Amélia Regina Somensi Zeggio
PRÓPOLIS CATARINENSE:
INFLUÊNCIA DA SAZONALIDADE E DA ORIGEM GEOGRÁFICA NO PERFIL DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Biotecnologia e Biociências
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Maraschin
Florianópolis 2016
AGRADECIMENTOS
Aos que me deram condições para iniciar qualquer caminhada: meus pais, Neura e Udecir, primeiros mestres da vida, por todo apoio, amor e dedicação.
Aos que participaram do caminho:
- meu orientador, prof. Dr. Marcelo Maraschin, por todo ensinamento, gentileza e compreensão;
- a Maíra Tomazzoli e Elis Rosa por todas as horas compartilhadas de bancada;
- ao colega Virgílio Uarrota e ao prof. Miguel Rocha, pelo suporte na análise de dados;
- a todos os colegas do LMBV, em especial à Aline Pereira, Beatriz Veleirinho, Bianca Coelho, Fernanda Ramlov e Rodolfo Moresco, que estiveram presentes em toda a caminhada;
- Nésio da FAASC, as abelhas e os apicultores, pelo entusiasmo, aprendizado, trabalho e colaboração;
- ao querido casal Thobias Furlanetti e Daniela Lombardi, pelo tempo dedicado à confecção do mapa;
- a banca examinadora, profs. Drs. Adair dos Santos, Admir Giachini, Caio Córdova, Rivaldo Niero e Shirley Kuhnen, pelo apoio técnico-científico;
- ao CNPQ e CAPES pelo auxílio financeiro;
- ao CEBIME, por conceder o espaço físico à realização das análises; - ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia e Biociências, por aceitar meu projeto e me oferecer esta oportunidade;
- a UFSC que tem me aberto caminhos desde a graduação.
Aos que caminham diariamente de mãos dadas comigo: meu marido Rodrigo e meu filho Caetano, pelo amor, compreensão e sentido que dão ao meu caminho.
A quem deu o sopro inicial ao meu caminho e o ilumina diariamente, Deus, pela minha existência, pelas graças recebidas, pelos tropeços que me ajudaram a crescer e pelos “caminhantes” que encontro em meu caminho.
Caminhante, são tuas pegadas o caminho e nada mais; caminhante, não há caminho, se faz caminho ao andar. Ao andar se faz caminho, e ao voltar a vista atrás se vê a senda que nunca se há de voltar a pisar. Caminhante não há caminho senão há marcas no mar…
Antonio Machado, poeta espanhol Proverbios y Cantares 1909
RESUMO
O presente estudo objetivou determinar a influência da origem geográfica (OG), sazonalidade e variáveis ambientais (temperatura e altitude) na composição química da própolis produzida em Santa Catarina (SC). Adicionalmente, identificou-se entre as amostras com maior concetração de compostos fenólicos, os metabólitos candidatos a marcadores e as eventuais espécies botânicas fontes de resina. Para tal, os teores de fenólicos totais (FT), flavononas e flavonóis (FF), flavanonas e dihidroflavonois (FD), extrato seco e a atividade antioxidante (ensaio do radical DPPH) de extratos hidroalcoólicos de própolis (EHP), coletadas ao final de cada estação nos anos de 2010 e 2011, em vinte apiários de SC (n=133), foram determinados. Os resultados revelaram teores superiores de FT, FF e FD, porém similar atividade antioxidante, em amostras coletadas em maiores altitudes (≥
900m). A influência das variáveis ambientais foi determinada via análises de predição à classificação da própolis quanto a região de coleta ou estação, utilizando-se dados de espectrofotometria de varredura UV-Vis (200-700 nm) dos EHP. Os modelos de classificação quanto a região e sazonalidade alcançaram acurácias de até 75% e 46%, respectivamente. Para o detalhamento da caracterização química de própolis coletadas em altitude (n=27), duas abordagens analíticas foram adotadas: i) injeção direta em espectrômetro de massa (EM), utilizando como fonte de ionização electrospray em modo negativo [IES(-)] e, ii) CLAE acoplada à EM em tandem (EM/EM). Quarenta e cinco compostos foram identificados e a seleção dos analitos majoritários nas amostras permitiu identificar dois tipos de perfis químicos: i) contendo ácidos diterpênicos (ácidos isocupréssico, comúnico, 15-acetoxi-isocupréssico, agático e agatálico), identificados na própolis de Água Doce, Bom Retiro, Urupena, Porto União e São Joaquim (SJ), e ii) rico em substâncias comuns à própolis verde como a artepillin C, bacarina e drupanina, restrito à própolis de SJ. A análise comparativa dos espectros de massas de amostras destes quimiotipos com os de resinas de Baccharis dracunculifolia e Araucaria angustifolia, revelou ser B. dracunculifolia a principal fonte de resina à produção de própolis em SJ, enquanto a própolis contendo ácidos diterpênicos teve seu perfil químico associado à resina incolor de A. angustifolia. Estes resultados indicam que a própolis coletada na regiões de altitude em SC destaca-se em relação as demais regiões do estado, apresentando dois quimiotipos principais, um contendo metabólitos típicos de própolis verde e outro ácidos diterpênicos, provenientes da singular cobertura vegetal do
estado.
Palavras-chaves: Própolis. Metabólitos Secundários. Sazonalidade. Origem geográfica. Origem Botânica.
ABSTRACT
This study aimed to determine the influence of geographical origin (G.O.), seasoning, and environmental factors (temperature and altitude) on the chemical composition of propolis produced in Santa Catarina (SC). Besides, propolis samples with superior content of phenolic compounds and flavonoids were further investigated regarding their eventual biochemical markers and the botanical species sources of resins for its production. Firstly, the total content of phenolic compounds (TP), flavones and flavonols (FF), flavanones and dihydroflavonols (FD), dry extract and antioxidant activity (DPPH radical assay) were determined in propolis samples collected in SC, over the seasons in 2010 and 2011, from twenty apiaries (n=133). The results shown that samples from regions with altitude ≥ 900m presented superior amounts of TP, FF, and FD, while the antioxidant activity was similar regardless the G.O. and season of harvest. In a second experimental approach, attempts to classify propolis according to their G.O. and season of collection were performed by applying supervised prediction models on the UV-Vis scanning (200-700 nm) data set. The classification models built reached accuracies of 75% and 46%, in the best cases, to predict the region and season of harvest of propolis samples, respectively. Further, to better characterize the chemical composition of propolis with G.O. in high altitudes regions (n=27), two analytical approaches were adopted: i) direct injection of the extracts into mass spectrometer (MS) equipped with an electrospray ion source, operating in negative mode [IES(-)] and ii) HPLC-MS/MS, allowing to identify forty-five compounds. Besides, two main chemotypes of propolis were detected: i) the first one rich in diterpene acids, such as isocupresic acid, communic acid, agathic acid, agathalic acid, and 15-acetoxy-cupressic acid and, ii) the second group, restricted to SJ propolis, characterized by containing compounds usually found in green propolis, e.g., artepillin C, baccharin, and drupanin. Finally, mass spectra of the EHs of propolis were compared to those of resins from Baccharis dracunculifolia and Araucaria angustifolia species. It was possible to identify B. dracunculifolia as the main source of resin in SJ propolis, while A. angustifolia seemed to be a relevant source of diterpenic acids altitude propolis. These results indicate that catarinense propolis with G.O. in regions above 900m show a peculiar chemical profile as two main chemotypes of propolis could be found: one characterized by the presence of biochemical marker typical of green propolis, and a second group with diterpenic acids, both resulting from
the particular flora of SC.
