Estandarización de la técnica de cromatografía de gases con detector de ionización por llama para la determinación de BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) en matrices acuosas

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(1)ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA PARA LA DETERMINACIÓN DE BTEX (BENCENO, TOLUENO, ETILBENCENO Y XILENO) EN MATRICES ACUOSAS. JHON EDGAR ARROYAVE GARCÍA LINA MARÍA VILLA FLÓREZ. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA QUÍMICA INDUSTRIAL PEREIRA 2011. 1.

(2) ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA PARA LA DETERMINACIÓN DE BTEX (BENCENO, TOLUENO, ETILBENCENO Y XILENO) EN MATRICES ACUOSAS. JHON EDGAR ARROYAVE GARCÍA LINA MARÍA VILLA FLÓREZ. TRABAJO DE GRADO Requisito final para optar al título de Químico Industrial. DIRECTOR: JUAN PABLO ARRUBLA VÉLEZ Qco MSc. ASESOR: CARLOS HUMBERTO MONTOYA N Qco Ind GRUPO DE ESTUDIO DEL RECURSO HÍDRICO.. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA QUÍMICA INDUSTRIAL PEREIRA 2011. 2.

(3) NOTA DE ACEPTACIÓN DE TRABAJO DE GRADO ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA PARA LA DETERMINACIÓN DE BTEX (BENCENO, TOLUENO, ETILBENCENO Y XILENO) EN MATRICES ACUOSAS. Presentado por: JHON EDGAR ARROYAVE GARCÍA LINA MARÍA VILLA FLÓREZ. Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar: La nota de -----------------------------------------------------------------Con la connotación: -----------------------------------------------------. Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy: Director: JUAN PABLO ARRUBLA VÉLEZ Firma: ------------------------------------------------------------Asesor: CARLOS HUMBERTO MONTOYA N Firma: ------------------------------------------------------------Jurado: Firma: ------------------------------------------------------------3.

(4) DEDICATORIA. A Dios por darnos la vida y su amor infinito, por acompañarnos y darnos fortaleza en todo momento de nuestras vidas y mostrarnos el camino que debemos seguir para alcanzar la verdadera felicidad. A la Virgen María por su amor, acompañamiento e intercesión ante su Hijo. A nuestras familias por su amor, apoyo, comprensión y dedicación en cada momento. Por inculcar en nosotros valores y principios morales que nos hacen ser mejores personas. Por estar siempre con nosotros especialmente en los momentos difíciles ayudándonos a superar las dificultades. A nuestros amigos por el cariño y apoyo que siempre nos brindaron.. 4.

(5) AGRADECIMIENTOS. A Dios todopoderoso, por estar siempre con nosotros, cambiando nuestras vidas, mostrándonos el camino que debemos seguir. Por darnos la fuerza necesaria para cumplir nuestras metas y sueños a pesar de los obstáculos que se pueden presentar. Por enseñarnos la felicidad que se alcanza al estar cerca de Él. A la Virgen María por su compañía en cada instante de nuestras vidas y por interceder en todo momento y lugar por nosotros ante su Hijo. A nuestras familias por el cariño, apoyo y amor incondicional que nos han brindado durante el transcurso de nuestras vidas. Por el ánimo y la motivación en los momentos difíciles, haciendo posible la superación de las dificultades. A nuestro director Juan Pablo Arrubla y asesor Carlos Humberto Montoya por el apoyo, tiempo, dedicación y conocimientos que nos brindaron para la realización de este proyecto. A Hugo Fernando Arias, Jaime Alejandro Martínez y Paula Andrea Giraldo que con paciencia nos enseñaron a operar el cromatógrafo de gases y nos brindaron su conocimiento y experiencia en el campo de la investigación. A los profesores de la escuela de química por los conocimientos aportados durante el transcurso de nuestra carrera. A María Victoria, Javier y Germán por su colaboración cada que fue necesario. A nuestros amigos por apoyarnos cuando lo necesitamos. Por hacer más agradable nuestra estadía en la universidad. A todas las entidades y personas que de alguna manera hicieron posible cumplir nuestra meta.. 5.

(6) TABLA DE CONTENIDO Pág. ÍNDICE DE TABLAS. 11. ÍNDICE DE FIGURAS. 13. ÍNDICE DE ANEXOS. 14. GLOSARIO. 15. RESUMEN. 17. JUSTIFICACIÓN. 18. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 21. OBJETIVOS. 22. 1. MARCO TEÓRICO. 23. 1.1. ESTANDARIZACIÓN. 23. 1.1.1. Linealidad y rango. 24. 1.1.2. Precisión. 26. 1.1.2.1. Repetibilidad. 26. 1.1.2.1.1. Repetibilidad del sistema instrumental. 26. 1.1.2.1.2. Repetibilidad del método. 27. 1.1.2.2. Precisión intermedia. 27. 1.1.2.3. Reproducibilidad. 27. 1.1.3. Exactitud. 27. 1.1.4. Límite de detección (LD). 28. 1.1.5. Límite de cuantificación (LC). 29 6.

(7) 1.1.5.1. Método basado en la relación señal/ruido. 29. 1.1.5.2. Método basado en la desviación estándar de la respuesta del blanco y. 29. La pendiente de la recta de calibrado 1.1.5.2.1. Métodos instrumentales que corrigen la señal frente a un blanco. 30. 1.1.5.2.2. Métodos instrumentales que no corrigen la señal frente a un blanco. 30. 1.1.5.3. Método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a. 31. concentración cero 1.1.6. Sensibilidad. 31. 1.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC). 31. 1.2.1. Ventajas. 32. 1.2.2. Instrumentación en cromatografía de gases. 33. 1.2.2.1. Gas portador. 35. 1.2.2.2. Sistema de inyección. 36. 1.2.2.3. Configuración de la columna y del horno de la columna. 37. 1.2.2.4. Sistemas de detección. 38. 1.2.2.4.1. Detector de ionización por llama (FID). 39. 1.2.3. Análisis cualitativo y cuantitavivo. 42. 1.2.3.1. Análisis cualitativo. 42. 1.2.3.2. Análisis cuantitativo. 42. 1.2.3.2.1. Método del patrón interno. 43. 1.2.3.2.2. Método del estándar externo. 43. 1.2.3.2.3. Método de la normalización de las áreas. 44. 7.

(8) 1.3. EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE). 44. 1.3.1. Consideraciones teóricas. 45. 1.3.1.1. Interacciones polares. 46. 1.3.1.2. Interacciones apolares. 47. 1.3.1.3. Interacciones iónicas. 48. 1.3.2. Etapas de la extracción en fase sólida. 50. 1.3.2.1. Acondicionamiento del adsorbente. 50. 1.3.2.2. Aplicación de la muestra (adsorción). 51. 1.3.2.3. Lavado del adsorbente. 51. 1.3.2.4. Elución. 51. 1.3.3. Ventajas. 52. 1.4. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS (BTEX). 52. 1.4.1. Estabilidad. 52. 1.4.2. Propiedades físicas y químicas. 53. 1.4.2.1. Comportamiento de los BTEX en agua. 55. 1.4.3. Fuente de hidrocarburos aromáticos. 56. 1.4.3.1. Petróleo. 56. 1.4.3.1.1. Aromáticos del reformado catalítico. 56. 1.4.3.1.2. Aromáticos del craqueo con vapor. 58. 1.4.3.1.3. Separación de hidrocarburos aromáticos. 58. 1.4.4. Procesos de transformación de aromáticos. 60. 1.4.5. Refinación del petróleo y composición de la gasolina en Colombia. 60. 8.

