforilación de p27 por c-Src reduce la acción inhibitoria sobre la ciclina E-Cdk2, y promueve la proteólisis de p27, permitiendo la progresión del ciclo celular.47

c-Src a través de su actividad quinasa puede regular la activación de Erks y PI3K, y estas PTKs pueden participar en rutas celulares implicadas en la regulación de la supervivencia celular.17

c-Src y ROS

La producción regulada y moderada de especies reactivas de oxígeno (ROS) participa en diferentes procesos biológicos como la respuesta ante patógenos y la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la muerte.16 Diferentes estudios han mostrado que ROS puede activar a c-Src. De hecho, Lee et al. en 2018 mostraron que el incremento de ROS intracelular promueve metástasis, y migración celular al activar la señalización del complejo c-Src/FAK.48 En plaquetas humanas el tratamiento con peróxido de hidrógeno induce una rápida y fuerte activación de c-Src en un proceso dependiente de la proteína quinasa C (PKC).49 También se ha demostrado que la producción transitoria de ROS disparada por la unión de integrinas de células adherentes a la matriz extracelular induce la activación de c-Src.50 En queratinocitos humanos inmortalizados, la producción endógena de ROS promueve la proliferación mediada por la actividad de c-Src, que a su vez induce la expresión transitoria de ciclina D1.16 Todos estos resultados indican que ROS tiene un papel regulador en múltiples procesos celulares mediados por c-Src.

c-Src en migración e invasividad

c-Src transmite señales del exterior al interior celular mediante la fosforilación de sustratos efectores (Figura 3). En la transmisión de señales de c-Src es muy importante el complejo que forma con FAK.16 La activación de FAK por factores de crecimiento o por integrinas induce su autofosforilación en Y397, que a su vez sirve como un sitio de acoplamiento para proteínas que contienen dominios SH2 tales como c-Src, p85-PI3K y PLC.51 La interacción de pY397-FAK con el dominio SH2-c-Src induce la conformación abierta, y la activación de c-Src,52 que a su vez permite la activación completa de FAK.53-55 La activación del complejo c-Src-FAK conduce al reclutamiento de proteínas señalizadoras y citoesqueléticas, por lo que el complejo c-Src-FAK controla las vías desencadenadas por integrinas o factores de crecimiento que conducen a la proliferación, supervivencia, migración y reorganización del citoesqueleto.16

La integrina β5 activada por EGF (factor de crecimiento epidérmico) favorece la fosforilación de p130Cas por c-Src, activando una ruta de señales que modula la adhesión celular, y que en último termino favorece la invasividad y la metástasis.23

(26)

c-Src también tiene un papel importante en la reorganización del citoesqueleto, mediante la interacción con FAK, paxilina, PI3K, Cas, Rho GTPasa, cortactina, etc. El complejo c-Src-FAK coordina el ensamblaje del conjunto de las moléculas implicadas en la adhesión celular (p130Cas, paxilina, cortactina, etc.), así como su desacoplamiento,56 procesos muy importantes en la migración celular.

Así mismo, cabe destacar el papel de c-Src en la migración invasiva, al promover la acción de proteasas que degradan la matriz (metaloproteasas, MMP), a través de diversos mecanismos, que incluyen la activación del promotor de MMP7.57 También ERK y PI3K son señales que afectan a la expresión de MMP9,58 y la integrina α2 mediante el complejo c-Src-FAK activa las rutas p130Cas/Rac/JNK y paxilina/Rac/JNK que conducen al aumento de los niveles de MMP2 y MMP9.59 Además, parece que c-Src también incrementa la permeabilidad de células endoteliales mediada por la inducción de VEGF, facilitando así la extravasación de células tumorales a distintos sitios, lo que se traduce en la formación de metástasis.60