Keywords: Propolis. Secondary Metabolites. Seasonality.Geographical Origin. Botanical Origin.
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 – Atividade farmacológica de compostos isolados já identificados em própolis... 28 Quadro 2- Classificação dos compostos fenólicos de acordo com seu esqueleto básico... 30 Quadro 3- Classificação dos terpenos em função do número de unidades de isopreno... 38 Quadro 4 - Parâmetros físico-químicos exigidos pelo MAPA à comercialização da própolis e de seu extrato alcoólico... 50 Quadro 5 – Classificação da própolis brasileira proposta por Marcucci (2006)... 51 Quadro 6 – Classificação da própolis brasileira proposta por Park e colaboradores (2000)... 52
Tabela 1.1. – Registro da altitude do apiário (Alt A), altitude do município (Alt M), média da temperatura mínima (T min), média (T med) e máxima (T max) obtidas nas distintas OG em cada estação... 85 Tabela 1.2. (A-C)- Concentração de FT (mg GAE/g) e FF (mg QE/g), TDF (mg PI/g) e extrato seco (mg/g) e atividade antioxidante de própolis coletada durante as quatro estações em 20 OG de SC... 88 Tabela 1.3. – Correlação de Pearson entre as variáveis ambientais e os dados bioquímicos... 93 Tabela 1.4.- Abundância relativa (%) dos principais constituintes detectados por CLAE-DAD da própolis coletada em OG de altitude em SC... 98 Quadro 2.1. - Classificação dos municípios de acordo com o zoneamento agroecológico... 105 Tabela 2.1. – Índices de acurácia e kappa dos modelos preditivos para classificação em região ou estação os espectros
brutos e pré-processados……… 111
Tabela 2.2. – Contribuição relativa (%) dos dez comprimentos de onda mais relevantes à classificação das amostras de própolis por região geográfica, utilizando os dados de espectros não processados e pré-processados... 112 Tabela 3.1. – Perfil de composição química de amostras de própolis catarinense, oriundas de regiões com altitudes superior a 900 m, determinado por CLAE-EM/EM... 124
Tabela 4.1. – Abundância dos íons (%) identificados concomitantemente em própolis e nas resinas de A. angustifolia e B. dracunculifolia... 148
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química de um fenol, o mais simples dos compostos fenólicos... 30 Figura 2 - Estrutura química dos flavonoides e de suas principais classes... 32 Figura 3 - Detalhes da estrutura química de flavonoides comumente encontrados em própolis... 33 Figura 4 - Detalhes das estruturas químicas de ácidos fenólicos identificados em própolis, consoante ao precursor na via de biossíntese... 35 Figura 5 - Estrutura química do éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE)... 35 Figura 6 - Estrutura química do ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, artepillin C)... 36 Figura 7 - Estrutura química básica das benzofenonas poliisopreniladas... 37 Figura 8 - Estrutura química do isopentenil difosfato... 38 Figura 9 (A-B) – Detalhes das estruturas químicas de diterpenos isolados de própolis verde... 40 Figura 10 (A-B) - Estrutura química básica dos compostos derivados de benzopiranos e benzofuranos... 41 Figura 1.1. – Localização das 20 OG estudadas no mapa hipsométrico de SC... 80 Figura 1.2. (A-E) - Média anual das concentrações de FT, FF, FD, ES e atividade antioxidante dos EHP, consoante às estações de coleta e OG... 87 Figura 1.3. – Análise de Correspondência Canônica (CCA) entre os dados bioquímicos e as variáveis ambientais... 94 Figura 1.4.- Heatmap de correlação e similaridade das amostras de acordo com as variáveis bioquímicas e ambientais... 95 Figura 1.5. (A-B): Agrupamentos amostrais definidos pela análise de k-means (k=3)... 96 Figura 2.1.(A-B) – Espectros da varredura de UV-Vis (200-700 nm) de 133 EHPs coletados ao longo das estações em três regiões determinadas pelo zoneamento agroecológico de SC... 108 Figura 2.2.(A-B) – Dendograma dos espectros de UV-Vis processados dos EHPs obtido pela análise de cluster hierárquico utilizando distância euclidiana... 109
Figura 3.1.(A-B) - Gráfico de dispersão utilizando PC1 e PC2 calculado a partir dos compostos majoritários da própolis coletada em altitude em SC, identificados por injeção direta em EM-IES(-)... 127 Figura 3.2. (A-B) - Agrupamentos amostrais definidos pela análise de k-means (k=2)... 128 Figura 3.3. (A-B) - Heatmap de correlação das amostras de acordo com a intensidade e a presença ou ausência dos íons selecionados... 129 Figura 3.4. (A-B) - Cromatograma do extrato da própolis coletada em SJ, caracterizado pela presença de compostos da própolis verde... 133 Figura 3.5. (A-B) - Cromatograma típico dos extratos de própolis coletados em AD, BR, PU, SJ e UR... 134 Figura 3.6. (A-B) - Cromatograma dos extratos de própolis coletados em BR... 135 Figura 4.1.(A-B) - Espectros de massa de amostras de resina de B. dracunculifolia e de própolis coletada no município de SJ... 150 Figura 4.2.(A-B) - Espectros de massa de amostras de resinas vermelha e incolor de A. angustifolia e de amostra de própolis originária do município de AD... 151
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC Águas de Chapecó
AD Água Doce
AlCl3 Cloreto de alumínio
AltA Altitude do apiário
AltM Altitude do município
AN Angelina
BG Balneário Gaivotas
BR Bom Retiro
CAPE Éster fenetílico do ácido cafeico CCA Análise de correspondência canônica CCD Cromatografia em camada delgada
CE Campo Erê
CG Cromatografia gasosa
CH Cluster Hierárquico
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CN Canoinhas
CNO Campos Novos
DAD Detector de arranjo de diodos
DC Descanso
DCBEN 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano DHCA Ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico
DMAPP Dimetilalil pirofosfato DNF 2,4-dinitrofenilhidrazina
DO Denominação de origem
DPB 2,2-dimetil-6-carboxietenil-8-prenil-2H-1-benzopirano
EHP Extrato hidro alcoólico de própolis
EM Espectrometria de massa
EM-IES Espectrometria de massa com fonte de ionização por electrospray
EM/EM Espectrometria de massa em tandem
ES Extrato seco
FAASC Federação das Associações dos Apicultores de Santa Catarina
FD Flavanonas e dihidroflavonois
FDP Farnesil-difosfato
FF Flavononas e flavonois
FOM Floresta ombrófila mista
FR Fase reversa
FT Fenólicos totais
GGDP Geranilgeranil difosfato
GPP Geranil difosfato
GUPs Grandes Unidades de Paisagem
IFO Íons de Fontes Outras
IG Indicação Geográfica
IP Indicação de Procedência
INPI Instituto Nacional de Propriedade Industrial IPP Isopentenil difosfato
IT Itaiópolis
JB José Boiteux
KNN K-ésimo vizinhos mais próximos LDA Análise Discriminate Linear
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuário e Abastecimento
MG Minas Gerais
OG Origem Geográfica
PC Componentes Principais
PCA Análise de Componentes Principais
PLS-DA Análise Discriminante dos Mínimos
Quadrados Parciais
PR Paraná
PU Porto União
RF Random Forest
RMN Ressonância Magnética Nuclear
rpart Árvores de decisão
SA Serra Alta
SC Santa Catarina
SJ São Joaquim
SJC São José do Cerrito
TIC Cromatograma de Íons Totais
Tmax Temperatura máxima
Tmed Temperatura média
Tmin Temperatura mínima
UR Urupema
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 23
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 25
2.1. PRÓPOLIS – ASPECTOS GERAIS... 25
2.2. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS IDENTIFICADOS EM PRÓPOLIS... 27
2.2.1. Compostos fenólicos... 29
2.2.2. Terpenos... 37
2.2.3. Benzofuranos e benzopiranos... 41
2.3. MÉTODOS ANALÍTICOS USADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM PRÓPOLIS... 42
2.4. ANÁLISE MULTIVARIADA... 47
2.5. PADRONIZAÇÃO DA PRÓPOLIS... 49
2.6. CENÁRIO ATUAL DA APICULTURA EM SANTA CATARINA... 53
3. OBJETIVOS... 57
3.1. OBJETIVO GERAL... 57
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 57
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 59
Capítulo I – Influência da sazonalidade e origem geográfica no conteúdo de compostos fenólicos, atividade antioxidante e perfil químico da própolis produzida em Santa Catarina... 4 4 77 1. INTRODUÇÃO... 77
2. MATERIAL E MÉTODOS... 78
2.1. COLETA DAS AMOSTRAS... 78
2.2. PREPARO DOS EXTRATOS HIDROALCOÓLICOS DE PRÓPOLIS (EHP)... 79
2.3. QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS (FT), FLAVONAS E FLAVONOIS (FF) E FLAVANONAS E DIHIDROFLAVONOIS (FD) NOS EHPS POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS... 5 81 2.4. QUANTIFICAÇÃO DO EXTRATO SECO... 82
2.5. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE... 82
2.6. PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS EHP... 83
2.7. VARIÁVEIS AMBIENTAIS... 83
2.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 84
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 86
5 5
3.1. INFLUÊNCIA DA SAZONALIDADE E OG NO CONTEÚDO DE FT, FF, FD, ES E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EHP...