(9) 1.4.5.1. Refinación nacional del petróleo. 60. 1.4.5.2. Composición de la gasolina en Colombia. 60. 1.4.6. Usos de los BTEX. 62. 1.4.6.1. Benceno. 62. 1.4.6.2. Tolueno. 63. 1.4.6.3. Etilbenceno. 63. 1.4.6.4. p-Xileno. 63. 1.4.6.5. o-Xileno. 64. 1.4.6.6. m-Xileno. 64. 1.4.7. Toxicidad de los BTEX. 64. 1.4.7.1. Benceno. 65. 1.4.7.2. Tolueno. 66. 1.4.7.3. Etilbenceno. 67. 1.4.7.4. Xileno. 67. 1.4.8. Métodos de análisis de los BTEX. 69. 2. SECCIÓN EXPERIMENTAL. 72. 2.1. MUESTRA DE ANÁLISIS. 72. 2.2. MUESTREO. 72. 2.3. TRANSPORTE, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LA. 72. MUESTRA 2.4. EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA. 73. 2.5. COMPOSICIÓN DEL ESTÁNDAR DE BTEX. 74. 9.

(10) 2.6. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO. 75. 2.6.1. Estándar. 75. 2.6.2. Patrones. 76. 2.6.3. Curvas de calibración. 77. 2.6.4. Análisis de las muestras. 77. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 78. 3.1. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO DEL ESTÁNDAR. 78. 3.2. CALIBRACIÓN. 80. 3.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO. 84. 3.3.1. Indicadores de relación lineal. 87. 3.3.2. Exactitud. 89. 3.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE EXTRACCIÓN EN FASE. 90. SÓLIDA (SPE) 3.4.1. Porcentaje de recuperación. 90. 3.5. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS. 92. 3.5.1. Resultados de pH y temperatura en las trampas de grasas. 92. 3.5.2. Análisis cromatográfico. 93. 3.5.3. Análisis de un humedal. 97. 3.5.4. Interferencias en el análisis. 98. 4.. CONCLUSIONES. 99. 5.. BIBLIOGRAFÍA. 101. 6.. ANEXOS. 107 10.

(11) ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1.. Propiedades de los detectores para cromatografía de gases. 40. Tabla 2.. Fases estacionarias usadas en extracción en fase sólida. 50. Tabla 3.. Propiedades fisicoquímicas de los BTEX. 54. Tabla 4.. Valores más altos de los BTEX encontrados en agua subterránea. 55. urbana. Tabla 5.. Rango de valores de la vida media de los BTEX en días. 56. Tabla 6.. Composición de gasolinas reformadas.. 57. Tabla 7.. Composición gasolina procedente de craqueo con vapor.. 58. Tabla 8.. Puntos de ebullición de los BTEX.. 59. Tabla 9.. Gasolina corriente.. 61. Tabla 10.. Gasolina extra. 61. Tabla 11.. Diesel corriente. 62. Tabla 12.. Diesel extra o diesel premium. 62. Tabla 13.. Valores permitidos por la EPA. 68. Tabla 14.. Clasificación de riesgo carcinógeno de la EPA. 69. Tabla 15.. Composición del estándar de BTEX marca RESTEK código de. 74. Catálogo 30213 Tabla 16.. Programación de la temperatura del horno de cromatógrafo. 77. Tabla 17.. Tiempos de retención y áreas medidas por el equipo de los. 79. hidrocarburos aromáticos. 11.

(12) Tabla 18.. Áreas de la cola del diclorometano medida por el equipo. 80. Tabla 19.. Datos de las áreas obtenidos de cada patrón para la construcción de. 81. las curvas de calibración. Tabla 20.. Datos de las áreas obtenidas para la elaboración de la curva de. 82. calibración del benceno Tabla 21.. Datos para determinar la repetibilidad instrumental. 84. Tabla 22.. Datos para el cálculo de la SD y el % RSD para el benceno. 86. Tabla 23.. Resultados estadísticos obtenidos de las curvas de calibración. 87. Tabla 24.. Datos obtenidos para el test de linealidad. 88. Tabla 25.. Datos obtenidos para calcular la exactitud. 89. Tabla 26.. Datos obtenidos para el porcentaje de recuperación de cada patrón. 90. Tabla 27.. Porcentajes de recuperación de los BTEX. 91. Tabla 28.. Temperatura y pH en las trampas de grasas. 93. Tabla 29.. Concentraciones de BTEX en las estaciones de servicio. 95. Tabla 30.. Concentración de BTEX en la salida del humedal. 98. 12.

(13) ÍNDICE DE FIGURAS. Pág.. Figura 1.. Diagrama de un sistema de cromatografía gas-líquido. 35. Figura 2.. Detector de ionización por llama característico. 41. Figura 3.. Fases estacionarias polares y sus interacciones con los analitos. 46. Figura 4.. Fases estacionarias apolares y sus interacciones con los analitos. 47. Figura 5.. Fases estacionarias de intercambio iónico. 49. Figura 6.. Etapas de la extracción en fase sólida. 51. Figura 7.. Molécula del benceno. 53. Figura 8.. Principales reacciones de aromatización. 57. Figura 9.. Trampa de grasas. 72. Figura 10.. Cromatógrafo de gases utilizado en el análisis. 75. Figura 11.. Cromatograma patrón 50ppm. 78. Figura 12.. Cromatograma del solvente de elución (Diclorometano). 79. Figura 13.. Gráfica de barras de las concentraciones de BTEX. 83. Figura 14.. Curva de calibración para el benceno. 83. Figura 15.. Gráfica de barras de los porcentajes de recuperación de los BTEX. 91. Figura 16.. Cromatograma del extracto obtenido en la muestra tomada de la. 94. estación de servicio centro Figura 17.. Cromatograma de la salida del humedal 13. 97.

(14) ÍNDICE DE ANEXOS. Pág.. Anexo 1. Reacciones de los BTEX para la producción de diferentes productos 107. Anexo 2.. Certificado del análisis del estándar. 110. Anexo 3.. Datos de las áreas obtenidas de cada patrón para la construcción de. 111. las curvas de calibración. Anexo 4.. Datos de las áreas obtenidas para la elaboración de la curva de. 113. calibración del benceno Anexo 5.. Curvas de calibración de los BTEX. 115. Anexo 6.. Datos para la determinación de la repetibilidad instrumental.. 118. Anexo 7.. Distribución de t para diferentes niveles de confianza. 119. Anexo 8.. Cromatogramas de los extractos obtenidos en las muestras. 120. tomadas de las estaciones de servicio Anexo 9.. Cromatogramas de los patrones de BTEX. 14. 123.

(15) GLOSARIO. BTEX: Acrónimo que define la mezcla de benceno, tolueno, etilbenceno y los tres isómeros del xileno (orto, meta y para). CROMATOGRAMA: Es un gráfico de la respuesta del detector en función del tiempo. DETECTOR: Dispositivo que responde a cierta característica del sistema que está sujeto a observación y convierte esa respuesta en una señal susceptible de medirse. ESTANDARIZACIÓN: Procedimiento estadístico que consiste en verificar y documentar, que exista un alto grado de seguridad en la obtención de resultados que deberían ser precisos y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. EXACTITUD: Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (Material de referencia interno de la firma), sea como un valor de referencia aceptado (Material de referencia certificado o estándar de una farmacopea) y el valor encontrado (Valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces. FID (FLAME IONIZATION DETECTOR) DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA: Detector para cromatografía de gases que se basa en la captura de los iones producidos durante la pirólisis de analitos orgánicos en una flama. GC (GAS CHROMATOGRAPHY): CROMATOGRAFÍA DE GASES: Es una técnica de gran sensibilidad y exactitud que se utiliza para separación, identificación y cuantificación de compuestos volátiles. Se basa en la distribución del analito entre un fase móvil gaseosa y una fase liquida inmovilizada sobre la superficie. La fase móvil se denomina gas transportador, ya que es un gas inerte cuya finalidad es transportar las moléculas de la muestra a través de la columna. Los adsorbentes, tales como gel de sílice, alúmina, sales inorgánicas, polímeros porosos, tamices moleculares y carbón grafitizado, son las fases estacionarias. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN: Cantidad más pequeña del analito en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del 15.

