Paquete de funciones para la modificación de imágenes de células vegetales en suspensión para facilitar el conteo celular

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(1)Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Departamento de Telecomunicaciones y Electrónica. TRABAJO DE DIPLOMA Paquete de funciones para la modificación de imágenes de células vegetales en suspensión para facilitar el conteo celular Autor: Yoisel Leopoldo Rojas Hernández. Tutor: Ing. Julio Cesar Ventosa Almeida Ing. Denis Hernández Pacheco. Santa Clara 2008 “Año 50 de la Revolución”.

(2) Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Departamento de Telecomunicaciones y Electrónica. TRABAJO DE DIPLOMA Paquete de funciones para la modificación de imágenes de células vegetales en suspensión para facilitar el conteo celular Autor: Yoisel Leopoldo Rojas Hernández [email protected]. Tutor: Ing. Julio Cesar Ventosa Almeida Prof. Instructor, CEETI, Facultad Eléctrica, [email protected]. Ing. Denis Hernández Pacheco Prof. Instructor, CEETI, Facultad Eléctrica, [email protected] Santa Clara 2008 “Año 50 de la Revolución”.

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ingeniería en Telecomunicaciones y Electrónica, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. Firma del Autor. Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. Firma del Autor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. Firma del Responsable de Información Científico-Técnica.

(4) i. PENSAMIENTO. “Lo que sabemos es una gota, lo que ignoramos, un océano” Isaac Newton.

(5) ii. DEDICATORIA. Tener la oportunidad de cursar y vencer estudios universitarios constituye una meta difícil de alcanzar, pues los tiempos actuales requieren de un esfuerzo titánico para cumplir con las exigencias del plan de estudio, concebido en la especialidad de Ing en Telecomunicaciones y Electrónica, de la Universidad Central de las Villas. Si a esto se le une la crisis económica que sufre actualmente nuestro país, producto a la política genocida del gobierno norteamericano, no es difícil darse cuenta que el estudiante universitario y su familia, deben tener mucha voluntad y mucha paciencia para poder vencer todos los obstáculos que el pasado, el presente y el futuro impone. Por esta razón dedico este trabajo de diploma a la persona que ha vivido, junto a mi, los momentos felices y los momentos tristes de esta larga carrera universitaria. Dedico este ejercicio de graduación a la persona que me ha apoyado incondicionalmente en mi actividad estudiantil, aun sin poder hacerlo. Dedico este festejo personal a una mujer que ha sido durante toda mi vida, padre y madre. En fin, este logro está dirigido a Margarita Hernández García, mi madre. Gracias por todo el apoyo que me has dado, te quiere, tu hijo yoisel..

(6) iii. AGRADECIMIENTOS. A lo largo de este período he recibido la ayuda de muchas personas, realmente son variadas las formas de dar y recibir apoyo. Lléguele mis más sinceros agradecimientos a todos aquellos amigos y familiares que de una forma u otra me han sacado de aprietos, brindándome su más sincera atención.. En especial, agradezco al Ing. Aslián Rodríguez Caballero, mi amigo, por mostrarme el hermoso mundo de la tecnología y por apoyarme, con su experiencia, en el transcurso de los años que componen la especialidad. Gracias por la atención y la paciencia que me tuviste.. En especial, agradezco al Ing. Denis Hernández Pacheco, mi amigo, por dedicarme tanto tiempo en el desarrollo de este trabajo de diploma, sin su apoyo no hubiese sido posible lograr la terminación y calidad del trabajo. Sin su espontaneidad e ingenio, este tema no hubiese existido. Gracias amigo Berlusconi..

(7) iv. TAREA TÉCNICA La realización de un estudio de las características de las imágenes digitales celulares. La realización de un estudio de las características de las imágenes utilizadas para el conteo de objetos. La realización de un estudio de las técnicas de mejorado de contraste de imágenes. La realización de un estudio de las técnicas de realce en imágenes. La realización de un estudio de las técnicas de detección de bordes en imágenes. La realización de un estudio de las técnicas de reducción de ruido en imágenes. La realización de un estudio de las técnicas de filtrado de imágenes. La realización de un estudio de las técnicas morfológicas aplicadas a imágenes. La realización de un estudio de las técnicas de restauración de imágenes. La evaluación de la efectividad de las técnicas propuestas.. Firma del Autor. Firma del Tutor.

(8) v. RESUMEN. Actualmente en la mayoría de los centros de biotecnología de las plantas del país no se utilizan las técnicas de Procesamiento Digital de Imágenes (PDI) para el tratamiento de las imágenes microscópicas. El Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) no cuenta con softwares para la clasificación y conteo celulares utilizados en los estudios de plantas transgénicas, sino que estos procedimientos se realizan de manera manual con todos los inconvenientes relacionados con los errores humanos y de distribución de recursos que esto acarrea. El trabajo tiene como objetivo desarrollar una metodología para obtener imágenes de células vegetales en suspensión aptas para el conteo celular utilizando las técnicas de PDI. Eliminándose las partículas no deseadas de la imagen y logrando un procedimiento que contribuya, en alguna medida, a conservar la forma y tamaño celular. La metodología propuesta incrementa la confiabilidad del estudio de imágenes celulares. Reduce de manera considerable el costo humano implicado e incrementa la eficiencia y eficacia del proceso, garantizando el buen funcionamiento de los algoritmos de conteo celular. Con este proyecto se pretende contribuir al desarrollo de los procesos de estudios celulares que se realizan en el IBP, ofreciéndose una respuesta a la constante demanda de desarrollo que enfrenta el país en esta rama con soluciones económicamente factibles. El algoritmo desarrollado permite obtener imágenes binarias que son representativas de la imagen original, manteniendo, en alguna medida, los parámetros de forma y tamaño celular, logrando eliminar todas las impurezas presentes en la muestra, facilitando con esto el desempeño de los algoritmos de clasificación y conteo celular..

(9) vi TABLA DE CONTENIDO. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................1 CAPÍTULO 1.. IMÁGENES DIGITALES PARA EL CONTEO CELULAR Y. TÉCNICAS DEL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES ....................................5 1.1. Imágenes digitales de microscopía celular .............................................................5. 1.1.1. Algunas características de las imágenes de microscopia celular....................8. 1.2. Imágenes utilizadas en el conteo de objetos. Características................................10. 1.3. Procesamiento digital de imágenes para la modificación de la información. pictórica ............................................................................................................................11 1.3.1. Mejorado del contraste..................................................................................11. 1.3.1.1. Modificación global del histograma .........................................................12. 1.3.1.2. Ecualización adaptativa del histograma limitada en contraste (CLAHE) 16. 1.3.1.3. Ecualización del histograma adaptativo (AHE)........................................16. 1.3.2. Detección de bordes......................................................................................18. 1.3.3. Restauración..................................................................................................19. 1.3.4. Reducción de ruido .......................................................................................19. 1.3.5. Filtrado..........................................................................................................24. 1.3.6. Realce............................................................................................................26. 1.3.7. Transformaciones geométricas .....................................................................26. CAPÍTULO 2.. DESCRIPCIÓN. DE. LA. METODOLOGÍA. PARA. LA. MODIFICACIÓN DE LAS IMÁGENES DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN 28 2.1 Selección de las herramientas .....................................................................................28.