c-Src y CSC

Las células troncales tumorales (CSCs) se definen como células pluripotentes capaces de autorrenovarse, de formar tumores en ratones inmunodeprimidos, y de diferenciarse en otros tipos celulares.8 Además, se ha descrito que presentan resistencia a fármacos y son las responsables de la recurrencia tumoral,7 por lo que es muy importante el estudio de esta subpoblación celular. Las CSCs mamarias se caracterizan por ser CD44⁺ y CD24ˉ, y por ser capaces de formar estructuras pseudoesféricas in vitro (tumoresferas) al crecer en suspensión en un medio definido. Además, expresan marcadores de pluripotencia como Nanog, Sox2, y Oct3/4. Células CD44⁺-CD24⁺ aisladas de líneas celulares MCF-7, MDA-MB-231, y SUM159PT no son invasivas, mientras que las CD44⁺-CD24ˉ si lo son.8 Esto demostró que realmente las CSCs son las células tumorigénicas. Análisis comparativos de la firma genética de CSCs mostraron que estaban asociadas con las de células TN, sugiriendo que los tumores TN estaban enriquecidos en CSCs.8 La inhibición de c-Src/FAK y STAT3 por Shikonin reduce la expresión de marcadores de EMT, y de pluripotencia, así como la formación de tumoresferas y metástasis en células 4T1.61

c-Src en glicólisis

Las células cancerosas típicamente potencian la absorción de glucosa, la glicólisis, y la producción de lactato independientemente de la disponibilidad de oxígeno, un fenotipo conocido como glicolisis anaeróbica o efecto Warburg. El producto final de la glicólisis, piruvato, no se emplea en el metabolismo oxidativo mitocondrial en cáncer.62 Esto es

(27)

debido a que la respiración mitocondrial es la mayor fuente de ROS, y las células con fenotipo metabólico Warburg evitan la producción de ROS por oxidación de piruvato.

Lo cual limita el estrés oxidativo celular, y potencia el crecimiento tumoral, la metástasis, y la resistencia a terapias.62 Además, se ha descrito que el fenotipo Warburg incrementa las propiedades de las CSCs en mama.63

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

Frustosa-6-fosfato

Frustosa-1, 6-bisfosfato

ATP

ADP

ATP

ADP

PGI HK

PFK1

Gliceraldheído-3-fosfato Dihidroxiacetona

fosfato

1,3-Bisfosfoglicerato

3-Fosfoglicerato

2-Fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

Piruvato

Lactato

Acetil CoA

NAD+

NADH

ADP

ATP

ADP

ATP

NADH

NAD+

GAPDH FBA

PGK1

PGM

ENO

PKM2

LDH

PDH TPI1

3-Fosfohidroxipiruvato Serina

5,10-metileno THF 5-metilo THF

Metionina

SAM Síntesis

Nucleótidos Síntesis

Proteínas

THF

Ruta pentosas fosfato

Ribosa 5-fosfato

Síntesis nucleótido

NADPH

Síntesis

lípidos Estrés oxidativo

Figura 4. Esquema de la Glicolisis, en verde las proteínas que son fosforiladas por c-Src. Modificado de.64

Diferentes trabajos muestran la relación directa de la actividad quinasa de c-Src con el metabolismo celular. c-Src fosforila a hexokinasa (HK) 1 y 2, incrementando su actividad catalítica, y potenciando la glicolisis y la proliferación. Según el trabajo realizado por Zhang y cols., la actividad de estas enzimas glicolíticas es esencial para los procesos de migración, invasión y metástasis in vivo promovida por c-Src.65 Además, c-Src fosforila a Lactato deshidrogenasa A (LDHA) en Y-10 estimulando su actividad enzimática. El incremento de actividad de LDHA promueve la invasividad y metástasis en cáncer de cabeza y cuello, y en mama.66 c-Src fosforila directamente a piruvato deshidrogenasa (PDH) reprimiendo su actividad, la respiración mitocondrial, y la producción de ROS, e

(28)

incrementando la metástasis y la resistencia a quimioterapia.62 Todos estos datos muestran la importancia de c-Src en el metabolismo de las células tumorales.