(16) análisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa particularmente para impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración del analito. LÍMITE DE DETECCIÓN: Cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser detectada por una única medición, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es comúnmente expresado como concentración del analito. LÍNEA BASE: Es la parte del cromatograma que registra la respuesta del detector en ausencia de soluto o solvente. PICO: Es la parte del cromatograma que registra la respuesta del detector mientras que uno o más componentes son eluídos de la columna. PRECISIÓN: Expresa la cercanía de coincidencia (Grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad. SPE (SOLID PHASE EXTRACTION) EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA: La SPE es una técnica muy empleada en la preparación de muestras para análisis por cromatografía líquida, de gases, electroforesis y aún para espectrofotometría. También, se ha convertido en una de las técnicas para clean-up y concentración de muestras utilizadas por los químicos analíticos. SPLIT: Modo de inyección con división de flujo, en el cual rápidamente se vaporiza la muestra antes de entrar en la columna. Una fracción definida de la muestra de vapor entra en la columna y el resto sale de la entrada a través de un orificio de ventilación. SPLITLESS: Modo de inyección sin división de flujo, el cual utiliza una entrada divisora en donde la abertura de división de flujo se bloquea durante el período de inyección de tal manera que la mayor parte del vapor de la muestra entra en la columna USEPA: (United States Environmental Protection Agency) Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos cuya misión es la de proteger la salud de los humanos y la del medio ambiente [1,17,25,41]. 16.

(17) RESUMEN. La cromatografía de gases es una de las técnicas más ampliamente usadas en el análisis de contaminantes ambientales derivados del petróleo, ya que esta es una técnica analítica instrumental de alta sensibilidad capaz de identificar cualitativa y cuantitativamente concentraciones muy bajas de estos componentes. Se realizó la estandarización de la técnica de Cromatografía de Gases con Detector de Ionización por Llama (GC/FID) para la determinación de BTEX en matrices acuosas. En el proceso de estandarización se estimaron los valores para los parámetros que determinan el rendimiento del método analítico como son: precisión, exactitud, linealidad, límite de detección, límite de cuantificación y sensibilidad; logrando valores aceptables de estas medidas. En la extracción y preconcentración de la matriz, se empleó la extracción en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos C18 y diclorometano como solvente de elución. Este método de extracción expuso buenos porcentajes de recuperación, entre 69,22 y 80,01%, con desviaciones estándar inferiores al 10%. El método fue aplicado para la determinación de BTEX en matrices acuosas, usando muestras reales procedentes de la trampa de grasas más limpia de tres estaciones de servicio de la ciudad de Pereira. Se encontraron concentraciones de 0,013ppm, 0,014ppm y 0,018ppm de etilbenceno, m,p-xileno y o-xileno respectivamente en una de las tres estaciones de servicio. Aunque en Colombia no existe una ley como tal que limite la concentración de BTEX en agua, los resultados obtenidos indican que se genera poca contaminación de agua con estos compuestos en las estaciones de servicio analizadas.. 17.

(18) JUSTIFICACIÓN. El crecimiento exponencial de la población mundial ha dado como resultado una mayor demanda de combustibles fósiles (hidrocarburos). Aunque muchos de estos compuestos se utilizan para generar energía, un alto porcentaje se libera al ambiente en los procesos de extracción, refinado, transporte y almacenamiento, lo que representa un riesgo potencial para los ecosistemas; tal es el caso de algunos componentes de la gasolina denominados BTEX (Benceno, Tolueno, Etilbenceno, orto-, meta-, para-xileno) que constituyen una de las principales fuentes de contaminación de suelos, aire y agua. Son usados ampliamente en industrias, tales como de impresión, pinturas, resinas sintéticas, gomas sintéticas y como intermedios químicos en la síntesis de diversos compuestos. Las fuentes más comunes de contaminación por BTEX en el agua son: pérdidas producidas en los tanques subterráneos de almacenamiento de productos derivados del petróleo o vertidos ocurridos durante el transporte de dichos productos, efluentes de estaciones de gasolina y de las industrias químicas, lixiviación de tanques de almacenamiento de gasolina y de los vertederos. El uso de agua contaminada ocasiona un montón de problemas para la salud humana y las vidas acuáticas [2,3,4,5]. Los efectos potenciales en la salud humana por exposición a los BTEX por encima del máximo nivel contaminante (MCL, por sus siglas en inglés) permitido en agua potable; son: anemia, disminución de plaquetas en la sangre, mayor riesgo de cáncer, daños en el sistema nervioso y problemas en el hígado y el riñón. Por ende, la presencia de estas sustancias químicas en el agua, son un enorme peligro para la salud humana [6]. Para el caso de Colombia, aunque no existe una ley como tal que limite la concentración de estos compuestos en el agua, los BTEX son foco de atención dentro de los aspectos de salud y de conservación del medio ambiente; por lo que se han incluido como sustancias de interés sanitario en el Decreto 3930 de 2010 para usos de agua y residuos líquidos [7].. 18.

(19) El benceno es una sustancia cancerígena, razón por la cual el Ministerio de Trabajo, por medio del Decreto 1214 del 6 de Julio de 1999, restringió el uso de éste en las industrias de Colombia [8]. A nivel internacional: el benceno, el tolueno y el etilbenceno son compuestos designados como “contaminantes prioritarios” por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, por sus siglas en inglés). Y La acción y niveles de riesgo del benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos son descritos en las normas de calidad del gobierno Holandés para la evaluación de la contaminación del suelo y el agua [9]. La USEPA establece los siguientes límites máximos permisibles en agua potable en mg/L para BTEX: benceno, 0.005; tolueno, 1.0; etilbenceno, 0.7 y mezcla de xilenos, 10 [10]. Los límites máximos permisibles establecidos por la Secretaría de Salud de México permisible en agua potable para BTEX en mg/L son: benceno, 0.01; tolueno, 0.3; etilbenceno, 0.7 y mezcla de xilenos, 0.5 [11]. La unión europea (EU) establece el máximo nivel contaminante de 0,001 mg/L para el benceno en agua potable [12]. Las consecuencias de la contaminación con BTEX de las aguas sobre el abastecimiento público, su uso agrícola e industrial, así como sus efectos ambientales pueden llegar a tener influencias negativas de gran magnitud, es por esto que se necesita verificar la concentración de estos compuestos en las fuentes de captación de plantas potabilizadoras y efluentes de empresas como el de las estaciones de servicio. Con este trabajo se pretende estandarizar por Cromatografía de Gases utilizando un Detector de Ionización por Llama (GC/FID) el análisis de BTEX en matrices acuosas, ya que esta es una técnica analítica instrumental de alta sensibilidad capaz de identificar cualitativa y cuantitativamente concentraciones muy bajas de constituyentes volátiles y semivolátiles del petróleo. El análisis de estos compuestos con este método analítico requiere de una extracción y preconcentración previa, para lo cual se han utilizado técnicas como el método de purga y trampa con cromatografía de gases, extracción en fase sólida (SPE), y la microextracción en fase sólida (SPME). Para el desarrollo de este proyecto se busca la estandarización de la SPE [13]. Atendiendo a la demanda del sector industrial, organismos de control y a la comunidad en general, el grupo de estudio del recurso hídrico implementó un método analítico 19.

