Identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en la interacción no compatible Musa acuminata (AA) genotipo 'Calcutta 4' Mycosphaerella fijiensis Morelet

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(1)TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL. Título: Identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en la interacción no compatible Musa acuminata (AA) genotipo 'Calcutta 4'- Mycosphaerella fijiensis Morelet.. Autor: Lic. Milady Francisca Mendoza Rodríguez Tutor: Dr. Elio Jiménez González. Santa Clara, CUBA 2008.

(2) TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL. Título: Identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en la interacción no compatible Musa acuminata (AA) genotipo 'Calcutta 4'- Mycosphaerella fijiensis Morelet.. Autor: Lic. Milady Francisca Mendoza Rodríguez Tutor: Dr. Elio Jiménez González. Santa Clara, CUBA 2008.

(3) Dedico este trabajo a: Mis padres y hermanas, por su cariño y apoyo incondicional..

(4) Después de culminar el presente trabajo, quisiera agradecer: Al consejo de Universidades Flamencas de Bélgica a través del programa de cooperación institucional. A mis compañeros del Laboratorio de Biología Molecular, María. I. Oloriz, Bárbara Ocaña, Neyda Bacallao, Luis Rojas, Orelvis Portal, Aminael Sánchez, José M. Machado, Eduardo Cruz, María J. Manso por el apoyo constante y dedicación. Al Dr. Elio Jiménez por todos los consejos y constante preocupación por mi superación profesional. A los compañeros del Laboratorio de Fitopatología Yelenys Alvarado, Michel Leiva, Berkis Roque y Mayra Acosta por todo el apoyo brindado. A todos los trabajadores del IBP que de una forma u otra han propiciado la culminación de esta investigación. A mis padres, hermanas, por todo su amor y apoyo constante. A mis buenos amigos y amigas, José A. Cabezas, Hernán Laurentín, Ana Rodrigo, Nayuf Valdéz, Silvia Schrey y Miladis León. A todos,. Muchas Gracias.

(5) RESUMEN La enfermedad de la Sigatoka negra producida por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet (teleomorfo) (Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton, anamorfo), se considera la enfermedad foliar mas destructiva y costosa a nivel mundial que afecta la producción de bananos y plátanos. El estudio de los genes involucrados en la respuesta de defensa en la planta ante el ataque de patógenos, constituye un paso importante para la elucidación de los mecanismos moleculares de resistencia a enfermedades. En este trabajo se obtuvo una biblioteca sustractiva de ácido desoxirribonucleico complementaria que contiene secuencias expresadas diferencialmente en el genotipo resistente 'Calcutta 4' ante la infección con M. fijiensis (6 a 12 días posteriores a la inoculación), la cual consta de un total de 600 clones recombinantes, con longitud de inserto entre 100 y 1 400 pares de bases (pb) y una longitud promedio de 537 pb. Como resultado del ensamblaje con la herramienta bioinformática CAP3, de 97 secuencias de la biblioteca sustractiva fueron obtenidas 63 secuencias blanco expresadas, que incluían 42 secuencias aisladas y 21 ensamblajes. La identificación de las mismas según su homología con secuencias anotadas en la base de datos para proteínas no redundante (GenBank), permitió agruparlas en: destino de proteínas (1,6%), estrés oxidativo (4,8%), metabolismo (6,3%), producción de energía (6,3%), función desconocida (38,1%) y sin homología (42,8%)..

(6) Índice INDICE 1. INTRODUCCIÓN................................................................. ¡Error! Marcador no definido. 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..............................................................................................1 2.1 Generalidades del cultivo..............................................................................................1 2.1.1Origen y distribución del género Musa ....................................................................1 2.1.2 Taxonomía y diversidad genética...........................................................................1 2.1.3 Características del banano silvestre diploide 'Calcutta 4' (Musa acuminata ssp. burmannicoides) .............................................................................................................2 2.1.4 Importancia de los plátanos y bananos ..................................................................4 2.2 Enfermedades en Musa spp. ........................................................................................4 2.2.1 Las manchas foliares .............................................................................................5 2.3 Sigatoka negra .............................................................................................................5 2.3.1 Agente causal ........................................................................................................5 2.3.2 Origen y distribución ..............................................................................................7 2.3.3 Epifitiología ............................................................................................................8 2.3.4 Modo de infección, síntomas y control ...................................................................8 2.4 Generalidades acerca de la interacción planta-patógeno............................................10 2.4.1 Respuesta de defensa .........................................................................................12 2.5 Tipos de resistencia ....................................................................................................12 2.6 Modelo de resistencia propuesto para genotipos resistentes en Musa spp. ................13 2.7 Técnicas moleculares empleadas para el estudio de interacciones hospedante patógeno. .........................................................................................................................14 2.8 Utilización de herramientas bioinformáticas ................................................................18 3. MATERIALES Y METODOS. ...........................................................................................21 3.1 Obtención de transcritos expresados diferencialmente en la interacción 'Calcutta 4'- M. fijiensis. ............................................................................................................................22 3.1.1 Purificación de ARN total y ARNm. ......................................................................22 3.1.2 Construcción de la biblioteca sustractiva. ............................................................24 3.2 ESTs: determinación de posible función biológica. .....................................................26.

(7) Índice 3.2.1 Secuenciación de los clones de la biblioteca y análisis de ESTs. .......................27 3.2.2 Ensamblaje de ESTs. ..........................................................................................28 3.2.3 Identificación de ESTs. ........................................................................................28 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ........................................................................................30 4.1 Obtención de transcritos expresados diferencialmente en la interacción 'Calcutta 4'- M. fijiensis. ............................................................................................................................30 4.1.1 Purificación de ARN total y ARNm. ......................................................................30 4.1.2 Construcción de la biblioteca sustractiva. ............................................................32 4.2 ESTs: determinación de posible función biológica ......................................................34 4.2.1 Secuenciación de los clones de la biblioteca y análisis de ESTs .........................34 4.2.2 Ensamblaje de ESTs ...........................................................................................35 4.2.3 Identificación de ESTs. ........................................................................................46 5. CONCLUSIONES.............................................................................................................59 6. RECOMENDACIONES ....................................................................................................60 7. BIBLIOGRAFÍA.

(8) Introducción 1. Introducción Los bananos y plátanos (Musa spp.), son cultivos de gran importancia para la alimentación de millones de personas y tienen un papel fundamental en la economía de los países en vías de desarrollo. Se cultivan en más de 130 países, en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Aert et al., 2004) y son utilizados más de 10 millones de hectáreas para su cultivo (Marín et al., 2003). Forman parte de la dieta alimentaría de más de 400 millones de personas y se ubican en el cuarto renglón en la categoría de productos alimenticios después del arroz, del maíz y el trigo (FHIA, 2007). Estos cultivos se encuentran severamente afectados por plagas y enfermedades, entre las cuales la Sigatoka negra, causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet se considera la enfermedad foliar más destructiva y costosa a nivel mundial (Carlier et al., 2000). La misma produce pérdidas del área fotosintética, tanto por la acción del patógeno como de sus toxinas difundidas (Mourichon, 1995) y en los rendimientos entre un 20 y 90% (Etebu et al., 2005). La aparición de la enfermedad Sigatoka negra a nivel mundial, así como en Cuba (Álvarez, 1997), ha tenido un gran impacto en la esfera económica, ya que se ha producido un aumento en los costos de las producciones de bananos y plátanos, asociado fundamentalmente con la compra de agroquímicos (fungicidas), los cuales constituyen la vía principal para el control de la enfermedad (Gómez et al., 2004). La búsqueda de resistencia a esta enfermedad, ha sido la prioridad en las investigaciones realizadas en el género Musa. Por el método convencional de cruzamiento en La Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA), fueron obtenidos híbridos con diferentes niveles de resistencia (Pérez et al., 2002); sin embargo, desde el punto de vista comercial no tienen gran aceptación y a través de la biotecnología de plantas, aún no se han logrado resultados satisfactorios (Swennen et al., 2004). A pesar de todos los esfuerzos realizados en la comunidad científica internacional para lograr este objetivo, aún no se cuenta con variedades comerciales resistentes, por lo que la temática continúa como una línea de investigación de gran importancia.. 1.