(10) vii 2.1. Selección de las técnicas de procesamiento que modifican la información. pictórica ............................................................................................................................29 2.2. Selección de las técnicas de mejorado de contraste..............................................30. 2.3. Selección de las técnicas de filtrado .....................................................................31. 2.4. Selección de las técnicas de detección de bordes .................................................33. 2.5. Selección de las técnicas morfológicas.................................................................33. 2.6. Selección de la metodología para la modificación de imágenes de células. vegetales en suspensión ....................................................................................................34 CAPÍTULO 3.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..............................................................37. 3.1. Descripción del experimento ................................................................................37. 3.2. Algoritmo # 1 para la modificación de las imágenes de células vegetales en. suspensión.........................................................................................................................37 3.3. Algoritmo # 2 para la modificación de las imágenes de células vegetales en. suspensión.........................................................................................................................38 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................................40 Conclusiones.....................................................................................................................40 Recomendaciones .............................................................................................................41 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................42 Anexo I. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. promedio (average)...........................................................................................................43 Anexo II. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. disco (disk) 45 Anexo III. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. gaussiano (gaussian).........................................................................................................47 Anexo IV. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. laplaciano (laplacian) .......................................................................................................49.

(11) viii Anexo V. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. logarítmica (log) ...............................................................................................................51 Anexo VI. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de filtro. prewitt. 53. Anexo VII. Imágenes obtenidas a partir del filtrado lineal espacial con máscara de. filtro sobel. 55. Anexo VIII. Imágenes obtenidas a partir de los métodos de detección de bordes de. sobel, prewitt, roberts, log, zerocross, canny ...................................................................57 Anexo IX. Algoritmos desarrollados para la modificación de las imágenes de células. vegetales en suspensión ....................................................................................................60.

(12) INTRODUCCIÓN. 1. INTRODUCCIÓN. En los estudios celulares se utilizan fotografías digitales de alta resolución, que al igual que ocurre con otros métodos de adquisición de imágenes, se encuentran afectadas por las características del sistema de adquisición y de almacenamiento de los datos. En el caso particular de las imágenes obtenidas a través de un microscopio digital, a este inconveniente se le añade que, para su estudio, la preparación de la muestra se realiza en una disolución acuosa que aporta partículas no deseadas que se comportan como ruido agregado a la imagen. Además, en algunos casos se utilizan también tinturas o disoluciones para hacer más visibles o para separar las agrupaciones de células, que pueden haberse formado en el proceso de preparación de la muestra, cuyo efecto se suma a los ya conocidos problemas asociados a la adquisición de imágenes digitales: contraste, ruido, desenfoque y distorsión. Las técnicas del procesamiento digital de imágenes constituyen una herramienta que aplicada adecuadamente puede resolver o atenuar, en gran medida, los problemas asociados con el tratamiento de imágenes celulares, incrementando la confiabilidad del estudio, reduciendo de manera considerable el costo humano implicado e incrementando la eficiencia y eficacia del proceso, debido a las ventajas asociadas a su automatización. En el caso específico de las aplicaciones de conteo de objetos, el objetivo es obtener una imagen que represente solamente los objetos de interés sobre un fondo homogéneo, de forma tal que los algoritmos de conteo no se vean afectados por partículas no deseadas. Este trabajo tiene como propósito desarrollar una metodología para obtener imágenes aptas para el conteo celular, a partir de las imágenes de células vegetales en suspensión de plátano gran enano, obtenidas en el Instituto de Biotecnología de las Plantas, utilizando las técnicas de procesamiento digital de imágenes. Este proceso implica la eliminación de las.

(13) INTRODUCCIÓN. 2. partículas no deseadas que se introducen en la imagen como consecuencia de la preparación de la muestra y la obtención de una imagen en blanco y negro que sea representativa de la imagen original y que mantenga, en alguna medida, los parámetros de forma y tamaño celular. Actualmente en la mayoría de los centros de biotecnología de las plantas y laboratorios clínicos del país no se utilizan las técnicas de procesamiento digital de imágenes, para el tratamiento de las imágenes microscópicas. Aunque estas técnicas están desarrolladas desde la década del 50, el uso de las mismas implica inversiones costosas tanto en equipamiento, como en software de propósitos específicos, debido a las características de este tipo de imágenes. Con este proyecto se pretende contribuir al desarrollo de los procesos de estudios celulares que se realizan en el Instituto de Biotecnologías de las Plantas, de manera que se alcance una mayor eficiencia y eficacia; y se ofrezca además, una respuesta a la constante demanda de desarrollo que enfrenta el país en esta rama, con soluciones económicamente factibles. Objetivo Desarrollar un paquete de funciones utilizando Matlab 7.0 y las técnicas del procesamiento digital de imágenes, para obtener imágenes que permitan aumentar la eficiencia y la eficacia de los algoritmos de conteo de objetos y que mantengan, en alguna medida, las características de forma y tamaño de las células originales, para utilizarlas en los proceso de clasificación y conteo de células vegetales en suspensión, realizados en el laboratorio de plantas transgénicas del Instituto de Biotecnología de las Plantas. Objetivos Específicos 1. Realizar un estudio de las características de las imágenes digitales de microscopia celular. 2. Realizar un estudio de las características de las imágenes digitales utilizadas para el conteo de objetos. 3. Realizar un estudio del estado del arte de las técnicas de mejorado de contraste utilizadas en imágenes digitales..

(14) INTRODUCCIÓN. 3. 4. Realizar un estudio del estado del arte de las técnicas de detección de bordes utilizadas en imágenes digitales. 5. Realizar un estudio del estado del arte de las técnicas de reducción de ruido utilizadas en imágenes digitales. 6. Desarrollar un paquete de funciones que permita obtener imágenes aptas para el conteo de objetos, a partir de imágenes de células vegetales en suspensión, utilizando las técnicas del procesamiento digital de imágenes. Con la ejecución del proyecto se dan soluciones a problemáticas modernas, vinculadas con la adquisición de un software de complejidad y valor, cuya adquisición no es viable actualmente en el Instituto de Biotecnología de las Plantas. Además, con el estudio realizado se optimiza el proceso de estudios celulares, lo cual tiene un impacto directo en el desarrollo de esta rama en el país y consecuencias económicas importantes. Este trabajo es la primera parte de un proyecto en desarrollo conjunto entre el Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) y el Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información (CEETI). El IBP aportará las imágenes de células vegetales necesarias para llevar a cabo la investigación y el soporte técnico para validar el proceso. El CEETI aportará especialistas en procesamiento digital de imágenes para el desarrollo del proyecto. Se cuenta con la tecnología adecuada, tanto para la adquisición de este tipo de imágenes, como para el procesamiento de las mismas (computadoras, software). Estructura del documento Este documento consta de los capítulos siguientes: “Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes”, “Descripción de la metodología para la modificación de las imágenes de células vegetales en suspensión” y “Resultados y discusión”. El Capítulo 1, “Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes”, se realiza una revisión de la teoría básica de las imágenes digitales utilizadas en el conteo celular, y se revisan las técnicas de procesamiento digital de imágenes dirigidas a la modificación de la información pictórica, como son, el mejorado.