(20) estandarizado para el análisis de BTEX, como aporte de la universidad en el soporte técnico a la comunidad regional.. 20.

(21) PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Las consecuencias de la contaminación de aguas con BTEX sobre el abastecimiento público, su uso agrícola e industrial, así como sus efectos ambientales, pueden llegar a tener influencias negativas. Corporaciones como la Corporación Autónoma Regional de Risaralda (CARDER) y la Secretaría de Salud de Risaralda son las encargadas de velar por el cuidado del medio ambiente en la región; es por esto que se requiere de una técnica analítica instrumental de alta sensibilidad para determinar de manera confiable el grado de contaminación y poder tomar así las medidas respectivas. Teniendo en cuenta la gran demanda del sector industrial y comunidad en general para la determinación de BTEX en el agua, y ante la ausencia de un método analítico estandarizado para el análisis de estos compuestos en el Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira, es fundamental contar con una técnica analítica estandarizada como la cromatografía de gases con detector de ionización por llama que permita implementar el método analítico y sobre todo arrojar datos con adecuado y comprobable grado de confianza. Igualmente esto ayudaría a estudios posteriores del Grupo de Investigación del Recurso Hídrico, brindándole más herramientas para profundizar en el estudio sobre BTEX. ¿Puede el Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira suplir la necesidad regional para analizar BTEX en matrices acuosas a concentraciones bajas por medio de la estandarización de una técnica cromatográfica de alta resolución?. 21.

(22) OBJETIVOS. 1.1 OBJETIVO GENERAL •. Estandarizar la técnica de cromatografía de gases con detector de ionización por llama (CG/FID) para la identificación y cuantificación de BTEX en matrices acuosas.. 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS •. Estandarizar la técnica de extracción en fase sólida determinando los parámetros de: porcentaje de recuperación y precisión.. •. Obtener en forma experimental los parámetros de: precisión, exactitud, límite de detección y cuantificación, linealidad y sensibilidad para la técnica cromatográfica.. •. Analizar el contenido de BTEX en los efluentes (trampas de grasas) de tres estaciones de servicio de la ciudad de Pereira para determinar su grado de contaminación.. 22.

(23) 1. MARCO TEÓRICO. 1.1 ESTANDARIZACIÓN La necesidad de contar con mediciones exactas en la actualidad es una premisa fundamental del desarrollo industrial y por ende, económico y comercial de la sociedad. Las mediciones en general, y particularmente las analíticas, se utilizan para tomar decisiones en diferentes campos: uno de ellos es la relación compra/venta o aceptación y rechazo, como puede ser la aceptación de un producto en otro país o de un lote de producto en una empresa; la elección de un proveedor o la evaluación de la conformidad de un producto; en ciertos casos el establecimiento de multas si no se cumple con la normatividad, etc. Claramente es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de demostrar que lo es, para que cualquier decisión basada en él pueda tomarse con confianza; es allí donde se hace importante la estandarización de métodos de análisis que permite demostrar que un método analítico cumple con los requisitos particulares para un uso específico en el laboratorio mediante el examen y provisión de evidencias objetivas [14,15]. La estandarización de un método analítico es un proceso riguroso que dependiendo de la técnica analítica a la que pertenezca el método, la matriz, el analito, la cantidad de parámetros de estandarización, y de la logística empleada para su desarrollo, puede requerir de un tiempo más o menos considerable (en algunos casos puede superar los seis meses) [15]. Muchos analistas consideran que un método estándar o de referencia, que ha sido estandarizado por algún organismo que posee una cierta reputación, puede aplicarse directamente al laboratorio. Siguiendo un método previamente estandarizado se puede alcanzar buenos resultados, pero hace falta demostrar que funcionan en nuestro ámbito de trabajo. Por tanto, un método siempre debe estandarizarse cuando es necesario verificar que sus parámetros de calidad se adecuan al problema analítico particular que se debe resolver en el laboratorio [16].. 23.

(24) Siguiendo un método previamente estandarizado se puede alcanzar buenos resultados pero hace falta demostrar que funcionan en nuestro ámbito de trabajo. Por tanto, un método siempre debe estandarizarse cuando es necesario verificar que sus parámetros de calidad se adecuan al problema analítico particular que se debe resolver en el laboratorio [16]. De acuerdo al método de ensayo que se esté estandarizando; volumétrico, gravimétrico, instrumental, se debe establecer una metodología específica para encontrar los parámetros que se quieran como son:. 1.1.1 LINEALIDAD Y RANGO La linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que sea posible se buscará una respuesta de tipo lineal que facilitará su trazado, interpolación e interpretación. En el caso que la respuesta del método no sea lineal pero si proporcional a la concentración son válidos otros ajustes matemáticos. El rango se define como el intervalo comprendido entre la concentración mínima y máxima de analito para el cual se ha demostrado su correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito. Para evaluar la linealidad se recomienda que dentro del rango establecido se estudien al menos 5 niveles de concentración las cuales se analicen por triplicado (K=5, n° de replicas=3); estadísticamente lo correcto sería analizar las muestras de forma aleatoria, pero para minimizar posibles efectos de memoria en el equipo es conveniente analizarlas en sentido creciente de concentración. Otro aspecto importante es realizar pesadas independientes, ya que así se elimina el posible error sistemático que se podría arrastrar partiendo de una sola pesada y realizando diluciones; no obstante, para evaluar la linealidad en las impurezas se suelen utilizar sucesivas diluciones ya que normalmente se trabaja a niveles de concentración muy bajos y esto dificultaría las pesadas.. 24.

(25) Con los resultados de estudio de la linealidad se hace una relación entre las cantidades o concentraciones “X” (variable independiente o predictiva) y la respuesta “y” (variable dependiente, por ejemplo áreas, alturas, absorbancias, etc.). La relación entre ambas variables se expresa matemáticamente como una recta de regresión del tipo y = bx + a, donde b es el valor de la pendiente y a el término independiente. Esta regresión es obtenida por un método de ajuste (por lo general mínimos cuadrados); en algunos casos podría ser necesaria alguna transformación matemática previa (uso de logaritmos, recíprocos de las variables, etc.) para obtener funciones lineales. La pendiente b se encuentra relacionada con la sensibilidad del método analítico de forma que a mayor pendiente mayor sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de la concentración del analito). El término independiente a, u ordenada en el origen, es la intersección de la recta con el eje de ordenadas y es indicativo del error sistemático. La representación gráfica de la recta de regresión en un sistema de coordenadas junto con los valores experimentales, permite visualizar la bondad del ajuste. Si la recta no pasa cerca del origen de coordenadas significa que el método a evaluar está afectado por un error sistemático por defecto o exceso en el intervalo estudiado. Si existen diferencias apreciables entre los valores experimentales y los puntos de la recta significa que la linealidad no es buena. Independiente de la apariencia de la recta, resulta conveniente evaluar el coeficiente de correlación (r) y el coeficiente de determinación (r2). El coeficiente de correlación nos indica el grado de relación entre la variable x (concentración), y la variable y (respuesta). Su valor máximo es 1. Si r es cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad elevada. Un valor nulo indica ausencia de relación lineal entre las variables. El valor recomendable para el coeficiente de correlación es ≥ 0,999, aunque en el caso de impurezas se admite ≥ 0,990. La información obtenida mediante el cálculo de r es limitada y no justifica por sí sola la linealidad, siendo r2 coeficiente de determinación el que aporta una mayor significación estadística ya que representa la proporción de la variación total de y explicada por el modelo [17].. 25.