(9) Introducción La utilización de técnicas de biología molecular e ingeniería genética, se presentan como herramientas útiles en los estudios relacionados con la resistencia a patógenos en plantas (Tripathi, 2003). Dentro de ellas la transformación genética, tanto por pistola de genes (Becker et al., 2000), como mediada por Agrobacterium tumefaciens (Ganapathi et al., 2001; Tripathi et al., 2005; Pérez et al., 2006); con el empleo de genes reporteros o que codifican para proteínas antifúngicas ha sido y continua como una de las estrategias a seguir, para la obtención de plantas transgénicas con resistencia a hongos (Sreeramanan et al., 2006). Las investigaciones en el género Musa, han estado encaminadas al estudio de los genomas, así como de los genes expresados en la interacción Musa-M. fijiensis, como aspecto importante en la búsqueda de nuevas fuentes (genes) de resistencia a este patógeno. Para este propósito, varias técnicas moleculares han sido utilizadas, con el objetivo de determinar los patrones de transcripción o para la identificación de genes regulados diferencialmente, las cuales parten de la purificación inicial de ácido ribonucleico total (ARN total). Dentro de ellas están: el despliegue diferencial de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y reverso transcripción (DDRT-PCR, del inglés Differential Display Reverse Transcription) (Liang y Pardee, 1992), el análisis serial de expresión génica (SAGE, del inglés Serial Analysis of Gene Expression) (Velculescu et al., 1995), los polimorfismos para la longitud de los fragmentos amplificados basado en las huellas de ARNm (cDNA-AFLP, del inglés Complementary Deoxyribonucleic Acid-Amplified Fragment Length Polymorphism) (Bachem et al., 1996), hibridación sustractiva por supresión (SSH, del inglés Suppression Subtractive Hybridization) (Diatchenko et al., 1996) y los microarreglos (Microarrays, del inglés) (Brown y Botstein, 1999). A pesar del empleo de diversas técnicas moleculares en el estudio del género Musa, el desarrollo alcanzado en el área de la genómica (específicamente en la construcción de bibliotecas); ha sido la estrategia fundamental en las investigaciones relacionadas con la búsqueda de fuentes de genes de resistencia. Varias bibliotecas genómicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) han sido obtenidas, a partir de genotipos resistentes a la enfermedad Sigatoka negra. Entre ellas están: en Musa. 2.

(10) Introducción acuminata subsp. burmannicoides 'Calcutta 4' (Vilarinhos et al., 2003); Musa balbisiana 'Pisang Klutuk Wulung' (Šafá et al., 2004) y Musa acuminata 'Tuu' (Ortiz et al., 2005), cuyo número total de clones fue de 122 716, con una talla de inserto promedio de 100, 135 y 100 kilobases (kb) respectivamente. Aún cuando ha sido obtenida por esta vía gran información acerca del genoma, solo han sido publicados resultados parciales de la secuenciación de 6 252 clones (Aert et al., 2004; Cheung y Town, 2007). Sin embargo, el empleo de la biblioteca de ácido desoxirribonucleico complementaria (ADNc), específicamente del tipo sustractiva, ha resultado ser la herramienta molecular más poderosa y efectiva para la búsqueda de genes relacionados con la respuesta de defensa en la planta. La técnica ofrece la ventaja de poder obtener fragmentos específicos, entre dos poblaciones de ARNm. Por un lado se logra normalizar la abundancia de los ADNc “blancos” (expresados diferencialmente) y simultáneamente suprimir la amplificación de secuencias comunes entre las poblaciones, además constituye una vía rápida, para descubrir e identificar nuevos genes (Diatchenko et al., 1996). Por los motivos expuestos anteriormente ha sido de gran aceptación en estudios de biología molecular, para la clonación de genes desconocidos, especialmente si el mensaje de interés es poco abundante y diferencialmente expresado entre dos poblaciones de células. En Musa, la realización de bibliotecas sustractivas ha sido utilizada para la obtención de genes expresados diferencialmente ante factores de origen biótico (específicamente a patógenos) y abióticos. Solo ha sido referida una a partir del patosistema Musa-M. fijiensis por Dagert et al. (2002), quienes a partir de plantas in vitro del genotipo resistente a la Sigatoka negra Yangambí km5 (Musa AA) inoculadas con conidios de M. fijiensis, obtuvieron secuencias expresadas diferencialmente ante la infección con el patógeno. Más recientemente, (Yu et al., 2007; Mbéguié et al., 2007), la emplearon para la obtención de genes durante el proceso de maduración en bananos. A pesar de la importancia agrícola y el pequeño tamaño del genoma de Musa (Lysák et al., 1999), el género no ha sido investigado extensivamente a escala genómica, ni a nivel de la interacción Musa-M. fijiensis, por lo que las investigaciones realizadas resultan insuficientes. 3.

(11) Introducción para el entendimiento de los procesos fisiológicos y bioquímicos implicados en el patosistema. En la literatura científica, no se han descrito estudios relacionados con la interacción 'Calcutta 4'-M. fijiensis, a partir de la inoculación artificial en condiciones de casa de cultivo de plantas. Teniendo en cuenta los antecedentes planteados, la realización de una biblioteca sustractiva por supresión en el genotipo resistente 'Calcutta 4', de referencia por La Red Internacional de Mejoramiento de Bananos y Plátanos (INIBAP, del inglés International Network for Improvement of Banana and Plantain) (Carlier et al., 2002), en estadio temprano de la infección con M. fijiensis, permitirá obtener información acerca de la expresión de genes que pudieran estar involucrados en la respuesta de la planta ante el patógeno. De este modo, contribuirá a un mejor conocimiento de la enfermedad y sentará las bases para el empleo de estos genes en la modificación genética de plantas. Basados en la problemática anterior, se plantea la siguiente hipótesis de trabajo: La obtención de fragmentos de ADNc de Musa acuminata genotipo 'Calcutta 4', que se expresan diferencialmente ante la infección con Mycosphaerella fijiensis Morelet, permitirá identificar secuencias relacionadas con la respuesta de defensa a este hongo fitopatógeno. Para dar cumplimiento a esta hipótesis, en el presente trabajo se propusieron los siguientes objetivos: Objetivo general Identificar secuencias expresadas diferencialmente, en el genotipo resistente 'Calcutta 4' ante la infección con Mycosphaerella fijiensis Morelet, en estadio temprano de desarrollo de la enfermedad. Objetivos específicos 1.-. Obtener. una. biblioteca. sustractiva. que. contenga. secuencias. expresadas. diferencialmente en el genotipo resistente 'Calcutta 4', ante la infección con Mycosphaerella fijiensis Morelet. 2.- Secuenciar e identificar los clones de la biblioteca sustractiva de ADNc.. 4.

(12) Revisión bibliográfica. 2. Revisión bibliográfica. 2.1 Generalidades del cultivo. 2.1.1Origen y distribución del género Musa. Se considera a la península Malaya en Asia, como el sitio probable de origen del género Musa, así como centro de origen primario tanto de Musa balbisiana como de Musa acuminata, cuyos cruzamientos dieron origen a todas las variedades comestibles conocidas en América (De Langhe, 1996; Jones, 2000). El proceso de evolución de los cultivares desde especies silvestres, así como su expansión desde el Sudeste de Asia ha sido descrito por Simmonds (1962). El plátano fue introducido a las Islas Canarias por los portugueses y de ahí pasó al Nuevo Mundo. Se atribuye a Fray Tomás de Berlanga, obispo de Panamá y descubridor de las Islas Galápagos, el traslado de la banana dulce desde las Islas Canarias a Santo Domingo, en el año 1516, de donde se propagó a otras regiones como el Caribe y posteriormente al continente (Mourichon y Fullerton, 1990). 2.1.2 Taxonomía y diversidad genética. Las Musáceas pertenecen a la clase de las monocotiledóneas, orden Zingiberales y familia Musaceae, la que a su vez incluye los géneros Musa y Ensete. El género Musa ha sido clasificado en cuatro secciones: Australimusa, Callimusa, Rhodochlamys y Eumusa. Dentro de esta última se encuentran las especies Musa acuminata y Musa balbisiana (Simmonds, 1962). El número cromosómico básico en el género Musa para la (sección Eumusa) es de n=11. Las musáceas comestibles se dividen fundamentalmente en bananos y plátanos y tuvieron su origen en dos especies diploides, Musa acuminata Colla y Musa balbisiana Colla. La ploidía y el genoma de cada cultivar está representado, con A para indicar la procedencia de Musa acuminata (2n=2x=22) y con B de Musa balbisiana (2n=2x=22). De esta manera las letras A y B sirven para la clasificación e identificación de genotipos (Stover y Simmonds, 1987). Es posible encontrar genotipos diploides AA y triploides AAA, que son los dos tipos de bananos cultivados, mientras que los plátanos son híbridos entre las dos especies. 5.