(15) INTRODUCCIÓN. 4. del contraste, la detección de bordes, la restauración, la reducción de ruido, el filtrado, el realce, y las transformaciones geométricas. El Capítulo 2, “Descripción de la metodología para la modificación de las imágenes de células vegetales en suspensión”, se presentan dos metodologías para la modificación de las imágenes de células vegetales en suspensión. Se describen las herramientas y técnicas utilizadas para desarrollar el paquete de funciones. En el Capítulo 3, “Resultados y discusión”, se hace un análisis del desempeño de los algoritmos propuestos para la modificación de la información pictórica de imágenes de células en suspensión de plátano gran enano..

(16) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 5. CAPÍTULO 1. IMÁGENES DIGITALES PARA EL CONTEO CELULAR Y TÉCNICAS DEL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES. En este capítulo se hace una revisión de la teoría básica de las imágenes digitales, utilizadas para el conteo de objetos, enfocado principalmente a las imágenes digitales de microscopía celular y sus características. Se revisan también las técnicas del Procesamiento Digital de Imágenes (PDI) dirigidas a la modificación de la información pictórica, como son el mejorado del contraste, la detección de bordes, la restauración, la reducción de ruido, el filtrado, el realce, y las transformaciones geométricas. 1.1. Imágenes digitales de microscopía celular. Desde el punto de vista físico, la imagen es una distribución bidimensional de energía electromagnética. Si se considera una fuente radiante, cuya distribución espectral de energía esté dada por una función c(λ) y se le hace incidir sobre una superficie de reflectancia ρ(λ), la energía E devuelta será: [1] E = K ∫ c(λ )ρ (λ )dλ λ. Siendo K una constante asociada al coeficiente de reflectancia del material. Existen dos tipos de imágenes usadas en la imagenología: las imágenes analógicas y las imágenes digitales. Las imágenes analógicas se reproducen mediante dispositivos electrónicos analógicos que registran los datos de la imagen con precisión, utilizando varios métodos, como pueden ser una secuencia de fluctuaciones de la señal eléctrica o cambios en la naturaleza química de.

(17) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 6. la emulsión de una película, que varían continuamente en los diferentes aspectos de la imagen. Para procesar o visualizar en el ordenador una imagen analógica se debe convertir primero a un formato comprensible para el ordenador o formato digital [2]. Una imagen digital es una representación de una imagen en dos dimensiones, como un conjunto finito de valores digitales que se denominan píxeles y se obtiene cuando se discretiza una imagen tanto en las coordenadas espaciales como en el brillo o intensidad. Matemáticamente se puede representar como f(x, y), donde x e y representan las coordenadas espaciales y f es el valor, en un punto cualquiera (x, y), del brillo o intensidad de la imagen. Píxel es un término que deriva de la contracción de picture by element, (imagen por elemento), y es la unidad mínima que forma una imagen informática. Típicamente los píxeles se almacenan en memorias en forma de arreglos de enteros en dos dimensiones. Cada píxel de una imagen se asocia a una posición dentro de este arreglo y tiene un valor correspondiente a una o más muestras relativas a esta posición [1]. Las imágenes digitales se clasifican de acuerdo con la cantidad y naturaleza de estas muestras en: •. Imágenes binarias (también conocidas como. imágenes de dos niveles): son. imágenes en las que cada uno de sus píxeles puede tomar solo dos posibles valores. Generalmente son imágenes en blanco y negro, y los valores que se asignan a cada píxel a menudo son 0 para representar el negro y 1 (255) para representar el blanco. Las imágenes binarias se utilizan principalmente para la identificación de objetos, orientación e interpretación de texto. Figura 1.1.1 ⎧1 para b ( x, y ) = ⎨ ⎩0 para. puntos del objeto puntos del fondo.

(18) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 7. Figura 1.1.1. Imagen binaria. •. Imágenes en escala de grises: en este tipo de imágenes el valor de cada píxel representa solo una muestra. Las imágenes de este tipo generalmente están compuestas por varios tonos de gris, variando desde el negro hasta el blanco. Estas imágenes a menudo son el resultado de medir la intensidad de la luz en cada píxel. Las imágenes en escala de grises típicamente se almacenan usando 8 bits por píxel muestreado, lo que permite obtener 256 niveles de intensidades o tonos de gris diferentes. La precisión que provee este formato es apenas suficiente para permitir la visibilidad de algunos detalles, pero es muy conveniente para los propósitos de la programación y para algunas aplicaciones poco exigentes.. •. Imágenes en colores: este tipo de imágenes incluye información de color para cada píxel. Para obtener resultados aceptables visualmente, es necesario tomar tres muestras por cada píxel, una por cada uno de los colores básicos. Estas muestras son interpretadas como coordenadas en el espacio de color que puede ser RGB, YUV, o HSV, entre otros.. Las imágenes digitales pueden clasificarse de acuerdo a su forma de representación: • Imágenes raster o vectoriales: son imágenes en las que la información de cada uno de los puntos se recoge en forma de ecuación matemática, que lo relaciona con el resto de los puntos que forman la imagen. Ofrece la gran ventaja de que la calidad de la imagen no varía al modificar el tamaño, ya que la información de cada punto no es absoluta sino relativa al resto de la imagen. Además, debido a su definición.

(19) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 8. matemática apenas ocupa espacio, ya que una fórmula que la represente es suficiente para describir todos los puntos que la componen. Es el tipo adecuado para el diseño de línea y figura [1]. • Imágenes de mapa de bits o bitmap: tal como sugiere su nombre, se construyen describiendo cada uno de los puntos que componen la imagen y llevan, por tanto, información acerca de la posición absoluta y el color de cada uno de ellos. La ventaja que presenta este formato es la posibilidad de recoger una amplísima gama tonal, por lo que es el tipo adecuado para representar imágenes captadas de la realidad. A cambio, la variación de tamaño supondrá modificaciones en la calidad, ya que el número de celdas que forman la imagen permanece invariable, por lo que un aumento del tamaño hace que el único recurso posible sea ampliar el tamaño de cada una de ellas [2]. Las imágenes de microscopía celular son imágenes digitales, que se utilizan para observar los objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. La adquisición de este tipo de imágenes requiere el uso de equipos con características especiales. Como consecuencia los valores de los parámetros resolución, y profundidad de bits de estas imágenes son elevados, en comparación con otras imágenes digitales utilizadas en el campo de la imagenología médica.. 1.1.1. Algunas características de las imágenes de microscopia celular. Las imágenes de microscopia celular se caracterizan por tener altos valores de resolución y profundidad de bits. Estos parámetros inciden directamente en la calidad y tamaño de la imagen. Un parámetro importante en las imágenes digitales es la profundidad de bits, que es la cantidad de bits que existen en un sistema digital para representar cada píxel de la imagen. Cuanto mayor sea la profundidad de bits, mayor será la cantidad de tonos, escala de grises o colores, que puedan ser representados. Por ejemplo, con una profundidad de bits de 4 bits por píxel, un píxel está limitado a tener solamente 16 valores de brillo. Los sistemas de adquisición que permiten obtener imágenes de microscopía celular, necesitan tener un valor.