(26) 1.1.2 PRECISIÓN La precisión está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea. La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar (SD), o más comúnmente como la desviación estándar relativa (RSD) o coeficiente de variación (CV) [18]. El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles que influirán sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo, instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión. La precisión diferentes tipos de estudios: 1.1.2.1 Repetibilidad: se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación (desviación estándar relativa) de una serie de medidas. Esta estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos, etc.), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. Uno de los factores que más puede influir en la Repetibilidad del método de análisis es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del analito. 1.1.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental Este parámetro estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento, y se determina analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces. La estimación de esta se realiza con el cálculo del coeficiente de variación de las respuestas obtenidas. 26.

(27) Los resultados obtenidos en la repetibilidad instrumental dependen del instrumento, por ejemplo no se puede obtener el mismo coeficiente de variación en un equipo con inyección automática que con inyección manual. 1.1.2.1.2 Repetibilidad del método El ensayo de Repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista. La Repetibilidad del método depende generalmente del proceso de preparación de la muestra. Es decir, cuanto mayor sea la manipulación de la muestra más probable es que la variabilidad del método aumente. 1.1.2.2 Precisión intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio. 1.1.2.3 Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios [17].. 1.1.3 EXACTITUD La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimentalmente encontrado. De esta definición surge el problema de saber cuál es el valor verdadero. No obstante, cuando se dispone de patrones de referencia certificados, el valor de dicho patrón es el que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el método sobre dicho patrón, o bien analizando muestras de placebo o de problema a las que se ha añadido una cantidad conocida de dicho patrón. También se acepta la comparación de los resultados con un método de referencia validado del que se ha demostrado su exactitud; entonces el valor verdadero es el que se obtiene con dicho método de referencia. 27.

(28) La exactitud debe determinarse en todo el rango especificado para el método analítico. Se recomiendan un mínimo de 9 determinaciones sobre 3 niveles de concentración del analito que cubran el rango especificado (por ejemplo 3 determinaciones por 3 niveles de concentración, que podría ser la concentración central y las concentraciones en los extremos del rango). La exactitud se expresará como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza. No siempre se obtienen valores de recuperación cercanos al 100%, ya que ésta depende de la matriz de la muestra, de la efectividad de método de preparación y extracción y de la concentración del analito. Aunque es deseable alcanzar valores de recuperación cercanos al 100%, en algunas muestras de matrices complejas solo se obtienen valores del 50, 80 o 90%. En estos casos es importante que aunque la recuperación sea baja, la precisión del método sea alta ya que entonces puede intentar aplicarse un factor de corrección. La desviación de la exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias y la selectividad del método no es la adecuada, entonces se obtienen resultados superiores al valor verdadero. En este caso, si es posible, se debería modificar las condiciones del método para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro alternativo que sea selectivo. La desviación de la exactitud por defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra es compleja y la extracción del analito requiere varios pasos obteniéndose recuperaciones más bajas. Cuando esto ocurre sería conveniente intentar optimizar la preparación de la muestra para mejorar el factor de recuperación. Si esto es muy costoso o no es posible, cuando la exactitud obtenida es repetible, es decir, tienen una precisión elevada y además es homogénea en todos los niveles de concentración estudiados, puede aplicarse un factor de corrección en el cálculo final para compensar las pérdidas del analito debidas al método de extracción [17]. 1.1.4 LÍMITE DE DETECCIÓN (LD): El límite de detección (LD) corresponde a la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar en las condiciones establecidas. 28.

(29) y se expresa en unidades de concentración (%, ppm, ppb, etc.). Su determinación puede efectuarse mediante la relación entre el ruido y la señal debida al analito. 1.1.5 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC): Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de cuantificación (LC) de dicho método, la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisión y exactitud; también se expresa en unidades de concentración [17,18]. Existen diversos procedimientos de análisis y sistemas instrumentales que dependiendo de sus características definen en muchos casos cuál es el método óptimo para determinar tanto el límite de detección como el de cuantificación. Entre los métodos más comunes se tienen los siguientes: 1.1.5.1 Método basado en la relación señal/ruido Este método, uno de los más conocidos y empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una línea de base, es decir una señal residual a concentración cero de analito (espectrofotometría UV-visible o la cromatografía de gases o líquida). Este procedimiento presenta la desventaja de que en numerosas ocasiones al llevar a cabo la comprobación experimental del LC calculado, se observa que es posible obtener resultados igualmente precisos y exactos aún cuando se desciende más en la concentración límite 1.1.5.2 Método basado en la desviación estándar de la respuesta del blanco y la pendiente de la recta de calibrado De acuerdo a la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), puede calcularse el LD Y LC de un método analítico a partir del conocimiento de la desviación atribuible a la respuesta de una muestra de placebo y la pendiente de la recta de calibrado del analito. La expresión a aplicar para este cálculo varía en función de si el método instrumental empleado corrige la señal frente a un blanco o no. 29.

(30) 1.1.5.2.1 Métodos instrumentales que corrigen la señal frente a un blanco Este primer caso correspondería a un método espectrofotométrico en el que se podría calcular el LD y el LC teóricos mediante la expresión: . . Donde: CL= Concentración de analito en el límite de cuantificación o detección. K= Constante que usualmente se considera igual a 10 para el LC e igual a 3 para el LD. Sbl= desviación estándar correspondiente a la señal del blanco o placebo. b= pendiente de la curva de calibración obtenida al representar la respuesta del método frente a la concentración de analito. Evidentemente el rango de esta recta tiene que ser cercano en concentraciones a los niveles límite de cuantificación [17]. Si el método analítico realiza la lectura final por duplicado o triplicado, mejorando con ello la precisión, se ha de introducir en la fórmula el término correspondiente a las réplicas (n) en la siguiente forma: . √. 1.1.5.2.2 Métodos instrumentales que no corrigen la señal frente a un blanco El caso en que no se realiza corrección frente a un blanco es típicamente el de métodos cromatográficos GC o HPLC. En éstos se ha de tener en cuenta también la señal media obtenida del análisis correspondiente al placebo, es decir, el ruido de fondo o background del sistema (Ybl) con lo que la expresión final será entonces:. . . . . 30. . √.

(31) 1.1.5.3 Método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero Se trata de un procedimiento aplicable también a métodos analíticos instrumentales que proporcionan resultados numéricos y dirigido a evitar el cálculo, en ocasiones costoso en tiempo, como se ha podido observar, de la señal media del blanco y su desviación estándar. El método utiliza la pendiente de una recta de calibrado realizada a niveles de concentración cercanos a los límites esperados, pero sustituye el valor real de la señal del blanco por el resultante de la extrapolación de dicha recta. La intersección con el eje “Y” corresponderá teóricamente al valor de la respuesta a concentración cero de analito [17].. 1.1.6. SENSIBILIDAD. La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo [18]. En contraste con el límite de detección, la sensibilidad de un método está definida como la habilidad para distinguir entre diferentes concentraciones, y se calcula así: . . Para métodos donde la respuesta con respecto a la concentración es una función lineal, la sensibilidad es constante con respecto a la concentración y es igual a la pendiente de la curva de calibración. Contrariamente a las funciones lineales, la sensibilidad de métodos cuando su respuesta es no-lineal cambia con la concentración del analito [19].. 1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES Desde sus inicios en los años cincuenta, la cromatografía de gases (GC) se ha convertido en la técnica principal para la separación y análisis de compuestos volátiles. A partir de entonces, las aplicaciones de ésta técnica han ido aumentado a medida que se han mejorado los instrumentos de cromatografía; siendo factible la separación, caracterización y cuantificación de una gran variedad de compuestos tanto en muestras ambientales, biológicas y médicas, como en comidas, sabores y fragancias. En la actualidad es usada 31.