(13) Revisión bibliográfica. ancestrales, AAB (Simmonds, 1962). También existen triploides (ABB, BBB) y tetraploides (AAAA, AAAB y AABB) (Sandoval y Muller, 1999). Los genomas de Musa son pequeños (aproximadamente entre 537 y 615 megabases (Mb). Los genomas A y B de Musa difieren en tamaño, siendo el B más pequeño en un 12%. No se han encontrado variaciones en el tamaño del genoma, entre las accesiones de Musa balbisiana (talla promedio de 537 Mb) (Osuji et al., 1998; Dolezel et al., 1999). 2.1.3 Características del banano silvestre diploide 'Calcutta 4' (Musa acuminata ssp. burmannicoides). Según Pulseglove (1972), los diploides silvestres como Calcutta 4 (Musa AA), se originaron de la especie Musa acuminata Colla y tiene su centro de diversidad en el oeste de Malasia donde se han encontrado cuatro de las cinco subespecies, estas se denominaron: Musa acuminata malaccensis (RidI) Simmonds, Musa acuminata microcarpa (Beccari) Simmonds, Musa acuminata burmannicoides Simmonds y Musa acuminata siamea Simmonds. Descripción morfotaxonómica (Musalogue, 2001) Características de la planta Hábito foliar: intermedio Altura del pseudotallo (m): <= 2 Color del pseudotallo: verde amarillo, con algunas manchas de color carmelita Apariencia del pseudotallo: cerosa Color de la savia: lechosa Desarrollo de los hijos: entre ¼ y ¾ del tamaño de la planta madre Características del fruto: Posición del fruto: curvos al raquis Número de frutos 2da mano: 13-16 Longitud de los frutos (cm): <= 15 Forma del fruto: rectos o curvas poco marcadas Sección transversal del fruto: débilmente pronunciados. 6.

(14) Revisión bibliográfica. Características de la inflorescencia/brote masculino: Longitud del pedúnculo (cm): <= 30 Posición del racimo: oblicuo Tipo de raquis: presente Posición del raquis: pendular verticalmente Tipo del brote masculino: normal Forma del brote masculino: lanceolada Forma del ápice de la bráctea: ligeramente puntiaguda Imbricación de las brácteas: brácteas jóvenes lo cubren claramente Color de la parte externa de la bráctea: azul-violáceo Color de la parte interna de la bráctea: rojo-violáceo Cicatriz de la bráctea en el raquis: muy prominente Comportamiento de la bráctea antes de caer: resoluto Cera en la bráctea: muy cerosa Ápice del fruto: puntiagudo Sabor predominante: dulce Color de la cáscara del fruto maduro: amarilla Pulpa en el fruto: con pulpa Presencia de semillas: > 20 Forma de la semilla: achatada Esta subespecie se distribuye geográficamente desde Sri Lanka, India del este y Burma. Calcutta 4, se considera desde el punto de vista de su resistencia, como una línea pura (true-breeding), adecuada para su utilización en el mejoramiento genético. Por otra parte, se ha confirmado que su característica de desarrollar racimos con frutos pequeños y con semillas, no es transmitida a la progenie tetraploide mejorada (Swennen y Vuylsteke, 1993). Este banano ha sido empleado en el programa de mejoramiento genético manejado por FHIA (Honduras) y en el programa del Instituto Internacional de Agricultura tropical en África (IITA, del inglés International Institute of Tropical Agricultura); de estos se han generado. 7.

(15) Revisión bibliográfica. híbridos e información muy valiosa. Los híbridos tetraploides, obtenidos por el cruce de plátanos (AAB) con este diploide silvestre, muestran una variación en la respuesta a la Sigatoka negra, desde susceptible a moderadamente resistente (Crouch et al., 1998). 2.1.4 Importancia de los plátanos y bananos. Bananos y plátanos (Musa spp.), se cultivan en más de 130 países en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Sharrock y Frison, 1999), en un área aproximada de 10 millones de hectáreas (Marín et al., 2003). Forman parte de la dieta básica de millones de personas, que los consumen como alimento cocido o fruta fresca (Karamura y Akyeampong, 2004). El fruto es altamente energético, rico en vitaminas A, B, C, E y minerales (Adeniji et al., 2006). Estos cultivos tienen gran importancia en los países del trópico y subtrópico, porque además de alimento, suministran empleo e ingreso a los miembros de las comunidades. En las condiciones de Cuba también adquieren relevancia, ya que permiten lograr la estabilidad de los productos alimenticios en el mercado, sobre todo en los meses que son desfavorables para los cultivos de producción subterránea (Barranco, 2000). La producción mundial de musáceas (banano y plátano) va en ascenso y es de unas 108 millones de toneladas métricas por año, de las cuales el 68% corresponde a banano y el 32% a plátano, siendo los mayores productores la India, Ecuador, Brasil y China y en menor escala los países tropicales de América, Asia y África (FHIA, 2007). 2.2 Enfermedades en Musa spp. Las enfermedades están entre los factores más importantes que limitan la producción de bananos y plátanos a nivel mundial, las cuales se han incrementado durante los últimos 20 años (Marín et al., 2003; Kiggundu et al., 2003), que de conjunto con el agotamiento de los nutrientes del suelo, contribuido en gran medida a la disminución de los rendimientos de estos cultivos (Mobambo, 2002). Entre las principales enfermedades que los afectan están: el Mal de Panamá causada por Fusarium oxysporum Schlecht. F. sp. cubense [E.F. Smith] Snyd. Y Hans) (Ploetz, 2000; 2005), el virus del cogollo racemoso en bananos (BBTV, del inglés Banana Bunchy Top virus) (Laughlin, 1997), la enfermedad del moko (Ralstonia solanacearum) (Belalcázar, 2004; Hayward, 2006), el marchitamiento bacteriano producido. 8.

(16) Revisión bibliográfica. por la bacteria Xanthomonas campestris y entre las plagas está la afectación por nemátodos barrenadores (Radopholus similis) (Marín, 2000; Jain, 2002; Marín et al., 2003). Sin embargo, las enfermedades más importantes son las manchas foliares, producidas por Mycosphaerella spp., entre ellas por M. fijiensis, M. musicola y M. eumusae, que causan daños de moderados a severos en las plantaciones, por lo que se le atribuyen la mayoría de las pérdidas en la industria dedicada a la producción y exportación de los frutos (Mourichon y Fullerton, 1990; Fouré, 1994; Marín et al., 2003). 2.2.1 Las manchas foliares. Los principales patógenos fúngicos responsables de las manchas foliares en banano son: Mycosphaerella musicola (Anamorfo: Pseudocercospora musae), que causa la enfermedad conocida como Sigatoka amarilla; M. fijiensis (Anamorfo: Pseudocercospora fijiensis), que causa la enfermedad de la raya negra de la hoja (Sigatoka negra) y M. eumusae (Anamorfo: Pseudocercospora eumusae), que produce la mancha foliar eumusae (Mulder y Stover, 1976; Crous et al., 2003). Los tres patógenos, causan severos daños económicos al cultivo de bananos y plátanos a nivel mundial y dada la similitud de los síntomas que producen en las plantas, se ha sugerido que las enfermedades causadas por estos, se denominen manchas foliares de Sigatoka (Jones, 2003). 2.3 Sigatoka negra. La enfermedad de la raya negra de la hoja causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet, se considera el principal problema para la producción de bananos y plátanos a nivel mundial (Stover y Simmonds, 1987). Es de destacar que a partir de la década del 60 del siglo XX, esta enfermedad comenzó a reemplazar a la Sigatoka amarilla producida por M. musicola y que aún se desconoce cómo este proceso de cambio tuvo lugar en la naturaleza (Romero, 2003). 2.3.1 Agente causal. El género Mycosphaerella es uno de los más grandes dentro de los de ascomicetos, que contiene más de 3000 taxa nombrados. La Sigatoka negra o raya negra de la hoja, como. 9.

