Cultivo de tejidos vegetales (CTV)

-

Cultivo de tejidos vegetales (CTV)

Dra. Marisa LOPEZ BILBAO [email protected] Instituto de Biotecnología, INTA

AGROBIOTECNOLOGIA

CURSO 2017

El fundamento del CTV se basa en la teoría de la totipotencialidad celular.

Esta teoría sostiene la posibilidad de obtener una planta entera a partir de cualquier célula viva, bajo condiciones controladas de cultivo.

Requisitos:

1° lograr la desdiferenciación (pérdida de las características de especialización de la célula hasta un estado de desdiferenciación meristemática).

2° continuar con la rediferenciación de esta célula de partida, para lograr variadas respuestas morfogenéticas tales como la obtención de un callo, la regeneración de brotes o primordios de raíz, etc.

La expresión cultivo de tejidos vegetales (CTV) o cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial.

Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales:

- la asepsia (ausencia de gérmenes)

- el control de los factores que afectan el crecimiento

Gottlieb Haberlandt (1898) aisló células y tejidos de plantas superiores y las colocó en soluciones nutritivas para su crecimiento y estudio, dando origen de esta manera a la técnica de cultivo de células y tejidos vegetales.

Explante o explanto: se denomina así a la parte del órgano o tejido vegetal que se cultiva in vitro

Las plantas continuamente responden a señales o estímulos, externos e internos, que usan para alterar su fisiología, morfología y desarrollo: luz, nutrientes minerales, compuestos orgánicos, agua, suelo, calor, frío, reguladores de crecimiento vegetal, pH, gases (CO₂, O₂, C₂H₄)

Por lo que deben considerarse los siguientes factores cuando se desean establecer cultivos in vitro :

a) fuente de explantos (nombrar ejemplos)

b) constituyentes nutricionales inorgánicos y orgánicos del medio de cultivo, c) temperatura, luz y pH

d) PGR ( reguladores del crecimiento de plantas)  Auxinas estimulan el crecimiento por elongación celular

 Citocininas estimulan el crecimiento por división celular.

Objetivos perseguidos con la utilización del CTV :

a) estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines b) bioconversión y producción de compuestos útiles

c) obtención de plantas libres de patógenos e) propagación masiva de plantas

f) conservación e intercambio de germoplasma g) obtención de plantas transgènicas

Sistemas de micropropagación vegetal

Proliferación de yemas axilares o apicales Cultivo de meristemas

Cultivo de suspensiones celulares y de protoplastos

Liberación de patógenos

«Especialidades» o usos especificos del CTV

Micropropagación vegetal

Presenta numerosas ventajas:

- Propagación vegetativa rápida y a gran escala - Uniformidad seleccionada del material clonado

- Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales

- Reducción en el tiempo de multiplicación y el espacio requerido para tal fin - Mayor control sobre la sanidad del material propagado

- Introducción rápida de nuevos cultivares - Conservación de germoplasma

- Facilidades para el intercambio internacional del material vegetal.

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del CTV Consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de Cultivo de Tejidos.

Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

Requiere:

 una infraestructura mínima especializada

 condiciones controladas de cultivo

Compuestos inorgánicos

Macronutrientes: NO₄^-, PO₄^3- , K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, SO₄^2-

Micronutrientes: Fe²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Mo²⁺, Co²⁺, I^-

Carbohidratos

Sacarosa, glucosa, mio-inositol

Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina

Acido nicotínico (C) Biotina

Aminoácidos Glicina

Reguladores del crecimiento Auxinas

Citocininas Giberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%)

Gelrite^®

pH

5,6 – 5,8

Esterilización

1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave

Medios de cultivo: composición general

• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener

importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

- Cultivo de protoplastos

- Cultivo de suspensiones celulares

Consistencia

del medio

Semisólido

Líquido

Propiedades físicas de los medios de cultivo

• Intercambio gaseoso:

La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.

- La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno

- La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes

Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno / film “de cocina”/ Parafilm/ tapones de algodón, para posibilitar el intercambio de gases.