(32) rutinariamente en multitud de laboratorios universitarios, de investigación e industriales, debido a su alta resolución, sensibilidad y selectividad. Además de las aplicaciones típicamente analíticas, la GC puede utilizarse a escala preparativa para la obtención de compuestos de elevada pureza [20,25]. En cromatografía de gases los analitos (siempre en estado gaseoso) se distribuyen entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria que puede ser un sólido o una delgada película líquida que recubre al sólido; dependiendo de la fase estacionaria que se utilice (sólida o líquida) la cromatografía en fase gaseosa se clasifica en: cromatografía gassólido (CGS) y cromatografía gas-líquido (CGL). De las dos modalidades, la CGL es la forma más selectiva de la cromatografía y la que se presta a mayores usos. En cromatografía de gases, la fase móvil se denomina gas transportador, ya que es un gas inerte cuya finalidad es transportar las moléculas de la muestra a través de la columna. Los adsorbentes, tales como gel de sílice, alúmina, sales inorgánicas, polímeros porosos, tamices moleculares y carbón grafitizado, son las fases estacionarias en la CGS. Esta se utiliza principalmente para la separación de gases permanentes y compuestos orgánicos muy volátiles. Los líquidos orgánicos de alto punto de ebullición constituyen la fase estacionaria de la CGL. La fase liquida se extiende como una película delgada sobre un sólido inerte llamado soporte sólido. La base para la separación es la partición de la muestra dentro o fuera de esta película líquida. Si se puede encontrar una fase líquida que tenga solubilidad selectiva para dos compuestos, entonces estos dos pueden separarse mediante cromatografía de gases. 1.2.1 VENTAJAS Las siguientes son algunas ventajas generales de GC que cabe destacar: •. Alta Resolución: La eficiencia puede ser expresada en números de platos, y las columnas capilares suelen tener números de platos de cientos de miles. Los isómeros con puntos de ebullición muy próximos que no pueden separarse por destilación se separan fácilmente mediante la cromatografía de gases. Además, el hecho de que las concentraciones de soluto son muy diluidas, en las columnas de GC se elimina la posibilidad de azeótropos, que a menudo plaga las separaciones por destilación.. 32.

(33) La CG se presta a usos más variados que la mejor columna de destilación, ya que la columna cromatográfica puede sustituirse fácilmente. Esto permite la separación selectiva debido a solubilidades diferentes, aun cuando los puntos de ebullición estén muy cercanos. Como hay numerosas columnas, se puede escoger entre ellas, lo que confiere variedad a la gama de muestras que pueden manejarse [20]. •. Sensibilidad: Esta característica del sistema de cromatografía de gases explica en gran medida su uso extensivo. El más simple detector de conductividad térmica puede medir fácilmente microgramos. El detector de ionización por llama fácilmente mide nanogramos (10-9g), y los detectores más selectivos como el de captura de electrones y el detector fotométrico de llama alcanzan los picogramos (10−12 g). Este nivel de sensibilidad es más impresionante si se tiene en cuenta que el tamaño de la muestra utilizada es del orden de 1µL o menos.. •. Tiempo de análisis: La separación de todos los componentes de una muestra puede tardar desde varios segundos hasta 30 minutos. Análisis que rutinariamente tardan una hora o más se pueden reducir a una cuestión de minutos, debido a la alta tasa de difusión en fase gaseosa y el rápido equilibrio entre las fases móvil y estacionaria [23].. •. Resultados cuantitativos: La GC permite obtener muy buenos resultados cuantitativos. Sin embargo, la exactitud es función de muchos factores. Se puede obtener buena exactitud en una amplia gama de concentraciones de la muestra, desde miligramos hasta nanogramos [22].. •. Comodidad: El funcionamiento del GC es un procedimiento relativamente sencillo. No es difícil para capacitar al personal no técnico para llevar a cabo separaciones de rutina [23].. •. Costos: En comparación con muchos instrumentos de análisis disponibles en la actualidad, los cromatógrafos de gases representan un valor excelente [23].. 1.2.2 INSTRUMENTACIÓN EN CROMATOGRAFÍA DE GASES. 33.

(34) En 1954 se introdujo en el mercado el primer cromatógrafo de gases comercial. Rápidamente fue aceptado como un importante instrumento para el análisis químico tanto en la investigación como en la industria. Con igual rapidez se han ideado y desarrollado perfeccionamientos, accesorios, complementos y variantes, que no han cesado de aparecer hasta la fecha. En los años sesenta, se hicieron habituales los integradores electrónicos y los equipos para el procesamiento de datos basados en una computadora. Los años ochenta introdujeron la utilización de las computadoras para el control automático de la mayoría de los parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la inyección de la muestra; el desarrollo de instrumentos de alto rendimiento a un coste moderado; y tal vez lo más importante, el desarrollo de las columnas abiertas que son capaces de separar una multitud de analitos en un tiempo relativamente corto [22,25]. Un cromatógrafo de gases funciona de la siguiente manera. Un gas portador inerte (como el helio) fluye continuamente desde un cilindro de gas de gran tamaño mediante el puerto de inyección, la columna, y el detector. La tasa de flujo del gas portador es cuidadosamente controlada para garantizar tiempos de retención reproducibles y reducir al mínimo el ruido y la deriva del detector. La muestra se inyecta (normalmente con una microjeringa) en el puerto de inyección con calefacción donde se vaporiza y es llevada a la columna; por lo general una columna capilar de 15 a 30 m de largo recubierta en su interior con una delgada (0,2 µm) película de un líquido de alto punto de ebullición (fase estacionaria). Se da la partición de la muestra entre las fases móvil y estacionaria, ocasionando la separación en componentes individuales basados en la solubilidad relativa en la fase líquida y presión de vapor relativa. Después de la columna, el gas portador y la muestra pasan por un detector. Este dispositivo mide la cantidad de la muestra, y genera una señal eléctrica. Esta señal va a un sistema de datos integrador que genera un cromatograma (el acta de análisis). En la mayoría de los casos el sistema informático de gestión integra automáticamente el área del pico, calcula el rendimiento e imprime un informe con los resultados cuantitativos y tiempos de retención. Cada uno de estos siete componentes se muestran en la figura 1.. 34.

(35) Figura 1. Diagrama de un sistema de cromatografía gas-líquido.. 1.2.2.1 GAS PORTADOR El gas portador es la fase móvil en GC. Su objetivo principal es la de llevar la mezcla de los solutos desde que se introduce en el sistema cromatográfico hasta la salida del detector, pasando a través de la columna donde se produce la separación. Debe ser químicamente inerte y no interaccionar ni con la columna ni con los componentes de la mezcla, es decir, no debe afectar a los procesos de partición o de adsorción. Un objetivo secundario es proporcionar una matriz adecuada para el detector que permita medir los componentes de la muestra [22]. Los gases más utilizados son: nitrógeno, hidrógeno y helio. La elección de uno de ellos va a depender de: la fase estacionaria, y el tipo de detector utilizado. Otros aspectos a considerar serían costo, pureza y seguridad en su uso [22,24]. 35.