(17) Revisión bibliográfica. también se le conoce es causada por el patógeno fúngico Mycosphaerella fijiensis Morelet (Deighton), el cual es un hongo ascomicete heterotálico (Mourichon et al., 1990) y cuyo ciclo de vida se caracteriza por dos estados: perfecto (teleomorfo) e imperfecto (anamorfo) (Alexoupoulos y Mims, 1979). Este hongo está muy relacionado con M. musicola, agente causal de la Sigatoka amarilla y los patógenos solo pueden ser distinguidos a nivel morfológico, por las características de sus conidios y conidióforos (Meredith y Lawrence, 1969; Mulder y Stover, 1976; Carlier et al., 2002; Crous et al., 2003). Cuando la Sigatoka negra se descubrió en América Latina, se le denominó al patógeno M. fijiensis var. difformis (Stover 1974), la cual fue validada por Mulder y Stover en 1976, a través del examen de muestras de Musa spp. colectadas en La Lima, Honduras. Para separar a M. fijiensis var. fijiensis de M. fijiensis var. difformis, se utilizó como criterio de selección, el estado anamorfo, ya que no existían diferencias morfológicas en el estado teleomorfo. M. fijiensis var. difformis, se caracterizaba por la presencia de un estroma con conidióforos, el cual estaba ausente en M. fijiensis var. fijiensis. El estado anamorfo de M. fijiensis var. fijiensis y M. fijiensis var. difformis, que en los inicios se refirió al género Cercospora Fres (Morelet) (Mulder y Stover, 1976), se transfirió por Deighton a un nuevo género, Paracercospora, bajo la combinación de Paracercospora fijiensis (Morelet) Deighton y P. fijiensis var. difformis (Mulder & Stover) Deighton (1979). Para el diagnóstico certero de estos hongos, se necesitan observaciones al microscopio, por la semejanza de los síntomas que producen en los tejidos afectados y por otro lado sus diferencias morfológicas, al ser confusas, también dificultan su diferenciación. Stover y Simmonds (1987) y Pons (1987, 1990), basados en las características morfológicas, determinaron que M. fijiensis y M. fijiensis var difformis son sinónimos, lo cual fue confirmado por estudios taxonómicos posteriores de aislados de ambos patógenos (Pons, 1990) y molecularmente por Carlier et al. (1996). Aunque en los inicios la fase anamorfa de M. fijiensis y M. musae, se colocó en el género Cercospora, luego se clasificaron como: Paracercospora fijiensis y Pseudocercospora musae respectivamente (Deighton, 1976, 1979; Pons, 1990). Sin embargo, Crous et al.. 10.

(18) Revisión bibliográfica. (2003), secuenciaron el espacio de transcripción interna (ITS, del inglés Internal Transcribed Spacer), del ácido desoxirribonucleico ribosomal (ADN ribosomal) y mostraron que Paracercospora es sinónimo de Pseudocercospora, por lo tanto Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton es el nombre correcto del estado anamorfo del hongo. 2.3.2 Origen y distribución. La Sigatoka negra se reconoció como una enfermedad nueva en 1963, en el sureste de Viti Levu, a 60 km del Valle de Sigatoka en Fiji, donde la Sigatoka amarilla ya había sido descubierta en 1902 (Rhodes, 1964), sin embargo, exámenes de especímenes de herbarios indicaron que probablemente estuvo presente en otras áreas de Asia y el Pacífico antes de 1963 (Stover, 1978; Long, 1979). Los primeros informes de la presencia de M. fijiensis fuera del continente asiático y las islas del Pacífico, se realizaron en Honduras en 1972, Costa Rica en 1979, en México y a través de América Central en los 1980 (Stover, 1980). Posteriormente se evidenció en Colombia y Ecuador en 1987 (Stover y Simmonds, 1987) y en Cuba en 1990 (Vidal, 1992). En América del Sur, los síntomas fueron primeramente descubiertos en Venezuela, en las islas del Caribe en 1991 (Martínez, 1997), en Jamaica y República Dominicana (1995-1996) y en Brasil en 1998 (Jones, 2000; Rivas, 2004). En los Estados Unidos se registró en 1998, en Florida (Ploetz, 1999). En las Islas Galápagos a principios del 2002 y para finales de ese año, se encontró por primera vez en un área de producción comercial cerca de Tully al norte de Queensland (Jácome, 2003). El último descubrimiento en América Latina, fue en Puerto Rico en el 2006 (Irish et al., 2006). La enfermedad se ha convertido en la más importante en bananos y plátanos en América Central y del Sur, Asia e Islas del Pacífico (Meredith y Lawrence, 1969; Long, 1973; Stover, 1976). En África, se reconoció por primera vez en Zambia en 1973 (Raemaekers, 1975). Después la enfermedad se expandió rápidamente por África Central y Oriental, en Gabón (1978) (Frossard, 1980), Gambia (1979), Cameroon, en 1980 y en Nigeria, en 1986 (Mourichon y Fullerton, 1990). En África del este, la enfermedad fue primeramente identificada en Zanzíbar, Rwanda, Burundi y Tanzania en 1987 (Sebasigari y Stover, 1988) y finalmente. 11.

(19) Revisión bibliográfica. confirmada en Uganda y Kenya en 1996 (Johanson, 1997) y el último hallazgo fue en Madagascar (2000). M. fijiensis, no solo causa daños al sistema foliar en bananos y plátanos, sino también al de las plantas de Heliconia psittacorum L. (Gasparotto et al., 2005), además fue reconocida su presencia en frutos de plátano cv Hartón en Venezuela (Cedeño et al., 2000). 2.3.3 Epifitiología. En la diseminación de la enfermedad de la raya negra de la hoja, tienen un papel fundamental la presencia de conidios y ascosporas. Los conidios se forman cuando existen condiciones de alta humedad en la hoja, en los primeros estadios de desarrollo de la enfermedad (específicamente en los estadios de raya, estriado y mancha). Su principal medio de dispersión son los lavados de la lluvia y las salpicaduras, no se desprenden por los vientos y se asocian principalmente con la extensión local de la enfermedad. Son importantes durante los períodos de alta humedad, fuertes rocíos y aguaceros intermitentes. En M. fijiensis, las ascosporas se consideran la principal fuente de dispersión de la Sigatoka negra, (Meredith y Lawrence, 1969) ya que la producción de conidios es relativamente baja (Stover, 1980; Gauhl, 1994); aunque El-Hadrami et al. (1998), lograron el desarrollo de los síntomas de la enfermedad similares a las condiciones de campo, a partir de la inoculación de discos de hojas con conidios de M. fijiensis, bajo condiciones controladas. 2.3.4 Modo de infección, síntomas y control. Los tubos germinativos de las ascosporas y conidios penetran a través del estoma después de 48-72 horas con temperaturas superiores a 20 °C (Stover, 1980; Fouré y Moreau, 1992). Después de penetrar la hifa, ocurre la colonización de las células adyacentes, aproximadamente en siete días sin evidencia de destrucción de las mismas. Una vez establecida la infección, una o más hifas vegetativas emergen desde los estomas que están en el envés de las hojas. Estas hifas epifíticas se desarrollan a través de la superficie de la hoja paralela a las venas con una distancia de tres milímetros adyacente a la infección estomática (Stover, 1980; Gauhl, 1989). Pueden formar una compleja red de hifas y a varios intervalos se desarrollan ramificaciones, las cuales terminan en un hifopodio sobre el estoma. 12.