• pH:

- Constituye un factor crítico - Se ajusta en el rango 5,5-5,8

- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

Propiedades físicas de los medios de cultivo

Ejemplo aluminio

Composición de medios de cultivo comúnmente usados

8,6 1

2 1

- ZnSO₄.7H₂0

- -

0,025 0,2

- CuSO₄

6,2 1

3 5

- H₃BO₃

- -

10 10

- MnSO₄.H₂O

- 600

- -

- NaNO₃

1.900 -

300 2.500

81 KNO₃

- -

- -

142 Ca(NO₃)₂

- -

134 -

- (NH₄)₂SO₄

- -

- 300

- NH₄H₂PO₄

1.650 -

- -

- NH₄NO₃

- 750

- -

65 KCl

440 75

150 200

- CaCl₂.2H₂O

370 250

500 400

74 MgSO₄.7H₂O

22,3 0,1

- -

- MnSO₄.4H₂O

- 125

150 -

- NaH₂PO₄.H₂O

170 -

- -

12 KH₂PO₄

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

- 0,03 0,01 Heller

0,25 0,25

0,1 -

NaMoO₄.2H₂O

0,025 -

- -

CuSO₄.5H₂O

0,83 0,75

1 -

KI

Murashige y Skoog Gamborg

(B₅ Schenk y

Hildebrandt (SH) White

8,6 1

2 1

- ZnSO₄.7H₂0

- -

0,025 0,2

- CuSO₄

6,2 1

3 5

- H₃BO₃

- -

10 10

- MnSO₄.H₂O

- 600

- -

- NaNO₃

1.900 -

300 2.500

81 KNO₃

- -

- -

142 Ca(NO₃)₂

- -

134 -

- (NH₄)₂SO₄

- -

- 300

- NH₄H₂PO₄

1.650 -

- -

- NH₄NO₃

- 750

- -

65 KCl

440 75

150 200

- CaCl₂.2H₂O

370 250

500 400

74 MgSO₄.7H₂O

22,3 0,1

- -

- MnSO₄.4H₂O

- 125

150 -

- NaH₂PO₄.H₂O

170 -

- -

12 KH₂PO₄

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

- 0,03 0,01 Heller

0,25 0,25

0,1 -

NaMoO₄.2H₂O

0,025 -

- -

CuSO₄.5H₂O

0,83 0,75

1 -

KI

Murashige y Skoog Gamborg

(B₅ Schenk y

Hildebrandt (SH) White

Composición de medios de cultivo comúnmente usados

5,8 5,5

5,9 pH

- -

1 0,5

- Piridoxina-HCl

- 0,03

- -

- NiCl₂.6H₂O

- 0,03

- -

- AlCl₃

0,025 -

0,025 0,1

- CoCl₂.6H₂O

- -

- -

2,46 Fe(SO₄)₃

27,86 -

- 15

- FeSO₄.7H₂O

- 1

- -

- FeCl₃.6H₂O

100 -

100 1.000

- Mio-inositol

37,26 -

- 20

- Na₂EDTA

- -

28 -

- Sequestrene 330 Fe

- -

- -

Extracto de 100 Levadura

- -

1 5

- Acido nicotínico

0,4 -

10 5

- Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

- Heller

30.000 20.000

30.000 20.000

Sacarosa

Murashige y Skoog (MS) Gamborg

B₅ Schenk y

Hildebrandt (SH) White

5,8 5,5

5,9 pH

- -

1 0,5

- Piridoxina-HCl

- 0,03

- -

- NiCl₂.6H₂O

- 0,03

- -

- AlCl₃

0,025 -

0,025 0,1

- CoCl₂.6H₂O

- -

- -

2,46 Fe(SO₄)₃

27,86 -

- 15

- FeSO₄.7H₂O

- 1

- -

- FeCl₃.6H₂O

100 -

100 1.000

- Mio-inositol

37,26 -

- 20

- Na₂EDTA

- -

28 -

- Sequestrene 330 Fe

- -

- -

Extracto de 100 Levadura

- -

1 5

- Acido nicotínico

0,4 -

10 5

- Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

- Heller

30.000 20.000

30.000 20.000

Sacarosa

Murashige y Skoog (MS) Gamborg

B₅ Schenk y

Hildebrandt (SH) White

Ahora uno compra los medios de cultivo

(hay muchísimas combinaciones!)