(20) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 9. de profundidad de bits alto, para representar los detalles microscópicos. Típicamente una resolución adecuada para la visión humana se consigue en sistemas con profundidad de bits de 8 bits por píxel, con lo que se puede representar hasta 256 niveles de brillo diferentes en cada píxel. Estas imágenes se caracterizan por tener hasta 24 bits por píxel. La resolución describe los detalles de una imagen y tiene significados diferentes dependiendo de las tres variantes que la definen: resolución espacial, rango dinámico y frecuencia espacial. La resolución espacial es la capacidad de distinguir los detalles espaciales en una imagen y es un término utilizado tanto en el contexto digital como en el analógico. El convenio utilizado para describir la resolución espacial se basa en dos números enteros: uno para describir la cantidad de píxeles por fila y el otro para describir la cantidad de píxeles por columnas. Otra forma muy popular de definir la resolución espacial de una imagen es a partir del número total de píxeles que conforman la misma [3]. El rango dinámico es el intervalo de diferencia tonal entre la parte más clara y la más oscura de una imagen. Cuanto más alto sea el rango dinámico, se pueden potencialmente representar más matices, a pesar de que el rango dinámico no se correlaciona en forma automática con la cantidad de tonos reproducidos, sino que esto depende de la profundidad de bits. El rango dinámico describe la capacidad de un sistema digital de reproducir información tonal, pero a diferencia de la profundidad de bits, el rango dinámico está limitado tanto por la capacidad de captura, como de visualización, en términos del intervalo de contraste. Esta capacidad es más importante en los documentos de tono continuo que exhiben tonos que varían ligeramente y en el caso de las fotografías puede ser el aspecto más importante de la calidad de imagen [5]. Por lo general la frecuencia espacial a la cual se realiza el muestreo de una imagen digital, frecuencia de muestreo, es un buen indicador de la resolución. Este es el motivo por el cual, los puntos por pulgada o píxeles por pulgada, son términos comunes y sinónimos utilizados para expresar la resolución de imágenes digitales. Generalmente, pero dentro de ciertos límites, el aumento de la frecuencia de muestreo también ayuda a aumentar la resolución. La resolución de las imágenes digitales depende además del tamaño de los píxeles. Esto se.

(21) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 10. debe a que todos los detalles dentro de un píxel individual son tomados en su conjunto y representados por un solo valor. El tamaño físico de un píxel, o lo que es lo mismo, el grado de detalle de una imagen se determina por la proporción que existe entre el tamaño real de la imagen y el tamaño de la matriz de la imagen. El tamaño de la imagen es la dimensión del campo de vista, FOV (Field Of View), no el tamaño de la imagen visualizada. El tamaño de la matriz es el número de píxeles sobre toda la longitud y ancho de una imagen. El incrementar el tamaño de la matriz, por ejemplo de 1024 píxeles a 2048 píxeles, sin cambiar el campo de vista de la imagen, producirá píxeles más pequeños y por consiguiente imágenes con mayor grado de detalle. 1.2. Imágenes utilizadas en el conteo de objetos. Características. Para el reconocimiento de patrones en imágenes digitales, es decir, la identificación de algún objeto presente en la escena, es necesario encontrar las características de los mismos que lo diferencien del resto de la imagen o fondo. La extracción de estas características se basa en algoritmos que identifican los objetos a partir de su forma, o a partir de los valores que toman en algún dominio que logre describirlos. En la mayoría de los casos, los métodos de clasificación y de conteo de objetos requieren de un procesamiento previo de la imagen que garantice la selección adecuada de los objetos y con ello un mejor desempeño de los algoritmos utilizados. Así, las imágenes utilizadas en estos procesos deben ser representativas de los objetos de interés, de manera que se consiga la mayor eficiencia y eficacia de los algoritmos usados. Esta representatividad está asociada no solo a la detección e identificación de los objetos, sino también a la preservación de determinados patrones que se quiera mantener de la imagen original para algún propósito [7]. Como la finalidad de los algoritmos de conteo de objetos, es contar los de objetos que pertenecen a una misma clase, las imágenes utilizadas para este propósito pueden caracterizarse por ser de baja resolución, baja profundidad de bits y ser imágenes binarias, debido a que los algoritmos usados para este propósito basan su funcionamiento en la identificación clara del objeto sobre su fondo..

(22) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 1.3. 11. Procesamiento digital de imágenes para la modificación de la información pictórica. El PDI es la disciplina científica que se ocupa de realizar transformaciones a la información visual, con el objetivo de facilitar su análisis, almacenamiento, transmisión o empleo en determinadas aplicaciones, auxiliándose de medios computacionales. Las diversas clases de procesado digital de imágenes biomédicas pueden agruparse de acuerdo al fin que persiguen; así tendríamos tres grandes grupos: 1. El que incluye aquellas clases de procesado que modifican la información pictórica para influir sobre la percepción humana y la interpretación de las mismas. 2. El que incluye aquellas clases de procesado de la información contenida en la imagen para ayudar en la toma de decisiones. 3. Otras clases de procesado digital. El interés de este trabajo se centra en las técnicas de procesamiento que modifican la información pictórica. Entre estas pueden citarse: • Mejorado del contraste: redistribución del rango de grises. • Detección de bordes: búsqueda de puntos de frontera. • Restauración: disminución de la degradación. • Reducción de ruido: limpieza. • Filtrado: modificación de la composición espectral o espacial. • Realce: mejora de la apariencia, definición, etc. • Transformación geométrica: modificación de la morfología.. 1.3.1. Mejorado del contraste. El contraste es un término que a menudo es usado para describir los atributos de brillo de una imagen y se define como la mínima diferencia de luminancia que existe entre dos puntos de una imagen. Es un elemento importante tanto para mejorar subjetivamente la interpretación humana de la imagen, como para facilitar el reconocimiento, diferenciación o.

(23) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 12. análisis automático de los objetos. El contraste es un factor decisivo en cualquier evaluación subjetiva de una imagen [4]. Entre las técnicas más utilizadas en el mejorado del contraste en imágenes pueden citarse: • Modificación global del histograma. • Contrast-Limited Adaptive Histogram Equalization (CLAHE). • Ecualización del Histograma Adaptativo (AHE).. 1.3.1.1 Modificación global del histograma El histograma es un diagrama de barras cuyas abscisas representan los niveles de gris de una imagen, y las ordenadas, las frecuencias relativas de los distintos niveles de gris, es decir, la cantidad de puntos asociados a cada nivel de gris, dividido por la cantidad total de puntos de la imagen y contiene la información de la probabilidad de aparición de las distintas tonalidades de color que contiene el rango dinámico, ya sea trabajando con distintos modelos de colores o en escala de grises. No obstante, el uso del histograma y sus modificaciones se aplican mucho mejor a imágenes en escala de grises [5].. p r (rk ) =. nk , siendo nk, la cantidad de píxeles del nivel de gris k, y n la cantidad total de n. píxeles. Un histograma se muestra como una gráfica donde en el eje horizontal está el brillo, que va de 0 hasta 255, para una profundidad de bits de 8 bits, y en el eje vertical el número de píxeles. El histograma proporciona una descripción de la apariencia global de una imagen, es una representación conveniente y fácil de leer, donde se relaciona la concentración de píxeles y el brillo en una imagen, figura 1a, b, c y d. Si los niveles de gris están concentrados hacia el extremo oscuro del intervalo de la escala de gris, la apariencia global de la imagen será oscura, figura 1.a; mientras que si sucede lo contrario, la imagen correspondiente será brillante, figura 1.b. Por su parte, un histograma que presente un perfil estrecho corresponderá a una imagen de bajo contraste, figura 1.c y un histograma con una dispersión considerable a una imagen de alto contraste, figura 1.d [5]..