(20) Revisión bibliográfica. (Jones, 2000). Este crecimiento epifítico del hongo provoca un desarrollo acelerado de los síntomas de la enfermedad (Gaulh, 1994; Stover, 1980). La sucesión de síntomas producidos por el patógeno fueron descritos por Stover y Simmonds (1987). Primero ocurre el desarrollo de pecas de color pardo rojizas las cuales se observan por el envés de la hoja, estas se elongan hasta llegar al estadio de rayas, las cuales cambian de color de pardo rojizo a carmelita oscuro o negro, haciéndose claramente visibles por el haz de la hoja. Las rayas se ensanchan y se hacen más o menos fusiformes o elípticas, con un borde acuoso. El centro oscuro de cada lesión se deprime y el borde se hace más pronunciado. Finalmente los centros de las lesiones se secan, adquieren un color gris claro y permanecen claramente visibles hasta después que la hoja haya colapsado debido a su color característico y los bordes oscuros. En plantas susceptibles (interacción compatible), ocurre el desarrollo completo de la enfermedad hasta la esporulación del hongo en un período corto de tiempo, por el contrario en plantas resistentes (interacción incompatible), la misma es bloqueada y no hay esporulación sexual ni asexual (Mourichon et al., 1997). De forma general se desarrolla un mecanismo de respuesta hipersensible, donde ocurre la rápida muerte celular de las células en contacto con el patógeno, lo que impide el avance de la enfermedad, la cual llega solo hasta el estadio de pecas. En los países que producen para la exportación, la enfermedad de la Sigatoka negra es usualmente controlada por la aplicación frecuente de fungicidas, esta es una práctica muy cara puesto que incluye el uso de aviones o helicópteros, pistas de aterrizaje, facilidades para la búsqueda y mezcla de fungicidas. Esto conlleva a la consiguiente degradación del ambiente, por el uso excesivo de estos tóxicos, lo que ha traído como consecuencia el desarrollo de hongos resistentes a estos productos, dificultándose así el control de la enfermedad (Romero y Sutton, 1998). En regiones plataneras, el control de la Sigatoka negra depende básicamente del empleo de agroquímicos (aceites minerales y fungicidas tales como bencimidazoles, triazoles, morfolinas y estrobilurinas) (Gómez et al., 2004). Sin embargo, se ha planteado la. 13.

(21) Revisión bibliográfica. posibilidad de integrar diferentes prácticas de manejo, teniendo en cuenta que aunque el manejo químico representa una herramienta de gran importancia en el combate de la Sigatoka, la capacidad competitiva del agente causal, su habilidad de reproducción y persistencia en la superfcicie foliar, pueden ser contrarrestadas con el manejo adecuado de las condiciones nutricionales y las labores de cultivo que logren reducir las condiciones que favorezcan el proceso de infección. Es por ello que las prácticas culturales como: el control de malezas, la eliminación de hojas secas, un buen drenaje del terreno, la regulación de la densidad de siembra, la quema de hojas e hijuelos infectados, el deshierbe, sumadas al uso de una variedad resistente o tolerante (obtenidas a través de la transformación genética con genes de resistencia) (Ortiz et al., 2002), representan parte fundamental de una estrategia integrada para el manejo de la Sigatoka (Gómez y Castaño, 2001). 2.4 Generalidades acerca de la interacción planta-patógeno. Las plantas han estado expuestas a condiciones ambientales adversas incluyendo estrés biótico desde sus orígenes. El estrés biótico comprende la acción de microorganismos como bacterias, hongos y virus, los cuales utilizan diferentes mecanismos moleculares como estrategias de virulencia para infectar la planta y eventualmente causan enfermedades. Frente a este ataque las plantas han desarrollado mecanismos y estrategias de defensa propios, los cuales le permiten protegerse de las enfermedades (Fujita et al., 2006; Osbourn y He, 2006). La resistencia a patógenos en plantas puede ser inducida, lo cual conlleva a una compleja red de alteraciones bioquímicas y estructurales en la célula de la planta, asociada con un aumento en la respuesta de defensa (Conrath et al., 2002). Ello involucra la percepción, amplificación y transducción de señales, que incluye el reconocimiento mediado por receptores del patógeno que invade, flujo de iones (Bolwell et al., 2002), estrés oxidativo (Conrath et al., 2002; Mur et al., 2006), generación de señales (Xiong et al., 2001; Yang et al., 2004; Pozo et al., 2005), activación de varios genes de defensa (Jones y Dangl, 2006) y cascada de fosforilación de proteínas (Stulemeijer et al., 2007).. 14.

(22) Revisión bibliográfica. La resistencia a enfermedades en las plantas, es el resultado de un mecanismo de resistencia innato del hospedero, el cual recae en la habilidad de la planta para reconocer la invasión y eficientemente aumentar la respuesta de defensa. Moléculas que indican la presencia del patógeno (elicitores), activan los receptores del hospedero y esto rápidamente genera una señal interna que dispara una respuesta de defensa temprana. Varias vías de transducción han sido propuestas, que recaen en el reconocimiento inicial de la señal, a través de vías delimitadas a nivel de membrana y citosol. La activación de estas vías de transducción de señales, asegura una respuesta cuantitativa inducida por elicitores en tiempo y coordinada con otras actividades de la célula hospedera (Sessa y Martín, 2000; Apel y Hirt, 2004). La expresión inducida de un gran número de genes relacionados con la defensa, es esencial para contrarrestar la infección por patógenos. Los principales cambios estructurales que ocurren incluyen la cutícula y la pared celular, las que forman una barrera física para impedir la entrada y diseminación del patógeno por los tejidos de la planta. Además de la protección preexistente, las plantas pueden reconocer directa o indirectamente la presencia de un patógeno e inducir mecanismos de defensa. La respuesta inducida, incluye la síntesis de moléculas señales tales como el ácido salicílico, el jasmonato y el etileno, las cuales regulan la expresión génica y la producción de moléculas de defensa tales como moléculas reactivas de oxígeno, fenilpropanoides, fitoalexinas y proteínas relacionadas con la patogenicidad, que permiten crear un ambiente fisiológico que impide el crecimiento e invasión del patógeno (Talarczyk y Hennig, 2001; Otálvaro et al., 2002). El resultado final de la interacción hospedante-patógeno, es el desarrollo de la enfermedad (compatibilidad) o la resistencia de la planta (incompatibilidad), lo cual está en dependencia de las características genéticas, el estado fisiológico de ambos elementos, además de las condiciones ambientales como luz, humedad y temperatura. Durante un proceso de infección, el patógeno tiene que evadir las barreras físicas de la planta, para lo cual utilizan diferentes estrategias. Algunos patógenos son específicos para una variedad de plantas y otros actúan inespecíficamente. La planta por su parte puede. 15.

(23) Revisión bibliográfica. percibir la presencia del patógeno e inducir una respuesta de defensa. La percepción del patógeno puede ser a través de moléculas de distinta naturaleza, llamados elicitores y pueden ser de la planta o del patógeno (Maor y Shirasu, 2005). 2.4.1 Respuesta de defensa. Las plantas resisten la invasión del patógeno, por el despliegue de varias respuestas de defensa que son activadas. Por un lado existen receptores que reconocen patrones transmembrana (PRRs, del inglés Pattern Recognition Receptors), que activan la respuesta de defensa basal, por reconocimiento de patrones moleculares extracelulares asociados con el patógeno (PAMPs, del inglés Pathogen Associated Molecular Patterns), común a muchas clases de microorganismos. La otra vía, está representada por productos del gen de resistencia (R, del inglés Resistance gene), que específicamente reconocen efectores correspondientes al patógeno que actúan como factores de avirulencia. La respuesta de defensa activada por PRRs y proteínas R, son en parte cualitativamente similares e incluyen alcalinización extracelular, incremento en los niveles de calcio, liberación de etileno, producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, activación de proteínas kinasas activadas por mitogén (MAPK, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase) y cambios en la expresión de genes. Sin embargo, esta resistencia mediada por el gen R se desarrolla más rápido y con mayor intensidad y se conoce como muerte celular localizada programada (Gómez-Gómez, 2004; Jones y Dangl, 2006; Balaji et al., 2007). 2.5 Tipos de resistencia. Existen dos tipos de resistencia de las plantas a las enfermedades. En el primer tipo, el hospedante se resiste al establecimiento de una relación parasítica exitosa, mediante la restricción del sitio y el proceso de infección, resistencia que en algunas ocasiones es denominada específica. En el segundo tipo de resistencia, el hospedante resiste la colonización y crecimiento del parásito, una vez ocurrido el proceso de infección, resistencia que ocasionalmente se le llama resistencia horizontal o resistencia no específica. El mejoramiento de plantas, se ha basado fundamentalmente en la resistencia vertical. Este tipo de resistencia puede ser introducido con relativa facilidad dentro de los cultivares y sus. 16.