Reguladores del crecimiento comúnmente usados en medios de cultivos vegetales/ PGR/ Fitoreguladores/ Hormonas vegetales

10^-7-10^-5 215,2

6-furfurilaminopurina K (kinetina)

10^-7-10^-5 203,3

2iP

N-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábil

y no debería ser autoclavada Las citoquininas

son normalmente disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso 10^-7-10^-5

225,2 BAP

6-bencilaminopurina Citoquininas

10^-7-10^-5 175,2

AIA Acido indol 3-acético

10^-7-10^-5 221,0

2,4-D Acido 2,4-

diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células vegetales. Es frecuentemente usado

como única fuente de auxinas en el medio

de cultivo Las auxinas son

usualmente tituladas en solución con

NaOH 10^-7-10^-5

186,6 pCPA

Acido clorofenoxiacético Auxina

10^-7-10^-5 202,2

NOA Acido-naftoxiacético

10^-7-10^-5 186,2

Acido 1-naftalenoacético NAA

10^-7-10^-5 203,2

Acido 3-indolbutírico IBA

10^-7-5x10^-6 10^-7-10^-5 Rango de concentración

(M)

Soluble en agua Preparación de

solución stock

Es termolábil, no debe ser autoclavada. Es comúnmente necesario

para la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensión. Algunas veces necesario para la

regeneración de plántulas.

364,4 GA3

Acido giberelico Giberelina

219,2 Zea

Zeatina

Comentarios Peso

Molecular Abreviatura

Nombre Clase

10^-7-10^-5 215,2

6-furfurilaminopurina K (kinetina)

10^-7-10^-5 203,3

2iP

N-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábil

y no debería ser autoclavada Las citoquininas

son normalmente disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso 10^-7-10^-5

225,2 BAP

6-bencilaminopurina Citoquininas

10^-7-10^-5 175,2

AIA Acido indol 3-acético

10^-7-10^-5 221,0

2,4-D Acido 2,4-

diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células vegetales. Es frecuentemente usado

como única fuente de auxinas en el medio

de cultivo Las auxinas son

usualmente tituladas en solución con

NaOH 10^-7-10^-5

186,6 pCPA

Acido clorofenoxiacético Auxina

10^-7-10^-5 202,2

NOA Acido-naftoxiacético

10^-7-10^-5 186,2

Acido 1-naftalenoacético NAA

10^-7-10^-5 203,2

Acido 3-indolbutírico IBA

10^-7-5x10^-6 10^-7-10^-5 Rango de concentración

(M)

Soluble en agua Preparación de

solución stock

Es termolábil, no debe ser autoclavada. Es comúnmente necesario

para la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensión. Algunas veces necesario para la

regeneración de plántulas.

364,4 GA3

Acido giberelico Giberelina

219,2 Zea

Zeatina

Comentarios Peso

Molecular Abreviatura

Nombre Clase

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscísico - Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su

concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Reguladores del crecimiento

• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas.

- Alargamiento y división celular

- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias

- Dominancia apical - Acción herbicida

- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:

- Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

N

OH O

Acido indol acético (AIA) (auxina endógena)

Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación

celular y la

inducción de la

morfogénesis

• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.

• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

- Promoción de la división celular

- Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas)

- Retardo de la senescencia

- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citoquininas endógenas:

- Zeatina (Zea)

- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:

- Kinetina (Kin)

- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.

• Su transporte es no polar.

Las citoquininas determinan

diferentes respuestas

morfogenéticas en

combinación con las

auxinas

• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban

marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada.