(24) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 13. 6000. 5000. 4000. 3000. 2000. 1000. 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 2000. 1500. 1000. 500. 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 2000. 1500. 1000. 500. 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 1000. 800. 600. 400. 200. 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. Figura 1.4.1.1.1 a, b, c y d. Imágenes y sus histogramas correspondientes. a) Imagen de apariencia global oscura. b) Imagen brillante. c) Imagen de bajo contraste. d) Imagen de alto contraste..

(25) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 14. Existen un conjunto de técnicas de procesado que se basan en la modificación global del histograma, básicamente pueden dividirse en dos grupos: ecualización y especificación de histograma. La ecualización del histograma de una imagen es una transformación que pretende obtener para una imagen un histograma con una distribución uniforme. Aunque el histograma es una función de dominio discreto, su ecualización está inspirada en una operación sobre funciones de dominio continuo. Supóngase que s es una variable aleatoria con valores en el intervalo continuo [0 1], con función de densidad f(s) y función de distribución F(s). Si queremos definir una nueva variable aleatoria r que sea función de s y que tenga distribución uniforme en [0 1], se debe cumplir que: s. r = F ( s ) = ∫ f (t )dt 0. Si el rango de variable s es estrecho, la trasformación expande el rango uniformemente sobre el intervalo [0 1]. Si f(s) es la densidad asociada al histograma, supuesto continuo, hemos obtenido una solución para el caso continuo. Para el caso no continuo, discretizamos la integral, dividiendo [0 1] en 256 partes iguales, para una profundidad de bits de 8 bits, para obtener una solución correspondiente a una escala de 256 niveles de gris. Quedando: k. F (k ) = ∑ f ( i =1. 1 i ) 256 256. La transformación F define una operación puntual que a cada píxel de nivel de gris k, lo transforma en un píxel de nivel de gris F(k), logrando una ampliación del rango dinámico de la imagen dada. Si F(0) es distinto de cero, mediante la utilización de la siguiente aplicación se pueden distribuir los niveles de gris en todo el rango dinámico. G (k ) = 255. F (k ) − F (0) 255 − F (0). El resultado de la ecualización maximiza el contraste de una imagen sin perder información de tipo estructural, esto es, conservando su entropía. La ecualización global del histograma no nos permite hacer el realce interactivamente y genera un sólo resultado: una aproximación a un histograma uniforme..

(26) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 15. Sin embargo, algunas veces necesitamos poder especificar un tipo de histograma con una forma particular, capaz de realzar ciertos niveles de gris. La especificación del histograma, constituye una generalización de la técnica anterior [12]. Este proceso requiere como entrada un histograma deseado y una imagen. Se realiza en dos sencillos pasos: [12] 1. Ecualizar el histograma de la imagen original. 2. Realizar una ecualización inversa sobre el histograma de la imagen ecualizada. La primera transformación, descrita anteriormente, nos permite pasar de una imagen con unas características dadas por la forma de su histograma, a una imagen con un histograma que aproxima una distribución uniforme. Para realizar una ecualización inversa sobre el histograma de la imagen ecualizada, se especifica la función de densidad deseada y se obtiene la transformación G(z). k. k. nj. i =0. j =0. n. v = G ( z k ) = ∑ p z ( z i ) ≈∑. , siendo pz la función de densidad deseada.. A continuación se aplica la función de transformación inversa z = G −1 ( s ) a los niveles de gris obtenidos en el paso 1. La segunda transformación nos permite pasar de la imagen "neutra" a una nueva imagen cuyo histograma tiene la forma dada por el histograma deseado que se ha utilizado [6]. Estas técnicas consisten, básicamente, en una expansión del histograma de la imagen, de forma que se haga más lineal y que ocupe el mayor intervalo del espectro de tonalidades grises. Las mejoras que se obtiene al aplicar estas técnicas sobre las imágenes son: [6] • Una mayor utilización de los recursos disponibles: al modificar de forma global el histograma, los tonos que antes estaban más agrupados, ahora se han separado, ocupando todo el intervalo de grises, por lo que la imagen se está enriqueciendo al tener muchos más niveles de gris, mejorando, por tanto, la apariencia visual..

(27) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 16. • Un aumento del contraste: esta ventaja es una consecuencia del punto anterior, ya que si hacemos que el histograma de la imagen ocupe el mayor intervalo de niveles de grises, estamos aumentando la distancia entre el tono más claro y el más oscuro de la imagen, aumentando el contraste de la imagen. • Constituyen una regulación óptima y automática del contraste de la imagen. Evitando los ajustes manuales con los que no se consigue un equilibrio óptimo entre el blanco y el negro. Las desventajas de estas técnicas están asociadas a la pérdida de información: puede ocurrir que algunos píxeles que en la imagen original tenían distintos niveles de gris, se les asigne, tras la ecualización global, el mismo nivel de gris. Por otro lado, hay casos en los que dos niveles de gris muy próximos se separen, dejando huecos en el histograma.. 1.3.1.2 Ecualización adaptativa del histograma limitada en contraste (CLAHE). El método de CLAHE (Contrast-Limited Adaptive Histogram Equalization) opera sobre pequeñas regiones de la imagen denominadas azulejos (tiles), en lugar de la imagen completa. El contraste de cada tile se modifica, de manera que el histograma modificado de cada tile coincide aproximadamente con el histograma especificado por el parámetro de distribución, que puede ser uniforme, rayleigh, o exponencial. Los tiles vecinos se combinan usando interpolación bilineal para eliminar las fronteras artificiales inducidas. El contraste, especialmente en áreas homogéneas, puede limitarse para evitar cualquier amplificación de ruido que pueda presentarse en la imagen.. 1.3.1.3 Ecualización del histograma adaptativo (AHE). La ecualización del histograma adaptativo es un método que permite altas velocidades de procesamiento y una atenuación significativa del ruido en la imagen. Estos excelentes resultados se obtienen gracias a que este método utiliza la interpolación. Para obtener altas velocidades de ejecución el método AHE, en vez de hacer la ecualización del histograma de todos los píxeles, con sus correspondientes regiones de contexto, se.

(28) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 17. realizará solo en algunos puntos. El único valor que se modificará con cada ecualización será el píxel central, los demás se obtendrán mediante la interpolación [8]. Cada región contextual afectará con su ecualización del histograma a una zona que es doble a la que ocupa, así una región Rij afectará a una zona Sij.. Figura 1.4.1.3.2. Zonas afectadas por la ecualización de cada región contextual. De esta forma si tomamos cuatro regiones vecinas el resultado será el siguiente:. Figura 1.4.1.3.3. Efecto de cuatro regiones vecinas sobre una zona. Se puede observar que hay una zona que está afectada por las cuatro regiones. En esta zona se producirá un mapeo de los puntos pertenecientes a ella por interpolación de las cuatro zonas mencionadas. El valor final de cada píxel se obtendrá por la aplicación del mapeo del píxel con su peso correspondiente a cada zona:.