8 86
3.2. EFEITO DE VARIÁVEIS AMBIENTAIS NA
QUALIDADE DOS EHP... 91
3.3. PERFIL QUÍMICO DA PRÓPOLIS COLETADA EM REGIÕES DE ALTITUDE EM SC... 96
4. CONCLUSÃO... 99
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 100
Capítulo II – Efeito da sazonalidade e da origem geográfica no perfil espectroscópico UV-Visível da própolis catarinense – quimiometria aplicada ao reconhecimento de padrões... 7 7 103 1. INTRODUÇÃO... 103 2. MATERIAIS E MÉTODOS... 105 2.1. AMOSTRAS... 105
2.2. PREPARO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE PRÓPOLIS (EHP)... 105
2.3. AQUISIÇÃO DOS ESPECTROS DE VARREDURA UV-VIS... 106
2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 106
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 106
4. CONCLUSÃO... 114
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 115
Capítulo III - Caracterização do perfil químico e compostos candidatos a marcadores bioquímicos da própolis de altitude em Santa Catarina... 119
1. INTRODUÇÃO... 119
2. MATERIAL E MÉTODOS... 120
2.1. AMOSTRAS... 120
2.2. PREPARO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS... 121
2.3. ESPECTROMETRIA DE MASSA... 121
2.4. ANÁLISE DOS DADOS... 122
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 122
4. CONCLUSÃO... 136
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 137
Capítulo IV- Análise comparativa dos perfis químicos da própolis de altitude com os exsudatos resinosos de Baccharis dracunculifolia e Araucaria angustifolia... 143
1. INTRODUÇÃO... 143
2. MATERIAL E MÉTODOS... 145
2.2. PREPARO DOS EXTRATOS... 146 2.3. ESPECTROMETRIA DE MASSA... 146 2.4. ANÁLISE DE DADOS... 146 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 146 4. CONCLUSÃO... 153 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 154 CONCLUSÕES FINAIS... 157 PERSPECTIVAS FUTURAS... 159
1. INTRODUÇÃO
A própolis é produzida pelas abelhas a partir de exsudatos resinosos vegetais e tem como função primordial a proteção das colméias. A função de proteção da própolis extrapola o habitat das abelhas, sendo usada desde antigas civilizações por suas propriedades terapêuticas. Todavia, por sua composição química ser dependente da vegetação fonte de resina, o conhecimento dos constituintes da própolis de uma determinada região é de suma importância na garantia de produtos seguros e eficazes.
Santa Catarina (SC) é um dos estados do Brasil com maior atividade apícola, sendo responsável por 10,4% da produção nacional de mel. Segundo o IBGE (2014), apesar de sua reduzida dimensão territorial, SC ocupa o 5O lugar entre os estados do Brasil produtores de mel e é o 2o maior produtor da região Sul. Estima-se que em SC haja cerca de 30 mil apicultores profissionais e amadores, totalizando 300 mil colmeias. Desses, cerca de 3 mil são considerados profissionais e têm na apicultura sua principal fonte de renda (SEBRAE, 2013a). Apesar de ter uma importância relevante no cenário apícola nacional, quase toda apicultura catarinense é voltada à produção de mel e pouco se sabe sobre a qualidade de outros produtos derivados das abelhas como a própolis.
O mercado de própolis movimenta anualmente cerca de US$ 25 milhões e já alcança um volume de exportação de 70 t, tendo como principais compradores o Japão, Estados Unidos, Alemanha e China (ALBUQUERQUE, 2007). A própolis brasileira, em especial a verde, é muito apreciada pelo mercado asiático, principalmente pelo Japão, aonde um frasco de extrato alcoólico contendo 30 g de própolis é comercializado a U$ 150,00. O Brasil responde por 10 a 15% da produção mundial de própolis e atende 80% da demanda japonesa (SEBRAE, 2013b). O valor agregado e a procura pela própolis brasileira é um incentivo ao investimento no controle de qualidade dos produtos apícolas produzidos no Brasil, evitando que este perca espaço para outros países produtores. O Brasil representa a segunda maior produção mundial de produtos apícolas, perdendo somente para a China (LUSTOSA et al., 2008). O presente trabalho insere-se em uma demanda da Federação das Associações de Apicultores e Meliponicultores de Santa Catarina (FAASC), que busca uma melhor inserção dos produtos apícolas regionais a partir do conhecimento destes.
A presente tese de doutorado buscou investigar a natureza química da própolis catarinense, utilizando-se de métodos analíticos para identificar classes de compostos e substâncias marcadoras em amostras de própolis coletadas ao longo dos anos de 2010 e 2011, em apiários localizados em diversas regiões do estado. No Capítulo I foi descrita a influência das estações, da origem geográfica (OG) e de variáveis ambientais sobre os parâmetros rotineiramente utilizados para identificar a qualidade da própolis, consoante à legislação vigente. No Capítulo II investigou-se a acurácia de modelos de classificação de própolis baseado nos perfis químicos (UV-Vis) dos extratos hidroalcoólicos destas, segundo a estação e região de coleta. No Capítulo III as amostras de própolis que se destacaram em relação a sua qualidade foram analisadas por espectrometria de massa (EM), buscando-se identificar metabólitos candidatos a marcadores químicos e reconhecer padrões de perfil químico. Por fim, no Capítulo IV, perfis químicos de resinas vegetais candidatas a fontes de exsudatos à própolis foram determinados.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. PRÓPOLIS – ASPECTOS GERAIS
Própolis (CAS 9009-62-5) é o termo genérico utilizado para denominar o material resinoso coletado por abelhas de diversas partes das plantas, como gemas vegetativas, botões florais e exsudados resinosos, que, por fim, serão misturados com cera e enzimas presentes na saliva destes insetos. A palavra própolis é derivada do grego pro (em
defesa de) e polis (cidade), o que quer dizer “em defesa da cidade”, no
caso, da colmeia. De fato, as abelhas utilizam esta substância para protegerem-se de insetos e microrganismos, para o reparo de frestas e danos na colmeia, no preparo de locais assépticos para postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores (GHISALBERTI, 1979).