En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales

- Crecimiento de yemas latentes

- Germinación de semillas en dormición - Floración

- Movilización de reservas en la semilla

• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el

alargamiento de los entrenudos de los brotes

O

H

CH₃ H COOH H

HO OH

CH₃ C O

Acido giberélico (GA3)

Elección de una planta madre selecta

Explantos

Desinfección superficial

Establecimiento en medio de cultivo apropiado

Transferencia a un medio de multiplicación

Formación de brotes o embrioides

Transferencia a un medio para el enraizamiento de

los brotes

Pasaje a maceta en un invernáculo

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

ETAPA 4

El proceso de micropropagación de

especies vegetales consta de varias etapas

Km

Rooting Greenhouse

Re1

Re2

Re3

Re4

RA Transformation

protocol

Agroinfection &

Co-culture

Transient GUS Assay

• Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Tritón X100.

Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio

(HgCl

), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H

O estéril (4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl

, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

PPM™ (Plant Preservative Mixture) is a broad-spectrum preservative and biocide, which kills bacteria and fungi cells, prevents germination of spores, and in higher concentrations, can eliminate endogenous contamination in explants.

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro

- La organogénesis es de origen pluricelular.

Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia

inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal.

mosaico

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.

Una célula del explanto constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que

completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Sistemas de micropropagación vegetal

Proliferación de yemas axilares o apicales

Cultivo de meristemas

• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partir

de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de

dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.

Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año a partir de una única yema inicial.

- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.

Propagación vegetativa a

partir de yemas

preexistentes

Cultivo de meristemas El empleo de

meristemas

como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas

infectadas

Meristema apical

Meristema axilar

Domo

meristemático

•

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Los meristemas son grupos de células

indiferenciadas que retienen

la capacidad de dividirse

durante todo el ciclo de vida

de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de

la planta y dan origen a sus diferentes órganos

- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menor

en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de meristemas facilita la

eliminación de

patógenos

Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides.

El cultivo de

tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas

vegetativamente

Partículas de Potato virus Y

El material vegetal infectado por virus,

bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:

• Termoterapia

• Quimioterapia

• Cultivo de meristemas

Estos tratamientos pueden usarse por

separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina,

trabajando in vivo e in vitro.

El tratamiento de plantas

madres puede

efectuarse

por distintas

técnicas

• Las plantas regeneradas in vitro deben ser

evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patógeno considerado.

• Estas pruebas se denominan ensayos de

indización (indexing) y difieren según el sistema huesped-patógeno de que se trate.

• Se incluyen entre estas pruebas:

- Selección visual u observación de síntomas - Empleo de hospedantes indicadores

- Métodos serológicos - Microscopía electrónica

La metodología

de saneamiento

empleada debe

ser evaluada

http://www.biofabrica.com.ar/

Caña de azúcar Mandioca

Eucalyptus grandis Banano (Musa sp)

Dendrobium phalaenopsis

Asistencia Tecnológica a Campo:

Nuestros profesionales están capacitados para asistir al cliente en el manejo, recomendaciones y seguimiento del desarrollo de los productos en campo.

Análisis Fitopatológico de Cultivos:

Tenemos un laboratorio de microbiología preparado para recibir muestras de plantas enfermas para su respectivo Análisis con Diagnóstico y recomendaciones de Control Fitosanitario.

Análisis de Suelo:

Ofrecemos un servicio de Análisis de Suelo “in situ” de los principales nutrientes de forma práctica que permita la toma de decisión en el manejo de los cultivos en corto espacio de tiempo.

Diagnóstico Molecular:

Hacemos Diagnóstico Molecular de las principales enfermedades de la Caña de Azúcar, permitiendo al cliente tener la seguridad de propagar material vegetal sano.

Conservación de germoplasma

Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos.

Conservación de germoplasma

• Colecciones in vitro

• Bancos de semillas

• Crioconservación

métodos para la conservación

de germoplasma

• La conservación de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitación del crecimiento del material vegetal.

• Implementación:

- Medios de cultivo de composición subóptima - Baja intensidad lumínica (<500 lux)

- Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las células y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)

- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol)

Bancos de germoplasma in vitro

• Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento.