(29) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 18. Figura 1.4.1.3.5. Zonas usadas para el mapeo de los píxeles. Si se considera que: m - - = Mapeo de la zona superior izquierda. (x -, y -) m + - = Mapeo de la zona superior derecha. (x +, y -) m - + = Mapeo de la zona inferior izquierda. (x -, y +) m + + = Mapeo de la zona inferior derecha. (x +, y +) El valor final obtenido estará representado por la siguiente expresión matemática: m(i ) = a[b * m− − (i ) + (1 − b) * m+ − (i )] + [1 − a ] * [b * m− + (i ) + (1 − b) * m+ + (i )]. donde: a=. ( y+ − y− ) ( x − x− ) ,y b= + ( y+ − y− ) ( x+ − x− ). Obteniéndose los puntos pertenecientes a la parte central de la imagen.. 1.3.2. Detección de bordes. En una imagen un borde es una curva que sigue un camino de cambio brusco en los valores de intensidad de la misma. Los bordes a menudo están asociados con las fronteras entre los objetos de la escena. De manera general, las técnicas de detección de bordes identifican los lugares en la imagen donde ocurren cambios bruscos en los valores de intensidad, usando uno de los criterios: 1) lugares donde la primera derivada del valor de intensidad es mayor en magnitud que algún umbral; 2) lugares donde la segunda derivada del valor de intensidad tiene un cruce por cero [9]..

(30) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 19. La detección de bordes está basada en estimadores derivativos, cada uno de los cuales implementa una de las dos definiciones numeradas anteriormente. Para algunos de estos estimadores se puede especificar si la operación será sensible a los bordes horizontales, verticales, o ambos. El éxito de los algoritmos de detección de bordes depende en gran medida de la calidad de las imágenes, específicamente de su contraste. Las técnicas de detección de bordes soportan otras técnicas como la segmentación, el mejoramiento, el registro, el filtrado, las transformaciones geométricas y la clasificación.. 1.3.3. Restauración. La restauración de una imagen es un proceso que permite recuperar una parte deteriorada de la imagen o que tiene algún objeto que la oculta, con el objetivo de mejorar su calidad. Las técnicas de restauración utilizan sofisticados algoritmos para recuperar las regiones dañadas o perdidas de las imágenes, a partir de la información disponible de su entorno. Por eso, esta técnica puede ser interpretada como un tipo especial de interpolación [13]. Los objetivos y las aplicaciones de la restauración de imagen son numerosos. Este proceso permite eliminar el desemborronado, el ruido, corregir las distorsiones geométricas causadas por los sensores, mejorar el brillo, el color y los detalles de una imagen. Las técnicas de restauración han evolucionado a lo largo del tiempo. Al principio se basaban en técnicas aplicadas en el dominio de la frecuencia. Actualmente se basan en métodos algebraicos y la manipulación de grandes sistemas de ecuaciones.. 1.3.4. Reducción de ruido. Entendemos por ruido en imágenes digitales cualquier valor de un píxel de una imagen que no se corresponde exactamente con la realidad, es decir, cualquier entidad en las imágenes, datos o resultados intermedios que no son interesantes para la computación que se pretende llevar a cabo, puede considerarse ruido. Cuando se adquiere una imagen digital, generalmente ésta está contaminada por ruido. El ruido se debe, la mayoría de las veces al equipo electrónico utilizado en la captación de las.

(31) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 20. imágenes (ruido de cuantificación de la imagen, efecto de niebla en la imagen, entre otros) y al ruido añadido en los tramos de transmisión (posibles interferencias o errores al transmitir los bits de información) [10]. Entre los modelos de ruido que afectan las imágenes digitales pueden citarse: •. Ruido uniforme: matemáticamente se corresponde con una función de densidad probabilística. con. distribución. uniforme. en. el. intervalo. [a,. b]:. ⎧ 1 a≤ x≤b a+b ⎪ f ( x) = ⎨ b − a ; la media de esta distribución es µ = ; y su varianza 2 ⎪⎩ 0 ∀ 2 ( b − a) . es σ =. 12. •. Ruido gaussiano aditivo: matemáticamente se corresponde con una función de densidad f ( x) =. probabilística. con. distribución. gaussiana:. ⎡ 1 (x − µ )2 ⎤⎥ ; siendo µ la media de esta distribución y σ su exp ⎢− 2 ⎣ 2σ ⎦ 2πσ 1. 2. varianza. El 70% de los datos se encuentran en el intervalo [µ -σ, µ +σ]. El 95% en el intervalo [µ -2σ, µ +2σ]. •. Ruido de sal y pimienta: matemáticamente se corresponde con una función: ⎧ I ( x, y ) x < p ⎪ f ( x, y ) = ⎨ A p ≤ x < q ; siendo x ∈ [0,1) 0 ≤ p ≤ q ≤ 1 , y A, B son números ⎪B q ≤ x < 1 ⎩. fijos, generalmente representando el blanco y el negro. q-p es la probabilidad de que se obtenga el valor A, y 1-q, es la probabilidad de que se obtenga el valor B. •. Ruido gaussiano multiplicativo: se caracteriza por ser dependiente de la señal, mientras más energía tenga la señal, mayor influencia del ruido.. •. Ruido de Poisson: matemáticamente se corresponde con una función de densidad probabilística con distribución f (k , λ ) =. e − λ λk , siendo k el número de ocurrencias k!. de un evento, y λ es un número real positivo, equivalente al número esperado de.

(32) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 21. ocurrencias durante un intervalo dado. Por ejemplo, si los eventos ocurren como promedio cada 4 minutos, y se está interesado en el número de eventos ocurriendo en un intervalo de 10 minutos, se usaría como modelo una distribución de Poisson con λ = 2.5. Algunas de las técnicas más utilizadas para la eliminación de ruido en imágenes son: [11] •. Filtrado lineal e invariante FIR o IIR: Los filtros FIR (Respuesta finita al impulso) se caracterizan por presentar en la entrada una señal impulso, dando como resultado a la salida un número finito de términos no nulos; la expresión matemática que N −1. caracteriza a este tipo de filtro digital es y n = ∑ bk x(n − k ) , done N es el orden del k =0. filtro, que también coincide con el número de términos no nulos y con el número de coeficientes del filtro, bk son los coeficientes. Estos filtros tienen todos los polos en el origen, por lo que son estables, los ceros se presentan en pares de recíprocos si el filtro se diseña para tener fase lineal. En el caso de los filtros IIR (Respuesta infinita al impulso), su entrada puede estar dada por una señal de impulso, lo que implica que la salida tendrá un número infinito de términos no nulos, es decir, nunca vuelve al reposo; la expresión matemática que caracteriza a este tipo de filtro digital es y n = b0 x n + b1 x n −1 + ..... + b N x n − N − a1 y n −1 − a 2 y n − 2 − ..... − a M y n − M , donde los a y la b son los coeficientes del filtro, el orden es el máximo entre los valores M y N; este tipo de filtros presenta polos y ceros que determinan la estabilidad y la causalidad del sistema, cuando todos los ceros están en el interior de la circunferencia unidad se dice que su fase es mínima. Si todos están en el exterior su fase es máxima, si algún polo está fuera de la circunferencia unidad, el sistema es inestable. •. Filtrado Kalman o Wiener: El filtrado Kalman responde a un filtrado que estima el estado oculto (no medible) de un sistema dinámico lineal y tiene gran aplicación cuando el sistema está sometido a ruido blanco aditivo. Este sistema de filtrado es capaz de determinar la ganancia K de realimentación del error de forma óptima, cuando se conocen las varianzas de los ruidos que afectan al sistema. El filtro de Wiener es una técnica utilizada para restauración de imágenes cuando estas han sido.