(24) Revisión bibliográfica. efectos son claros y obvios. Por otro lado, la resistencia horizontal funciona mediante la reducción de la tasa de desarrollo de la enfermedad, la cual puede resultar de mecanismos del hospedante que retardan la penetración y expresión de síntomas o período de incubación, incrementan el período de latencia, restringen la cantidad de tejido que es colonizado desde un solo sitio de infección y que reducen la cantidad y duración de la esporulación. Esta resistencia es relativamente difícil de introducir en cultivares, debido a la complejidad de su herencia. Sus efectos son a menudo oscuros y no siempre se manifiestan inmediatamente. El retardamiento de la tasa de desarrollo de enfermedad, parece ser uno de sus principales atributos (Molina y Castaño, 2003). 2.6 Modelo de resistencia propuesto para genotipos resistentes en Musa spp. Ortiz y Vuylsteke (1994), propusieron un modelo genético de resistencia donde existe un alelo de resistencia recesivo principal (bs1) y dos alelos independientes con efecto aditivo (bsr2 y bsr3), los cuales aumentan la resistencia a la enfermedad. Estos alelos de resistencia provienen principalmente del genotipo silvestre 'Calcutta 4' y del cultivar 'Pisang lilin'. Además plantearon que la densidad estomática y de cera en el pseudotallo, parecían estar controladas o vinculadas con los genes modificadores (bsi) en la planta hospedante y que estos genes están presentes en el genoma de plátanos susceptibles, pero que su expresión está enmascarada por el efecto dominante del gen principal de susceptibilidad. Según la hipótesis gen a gen (Flor, 1971), un sistema de resistencia basado en alelos recesivos es difícil de vencer por el patógeno, ya que requeriría de una mutación del alelo dominante del locus de virulencia y debido a que estas mutaciones son raras, esta resistencia basada en alelos recesivos podría ser más durable. Craenen y Ortiz (1997), con el objetivo de determinar el papel del gen de resistencia principal a la Sigatoka negra (bs1), en la respuesta del hospedero a la enfermedad, demostraron que la acción aditiva del gen bs1, constituía un factor importante en la respuesta de la planta ante el patógeno y que su acción podría proveer una resistencia duradera a la Sigatoka negra, disminuyendo el desarrollo de la enfermedad.. 17.

(25) Revisión bibliográfica. Craenen y Ortiz (2003), plantearon que la incorporación de diferentes tipos de resistencia en el mismo genotipo, podría conferir resistencia durable a la Sigatoka negra. Explicaron que en 'Calcutta 4', existe una resistencia poligénica hipersensible, que limita el desarrollo del patógeno, pero que también posee alelos recesivos que controlan la resistencia parcial en los híbridos de plátano. Esta resistencia parcial simplemente disminuye el desarrollo de la enfermedad y así puede ser más difícil de vencer que la respuesta hipersensible, la cual ya ha fallado en plantas jóvenes con cepas nuevas en Papua New Guinea. La respuesta hipersensible está frecuentemente asociada con la interacción gen-gen, pero esta hipótesis no ha sido probada en Musa. 2.7 Técnicas moleculares empleadas para el estudio de interacciones hospedante patógeno. El estudio de los mecanismos bioquímicos, fisiológicos que tienen lugar, durante la interacción planta patógeno, son de gran importancia para el desarrollo de futuras estrategias de mejoramiento de cultivos. El desarrollo y empleo de técnicas moleculares, de ingeniería genética y la utilización combinada de las mismas, han contribuido en gran medida, a un mayor conocimiento de estas interacciones. Para este propósito, varias técnicas moleculares han sido utilizadas, con el objetivo de determinar los patrones de transcripción o para la identificación de genes regulados diferencialmente, las cuales parten de la purificación inicial de ARN total. Dentro de ellas están: DDRT-PCR (Liang y Pardee, 1992), SAGE (Velculescu et al., 1995), cDNA-AFLP (Bachem et al., 1996), SSH (Diatchenko et al., 1996) y los Microarrays (Brown y Botstein, 1999). La técnica DDRT-PCR, como método rápido, de gran sensibilidad, basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction), fue empleada por Benito et al. (1996), en el estudio de la interacción Lycopersicum esculentum-Botrytis cinerea y encontraron la expresión diferencial de genes ante la infección e identificaron un fragmento que codificaba para una enzima de la ruta de los fenilpropanoides. Otra de las técnicas moleculares empleadas ha sido SAGE y una variante de la misma llamada SuperSAGE, las cuales permiten un análisis cuantitativo, seguro de la expresión de. 18.

(26) Revisión bibliográfica. miles de genes a la vez, además de un rápido análisis funcional de genes de interés. Matsumura et al. (2003), la emplearon para el estudio de la interacción Oryza sativa L. cv. Norin-Magnaporthe grisea, lo cual permitió la identificación rápida de genes expresados y reprimidos durante la interacción y demostraron su capacidad para el estudio de la expresión global de genes en organismos eucariotes. Avrova et al. (2003), emplearon la técnica de cDNA-AFLP, la cual se basa en el empleo del PCR para conocer los perfiles de expresión diferencial de genes, en la identificación de transcritos específicamente regulados en los diferentes tipos de células de Phytophthora infestan presentes previo a la infección del hospedero. A pesar de la existencia de varias técnicas para el estudio de las interacciones, la realización de bibliotecas de ADNc y específicamente la variante de la hibridación sustractiva, basada en PCR, ha sido la más utilizada para este propósito. La misma ofrece la ventaja de poder obtener fragmentos específicos, entre dos poblaciones de ARNm. Por un lado se logra normalizar la abundancia de los ADNc “blancos” (expresados diferencialmente) y simultáneamente suprimir la amplificación secuencias comunes entre las poblaciones, además de constituir una vía rápida para descubrir e identificar nuevos genes (Diatchenko et al., 1996). Por los motivos expuestos anteriormente, la técnica ha sido de gran aceptación en la biología molecular, ya que ha permitido la clonación de genes desconocidos, especialmente si el mensaje de interés es poco abundante y diferencialmente expresado entre dos poblaciones de células. Xiong et al. (2001), la emplearon para la búsqueda de genes expresados en Oryza sativa ante la infección con Magnaporthe grisea; Xiao et al. (2001) para la caracterización de genes de defensa en la interacción Lycopersicon esculentum-Pseudomonas syringae y Luo et al. (2002) para búsqueda de genes en Triticum aestivum relacionados con la defensa a Erysiphe graminis DC. Aunque existen diferentes vías para facilitar la identificación de los genes, que participan en un proceso bioquímico o fisiológico determinado, la combinación de los microarreglos con. 19.

(27) Revisión bibliográfica. las bibliotecas ADNc, son en la actualidad el sistema más eficiente para el estudio de la expresión diferencial de genes. Constituye una prueba poderosa, efectiva y costosa para el análisis de la expresión de genes a gran escala, pero su elevado costo de realización y la disponibilidad de bibliotecas ESTs, constituyen dos limitantes para su aplicación (Wan et al., 2002). Li et al. (2006), emplearon la técnica para conocer la expresión de genes en Oryza sativa en respuesta a la infección con Magnaporthe grisea y Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo), durante un estadio temprano de la interacción incompatible, compatible y encontraron la existencia de vías de defensa distintivas así como compartidas entre las interacciones. Específicamente en el estudio del patosistema Musa-M. fijiensis, el empleo de las diferentes técnicas moleculares mencionadas anteriormente, no ha sido tan extensivo, para la búsqueda de genes de interés regulados durante la interacción. Sobre la base de estudios previos en otras interacciones, se conoce que el reconocimiento planta-patógeno que conlleva a la muerte celular, es controlada por genes de resistencia R y de que un número de subfamilias del gen R, poseen dominios conservados entre las especies de plantas. Esta información ha sido utilizada en el género Musa spp., para la búsqueda de posibles miembros de esta familia de genes, mediante técnicas como DDRTPCR, PCR y la realización de bibliotecas sustractivas. La técnica DDRT-PCR, con el empleo de oligonúcleótidos específicos, fue utilizada en plantas de plátano cv. Hartón (AAB), infectadas con M. fijiensis, y como resultado se obtuvo la expresión diferencial de un gen análogo de resistencia (RGA, del inglés Resistance Gene Analog), específicamente una serina treonina quinasa, a los 38 dpi, la cual se relacionó con la cascada de señalización en plantas (de García et al., 2004). Ramírez y Gómez (2004), como resultado del empleo de la técnica DDRT-PCR y de una biblioteca sustractiva realizada en banano, Musa (AAA) (subgrupo Cavendish) cultivar 'Grande naine', encontraron bandas diferenciales que se correspondieron a genes regulados durante la interacción.. 20.