Mutantes de c-Src

La proteína c-Src, como se ha descrito anteriormente, esta compuesta por distintos dominios cada uno de los cuales tiene una función específica. Mediante mutaciones puntuales por sustitución de un aminoácido se puede suprimir la funcionalidad de cada uno de estos dominios. Para la realización del presente trabajo se han generado mutantes del dominio SH3, SH2, y tirosina quinasa de c-Src. En cuanto a los dominios adaptadores SH2 y SH3, se han generado dos tipos de variantes, unos que impiden interacciones inter e intramoleculares, y otros que solo impiden las interacciones intermoleculares.67 En el dominio SH3 se ha cambiado el triptófano (W) en posición 118 por alanina (A) (W118A) para impedir las interacciones inter- e intramoleculares; mientras que la sustitución de ácido aspártico (D) en posición 99 por asparraguina (N) (D99N) bloquea las interacciones intermoleculares, pero no las intramoleculares. En el caso del dominio SH2, el cambio en posición 175 de arginina (R) por leucina (L) (R175L) suprime las interacciones inter- e intramoleculares; y la sustitución de treonina (T) por triptófano (W) en posición 215 (T215W) solo afecta a las interacciones intermoleculares. De esta manera se logran dos aproximaciones experimentales para conocer el papel de estos dominios en las células.

Por un lado, los mutantes W118A y R175L no tendrán actividad de los dominios SH3 y SH2 respectivamente, en una proteína que siempre presentará la conformación abierta, y por tanto, activa. Por otro lado, en los mutantes D99N y T215W los dominios SH3 y SH2 respectivamente no interaccionan con otras proteínas, pero la proteína puede activarse e inactivarse cambiando de conformación.

En cuanto al mutante del dominio tirosina quinasa utilizamos el mismo que González y cols. en 2006, el SrcDN. Sustituyendo la lisina (K) en posición 295 por metionina (M) (K295M), lo que impide al ATP acceder al sitio de unión y, por tanto, impide la fosfotransferencia. Además, se cambió la tirosina (Y) en posición 527 por fenilalanina (F) (Y527F), lo que hace que la proteína se encuentre constantemente abierta. Estas dos mutaciones combinadas producen lo que se ha denominado como variante dominante negativa de c-Src (SrcDN), una forma mutada de c-Src sin actividad quinasa, y con los dominios adaptadores constantemente expuestos.

Efecto de la expresión de SrcDN en las células MCF-7

Los experimentos realizados por González y cols. en 2006 mostraron que la expresión condicional mediante un sistema Tet-ON de SrcDN en MCF7 reducía la proliferación, la

(29)

migración, y la adhesión in vitro. A la vista de estos resultados obtenidos in vitro, inyectaron células MCF-7 con expresión condicional de SrcDN en ratones inmunodeprimidos. Los ratones se dividieron en tres poblaciones, una control, otra a la que se le añadió doxiciclina (Doxy) en el agua de bebida (para la expresión de la forma SrcDN) desde que se le inyectaron las células, y una última a la que a las 6 semanas se suministró la doxiciclina en el agua de bebida. Los resultados mostraron que los ratones que desde el principio habían sido tratados con doxiciclina presentaban menos tumores con respecto al control, lo que implicaba que la expresión condicional de SrcDN reducía la tumorogénesis de las células MCF7. Por otro lado, los ratones que habían empezado el tratamiento con doxiciclina a las 6 semanas mostraron una reducción del número de tumores. De manera que al inducirse la expresión de SrcDN se producía la regresión tumoral cuando los tumores ya se habían producido. Sin embargo, estos resultados no permitían determinar claramente si la reducción era debida a la disminución de la masa tumoral, o de la capacidad tumorigénica de las CSCs producida por la expresión de SrcDN.68

(30)

Objetivos

(31)

Se ha descrito ampliamente el papel de c-Src en diferentes patologías tumorales. Sin embargo, la mayor parte de los estudios se han centrado en la actividad quinasa de la proteína c-Src, y en el papel que esta juega en diferentes procesos tumorigénicos como la proliferación, migración, invasividad, etc.