(36) El Helio es el gas portador más popular debido a que presenta mayor eficiencia a ratas de flujo rápidas, se utiliza para los detectores de conductividad térmica y de ionización por llama. El Hidrógeno también es comúnmente usado, aunque no se recomienda por su potencial de explosión. El nitrógeno proporciona una sensibilidad un poco mayor, pero un análisis más lento que el helio; se utiliza tanto para el detector de captura de electrones como el detector de ionización por llama [20,22]. Es importante que el gas portador sea de alta pureza. Las impurezas (en especial oxigeno y agua) pueden alterar químicamente la fase líquida y, por ende, modificar los tiempos de retención. Las columnas de poliésteres, poliglicoles y poliamidas son susceptibles de ser degradadas por el oxigeno y el agua. Trazas de agua pueden des-adsorber otros contaminantes en la columna y producir numerosas señales en el detector o hasta “picos fantasma” [22]. 1.2.2.2 SISTEMA DE INYECCIÓN Las muestras para GC pueden ser gases, líquidos o sólidos. La cantidad de muestra que se debe introducir depende del tamaño de la columna; pero, generalmente en cromatografía de gases se utilizan muestras pequeñas (entre 0,01 y 20 µL) [22,25]. La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un “tapón” de vapor; la inyección lenta de muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una pobre resolución. El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a través de un “septum” de goma de silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (esta cámara normalmente está unos 50 °C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra); el émbolo de la jeringa puede manejarse a mano (inyección manual) o mediante un dispositivo electrónico o neumático (inyección automática). Para columnas capilares el tamaño de la muestra es de aproximadamente 10−3µL; por lo cual, para mantener la cantidad de muestra en el intervalo correcto, existe un inyector especial que reduce la cantidad de muestra que llega a la cabeza de la columna capilar: el inyector split/splitless. En el modo split la muestra se divide permitiendo pasar a la columna solamente una pequeña fracción de la muestra, desechando el resto; mientras que en el modo splitless toda la muestra se inyecta en la columna [25,27]. 36.

(37) Para el caso de muestras sólidas, estas se disuelven en un solvente apropiado y se introducen de forma análoga a los líquidos normales [22]. 1.2.2.3 CONFIGURACIÓN DE LA COLUMNA Y DEL HORNO DE LA COLUMNA La columna constituye la parte esencial del sistema cromatográfico y de la que depende el éxito o el fracaso de los análisis. En ella está contenida la fase estacionaria, que determina la selectividad y la eficacia de las separaciones. Hasta hace poco tiempo, la mayor parte de las cromatografías de gases se realizaban con columnas empaquetadas o de relleno, mientras que actualmente se utilizan más extensamente las columnas tubulares abiertas o capilares porque ellas presentan mejor eficacia en la separación ya que proporciona un número mayor de platos teóricos. Las primeras suelen tener una longitud comprensible entre 1 y 6 m, con un diámetro interno que oscila entre 2 y 6 mm, mientras que las columnas capilares tienen longitudes entre 10 y 100 m y diámetros comprendidos entre 0,1 y 0,6 mm. En cuanto a los materiales de que están fabricadas, suelen ser acero inoxidable o vidrio para columnas empaquetadas, y sílice para las capilares, si bien se han utilizado también otros metales como aluminio o cobre, e incluso teflón [21]. La temperatura es una variable importante en cromatografía, siendo necesario su control preciso en orden a obtener resultados reproducibles. Por ello, las columnas cromatográficas suelen disponerse en rollos de 10 a 30 cm de diámetro, con el fin de poder colocarlas en el interior de un horno termostatizado que permita operar entre unos 10 °C por encima de la temperatura ambiente y unos 450 °C, con una precisión de 0,1 °C. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la práctica con temperaturas de la columna iguales o ligeramente superiores a la temperatura de ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30) minutos. Para muestras cuyos componentes presentan un amplio intervalo de temperaturas de ebullición, a menudo es conveniente emplear una programación de la temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua o bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separación [21,25].. 37.

(38) En general, la resolución óptima se asocia con una temperatura mínima; en contrapartida la reducción de temperatura produce un aumento en el tiempo de elusión, y por lo tanto del tiempo que se necesita para completar el análisis [25]. 1.2.2.4 SISTEMAS DE DETECCIÓN En el cromatógrafo de gases uno de los elementos más importantes es el detector; este es un dispositivo que indica y mide los solutos en la corriente del gas portador, convirtiendo una señal no medible directamente en una señal elaborable de una propiedad física. Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas portador puro y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es amplificada y registrada al momento de salir de la columna [29]. Varias son las características generales que debe reunir un detector para ser utilizado en cromatografía, y que se pondrán de manifiesto en la generación y calidad de la señal del mismo. Estas características son las siguientes: •. Sensibilidad adecuada: La sensibilidad del detector indica la respuesta del mismo ante un cambio de la propiedad física que mide; a su vez, este cambio de propiedad física se deberá a la presencia de una menor o mayor cantidad de componente en el detector. Debe ser lo más alta posible.. •. Buena estabilidad y reproducibilidad: La línea base de un cromatograma está sometida a fluctuaciones fortuitas, conocidas como ruido de fondo, el cual se puede producir en los distintos componentes del cromatógrafo. Originar una señal estable (línea de base) y reproducible (pico) [21,25].. •. Respuesta lineal: la linealidad del detector considera que la respuesta del mismo, señal, sea proporcional a la variación en la cantidad de componente que en un momento dado se encuentre en el detector. Esta debe extenderse a varios órdenes de magnitud.. •. Intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.. •. Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal.. •. Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o más tipos de solutos [25]. 38.

(39) Además de las características indicadas, es deseable que el detector posea también: tiempo de respuesta corto, resistencia mecánica y química, sencillez de manejo y mantenimiento. Algunos detectores son universales, es decir que son sensibles a prácticamente todos los compuestos que eluyen de la columna. Por otro lado, hay detectores discriminativos (selectivos) que son sensibles solo a compuestos específicos, dando un cromatograma muy sencillo. También pueden ser clasificados como destructivos o no de los analitos. Los detectores se clasifican en dos grupos dependiendo de si sólo conducen a una información única, como el tiempo de retención y los que producen, además de tiempo de retención, la información estructural del analito en cuestión. Por esta razón, algunos cromatógrafos de gases están equipados con dos o tres detectores vinculados en serie. Sin embargo, la respuesta de todos los detectores depende de la concentración molar o de la masa de analito en la compañía de gas de arrastre [28]. En la tabla 1 puede observarse los detectores más utilizados, con un breve resumen de sus ventajas.. 1.2.2.4.1 DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA (FID) El FID es el más usado de los detectores, posee una alta sensibilidad y es de respuesta universal, lo que significa que responde casi de la misma manera por unidad de masa de analito sin que influya su estructura química mientras tenga carbonos orgánicos. Es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2, y NOX. El FID se basa en la conductividad eléctrica de los gases. A temperatura y presión normales, los gases se comportan como aislantes, pero si en su interior existen átomos o moléculas cargadas eléctricamente, o electrones libres, se produce un incremento en la conductividad. Las moléculas de la muestra, que están presentes en el gas de arrastre, llegan al detector y son quemadas por la llama producida por la combustión de aire e hidrógeno, dando como resultado la formación de iones los cuales son reunidos en un electrodo colector que genera una corriente, que es convertida en voltaje, y posteriormente amplificada para ser captada por el registrador [21]. Un detector de ionización por llama característico se observa en la figura 2. 39.