(28) Revisión bibliográfica. Miller et al. (2004), realizaron un estudio en el genotipo 'Calcutta 4', con el objetivo de identificar posibles fuentes de resistencia, a través del análisis de los genes de resistencia análogos. Para ello utilizaron oligonucleótidos degenerados, diseñados a partir de los dominios conservados de unión a nucleótidos (NBS, del inglés Nucleotide Binding Site) y de las regiones repetidas ricas en leucina (LRR, del inglés Leucine Rich Repeat) y Pei et al. (2007), utilizaron la técnica de PCR con oligonucleótidos degenerados, para el aislamiento de RGAs de cinco especies de banana (Musa spp.) y como resultado obtuvieron una gran diversidad de genes, los cuales se dividieron en 12 grupos diferentes. Estos resultados no habían sido obtenidos con anterioridad y resultan de gran importancia en la búsqueda de genes de resistencia en el género. Coemans et al. (2004), emplearon la técnica SAGE, para realizar un análisis cuantitativo de la expresión de genes en hojas de M. acuminata, infectadas con M. fijiensis y encontraron genes expresados diferencialmente ante la infección. Además, Coemans et al. (2005), utilizaron la variante SuperSAGE por primera vez, para caracterizar el patrón de expresión de genes en banana (M. acuminata), a nivel de transcriptoma y demostraron su capacidad en combinación con otras técnicas, para el descubrimiento de genes en organismos no modelos. Aún cuando existen pocos estudios relacionados con la interacción, continúan las investigaciones encaminadas hacia la búsqueda de nuevas fuentes (genes) de resistencia a M. fijiensis, a partir de genotipos que presentan resistencia a la enfermedad Sigatoka negra y con mayor énfasis hacia el estudio de la genómica funcional, mediante la construcción de bibliotecas genómicas y de ADNc. Entre las bibliotecas genómicas realizadas en Musa están: en Musa acuminata subsp. burmannicoides 'Calcutta 4', utilizando como vector un Cromosoma Bacteriano Artificial (BAC, del inglés Bacterial Artificial Chromosome) (Vilarinhos et al., 2003), en Musa balbisiana 'Pisang Klutuk Wulung' (Šafá et al., 2004) y en Musa acuminata 'Tuu' en el vector Cromosoma Bacteriano Artificial Binario (BIBAC, del inglés Competent Binary Bacterial Artificial Chromosome) (Ortiz et al., 2005), de las cuales se han obtenido 55 152; 36 864 y. 21.

(29) Revisión bibliográfica. 30 700 clones, cuyo tamaño de inserto promedio ha sido de 100, 135 y 100 kilobases (kb) respectivamente. Del total de clones, solo han sido publicados resultados parciales de la secuenciación de 6 252 clones (Aert et al., 2004; Cheung y Town, 2007). La técnica de hibridación sustractiva, también ha sido utilizada para el estudio del patosistema Musa-M. fijiensis, pero en menor medida. Solo ha sido reportada su utilización por Dagert et al. (2002), quienes a partir de plantas in vitro del genotipo resistente a la Sigatoka negra Yangambí km5 (Musa AA), inoculadas con conidios de M. fijiensis, tomaron muestras de hojas entre 0 y 72 horas posteriores a la inoculación y obtuvieron secuencias expresadas diferencialmente. Finalmente, por la importancia que reviste el proceso de maduración de bananos, la técnica ha sido empleada para la búsqueda de genes asociados con el proceso de maduración (Yu et al., 2007; Mbéguié et al., 2007). A pesar de los logros alcanzados, con el empleo de las técnicas moleculares, en el estudio del género Musa, la búsqueda de genes expresados diferencialmente, en genotipos resistentes, ante la infección con M. fijiensis, continúa como una prioridad para el entendimiento del patosistema. A este conocimiento ha contribuido en gran medida, el procesamiento de la información obtenida de los análisis moleculares. 2.8 Utilización de herramientas bioinformáticas. La interacción planta-patógeno y las señales generadas de la misma, son extremadamente complejas y dinámicas, por lo que resulta difícil el poder monitorearla con los métodos genéticos y bioquímicos tradicionales. Con el advenimiento de proyectos para la secuenciación a gran escala de genomas y de secuencias blanco expresadas (EST, del inglés Expressed Sequence Tag) y con el desarrollo de nuevas tecnologías ahora es posible monitorear la expresión de cientos a miles de genes simultáneamente (Wan et al., 2002). Para lograr este objetivo, ha contribuido en gran medida el desarrollo alcanzado con el empleo de las herramientas bioinformáticas.. 22.

(30) Revisión bibliográfica. La bioinformática, es una de las áreas de investigación de mayor dinamismo, aborda el tratamiento y análisis de información en biología mediante el desarrollo y uso de procedimientos, métodos y sistemas basados en las tecnologías de la información. Mientras los proyectos de secuenciación de genomas avanzan rápidamente, la secuenciación y análisis de ESTs, permanecen como una herramienta de investigación primaria para la identificación y categorización de secuencias de genes, en una amplia variedad de especies y como un importante recurso para la anotación de secuencias genómicas (Quackenbush et al., 2001). Esta ha sido el área de mayor crecimiento en las bases de datos públicas y tiene un gran valor para el conocimiento de genes involucrados en la regulación de procesos específicos, identificación de genes y para la generación de pruebas biológicas informativas para los estudios de mapeo. Más de diez millones de ESTs se encuentran disponibles (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbESTsumary.html) y la existencia de las mismas ha permitido el acceso a la información genética de especies con genomas complejos, cuyo acceso es difícil a través de la genética convencional (Vettore et al., 2001). Se le considera una herramienta fundamental y novedosa en el descubrimiento y entendimiento de las vías bioquímicas involucradas en respuesta fisiológicas (Brendel et al., 2002; Ronning et al., 2003; Rudd, 2003). Un paso importante en el análisis de ESTs, lo constituye el ensamblaje de secuencias, para ello han sido desarrollados programas, entre los cuales el CAP3, permite obtener secuencias aisladas y únicas, lo cual contribuye a disminuir la redundancia resultante de la realización de bibliotecas (Huang y Madan, 1999). El análisis de secuencias por medio de la comparación de pares de secuencias, es otro aspecto importante dentro de los procedimientos bioinformáticos, ya que permite, encontrar el mejor alineamiento local o global de la secuencia nucleotídica o aminoacídica, con respecto a las secuencias anotadas en base de datos (proceso de marcar los genes y otros datos en una secuencia de ADN). El alineamiento local es más flexible y encuentra regiones relacionadas entre las secuencias, mientras que el global, tiene en cuenta todos los caracteres de las secuencias que participan en el alineamiento. Este último es más utilizado. 23.

(31) Revisión bibliográfica. para encontrar secuencias estrechamente relacionadas. La comparación mediante la herramienta de búsqueda para alineamiento básico local (Blast), es el método más utilizado para este propósito (Altschul et al., 1997). Los avances logrados en el área de la genómica funcional, aplicados al estudio del género Musa, específicamente del patosistema Musa-M. fijiensis, mediante el empleo de diferentes técnicas moleculares, resultan insuficientes para el conocimiento de los procesos fisiológicos y bioquímicos implicados en la interacción. En la literatura científica, aún no se han descrito estudios relacionados con la interacción 'Calcutta 4'-M. fijiensis, a partir de la inoculación artificial en condiciones de casa de cultivo de plantas, por lo que conocer acerca de la expresión diferencial de genes, durante la respuesta incompatible de la planta ante la infección con patógeno, constituye una oportunidad para el entendimiento del patosistema.. 24.