Actualmente hay muy pocos estudios centrados en el estudio de c-Src sobre la capacidad de autorrenovación de la subpoblación de células troncales tumorales (CSCs), también descritas como tumorigénicas. De igual manera, el papel que juegan los dominios adaptadores SH2 y SH3 de c-Src en la tumorigenicidad mamaria no se ha analizado en profundidad.

Por ello, los objetivos específicos que aborda esta Tesis Doctoral son:

Determinar el efecto de la expresión condicional de SrcDN (K295M/Y527F) en la subpoblación de células troncales tumorales derivadas de MCF7.

Estudiar el papel de los dominios adaptadores SH2 y SH3 de c-Src sobre la tumorigenicidad de células de cáncer de mama Triple Negativo bajo en claudinas.

(32)

Material y métodos

(33)

Reactivos

Doxiciclina (Doxy), MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), hidrocortisona, leche descremada en polvo, y albumina de suero bovino (BSA) de Sigma- Aldrich (St. Louis, MI, USA). Acrilamida/Bis-acrilamida (29:1), SDS, Clarity-ECL, y persulfato de amonio de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Membranas de PVDF, y ECL de GE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, PA, USA). BCA de Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Metanol, y cloroformo de Merck Chemicals (Darmstadt, Alemania). Blasticidina, higromicina, y zeocina (InvivoGen, IBIAN Technologies, Zaragoza). Suero fetal bovino libre de tetraciclina de PAA Laboratories GmbH (Passching, Austria). Prolong, hidroetidina, B27, glutamina, penicilina, y estreptomicina de Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). EGF, y bFGF (PeproTech EC Ltd., London, UK). Anticuerpos (ver tabla 1).

Matrigel de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Vectashield de Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Agar de Difco (Detroit, MI, USA). Insulina (Lilly, SA, España).

β-Actina Monoclonal ratón Sigma-Aldrich (Merck) A5441 San Luis, MI, USA 1:15000-….-….

Cadherin-E Hibridoma rata A. Cano IIB (UAM/CSIC) 1:200-....-1:20

Cadherin-P (clone 56C1) Monoclonal ratón Novocastra Laboratories #610227 Newcastle, UK ….-….-1:200

CD44-APC Monoclonal ratón BD-Biosciences #559942FIT Franklin Lakes, NJ, USA ….-1:20-….

CD24-PE Monoclonal ratón BD-Biosciences #555428 Franklin Lakes, NJ, USA ….-1:20-….

Caveolina-pY14 Monoclonal ratón BD-Biosciences 611338 Franklin Lakes, NJ, USA 1:1000-1:50-….

Caveolina Policlonal conejo BD-Biosciences 610059 Franklin Lakes, NJ, USA 1:5000-1:500-….

Ciclina D1 (H-295) Policlonal conejo Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-753 Dallas, TX, USA 1:1000-….-….

c-Src (MAb-327) Monoclonal ratón J.S. Brugge (Harvard University) Harvard University, MA, USA 1:1000-1:50-1:50

c-Src (MAb EC10) Monoclonal ratón Millipore (Merk) #05-185 Billerica, MA, USA 1:1000-1:50-….

c-Src-pY418 Policlonal conejo Invitrogen #44660G Camarillo, CA, USA 1:1000-1:50-….

ESA-FITC Monoclonal ratón Biomeda Corp. FM010 Foster City, CA, USA …._1:20_....

Fak Policlonal conejo ThermoFisher PA5-17591 Rockford, IL, USA 1:1000-1:50-….

Fak-pY397 Monoclonal ratón BD-Biosciences #611722 Franklin Lakes, NJ, USA 1:1000-….-….

Fak-pY576 Policlonal conejo Invitrogen 44652G Camarillo, CA, USA 1:1000-….-….

GAPDH (clone 6C5) Monoclonal ratón Millipore (Merk) CB1001 Billerica, MA, USA 1:4000_...._....