• El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cámara de mantenimiento:

- Bajas temperaturas

- Bajo contenido de humedad

• Este método no puede aplicarse a la conservación de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagación vegetativa obligada

Los bancos de semilla permiten la conservación de especies

vegetales que

se propagan

sexualmente

• Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC), por inmersión en nitrógeno líquido

• Diferentes explantos (ápices de yemas,

meristemas, anteras, embriones inmaduros) así como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a

-196 ºC.

Crioconservación de germoplasma

Etapas del proceso de

crioconservación de material

vegetal

Cultivo de protoplastos

Los protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular

Suspensión de protoplastos de mesófilo de tabaco

Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación.

Obtenciòn

• Protocolo para la obtención de protoplastos . de mesófilo de hoja de tabaco:

- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes de tabaco).

- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmótico.

- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporción 1:1.

- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 h en oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm.

Observar la liberación de los protoplastos en un microscopio invertido.

- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin.

- Remover el sobrenadante y resuspender los protoplastos en medio de cultivo.

Variación somaclonal

Causas:

• Modificaciones genéticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro

• Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos quiméricos y de mosaicos

• Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composición del medio, etc.)

• Aneuploides no separables en el cultivo

La variación somaclonal

puede explicar la variación

fenotípica

de las plantas regeneradas in vitro

Otra posibles causas de la

variabilidad de las plántulas

regeneradas

• Indeseable en la micropropagación de plantas de interés comercial (diversidad genotípica)

• Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas

modificaciones del material genético (variabilidad)

Características de la variación somaclonal

Cultivo in vitro de células haploides

y embriones

• Mejoramiento vegetal.

• Estudios de genética cuantitativa.

• Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones.

Aplicaciones del cultivo in vitro

de células haploides

Tétradas de microsporas Sacos polínicos

(con granos de polen)

Consiste en el cultivo de anteras inmaduras

en medios sintéticos que promueven la división celular y la formación de embriones o callos.

Los embriones, transferidos a un medio

de regeneración, darán lugar a plantas haploides.

Cultivo in vitro de anteras

anteras

- Genotipo de las plantas donantes

- Fisiología de las plantas donantes

- Caracterización citológica y bioquímica de etapas muy tempranas del desarrollo de los granos de polen

- Pretratamiento de las anteras con altas o bajas temperaturas o con choque

osmótico

- Medios de cultivo con alto contenido en osmóticos para la inducción de callos y menores concentraciones de sacarosa para la regeneración de plantas

Condiciones que afectan el cultivo

de anteras

- Permite la expresión e identificación de alelos recesivos

- Constituye una fuente útil para el mejoramiento intravarietal

- Permite la rápida introducción de caracteres citoplasmáticos en un fondo genético homocigótico

- Crea y acrecienta las reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los cultivos

- La obtención de haploides duplicados resulta útil para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y para ensayarlas en ellos.

- Las microsporas o células haploides pueden usarse para la inducción de mutantes y para la selección de caracteres esporofíticos.

El cultivo de anteras ofrece numerosas

ventajas para el

mejoramiento

de plantas de

interés comercial

• Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo.

• Rescate de embriones híbridos derivados

de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos.

• Produción de monoploides.

• Superación de la latencia de las semillas.

El cultivo

de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones

Embrión cigótico

Corte longitudinal de una semilla de Brassica

Embriones somáticos (es) obtenidos a partir del cultivo de óvulos de Arabidopsis.

• Rescate de embriones (mediante polinización y fertilización in vitro)

• Inducción de la embriogénesis somática a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.

Aplicaciones del cultivo de óvulos

es

Semillas sintéticas

Semillas sintéticas

Embriones somáticos de Pinus sp

Las semillas artificiales

reproducen la estructura de una semilla de origen sexual

Las semillas artificiales poseen una cubierta de protección, contienen sustancias de reserva y portan un embrión en su interior.

Procedimiento para

encapsular

embriones

somáticos