(33) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 22. adulteradas por adición de ruido y degradación (distorsión, turbulencias atmosféricas, muestreo, entre otras), basada en la minimización del error cuadrático medio. Se presenta como una mejora del filtro inverso, en la medida de que pone solución a la restauración de imágenes en presencia de ruido. •. Filtrado de mediana: Esta técnica de filtrado permite eliminar el ruido impulsivo. En el filtrado de mediana, el nivel de gris de cada píxel se reemplaza por la mediana de los niveles de gris en un entorno de este píxel, en lugar de por la media. La mediana M de un conjunto de valores es tal que la mitad de los valores del conjunto son menores que M y la mitad de los valores mayores que M, es decir, en un conjunto ordenado de mayor a menor o viceversa, sería el valor de la posición central. El filtro de la mediana no puede ser calculado con una máscara de convolución, ya que es un filtro no lineal. Este tipo de filtro elimina totalmente el punto que tiene un valor muy diferente al resto de sus vecinos. Como se selecciona el valor de centro, el filtrado de mediana consiste en forzar que puntos con intensidades muy distintas se asemejen más a sus vecinos, por lo que el filtro de mediana es muy efectivo para eliminar píxeles cuyo valor es muy diferente del resto de sus vecinos, como por ejemplo eliminando ruido de la imagen.. •. Transformada Wavelet: Todas las transformaciones wavelet pueden ser consideradas formas de representación en tiempo-frecuencia y por tanto, están relacionadas con el análisis armónico. Las transformadas de wavelets son un caso particular de filtro de respuesta finita al impulso. Las wavelets, continuas o discretas, como cualquier función norma dos de series numerables (L2), responden al principio de incertidumbre de Hilbert, el cual establece que producto de las dispersiones obtenidas en el espacio directo y en el de las frecuencias, no puede ser más pequeño que una cierta constante geométrica. En el caso de las wavelets discretas, la dispersión de los coeficientes se ha de medir de acuerdo con la norma L2. La transformada wavelet discreta se utiliza para la codificación de señales, mientras la continua se utiliza en el análisis de señales. Como consecuencia, la versión discreta de este tipo de transformada se utiliza fundamentalmente en ingeniería e informática, mientras que la continua se utiliza sobre todo en la física..

(34) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 23. Este tipo de transformadas están siendo cada vez más empleadas en un amplio campo de especialidades, a menudo sustituyendo a la transformada de Fourier. •. Redes Neuronales Artificiales (RNA): Se trata de un sistema de interconexión de neuronas en una red que colabora para producir un estímulo de salida, esta novedosa técnica fue inspirada en la forma en que funciona el sistema nervioso de los animales. Una de las misiones en una red neuronal consiste en simular las propiedades observadas en los sistemas neuronales biológicos, a través de modelos matemáticos recreados mediante mecanismos artificiales (como un circuito integrado, un ordenador o un conjunto de válvulas). El objetivo es conseguir que las máquinas den respuestas similares a las que es capaz de dar el cerebro, que se caracteriza por su generalización y su robustez. Una red neuronal se compone de unidades llamadas neuronas. Cada neurona recibe una serie de entradas a través de interconexiones y emite una salida. Las RNA tienen la habilidad de aprender mediante una etapa que se llama etapa de aprendizaje. Esta consiste en proporcionar a la RNA datos, como entrada, a su vez que se le indica cuál es la salida (respuesta) esperada. Una RNA crea su propia representación de la información en su interior, descargando al usuario de esto. Debido a que una RNA almacena la información de forma redundante, ésta puede seguir respondiendo aceptablemente aún si se daña parcialmente. Una RNA puede manejar cambios no importantes en la información de entrada, como señales con ruido u otros cambios en la entrada (ej. si la información de entrada es la imagen de un objeto, la respuesta correspondiente no sufre cambios si la imagen cambia un poco su brillo o el objeto cambia ligeramente). La estructura de una RNA es paralela, por lo cuál si esto es implementado con computadoras o en dispositivos electrónicos especiales, se pueden obtener respuestas en tiempo real. Por otro lado, las redes neuronales incluyen en muchos de los casos mecanismos de reducción de la dimensión, que en ocasiones son considerados más adecuados que las técnicas convencionales, debido a que su inherente no linealidad puede preservar mejor características locales de los datos, que se pierden en transformaciones lineales del tipo de la transformación en componentes principales..

(35) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. •. 24. Análisis espectral de alto orden (HOSA): Se basa en detectar la absorción o emisión de radiación electromagnética de ciertas energías y relacionar estas energías con los niveles de energía implicados en una transición cuántica. De esta forma, se pueden hacer análisis cuantitativos o cualitativos de una enorme variedad de elementos. El análisis espectral consisten específicamente en el estudio de una luz previamente descompuesta en radiaciones monocromáticas, mediante un prisma o una red de difracción.. 1.3.5. Filtrado. El filtrado tiene como propósito modificar la relación entre píxeles de acuerdo a la información espectral, espacial, morfológica, entre otras, por lo que se utiliza para: •. Reducir ruido, mejorar y restaurar.. •. Detectar bordes y morfologías.. •. Analizar texturas.. •. Segmentar.. •. Determinar gradientes o derivadas direccionales.. Entre los tipos de filtrado pueden mencionarse: [12] •. Frecuencial vs. Espacial: El filtrado en el dominio de la frecuencia incluye técnicas que están basadas en la modificación de los valores que se obtiene al aplicar la transformada de Fourier a una imagen, mientras que en el filtrado espacial las transformaciones se aplican directamente a los valores de los píxeles de la imagen.. •. Lineal vs. No lineal: En ambos casos, se recorre la imagen píxel a píxel, operando con los píxeles vecinos, obteniéndose un suavizado de la imagen y una reducción del ruido. En el caso del filtrado lineal, la operación que se implementa es la convolución, en este caso bidimensional, de una matriz de píxeles con otra matriz de coeficientes que define el comportamiento del filtro, mientras que en el caso del filtrado no lineal se aplica algún algoritmo u operación a la matriz de píxeles..