Glut-1 Policlonal conejo Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-7903 Dallas, TX, USA 1:1000-….-….

HK2 Policlonal conejo Cell Signaling Technology #C64G5 Danvers, MA, USA 1:1000-….-….

ISG15 Policlonal conejo ABCAM AB-36765 Cambridge, UK 1:1000-….-….

Ki67 (clon Ki-S5) Monoclonal ratón Millipore (Merk) #MAB4190 Billerica, MA, USA ….-….-1:50

LDHA Policlonal conejo Cell Signaling Technology #3582 Danvers, MA, USA 1:1000-….-….

LDHA-pY10 Policlonal conejo Cell Signaling Technology #8176 Danvers, MA, USA 1:1000-….-….

MCT-1 Monoclonal ratón Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-365501 Dallas, TX, USA 1:1000-….-….

c-Myc Policlonal conejo Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-764 Dallas, TX, USA 1:1000-….-….

Nanog Policlonal conejo Millipore (Merk) #AB9220 Billerica, MA, USA 1:1000-….-….

Oct3/4 Policlonal cabra Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-8629 Dallas, TX, USA 1:500-….-….

p21Cip1 Monoclonal ratón BD-Biosciences #556431 Franklin Lakes, NJ, USA 1:500-….-….

p27Kip1 (Clone G173-524) Monoclonal ratón BD-Biosciences #554069 Franklin Lakes, NJ, USA 1:1000-….-….

PARP (clone C-2-10) Monoclonal ratón Biomol Gmbh SA-249 Hamburg, Gemany 1:1000-….-….

Paxillina Monoclonal ratón BD-Biosciences 610051 Franklin Lakes, NJ, USA 1:10000-1:100-….

Paxillina-pY118 Policlonal conejo Cell Signaling Technology #2541 Danvers, MA, USA 1:1000-1:50-….

PKR Monoclonal ratón Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-6282 Dallas, TX, USA 1:500-….-….

Sox2 Policlonal cabra Neuromics GT15098 Minneapolis, MN, USA 1:1000-….-….

Total OXPHOS Human WB

Antibody Cocktail cocktail de 5 anticuerpos

monoclonaes de ratón ABCAM #ab110411 Cambridge, UK 1:1000-….-….

α-Tubulina Monoclonal ratón Sigma-Aldrich (Merck) T9026 San Luis, MI, USA 1:8000-….-….

Citometría de flujo (FC)/Immunofluorescencia (IF)**

Inmunohistoquímica (IHC)***

Nombre Tipo Suministrador Nº catalogo Origen Dilución

WB-FC/IF-IHC

Inmunotrasferencia (WB)*

Tabla 1. Relación de anticuerpos empleados

(34)

Líneas celulares

MCF7 (HTB-22) y MDA-MB-231 (HTB-26) fueron obtenidas de la “American Type Cell Culture Collection” (ATCC), y SUM159PT (CVCL-5423)69 fue proporcionada por la Dr. G.

Dontu (King’s College London School of Medicine, UK). Las líneas celulares fueron negativas a micoplasma, y autentificadas por análisis con secuencias cortas repetidas en tandem (GenePrintR 10 Sistema de Promega, y GeneMapper v3.7 STR programa de análisis de perfiles de Life Technologies). Los perfiles obtenidos se compararon con las bases de datos publicas de la ATCC y DSMZ (Colección alemana de microorganismos y células en cultivo).

Los experimentos se llevaron a cabo con las línea celulares de adenocarcinoma mamario MCF-7-Tet-On-c-Src-K295M/Y527F (SrcDN = c-Src Dominante Negativo), MDA-MB-231-Tet-On-SrcDN, SUM159PT-Tet-On-SrcDN, SUM159PT-Tet-On-c-Src- W118A/R175L (c-Src-SH3ˉ/SH2ˉ), SUM159PT-Tet-On-c-Src-R175L (c-Src-SH2ˉ), SUM159PT-Tet-On-c-Src-W118A (c-Src-SH3ˉ), SUM159PT-Tet-On-c-Src-D99N/T215W (c-Src-SH2ˉ/SH3ˉ), SUM159PT-Tet-On-c-Src-T215W (c-Src-SH2ˉ), SUM159PT-Tet-On-c- Src-D99N (c-Src-SH3ˉ), y SUM159PT-Tet-On-c-Src-normal (c-Src-wt). Estás células expresan de manera condicional una forma de Src aviar, que es funcional en humanos, y detectable con el anticuerpo monoclonal EC10, específico para la forma aviar de c-Src.