A apicultura no Brasil teve início com o padre Antônio Carneiro, que em 1839 trouxe algumas colônias de abelhas da espécie Apis mellifera da região do Porto, em Portugal, para o Rio de Janeiro (SOUZA et al., 2007). Até 1956, a população de abelhas no Brasil era principalmente de origem europeia. Porém, devido à introdução de abelhas africanas por um cientista brasileiro, com vistas a melhorar a produção de mel, um escape acidental de abelhas rainhas levou a um processo de africanização das abelhas, resultando numa rápida e ampla substituição das abelhas europeias pelas africanizadas (KOO; PARK, 1997). As abelhas mais utilizadas no Brasil para fins comerciais são um híbrido das abelhas europeias (Apis mellifera mellifera, Apis mellifera ligustica, Apis mellifera caucasica e Apis mellifera carnica) com a abelha africana Apis mellifera scutellata (PEREIRA et al., 2003). A abelha africanizada possui um comportamento semelhante ao de Apis mellifera scutellata, porém menos agressivo, além de apresentar grande facilidade de enxamear, alta produtividade, tolerância a doenças e adaptação a climas mais frios (SOUZA et al., 2007a).
O uso de produtos apícolas é documentado desde as mais remotas civilizações até os tempos atuais. No caso da própolis, há relatos de seu uso desde o Egito Antigo, quando era utilizada para embalsamar os mortos (CASTALDO; CAPASSO, 2002). Hipócrates (460-377 a.C), considerado o pai da medicina moderna, prescrevia própolis ao tratamento de feridas e úlceras internas e externas (NAJAFI et al., 2007). As propriedades medicinais da própolis também foram reconhecidas por médicos romanos e gregos, como Aristóteles, Dioscórides, Plínio e Galeno (CASTALDO; CAPASSO, 2002). Alguns
historiadores acreditam que os poderes curativos da própolis também estão registrados na Bíblia, onde a palavra tzori, traduzida como bálsamo, estaria referindo-se à própolis. Já no primeiro livro da Bíblia, em Gênesis, o patriarca Jacó define como os bens mais preciosos da terra para presentear José: bálsamo (ou própolis), mel, arômatas, mirra, amêndoas e pistache (Gênesis 43: 11) (TORETI et al., 2013). A própolis também foi empregada como antisséptico, cicatrizante e desinfetante bucal por médicos árabes e na idade média. Há também relatos do uso de própolis pelos incas como agente antipirético. No século XVII foi listada como droga oficial na farmacopeia britânica (CASTALDO; CAPASSO, 2002). No final do século XIX foi amplamente utilizada na África do Sul durante a guerra Anglo-Boer devido as suas propriedades cicatrizantes. Por essa mesma razão foi empregada também em várias clínicas soviéticas durante a segunda guerra mundial (PEREIRA; SEIXAS; AQUINO NETO, 2002).
O primeiro trabalho científico sobre própolis foi indexado ao Chemical Abstracts em 1908, descrevendo suas propriedades químicas e composição (PEREIRA; SEIXAS; AQUINO NETO, 2002). Atualmente, cada vez mais estudos científicos confirmam as ações terapêuticas da própolis, já relatadas na medicina popular e por antigas civilizações, evidenciando ações imunomoduladora, antitumoral, antimicrobiana, antiviral, antifúngica, antiprotozoários, anti-inflamatória, anti-ulcerativa, antioxidante, analgésica, no tratamento de alergias, asma, rinite e diabetes, além de ter seu uso bastante difundido em áreas como odontologia e dermatologia (para revisão ver GHISALBERTI, 1979; MARCUCCI, 1995; CASTALDO; CAPASSO, 2002; SFORCIN; BANKOVA, 2011).
A composição química da própolis depende das características fitogeográficas do local de coleta, pois as abelhas podem escolher diversas espécies vegetais como fontes de resinas (SFORCIN; BANKOVA, 2011). Mais de 300 constituintes químicos já foram identificados e/ou caracterizados em diferentes amostras de própolis, dentre eles: flavonoides, ácidos aromáticos, ácidos graxos, fenóis, aminoácidos, polissacarídeos, vitaminas A, B1, B2, B6, C e minerais como Mn, Cu, Ca, Al, Si, V, Ni, Zn e Cr (PEREIRA; SEIXAS; AQUINO NETO, 2002). Devido a esta grande complexidade, é extremamente difícil identificar qual a substância responsável por sua atividade terapêutica. Considerando que as abelhas existem em quase todas as regiões do mundo, uma grande variedade de tipos de própolis podem então ser encontrados. Geralmente, o espectro de voo de A. mellifera abrange um raio de 4-5 km em torno da colmeia, sendo que
suas escolhas são balizadas por uma refinada comunicação química com o ambiente, baseada no aroma, cor e valor nutricional das plantas (TEIXEIRA et al., 2005). A composição da própolis também é influenciada pelo componente genético da abelha, pela sazonalidade e pelo método de coleta utilizado (SOUZA et al., 2010).
As primeiras análises químicas de própolis foram realizadas com amostras originárias da Europa e demonstraram a presença de flavonoides agliconas, ácidos fenólicos e os seus ésteres. Em 1926, Jaubert constatou a origem vegetal da própolis ao isolar crisina desta matriz complexa, sendo este flavonoide também encontrado na espécie Populus nigra, conhecida no Brasil como álamo, a qual vegetava no local da colmeia (GHISALBERTI, 1979). No início dos anos 90, a própolis dos trópicos atraiu a atenção dos cientistas, que concluíram que se tratava de um produto com a composição química bastante distinta das amostras europeias. Estes achados indicavam que comparar própolis de diferentes regiões poderia ser o mesmo que comparar extratos de plantas de distintas famílias (BANKOVA, 2005). Nos países tropicais, os recursos botânicos disponíveis às abelhas para coleta de resinas são muito mais vastos, devido à extensa biodiversidade típica dessas regiões e, consequentemente, a composição química é mais variável em relação ao observado em territórios temperados (SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). Apesar da importante variabilidade química da própolis, os compostos do metabolismo secundário, oriundo das plantas visitadas pelas abelhas, parecem ser os responsáveis pelas suas ações farmacológicas.
2.2. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS IDENTIFICADOS EM PRÓPOLIS
Os metabólitos secundários são um grande grupo de constituintes químicos das plantas que não são requisitados à sua sobrevivência imediata, porém são sintetizados como respostas aos estímulos do ambiente, incluindo proteção contra patógenos, herbívoros e simbiose com insetos, por exemplo. Os metabólitos secundários são divididos em diversos grupos com base na sua estrutura química e vias de biossíntese. Dentro destes grupos podem ainda ser subdivididos em função de sua estrutura e atividade(s) biológica(s). De maneira geral, os fitoquímicos mais encontrados pertencem aos grupos de compostos fenólicos, alcaloides e terpenos (KENNEDY; WIGHTMAN, 2011). Em relação aos metabólitos secundários encontrados em própolis, foram
identificados principalmente compostos fenólicos e terpenos até o momento, mas não compostos nitrogenados, como alcaloides, glicosinolatos ou cianogênicos (SALATINO et al., 2011). Alguns compostos isolados de própolis e que tiveram sua atividade farmacológica estudada podem ser encontrados no Quadro 1. Maiores informações sobre os metabólitos secundários de própolis que não constam neste trabalho, podem ser encontradas em revisões recentes sobre composição, estrutura química e origem vegetal de própolis ao redor do mundo (ver SALATINO et al., 2011; MIGUEL; ANTUNES, 2011; HUANG et al., 2014).