(36) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. •. 25. Adaptativo: Los filtros adaptativos son dispositivos que se auto-diseña a través de un algoritmo recursivo, este tipo de filtro tiene condiciones iniciales y después de algunas iteraciones converge a la solución óptima, el mismo cuenta con dos procesos básicos, el primero es el proceso de filtrado (se obtiene un dato de salida en respuesta a datos de la entrada), el segundo es el proceso adaptativo (se ajustan los coeficientes del filtro de acuerdo a un algoritmo), estos dos procesos trabajan de manera interactiva.. •. Isotrópico vs. Anisotrópico: El filtrado isotrópico utiliza el algoritmo basado en la transformada de ondículas, calculadas mediante el algoritmo de cavidades, mientras que el filtrado anisotrópico es un método utilizado para filtrar píxeles en las aplicaciones de extracción de texturas, de modo que se produzca una imagen más suave.. Básicamente el proceso de filtrado consiste en realizar una serie de operaciones sobre cada uno de los píxeles que componen la imagen. Puesto que nosotros vamos a trabajar con imágenes en escala de grises, cada píxel se corresponde con un entero que indica la luminosidad del píxel [12]. En esencia filtrar no es mas que definir un entorno con los vecinos de un píxel central. Este entorno se denomina ventana, máscara o matriz de convolución y suele ser cuadrado o rectangular, aunque es posible definir otras formas, rómbicas, circulares, entre otras [12]. A cada posición en la ventana se le asigna un peso o participación en el cálculo que dará el nuevo valor para el píxel central. Desplazando la máscara, centrándola en cada uno de los píxeles de la imagen. Al recorrido completo es a lo que denominamos filtrado, y los sucesivos resultados, siempre a partir de los valores originales, forman la nueva imagen. Es obvio que en los bordes y esquinas la ecuación varía, ya que parte de la máscara se pierde [12]..

(37) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. 1.3.6. 26. Realce. El realce de imágenes consiste en destacar ciertos valores o regiones dentro de una imagen, para enfatizar e identificar características que sean de interés en las mismas, es decir, acentuar la claridad con que se observan ciertos rasgos de la imagen, para facilitar el análisis subsiguiente. •. Atenuación de ruido.. •. Resaltado de bordes o contrastes de estructuras de interés.. •. Pseudocoloración.. •. Endurecimiento (sharpering).. •. Magnificación.. Algunas de las técnicas de realce son: •. Ecualización del histograma.. •. Análisis de vecindad.. •. Filtrado paso alto.. 1.3.7. Transformaciones geométricas. Las transformaciones geométricas tienen como propósito modificar la relación espacial entre píxeles. No modifica el valor ni el contenido de información de los píxeles y se aplican para reducción de ruido, el análisis de texturas, el análisis de formas, la detección de bordes, el filtrado multiescalar, la comparación, clasificación, registrado, entre otros. Las transformaciones geométricas y morfológicas abarcan varios grupos de técnicas: [13] 1. Morfología matemática. 2. Transformaciones afines y geométricas. 3. Operaciones Booleanas, lógicas y con elementos. Entre las principales técnicas de morfología matemática pueden citarse: [13].

(38) CAPÍTULO 1. Imágenes digitales para el conteo celular y técnicas del procesamiento digital de imágenes. •. 27. Dilatación: Engrosa partículas y regiones, conecta vecindades y reduce invaginaciones.. •. Erosión: Contrario a dilatación, disminuye la talla de partículas y desaparece pequeños elementos.. •. Apertura: Erosión + dilatación. Elimina objetos pequeños, islas y picos, suaviza contornos y rompe istmos.. •. Cierre: Dilatación + erosión. Elimina cavidades pequeñas, rellena agujeros, alisa contornos y fusiona canales angostos.. •. Adelgazamiento: Erosión máxima de objetos sin llegar a romperlos.. •. Engrosamiento: Construye armaduras convexas de los objetos.. •. Esqueletización: Adelgazamiento hasta llegar al ancho de un píxel mediante búsqueda del eje medio de los objetos..

(39) CAPÍTULO 2. Descripción de la metodología para la modificación de las imágenes de células vegetales 28 en suspensión. CAPÍTULO 2. DESCRIPCIÓN DE LA METODOLOGÍA PARA LA MODIFICACIÓN DE LAS IMÁGENES DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN. En este capítulo se presenta las metodologías para la modificación de las imágenes de células vegetales en suspensión. Se describen las herramientas y técnicas utilizadas para desarrollar el paquete de funciones. 2.1 Selección de las herramientas. En el desarrollo del paquete de funciones para la modificación de las imágenes de células vegetales en suspensión para facilitar el conteo celular se utilizó la versión de Matlab 7.0. La razón por la cual se eligió Matlab es porque este es un lenguaje de alto desempeño, que integra cálculo, visualización y programación en un ambiente muy cómodo, donde los problemas y las soluciones se expresan en una notación matemática familiar. Además, este programa incorpora un extenso conjunto de paquetes, como el de procesamiento digital de imágenes, ampliamente utilizado en el desarrollo del paquete de funciones. Las imágenes utilizadas se obtuvieron en el Instituto de Biotecnología de las Plantas, mediante el microscopio Optom Axioskop (Germany) y la cámara digital de 12 Megapixel Olympus DP70. El acople utilizado entre el microscopio y la cámara es un adaptador óptico mecánico. Se garantizó una firme conexión entre ambos, evitando vibraciones de la cámara que pudiera disminuir la calidad de la imagen. Debido a las características de este tipo de imágenes, para facilitar su manipulación y además, agilizar su procesamiento en Matlab 7.0, se utilizó el Adobe Photoshop, para disminuir su resolución a 8 bits y se convirtieron a imágenes en escala de grises,.

(40) CAPÍTULO 2. Descripción de la metodología para la modificación de las imágenes de células vegetales 29 en suspensión. transformaciones que no atentan contra el resultado de los algoritmos desarrollados, debido a que los propósitos de los mismos están orientados al conteo de células vegetales en suspensión, lo que posibilita la simplificación de los requerimientos de calidad de las imágenes, comparado con otros campos dentro del procesamiento de imágenes. 2.1. Selección de las técnicas de procesamiento que modifican la información pictórica. Dentro del conjunto de técnicas del procesamiento digital de imágenes utilizadas para modificar la información pictórica de las células vegetales en suspensión, se seleccionaron las siguientes: •. Mejorado del contraste: debido a las características de la preparación de la muestra estas imágenes requieren de un mejorado de contraste, para facilitar la visibilidad de las células vegetales en suspensión que la conforman, dándole a la imagen los tonos adecuados, de forma tal que se facilite la identificación de cada célula, así como su cantidad numérica presente en la muestra. El proceso de mejorado del contraste incluye, además de la detección de las células de interés, la de las partículas no deseadas en la muestra, pues es el primer paso para llevar a cabo el proceso de limpieza de la imagen. Mejorar el contraste de la imagen implica reducir el margen de error, a la hora de someter dicha muestra a un proceso de filtrado, incrementando la posibilidad de obtener una eficiente detección de bordes. Mejorar el contraste de la imagen como primer paso en el procesamiento, permite tener una representación mejorada de la imagen original, lo que significa hacer visibles los contornos de las células, mientras se mantiene la relación de niveles de grises células - partículas.. •. Filtrado: este proceso está dirigido, básicamente, a eliminar las partículas no deseadas en la imagen, manteniendo en todo momento la integridad de las células vegetales en suspensión que son de interés para el conteo celular. Debido a las características de estas imágenes, las partículas no deseadas, componentes de alta frecuencia de la imagen en el dominio de la frecuencia, se pueden eliminar mediante un filtrado paso bajo..