Las células MCF-7 con expresión condicional de SrcDN se generaron como se describió previamente.68

Para generar las células MDA-MB-231-Tet-On-SrcDN y SUM159PT-Tet-On-SrcDN, SUM159PT-Tet-On-c-Src-R175L/Y527F, SUM159PT-Tet-On-c-Src-R175L, SUM159PT- Tet-On-c-Src-W118A, SUM159PT-Tet-On-c-Src-D99N/T215W, SUM159PT-Tet-On-c-Src- T215W), SUM159PT-Tet-On-c-Src-D99N, y SUM159PT-Tet-On-c-Src-wt, en primer lugar, las células SUM159PT se transfectaron con el plásmido pcDNA6/TR (Life Technologies) por el método del fosfato cálcico. Este plásmido contiene el represor de tetraciclina (TetR), y el gen de resistencia a blasticidina. Por ello, 48 h después de la transfección se seleccionaron las células con 6 μg/ml de blasticidina en el medio de cultivo. Los clones resistentes se crecieron, y se comprobó la expresión del TetR mediante inmunotransferencia.

En el caso de las MDA-MB-231 se utilizó el clon TR8 por presentar la máxima expresión de TetR sin cambio fenotípico aparente, y sobre este se transfectó el pcDNA4/

TO conteniendo la secuencia de SrcDN, y el gen de resistencia a zeocina. Tras la selección con 6 μg/ml de blasticidina y con 300 μg/ml de zeocina, los clones resultantes se crecieron en presencia o ausencia de 2 μg/ml de Doxy durante 72 h, y se testó la expresión de SrcDN por inmunotransferencia. Los clones que presentaban mayores

(35)

niveles de expresión de SrcDN en presencia de Doxy y no en su ausencia, se seleccionaron y mezclaron para realizar los ensayos.

En cuanto a las SUM159PT se seleccionó el clon TetR24, y sobre este se transfectó el pcDNA4/TO con la secuencia de c-Src-K295M/Y527F, c-Src-R175L, c-Src-D99N/

T215W, c-Src-D99N, c-Src-T215W y c-Src-wt, y se seleccionaron como se describió anteriormente. También se transfectó el pcDNA5/TO con la secuencia de c-Src-W118A/

R175L, y c-Src-W118A. Este plásmido es similar al pcDNA4/TO, pero con el gen de resistencia a higromicina. Las células se cultivaron en medio suplementado con 6 μg/ml de blasticidina, y con 300 μg/ml de higromicina. Los clones resultantes se crecieron en presencia y ausencia de Doxy (2 µg/ml) durante 72 h, y se examinó la expresión de los mutantes por inmunotransferencia. Los clones que presentaban mayores niveles de expresión de Src aviar en presencia de Doxy y no en su ausencia, se seleccionaron, y mezclaron para realizar los ensayos.

Cultivo celular

Las células MCF-7-Tet-On-SrcDN se cultivaron en el medio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 5 % suero bovino fetal libre de tetraciclina (Tet-Free- FBS), 2 mM glutamina, 100 IU/ml penicilina, 100 μg/ml estreptomicina, utilizando G418 y puromicina a una concentración final de 0,2 mg/ml cada uno, para mantenimiento de la expresión condicional del mutante.

Las células MDA-MB-231-Tet-On-SrcDN se cultivaron en el mismo medio que las MCF-7-Tet-On-SrcDN, salvo que se utilizaron 3 μg/ml blasticidina, y 100 μg/ml zeocina, para mantenimiento de la expresión condicional del mutante.