Quadro 1– Atividade farmacológica de compostos isolados já identificados em própolis.
Composto Classe Atividade Farmacológica
Referências Artepillin C Ácido
cinamico -Antimicrobiana (bactericida, fungicida e antiprotozoários - Antioxidante - Antitumoral -Anti-inflamatória -AGA et al., (1994); MARCUCCI et al., (2001); FERESIN et al., (2003) -KUMAZAWA; HAMASAKA; NAKAYAMA, (2004); UTO et al., (2006) - MATSUNO et al., (1997); SHIMIZU et al., (2006); OLIVEIRA et al., (2014) - PAULINO et al., (2008) Drupanina Ácido cinamico - Antitumoral -Antioxidante - MISHIMA et al., (2005); KUMAZAKI et al., (2014) - IZUTA et al., (2009) Bacarina Ácido
cinamico - Antitumoral - MISHIMA et al., (2005); KUMAZAKI et al., (2014)
- Antioxidante
- IZUTA et al., (2009) Ac.
Isocupréssico Ácidos diterpenicos - Bactericida - Antitumoral - Abortífero - BANKOVA et al., (1996) - IAWAMOTO et al. (2003) - GARDNER et al., (1994) 15-acetoxi-isocupréssico Ácidos diterpenicos
- Bactericida - BANKOVA et al., (1996) Ac.Comúnico Ácidos diterpenicos - Bactericida - Hepatoprotetor - Antitumoral - BANKOVA et al., (1996) -ALQASOUMI; ABDEL-KADER, (2012) - PERRY; FOSTER, (1994) 2.2.1. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são um grupo de fitoquímicos vastamente encontrados em plantas, sendo que mais de 8000 estruturas fenólicas já foram identificadas. Esses metabólitos são classificados e nomeados de acordo com sua origem, função biológica e estrutura química. Quimicamente, são definidos como substâncias que possuem anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (TSAO, 2010 - Figura 1 e Quadro 2). Nas plantas, os compostos fenólicos podem ser formados através de duas rotas biossintéticas: pela via do ácido chiquímico, a partir de carboidratos, ou pela via do acetato—polimalato, que se inicia com acetil-coenzima A e malonil-coenzima A. A via de origem determinará o padrão de substituição do composto fenólico resultante. Dessa forma, pela via do ácido chiquímico obtém-se compostos com grupo hidroxila em posição orto, que se formam a partir do ácido cinâmico. Já a via acetato-polimalato origina compostos com grupos hidroxilas dispostos em meta (SIMÕES et al., 2010). Entre os compostos fenólicos mais encontrados em própolis temos os flavonoides, os ácidos fenólicos e seus ésteres (BANSKOTA et al, 1998).
Figura 1 - Estrutura química de um fenol, o mais simples dos compostos fenólicos.
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
Quadro 2- Classificação dos compostos fenólicos de acordo com seu esqueleto básico.
Classe Estrutura
Fenólicos simples, benzoquinonas C6 Ácidos hidroxibenzóicos C6-C1 Acetofenol, ácidos fenilacéticos C6-C2 Ácidos didroxicinâmicos, fenilpropanóides C6-C3
Nafitoquinonas C6-C4 Xantonas C6-C1-C6 Estilbenos, antraquinonas C6-C2-C6 Flavonóides, isoflavonóides C6-C3-C6 Lignanas, neolignanas (C6-C3)2 Bioflavonóides (C6-C3-C6)2 Ligninas (C6-C3)n Taninos condensados (C6-C3-C6)n Fonte: Harborne (1989).
Os flavonoides são compostos largamente distribuídos no reino vegetal, ocorrendo em tecidos de frutas, folhas, sementes e em outras partes da planta, nas formas de glicosídios ou agliconas (HARBORNE; BAXTER; MOSS, 1999). A estrutura química dos flavonoides consiste em dois anéis aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado anel C (Figura 2). O anel aromático A é derivado do ciclo acetato/malonato, enquanto o anel B é derivado da fenilalanina (MERKEN; BEECHER, 2000). Variações em substituição do anel C padrão resultam em importantes classes de flavonoides, como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis, isoflavonas e neoflavonoides (Figura 2). Substituições nos anéis A e B
ampliam a variabilidade estrutural dentro de cada classe de flavonoides, sendo que estas podem incluir oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfatação, por exemplo (HOLLMAN; KATAN, 1999).
Embora a maioria dos flavonoides encontra-se nas plantas na forma de glicosídeos, no caso da própolis, as abelhas ao exporem tais compostos à ação da enzima 13-glicosidase, presente em sua saliva, converte-os as suas respectivas agliconas (PARK et al., 1997).
A própolis europeia caracteriza-se por ter uma alta concentração de flavonoides, o que muitas vezes não é visto em amostras de clima tropical (BANKOVA, 2005). Entre os flavonoides encontrados na própolis proveniente do álamo (Populus sp.) destacam-se os flavonóis, flavonas, flavanonas e os dihidroflavonóis. Flavanonas preniladas são também os constituintes majoritários de própolis das ilhas do Pácifico de Okinawa e Taiwan (CHEN; WU; LIN, 2003; KUMAZAWA, et al. 2004a). A figura 3 ilustra a estrutura química de alguns flavonoides comumente encontrados em própolis. Campferol, quercetina, isoramnetina e galangina são exemplos de flavonóis. Luteolina e crisina exemplos de flavonas. Pinocembrina é uma flavanona e pinobancsina um dihidroflavonol (MARCUCCI; WOISKY; SALATINO, 1998).
Em amostras tropicais são comumente encontrados flavonoides como isoflavonas e os neoflavonoides (Figura 2) provenientes de resinas de leguminosas (SALATINO et al., 2011). No Brasil, um novo tipo de própolis proveniente dos manguezais de Alagoas (AL), denominada de própolis vermelha, teve sua origem botânica atribuída à leguminosa Dalbergia ecastophyllum (DAUGSCH et al., 2008). Alencar et al. (2007) identificaram que pelo menos 3 isoflavonoides (homopterocarpina, medicarpina e 4’,7-dimetoxi-2’-isoflavonol) apresentaram-se como os compostos majoritários naquele tipo de própolis. A própolis vermelha brasileira apresentou uma composição química similar a um homólogo proveniente de Cuba, devido à presença comum de dois isoflavonóides, a medicarpina e a homopterocarpina (PICCINELLI et al., 2005; ALENCAR et al., 2007), e duas isoflavonas, a formononetina e a biochanina (PICCINELLI et al., 2005). Além destes compostos, outros sete isoflavonoides foram encontrados na própolis cubana, sendo três isoflavonas e outras quatro pterocarpanas. Dois isoflavonóides metilados de alta atividade antioxidante também foram identificados em própolis vermelha brasileira, um deles identificado como vestitol, já isolado da própolis vermelha cubana (PICCINELLI et al., 2005). Amostras de própolis procedentes do Nepal, provavelmente derivadas de Dalbergia sisoo, também apresentaram neoflavonóides
Figura 2 - Estrutura química dos flavonoides e de suas principais classes.