(40) TIPO. LÍMITE DE DETECCIÓN APROXIMADO (g s-1) 10- 5 – 10-6. INTERVALO LINEAL APROXIMADO. CARACTERISTICAS. 103 - 104. Ionización por llama (FID) Captura electrónica (ECD). 10-12. 106 - 107. 10-14. 102 - 103. Fotométrico de llama (FPD). 10-13. 102. Nitrógeno-Fósforo. 10-8 – 10-14. 105 - 107. Fotoionización (PID). 0-8 – 10-12. 105. Detectot Hall. 10-11. 105. Espectómetro de masas (MS). 10-12. Detector universal. Mide cambios en la conducción de calor Detector universal. Mide corrientes iónicas de pirolisis Detector selectivo para compuestos que contienen átomos con elevada afinidad electrónica Detector selectivo para compuestos que contienen S oP Selectivo para compuestos que contienen N o P Detector universal (alguna selectividad debida al gas de la lámpara) Detector especifico para compuestos que contienen un halógeno, S o N Detector universal. Conductividad térmica (TCD). Varía dependiendo del tipo de espectómetro de masas así como de los tipos de compuestos analizados 102 Moléculas polares. Espectrómetro 10-10 infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR) Tabla 1. Propiedades de los detectores para cromatografía de gases. El FID es tal vez el detector más ampliamente utilizado para la cromatografía de gases debido a varias ventajas: (a) responde a prácticamente todos los compuestos orgánicos 40.

(41) que contienen carbono con alta sensibilidad (aproximadamente 10-13g/mL); (b) no responde a las impurezas comunes del gas portador como agua y dióxido de carbono; (c) cuenta con un amplio rango de respuesta lineal (aproximadamente 107) y una excelente estabilidad de la línea base; (d) es relativamente insensible a pequeños cambios de flujo/rata en la columna durante la programación de la temperatura; (e) es altamente seguro, duradero, y fácil de usar; y (f) tiene detector bajo de volumen muerto y rápida respuesta. Sus limitaciones son: (a) se da poca o ninguna respuesta a los gases no combustibles y todos los gases nobles; y (b) es un detector destructivo que modifica las propiedades físicas y químicas de la muestra de forma irreversible [13].. Figura 2. Detector de ionización por llama característico [22]. El FID responde a compuestos que en la combustión ceden especies con carga eléctrica en una llama hidrógeno/aire, la reacción de los radicales libres que se da es:. 41.

(42) Estas especies cargadas, bajo la influencia de un campo eléctrico, son capturadas en un electrodo colector y medidas por un electrómetro, cuya salida es amplificada. El campo de aplicación del FID es muy grande, ya que responde a casi todos los compuestos orgánicos. Una desventaja es que a menudo es demasiado inespecífico y poco sensible para el análisis medioambiental y el análisis de residuos [26].. 1.2.3 ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO: La cromatografía ha llegado a ser el principal método para la separación de especies químicas estrechamente relacionadas entre sí. Además, se puede emplear para la identificación cualitativa y cuantitativa de las especies separadas [25]. 1.2.3.1 Análisis cualitativo: El tiempo de retención o el volumen de retención para un soluto dado se pueden utilizar para su identificación si se mantienen constantes las siguientes variables de la columna: longitud, espesor, temperatura y presión (rata del flujo del gas portador). Sin embargo, cuando se parte de una muestra desconocida, se hace difícil identificar sus componentes por este procedimiento, ya que los miles de compuestos conocidos hacen que existan demasiadas posibilidades entre las que elegir [22]. El analista no siempre se enfrenta con muestras totalmente desconocidas, por lo que, en muchos casos, el problema puede resolverse cromatográficamente. El procedimiento más simple de análisis cualitativo se realiza con ayuda de patrones: los tiempos de retención de los picos desconocidos se comparan con los tiempos de retención de compuestos conocidos, separados en la misma columna y en las mismas condiciones experimentales. Como alternativa, cuando se sospecha que un componente ya identificado corresponde a un pico dado se añade a la muestra problema algo de componente puro, y se realiza un cromatograma. En el registro obtenido debe aparece el pico del componente aumentado en su dimensión [21,30]. 1.2.3.2 Análisis cuantitativo: En cromatografía de gases los parámetros cuantitativos son la altura, o el área, del pico del analito, las cuales son comparadas con la de uno o más patrones. 42.

(43) •. Análisis basados en la altura del pico:. El uso de la altura del pico presenta como ventaja la comodidad de medida, pero solamente proporciona una exactitud aceptable en el caso de muestras sencillas de pocos componentes que den lugar a picos agudos, estrechos y claramente separados. Además la altura del pico es muy sensible a variaciones en las condiciones de operación, por lo que el uso de este parámetro exige un control cuidadosísimo de dichas condiciones. Las medidas de altura de pico son interesantes para los análisis de rutina, en los que se puede sacrificar algo de la exactitud a favor de la sencillez y rapidez de las determinaciones [20,25]. •. Análisis basados en las áreas de los picos:. El uso, como parámetro, del área del pico es más acertado cuando se requiere mayor exactitud en las determinaciones cuantitativas. Como se sabe, el área del pico es función de la cantidad de componente o de la concentración del mismo [21,25]. Los resultados de las áreas o alturas de los picos de los analitos, se utilizan para determinar las concentraciones exactas de cada una de las especies mediante los siguientes métodos: 1.2.3.2.1 Método del patrón interno: En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyección de la muestra. En este procedimiento, se introduce en cada estándar y en la muestra una cantidad exactamente medida del patrón interno, y la relación de las áreas (o alturas) del analito y del patrón interno sirve como parámetro analítico [25]. 1.2.3.2.2 Método del estándar externo: Un estándar externo es el que se analiza separadamente de la réplica desconocida que se está ensayando. Los estándares, que contienen distintas concentraciones conocidas de analito junto a la matriz que es similar o idéntica a la de la muestra, son inyectados. A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o áreas de pico en función de la concentración. La representación gráfica de los datos. 43.

(44) debería originar una línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en esta gráfica. [27]. 1.2.3.2.3 Método de la normalización de las áreas: Este método de la normalización de las áreas evita las incertidumbres asociadas con la inyección de la muestra. En éste método, se determinan las áreas de todos los picos eluídos; tras corregir esas áreas debido a las diferencias en la respuesta del detector a los distintos compuestos, la concentración del analito se calcula por la relación de su área con el área total de los picos [25].. 1.3 EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE) Normalmente las muestras a analizar que se reciben en un laboratorio no están en la forma apropiada para realizar directamente el análisis. A veces la muestra no está en el disolvente apropiado. La técnica de Cromatografía de Gases (GC) requiere que el analito esté en un disolvente volátil [31]. Es por esto que se procede por una técnica de extracción, en la cual se transfiere el soluto de cierto disolvente a otro que sea adecuado. En este caso, se utiliza la extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés). La (SPE) es muy empleada en la preparación de muestras para análisis por cromatografía líquida, de gases, electroforesis y aún para espectrofotometría [33]. La (SPE) se ha convertido en una de las técnicas para clean-up y concentración de muestras utilizadas por los químicos analíticos. Con los años, la SPE ha experimentado un crecimiento constante por las necesidades de los analistas a encontrar los procedimientos de preparación de muestras que sea sencillo y relativamente económico, que proporcione una buena recuperación del analito y adecuada selectividad, que reduzca el uso de disolventes orgánicos, y que pueda ser automatizado, cuando la necesidad surja [34]. Los usos más importantes de la SPE en matrices acuosas son: plaguicidas, hidrocarburos alifáticos, benceno y los bencenos alquílicos, contaminantes prioritarios, materiales aromáticos policíclicos, fenoles clorinados, bifenilos policlorinados (PCBs), cloroanilinas y cloruro de tributilestaño [35]. 44.