(32) Materiales y Métodos 3. MATERIALES Y METODOS. Establecimiento del sistema hospedante-patógeno. Se empleó el genotipo de referencia diploide de banano 'Calcutta 4' (AA), declarado por el INIBAP como resistente a la Sigatoka negra, cuyo número de acceso en el sistema de información de germoplasma en Musa es ITC0249 (sección Eumusa) (Carlier et al., 2002). Las plantas de 'Calcutta 4' se obtuvieron del Centro de Tránsito de INIBAP en la Universidad Católica de Leuven y las del cultivar susceptible de banano 'Grande naine' (AAA), del Instituto de Biotecnología de las Plantas. La propagación in vitro se realizó de acuerdo con la metodología utilizada por el INIBAP (Strosse et al., 2004). Las mismas se aclimatizaron por ocho semanas en casas de cultivo, hasta que alcanzaron una altura de 20 cm y cuatro hojas activas. El aislado de Mycosphaerella fijiensis Morelet empleado como inóculo fue el CCIBP-Pf83, aislado de Musa grupo Cavendish (cultivar 'Grande naine'), en el Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas, según el protocolo descrito por Stover (1976). La inoculación de las plantas se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Alvarado et al. (2003), con una suspensión micelial del aislado CCIBP-Pf83, cuya concentración fue ajustada a 105 fragmentos de micelio.ml-1. Para el diseño del experimento se utilizaron 18 plantas de 'Calcutta 4' (de las cuales nueve no fueron inoculadas) e igual número de plantas del cultivar 'Grande naine', que se utilizaron como control del experimento. La distribución de las mismas en la casa de cultivo fue al azar y una vez inoculadas, se elevó la humedad relativa al 100% durante tres días y posteriormente se garantizó una alta humedad, con riegos por aspersión varias veces al día. La temperatura en la casa de cultivo osciló entre 28 y 30 ºC, con una humedad relativa entre 60 y 70%. Toma de muestras. Se realizó a partir de cuatro hojas inoculadas y cuatro no inoculadas, a las cuales se les eliminó la nervadura central, de tres plantas de 'Calcutta 4' cada vez a los 6, 10 y 12 dpi. El material vegetal después de colectado fue inmediatamente congelado en nitrógeno líquido y. 25.

(33) Materiales y Métodos posteriormente almacenado a – 80°C, hasta el inicio del proceso de extracción del ARN total. Obtención de micelio para aislamiento de ARN total. Un fragmento de micelio, procedente de tubos de ensayo con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) (Difco, Alemania), se inoculó en 50 ml medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB) (Difco, Alemania). El cultivo se colocó a 28 ºC, en agitador orbital a 150 rpm durante 14 días. Transcurrido este periodo de tiempo se eliminó el medio de cultivo por decantación, se realizaron tres lavados con agua desionizada estéril, se colectó el micelio e inmediatamente se congeló a – 80 ºC, para su posterior liofilización a – 50 °C con una presión de vacío de 1,5 mbar durante 24 h. Las muestras se sellaron con Parafilm y se conservaron a 4 °C. 3.1 Obtención de transcritos expresados diferencialmente en la interacción 'Calcutta 4'- M. fijiensis. 3.1.1 Purificación de ARN total y ARNm. Este ensayo se realizó con el propósito de obtener el ARN de interés, para la construcción de la biblioteca sustractiva. Se realizaron purificaciones de ARN total, a partir de 1 gramo (g) de hojas de plantas inoculadas (6, 10 y 12 dpi) y no inoculadas de acuerdo con el protocolo descrito por Liao et al. (2004) y del micelio liofilizado. Extracción de ARN total a partir del micelio del hongo. Teniendo en cuenta las características de los hongos filamentosos, se utilizó el siguiente protocolo desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biotecnología de las Plantas. Se pesó 1 g liofilizado y se maceró en nitrógeno líquido. Al homogenizado obtenido se le añadieron 20 ml del tampón CleanUp (100 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,35 M de sorbitol, 10% de PEG 6 000 (p/v) y 2% de. -mercaptoetanol (v/v)) y se colocó en el vortex por 30 s,. posteriormente se realizó la centrifugación por 10 min a 8 000 gravedades (g) a 10 ºC. El precipitado obtenido se resuspendió en 10 ml del tampón de extracción (0,6 M NaCl, 10 mM. 26.

(34) Materiales y Métodos EDTA, 100 mM Tris HCl, pH 8,0, 4% de SDS y 2% de -mercaptoetanol (v/v), previamente calentado a 65 ºC) y se incubó la muestra durante 10 min a 65 ºC, cuyo contenido fue mezclado ocasionalmente. Pasado este período de tiempo, la muestra se enfrió a temperatura ambiente y se le adicionó 1 ml de acetato de potasio 5 M, 3 ml de etanol absoluto frío, 10 ml de fenol y 2 ml de cloroformo. Se procedió a agitar vigorosamente hasta formar una emulsión y se incubó durante 30 min en hielo, posteriormente se centrifugó por igual período de tiempo a 12 000 g a 4 ºC. El sobrenadante obtenido se transfirió a un nuevo tubo y se realizó una extracción con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), agitando suavemente durante 10 min en un balancín. Se centrifugó 10 min a 12 000 g a 4 ºC. La fase acuosa fue transferida a un nuevo tubo y se realizó una nueva extracción con solvente orgánico, bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Se transfirió nuevamente el sobrenadante a un tubo, que contenía ¼ del volumen total de LiCl 10 M, se mezclaron los componentes y se dejó precipitando el ARN toda la noche a 4 ºC. La recuperación del ARN se realizó por centrifugación a 12 000 g por 30 min a 4 ºC. El precipitado se resuspendió suavemente en 500 µl de SDS al 0,5%, se centrifugó 10 min a 12 000 g a 4 ºC y al sobrenadante obtenido se le adicionaron 2,5 volúmenes de etanol absoluto. El ARN se precipitó durante 2 h a – 80 ºC, posteriormente se centrifugó 30 min a 12 000 g a 4 ºC y se lavó el precipitado con etanol al 75%. El precipitado se secó durante 10 min y se resuspendió en 100 µl de agua libre de ribonucleasas. Para la purificación del ARNm, se utilizaron 500 µg de cada ARN total obtenido tanto de plantas como del hongo, mediante el sistema comercial Oligotex® mRNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Los ARN totales y mensajeros obtenidos se conservaron a – 80 °C hasta su utilización y la integridad de los mismos fue analizada mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%, en tampón TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM H3BO3, 2 mM EDTA, pH 8,0), el cual fue teñido con Bromuro de Etidio (EtBr) 0,5 µg.ml-1. La determinación de la concentración de ARN se realizó por medio de la lectura de la absorbancia (A) a una longitud de onda de 260 nm y la pureza se midió a través de las. 27.

(35) Materiales y Métodos relaciones de absorbancia 260/280 y 260/230, las cuales ofrecen una medida de la contaminación por carbohidratos, polisacáridos y proteínas respectivamente (Sambrook y David, 2001). Para este fin se utilizó el espectrofotómetro, BioPhotometer (Eppendorf, Alemania). 3.1.2 Construcción de la biblioteca sustractiva. La biblioteca sustractiva de ADNc, se realizó con el objetivo de obtener secuencias expresadas diferencialmente, en el genotipo resistente 'Calcutta 4', en respuesta a la infección con M. fijiensis. Para ello se siguieron las instrucciones del sistema comercial PCR-Select cDNA Subtraction (BD BIOSCIENCES CLONTECH, Palo Alto, CA, USA), basado en la metodología descrita por Diatchenko et al. (1996). El material de partida para la síntesis fueron 2 µg de ARNm de la muestra blanco, que incluía una mezcla de los ARNm purificados a los 6, 10 y 12 dpi, de plantas de 'Calcutta 4' inoculadas y una mezcla sustractora que incluyó 1 µg de ARNm de plantas de 'Calcutta 4' no inoculadas, más 1 µg de ARNm del micelio del hongo (Figura 1). Plantas inoculadas de 'Calcutta 4'. Plantas no inoculadas de 'Calcutta 4'. Colección de muestras (hojas) a los 6,10 y 12 dpi ARNT. ARNT ARNT. Colección de muestras (hojas) a los 6,10 y 12 dpi ARNT. ARNT. Micelio de M. fijiensis Colección del micelio a los 14 días de cultivo. ARNT. ARNm. ARNm. ARNm. ARNT. ARNm 'Calcutta 4':ARNm M. fijiensis (proporción 1:1). Muestra blanco. Síntesis de ADNc. Mezcla sustractora. Amplificación por PCR Biblioteca sustractiva. Figura 1. Diagrama de flujo del diseño experimental realizado, para la obtención de una biblioteca sustractiva de ADNc, en el genotipo resistente 'Calcutta 4', en respuesta a la infección con M. fijiensis.. 28.