Figura 3 - Detalhes da estrutura química de flavonoides comumente encontrados em própolis
como seus compostos majoritários (SHRESTHA; NARUKAWA; TAKEDA, 2007a; SHRESTHA; NARUKAWA; TAKEDA, 2007b ).
Outra classe de compostos fenólicos usualmente encontrada em própolis são os ácidos fenólicos, seus derivados ésteres e heterosídeos. Estas substâncias caracterizam-se por apresentarem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos hidroxila e/ou metoxila na molécula (ANGELO; JORGE, 2007). Os ácidos fenólicos consistem em dois grupos: i) derivados do ácido hidroxibenzoico e, ii) derivados do ácido hidroxicinâmico. Os ácidos hidroxibenzoicos apresentam como estrutura comum um composto aromático ligado a um carbono (C6-C1), enquanto os ácidos hidroxicinâmicos apresentam três carbonos formando a cadeia lateral (C6-C3) (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). Os ésteres e heterosídeos de ácidos fenólicos são principalmente derivados do ácido cafeico, podendo ser também derivados do ácido tartárico e lático. Ao contrário dos ésteres e heterosídeos do acido cinâmico, muito pouco se sabe sobre os derivados do ácido benzoico. Além do ácido gálico, o qual é constituinte básico
dos taninos hidrolisáveis, há relatos da ocorrência dos ácidos ρ -hidroxibenzoico, protocatecuico e vanílico na forma heterosídica (SIMÕES et al., 2010). A figura 4 ilustra a estrutura química de alguns ácidos hidroxibenzoicos (gálico, ρ-hidroxibenzoico, protocatecuico,
vanílico e siríngico) e hidroxicinâmicos (cafeico, ferúlico, ρ-cumárico e sinápico) comumente encontrados na natureza e que já foram identificados em própolis.
Os ácidos e ésteres de fenilpropanoides formam importantes classes de compostos orgânico em vegetais, sintetizados a partir de
reações enzimáticas das unidades básicas de ácido cinâmico e ρ -cumárico, que são comumente encontrados em própolis (SIMÕES et al., 2010; SALATINO et al., 2011). Na própolis europeia, o principal representante deste grupo é o éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE –
caffeic acid phenethyl ester - Figura 5). Este composto, relativamente simples, passou a receber destaque quando Metzner e colaboradores verificaram ser a substância com maior atividade bactericida e fungicida de amostras de própolis europeia (BANKOVA, 2009). O CAPE também demonstrou ações citotóxica, principalmente em linhagens tumorais (GRUNDBERGER et al., 1998), antioxidante (RUSSO; LONGO; VANELLA, 2002; VELAZQUEZ et al., 2007), antiviral (KISHIMOTO et al., 2005), anti-inflamatória (CUNHA, 2004a) e anti-HIV, pela inibição da síntese da integrasse HIV-1, envolvida na replicação viral (POMMIER; JOHNSON; MARCHAND, 2005).
Figura 4 – Detalhes das estruturas químicas de ácidos fenólicos identificados em própolis, consoante ao precursor na via de biossíntese.
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
Figura 5 - Estrutura química do éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE).
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
A própolis encontrada em regiões tropicais usualmente contém fenilpropanoides prenilados, sendo o mais conhecido o ácido 3, 5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA) (BANKOVA; CASTRO; MARCUCCI, 2000 - Figura 6), também denominado artepillin C pelos
japoneses, que o isolaram e o patentearam para uso na terapia de tumores (ARAI et al., 1998; KUMAZAWA et al., 2003; PARK et al., 2004).
Figura 6 - Estrutura química do ácido 3, 5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, artepilin C)
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
O artepillin C é considerado o principal marcador da própolis verde, sendo comercialmente o tipo de própolis brasileira mais importante (BANKOVA; CASTRO; MARCUCCI, 2000; MATSUDA; ALMEIDA-MURADIAN, 2008). Este tipo de própolis é típico do sudeste brasileiro, em especial do estado de Minas Gerais (MG), cuja resina à produção provém de botões vegetativos da Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), uma espécie popularmente conhecida como alecrim do campo (KUMAZAWA et al, 2003). Inúmeras atividades farmacológicas já foram atribuídas a este composto, como antimicrobiana, antioxidante, antitumoral, antiviral e anti-inflamatória (para revisão ver ESTRADA; SILVA; ANTUNES, 2008). A presença deste composto confere à própolis não somente um alto valor terapêutico, mas também um incremento no seu valor comercial. O maior importador da própolis verde é o Japão, sendo que além de maior consumidor, é também pioneiro em estudos relacionados à composição química, atividades farmacológicas, bem como detém várias patentes envolvendo a própolis verde brasileira (PEREIRA; SEIXAS; AQUINO NETO, 2002).
As benzofenonas preniladas (Figura 7) também são compostos fenólicos identificados em amostras tropicais provenientes da Venezuela (TOMÁS-BARBERÁN et al., 1993), Cuba (HERNÁNDEZ et al., 2005) e Brasil, na região nordeste e no Amazonas (TRUSHEVA et al., 2006; ISHIDA et al., 2011). Em Cuba e na Venezuela, a fonte de resina são os
exsudatos florais do gênero Clusia, a qual parece ser a possível fonte botânica também no Brasil, uma vez que já foram identificadas no país espécies de Clusia produzindo resinas com benzofenonas similares (OLIVEIRA et al, 1996; SALATINO et al., 2011).
Figura 7 - Estrutura química básica das benzofenonas.
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016). 2.2.2. Terpenos
Os terpenos constituem o grupo mais complexo estruturalmente e diversificado de metabólitos secundários, tendo sido documentados mais de 30.000 compostos na literatura. Estes metabólitos secundários apresentam um importante papel como fragrâncias na perfumaria, no aroma exalado por espécies condimentares utilizadas na culinária, como compostos à atração de polinizadores, ou à repulsão de predadores, bem como à terapia medicamentosa para inúmeras doenças, incluindo tumores (BREITMAIER, 2006). Os terpenos têm no isopentenil difosfato (IPP, Figura 8) e em seu isômero de posição dimetilalil difosfato (DMAPP) seus precursores. Em função do número destas unidades isoprênicas em sua estrutura, são classificados conforme descrito no quadro 3. Os precursores são gerados por duas vias localizadas nos plastídeos e no citosol das plantas. Neste úlltimo o IPP é derivado da via do ácido mevalônico, iniciando com a condensação do acetil-CoA. Já nos plastídios o IPP é formando a partir do piruvato e do gliceraldeído 3-fosfato. O IPP citosólico é precursor do farnesil-difosfato (FDP), o qual participa da síntese de sesquiterpenos e triterpenos, enquanto o IPP dos plastos forma os precursores geranil difosfafato (GPP) e geranilgeranil difosfato (GGDP) para mono, di e tetraterpenos (CHENG et al., 2007).
Figura 8 - Estrutura química do isopentenil difosfato.
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
Quadro 3- Classificação dos terpenos em função do número de unidades de isopreno.
Unidades de isopreno N° Carbonos Classe
2 10 Monoterpeno 3 15 Sesquiterpeno 4 20 Diterpeno 6 30 Triterpeno 8 40 Tetraterpeno N N Polisopreno
Fonte: Simões et al. (2010).