Las células SUM159PT se cultivaron en medio Ham’s F12 suplementado con 5 % Tet-Free-FBS, 2 mM glutamina, 100 IU/ml penicilina, 100 μg/ml estreptomicina, 5 µg/ml insulina, 1 µg/ml hidrocortisona, empleando 3 μg/ml blasticidina, y 100 μg/ml zeocina, para mantenimiento de la expresión condicional de las variantes de c-Src aviar: K295M/Y527F, R175L, D99N/T215W, D99N, T215W, y wt (cepa salvaje). Para los mutantes de c-Src W118A y W118A/R175L, expresados a través del plásmido pcDNA-5TO, se emplearon 3 μg/ml blasticidina, y 100 μg/ml higromicina, para mantenimiento de su expresión condicional.

Obtención de proteínas de extracto total

Se extrajeron las proteínas de las células adheridas a las placas previamente lavadas con PBS. Para ello, se empleó un tampón de lisis que contiene detergentes, y otros compuestos que ayudan a la rotura de las membranas celulares, e inhibidores de proteasas

(36)

y de fosfatasas (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM NaCl, 30 mM pirofosfato sódico, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,1 % SDS, 1 % Tritón X-100, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidina, 1 mM yodoacetamida, 1 mM ortho-fenantrolina). Todo el proceso se realizó a 4 °C. Las células se lisaron con ayuda de un “rascador”, los lisados se recogieron en un tubo eppendorf, y con una jeringuilla de 1 ml, y una aguja de 0,8 mm x 40 mm, se homogeneizaron. Las muestras se centrifugaron a 20.000 x g durante 30 min, los sobrenadantes se transfirieron a otro tubo eppendorf, y se determinó la concentración de proteínas mediante el método del BCA. Se igualaron las concentraciones de proteínas de las diferentes muestras del experimento con tampón de lisis, se añadió a cada una de ellas 1/5 del volumen de 5X tampón de Laemmli (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, glicerol, 0,01 % azul de bromofenol) con 5 % β-mercaptoetanol, y se hirvieron a 100 °C 5 min. Las muestras se analizaron posteriormente por electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE).

Inmunotransferencia

Se cargaron 30 μg de proteína de extractos celulares totales, equivalentes a 20-30 μl de muestras, en geles de acrilamida/bis-acrilamida/SDS entre el 8 % y el 10 %, dependiendo del tamaño molecular de las proteínas a analizar. Las proteínas se transfirieron a membranas PVDF por método semi-seco. Las membranas se bloquearon con leche descremada en polvo o albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % en TTBS (20 mM Tris/

HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) durante 1 h, posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo durante la noche a 4 °C, y a continuación, con los anticuerpos secundarios también diluidos en la solución de bloqueo durante 1-2 h a temperatura ambiente. Finalmente, se revelaron con el reactivo de quimioluminiscencia ECL, y la señal se recogió en películas fotográficas.

Aislamiento de células ESA⁺-CD44⁺-CD24ˉ/baja (CD24ˉ) y ESA⁺-CD44⁺-CD24⁺ (CD24⁺) y cultivo

A partir de la línea celular parental MCF-7-Tet-On-SrcDN, se aislaron células ESA⁺-CD44⁺-CD24ˉ (en adelante CD24ˉ), conocidas como población enriquecida en células troncales tumorales (CSC), y las ESA⁺-CD44⁺-CD24⁺ (en adelante CD24⁺), consideradas como no tumorigénicas. La subpoblación enriquecida de células CD24ˉ, y células CD24⁺, se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) como se describió previamente.70 Brevemente, se despegaron las células parentales de las placas de cultivo con Versene (5 min, 37 °C), y se marcaron simultáneamente 1x107 células con anticuerpos contra ESA-FITC, CD44-APC y CD24-PE. Posteriormente, las células se lavaron, y se sometieron a FACS con un clasificador de células FACS-

(37)