Os monoterpenos são os principais constituintes dos óleos voláteis, compreendendo cerca de 90% destes, sendo considerados industrialmente os terpenos mais importantes (VERPOORTE; ALFERMANN, 2000). Em termos farmacológicos, possuem uma ampla gama de propriedades medicinais, como: bactericida, antisséptica, anti-inflamatória, antinociceptiva, gastroprotetora (SANTOS et al., 2005), anticâncer (COMPAGNONE et al., 2010), antioxidante (MOHAMED et al., 2009), carminativa, expectorante, fungicida (SOUZA et al., 2006), antihelmíntica, larvicida (TORRES et al., 2008) e vasorrelaxante (MAGALHÃES, 2008). A unidade básica dos monoterpenos é o GPP, sintetizado a partir da fusão de IPP e DMAPP, por união do tipo
“cabeça-cauda”. O GPP pode sofrer isomerização, formando as três
estruturas básicas de diferenciação dos monoterpenos, i.e., os acíclicos , monocíclicos e bicíclicos (DEWICK, 2009)
Os sesquiterpenos são formados por três unidades isoprênicas. A
terminologia vem do latim e significa “um e meio”. São menos voláteis
que os monoterpenos e sua unidade básica é o FDP, sintetizado a partir
da fusão de GPP e IPP, por união do tipo “cabeça-cauda” (DEWICK,
com os fatores (a)bióticos (BREITMAIER, 2006), apresentando também atividades farmacológicas importantes, e.g., anti-inflamatória, antiespasmódica, antibacteriana e antifúngica (DEWICK, 2009).
Os diterpenos são um grupo bastante numeroso, tendo como unidade básica o GGDP, composto resultante da fusão de FDP e IPP,
por união “cabeça-cauda”. Geralmente não são voláteis e possuem alto
grau de ciclização devido a processos similares aos que ocorrem em monoterpenos e sesquiterpenos (DEWICK, 2009). Os diterpenos apresentam uma vasta gama de esqueletos, como: clerodanos, neoclerodanos, cembranóides, halimanos, cauranos, labdanos, traquilobanos e sarcopetalanos (SALATINO; SALATINO; NEGRI, 2007). Vários diterpenos apresentam propriedades medicinais a exemplo do taxol, um éster diterpênico isolado pela primeira vez em 1971 e utilizado à terapêutica do câncer de mama e alguns tipos de câncer de ovário (DEWICK, 2009).
Entre os triterpenos, o esqualeno é considerado o mais simples, sendo precursor de outros triterpenos e esteróides. Esta classe é
sintetizada pela união “cauda-cauda” de duas moléculas de FDP,
possuindo alto grau de ciclização e propriedades não voláteis. Os triterpenos são subdivididos quanto à estrutura da molécula em tetracíclicos (p.ex. lanosterol e eufol) ou pentacíclicos (p.ex. cicloartano,
lupeol e α-amirina) (DEWICK, 2009). Alguns triterpenos possuem atividades farmacológicas bastante estudadas como a α- e β-amirina, as quais são atribuídos efeitos anti- convulsionante, antidepressivo, ansiolítico e sedativo (ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2005)
Os óleos voláteis (monoterpenos e sesquiterpenos), diterpenos e triterpenos são os terpenos mais encontrados em própolis. Mono e sesquiterpenos são frequentemente detectados em própolis verde, conferindo seu odor característico e provavelmente contribuindo ao seu efeito antimicrobiano (SALATINO et al., 2005). Sesquiterpenos não voláteis, como a lactona dehidrocostus, um composto capaz de inibir a função citolítica de linfócitos T citotóxicos, também parece estar presente em própolis verde (TANIGUCHI et al., 1995).
Os diterpenos, como o ácido isocupréssico, são comumente encontrados em amostras de própolis do leste do Mediterrâneo, como Grécia, Creta e Turquia. As fontes botânicas desses diterpenos parecem ser espécies da família Cupressaceae, as quais são muito cultivadas naquelas regiões (POPOVA et al., 2010). Os diterpenos encontrados nesse tipo de própolis, demonstraram atividade contra células de adenocarcinoma de cólon humano HT-29, sem afetar as células normais, sendo o diterpeno manool o composto mais ativo (PRATSINIS et al.,
2010). Outras coníferas, como as Araucárias no sul do Brasil, também são consideradas possíveis fontes de diterpenos na própolis, enquanto a Baccharis dracunculifolia parece ser a principal fonte de diterpenos na região sudeste e central do Brasil (MISSIMA et al., 2007). Diterpenos do tipo labdano, como o ácido isocupréssico e o ácido agático, também foram encontrados em própolis brasileira, demonstrando atividade hepatoprotetora (BANSKOTA et al., 2001). Diterpenos do tipo clerodano, com atividade anti-carcinogênica, foram isolados de própolis verde, como o ácido 13- simfioreticúlico (MATSUNO et al., 1997b). Na Figura 9 estão ilustrados alguns diterpenos já identificados em própolis. Figura 9 (A-B) – Detalhes das estruturas químicas de diterpenos lábdanos isolados de própolis. (A) ácido isocupréssico e (B) ácido trans-comúnico.
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
Triterpenos com vasta ocorrência em plantas também já foram encontrados em própolis verde (NEGRI et al., 2000). Como exemplo, os triterpenos pentacíclicos lupeol e procrims a e b foram isolados nesse tipo de própolis (FURUKAWA et al., 2002). Embora os compostos fenólicos sejam os principais constituintes da própolis verde, constatou-se que em alguns casos os triterpenos são os únicos compostos encontrados em Baccharis dracunculifolia (TEIXEIRA et al., 2006). Em amostras de própolis de Minamar foram isolados treze triterpenoides cicloartanos e dentre esses, o ácido 27-dihidroxicicloartano-24E-en-26-oico apresentou a mais potente atividade citotóxica contra células de melanoma murino B16-BL6 (LI et al., 2009).
A+ +
B+ +
2.2.3. Benzofuranos e benzopiranos
Os benzopiranos (ou cromenos) e benzofuranos são estruturas formadas combinando metabólitos oriundos das vias biossintéticas de fenólicos e terpenos, gerando compostos heterocíclicos que caracterizam-se pela fusão de um anel benzênico com um pirano ou furano (PROKSCH; RODRIGUEZ, 1983) (Figura 10 A-B). Enquanto o anel fenólico é proveniente da via acetato-polimalato, o anel heterocíclico é formado por uma unidade de isopreno proveniente do metabolismo dos terpenos (TSUNG-JEN; RAMSTAD; HEINSTEIN, 1974).
Figura 10 (A-B) - Estrutura química básica dos compostos derivados de benzopiranos (A) e benzofuranos (B).
Fonte: Royal Society Of Chemistry (2016).
Estes metabólitos podem ser considerados precursores de compostos mais complexos e mudanças em sua estrutura básica oferecem um alto grau de diversidade, servindo como moléculas base à procura de novos agentes terapêuticos. Inúmeras propriedades farmacológicas já foram atribuídas a estes compostos como: hipoglicemiante, analgésica, anti-inflamatória, bactericida, fungicida, antitumoral, antiviral e antipirética (KHANAM; UZZAMAN, 2014).
Mais de 200 benzopiranos e benzofuranos Já foram isolados de espécies de plantas das famílias Rutaceae, Liliaceae, Cyperaceae e principalmente Asteraceae (PROKSCH; RODRIGUEZ, 1983). Na própolis brasileira estes compostos também já foram identificados. Um estudo isolou dois benzofuranos denominados de própolis-benzofurano A e própolis-benzofurano B, os quais apresentaram atividade citotóxica moderada contra células de carcinoma de cólon murino e fibrosarcoma humano (BANSKOTA et al., 2000). Marcucci e colaboradores (2001)
Benzopirano* Benzofurano*
isolaram quatro compostos de própolis brasileira, sendo dois derivados de benzopiranos (i.e. 2, 2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano - DCBEN e 2,2-dimetil-6-carboxietenil-8-prenil-2H-1-benzopirano - DPB), que exibiram atividades bactericida, anti-Trypanosoma cruzi e relaxante em músculo isolado de traqueia de roedores.