Vantage (BD, San Jose CA) equipado con un láser de ion argón (emisión a 488 nm) y un láser He-Ne (emisión a 633 nm), y se recogieron en base a las señales de los fluorocromos empleados usando filtros de paso de banda 530 nm (FITC), 575 nm (PE) y 660 nm (APC). Alrededor del 1,6 % de la población celular total mostró el fenotipo CD24ˉ (ESA⁺-CD44⁺-CD24ˉ/baja), y se aisló. En paralelo, el 50 % superior del 98,4 % de las células ESA⁺-CD44⁺-CD24elevado también se aisló, tal como se ha descrito.70

Ensayo tumorigenicidad in vivo

Se usaron ratones hembra atímicos desnudos-Foxn1nu de 6-8 semanas de edad (Harlan Laboratories). Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos, en una habitación con temperatura controlada, en un horario de 12/12 h de luz/oscuridad, con comida, y agua, ad libitum. Los procedimientos experimentales, de manejo y alojamiento de los animales llevados a acabo para la realización de este ensayo están basados en la última directiva europea 2010/63/UE y el Real Decreto 53/2013, garantizando así la protección de los animales y su bienestar.

A cada ratón se le implantó 1,7 mg de la píldora de 17β-estradiol (60 días de liberación continua, Innovative Research of America) para complementar el requerimiento de estrógenos para la proliferación de MCF-7. Una semana después de la implantación, se inyectaron 1x104 células CD24ˉ viables por vía subcutánea en el flanco posterior izquierdo, y 5x105 células CD24⁺ viables en el flanco posterior derecho de cada ratón. Los ratones se dividieron en dos grupos experimentales, cada uno de 9 animales. El grupo 1 (control) nunca recibió doxiciclina (Doxy) con el agua potable de bebida, mientras que el grupo 2 recibió Doxy (2 mg/ml) diluida en el agua potable desde el primer día tras la inyección de las células. Las botellas de agua se cambiaron cada 3 días. Los tumores se midieron con un calibre Vernier, semanalmente, y sus volúmenes se calcularon usando la fórmula LxWxHx0.52. Seis semanas después de la inyección de las células, se sacrificaron los ratones.

Inmunohistoquímica de xenoinjertos

Los ratones no tratados y tratados con Doxy, se sacrificaron por dislocación cervical seis semanas después de la implantación de las células tumorales, y se extrajeron los tumores. Las muestras tumorales se congelaron en nitrógeno líquido, y/o se fijaron inmediatamente después de la resección quirúrgica, en una solución de formaldehído al 4 % en PBS. Las muestras fijadas se incluyeron en parafina, y las secciones de 5 μm se analizaron mediante tinción con hematoxilina/eosina, tal como se ha descrito.71 También se realizó tinción inmunohistoquímica para Ki67, y c-Src total.

Referencias

Documento similar

To investigate the role of autophagy in otic neurogenesis, we studied the expression of autophagy genes in early stages of chicken (Gallus gallus) inner ear development and

a) To systematically review the indicators of PPF in breast cancer. i) To study the associations between the main constructs from positive psychology and breast cancer. ii)

We demonstrated some biological properties of these CaM mutants, such as their differential phosphorylation by the tyrosine kinase c-Src, and their action as compared

Given the much higher efficiencies for solar H 2 -generation from water achieved at tandem PEC/PV devices ( > 10% solar-to-H 2 energy efficiency under simulated sunlight) compared

TipC and the chorea-acanthocytosis protein VPS13A regulate autophagy in Dictyostelium and human HeLa cells.. Sandra Muñoz-Braceras a , Rosa Calvo a & Ricardo

The purpose of this study is to investigate the differential expression pattern of circRNAs in three different development stages of human thymocytes, including mature

Here we study the role of SFKs catalytic activity in triple-negative/basal-like and metastatic human breast cancer MDA-MB-231 cells employing three well-established

Even though the 1920s offered new employment opportunities in industries previously closed to women, often the women who took these jobs found themselves exploited.. No matter