2.3. MÉTODOS ANALÍTICOS USADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EM PRÓPOLIS
Devido ao grande número de tipos de própolis, é de extrema valia o desenvolvimento de métodos analíticos robustos que garantam a procedência e que identifiquem os compostos ativos de determinado tipo amostral, a fim de assegurar própolis de qualidade e sua correta indicação terapêutica. Impulsionados por estas necessidades, os métodos analíticos aplicados à caracterização da própolis têm evoluído substancialmente ao longo dos anos. Em geral, os procedimentos analíticos para determinação dos compostos ativos envolvem três passos principais: preparo do extrato, separação analítica e quantificação (GOMEZ-CARAVACA et al., 2006).
A própolis não é utilizada como matéria-prima bruta, antes os seus componentes são extraídos com solventes adequados. Esse processo deve remover o material inerte (resina, cera e material insolúvel) e preservar os compostos bioativos, em especial, os de natureza fenólica. O uso de etanol é particularmente eficiente à obtenção de extratos de própolis livres de cera, especialmente nas concentrações de 70 e 80% (v/v, BOSIO et al., 2000; PIETTA; GORDANA; PIETTA, 2002; POPOVA et al., 2005; SAWAYA et al., 2004a). A extração aquosa costuma recuperar principalmente ácidos fenólicos, os quais são bastante solúveis em água, porém o rendimento é menor e compostos menos hidrossolúveis não são incorporados (MIRODIKAWA et al., 2001; HAYASHI et al., 1999; MIYATAKA et al., 1997). Park e colaboradores (1998) compararam extratos de própolis utilizando diferentes concentrações de água e etanol como solventes extratores, por espectrofotometria UV-Vis, cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os autores verificaram que o extrato etanólico a 80% (v/v) apresentou a maior absorbância em 290 nm. As soluções hidroalcoólicas extratoras a 60 e 80% (v/v) propiciaram maiores recuperações de flavonoides, além de maior atividade antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória (PARK et al., 1998). Solventes como metanol, hexano, acetona e clorofórmio também
já foram utilizados (CAO; WANG; YUAN, 2004; PEREIRA et al., 2000; NEGRI; SALATINO; A SALATINO, 2003). Outras alternativas, principalmente quando o uso de etanol não é desejado, consideram o uso de óleos comestíveis, extração supercrítica e de surfactantes. Contudo, estes solventes não apresentam um rendimento tão efetivo quanto a extração com etanol. A extração com óleo exige um maior tempo e geralmente apresenta menor rendimento de compostos fenólicos. Por sua vez, o uso de CO2 em estado supercrítico não é capaz de extrair eficientemente os componentes polares; enquanto o uso de surfactantes implica preferencialmente na recuperação dos componentes menos polares (BURIOL et al., 2009; DANTAS et al., 2009; PAVIANI et al., 2010)
O método mais comum à extração dos compostos considera o contato da própolis com o solvente, processo este conhecido como maceração, em ausência de luz, à temperatura ambiente; sendo o rendimento afetado pelo tempo (SALOMÃO et al., 2004; AHN et al., 2004; KUMAZAWA; HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004; POPOVA et al., 2005; FU et al., 2005). Cunha e colaboradores (2006), ao compararem os tempos de maceração de 20 dias e 1 ano obtiveram rendimentos de 61% (m/m) e 67% (m/m), respectivamente. Dessa forma, períodos de maceração superiores a 20 dias não são economicamente justificáveis. O uso de extrator Soxhlet também é considerado uma boa alternativa por reduzir o tempo de extração e aumentar o rendimento (CUNHA et al., 2004b).
Após a extração, a demanda por métodos práticos, de baixo custo e rápidos faz com que as análises espectrofotométricas sejam utilizadas no controle de qualidade rotineiro da própolis. Os procedimentos espectrofotométricos para análises de própolis foram especialmente desenvolvidos para quantificar os três grupos principais de compostos fenólicos encontrados em própolis europeia: flavonóis/flavonas, flavanonas/ dihidroflavonóis e compostos fenólicos totais (POPOVA et al., 2004). Segundo Bankova (2005), a mensuração das concentrações de grupos de compostos ativos é de maior relevância do que analisar os componentes individualmente, porque até o presente momento, nenhum composto isolado mostrou-se tão efetivo quanto o extrato utilizado integralmente.
A determinação quantitativa de flavonoides em própolis é conduzida por dois métodos colorimétricos: utilizando cloreto de alumínio (AlCl3) para determinar os teores de flavonóis e flavonas, e 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNF) para quantificar dihidroflavonois e flavanonas (CHANG et al., 2002). O método do AlCl3 é baseado na
formação do complexo entre o íon alumínio (Al+3) e os grupos carbonil e hidroxila dos flavonóis e flavonas (POPOVA et al., 2004). O complexo Al+3-flavonoides gera um desvio bato-hipercrômico e desta maneira é possível determinar a quantidade de flavonoides evitando-se a interferência de outras substâncias fenólicas, principalmente os ácidos fenólicos, que invariavelmente acompanham os flavonoides nos tecidos vegetais (MARCUCCI; WOISKY; SALATINO, 1998). Para quantificar flavanonas e dihidroflavonois utiliza-se a interação desses compostos em meio ácido com a 2,4-DNF para formar fenilhidrazonas coloridas (NAGY; GRANCAI, 1996). A soma do conteúdo de flavonoides, determinada por esses dois métodos, representa o conteúdo de flavonoides totais na própolis (CHANG et al., 2002).
Embora os métodos para quantificação de flavonoides sejam frequentemente utilizados em própolis que não originárias da Europa, é importante salientar que há limitações em extrapolar tais métodos para outras amostras. No caso da própolis verde, o conteúdo de compostos fenólicos costuma ser muito mais pronunciado do que o de flavonoides. Dessa forma, a determinação do conteúdo de fenólicos totais é um método mais robusto para assegurar a qualidade das amostras (SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). Para determinação do conteúdo dos fenólicos totais é utilizado principalmente o reagente de Folin-Ciocalteu (solução de íons complexos poliméricos formados a partir dos heteropoliácidos fosfomolibdicos e fosfotungsticos), medindo-se a absorbância em 760 nm (WATERMAN; MOLE, 1994).
De forma similar, a dosagem de flavonóis e flavonas utilizando AlCl3 como reativo tem como inconveniente o fato de que algumas acetofenonas encontradas em própolis verde também mostram-se reativas, induzindo a resultados falsos-positivos (BANKOVA; MARCUCCI, 2000). As benzofenonas, encontradas em própolis vermelha, também não são adequadamente analisadas pela reação com o AlCl3 (SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). Dessa maneira, ao se deparar com um novo tipo de própolis, é importante identificar quem são seus compostos bioativos e, para este propósito, os métodos cromatográficos têm sido a escolha preferencial.
As cromatografias gasosa (CG), CCD e, em particular, a CLAE fornecem o perfil e a identificação dos compostos fenólicos. Como os extratos de própolis são solúveis em etanol e soluções hidro-alcoólicas, a CLAE em fase reversa (FR) é o método cromatográfico mais comumente utilizado. Os fenólicos e flavonoides, por absorverem radiação UV-Vis, podem ser facilmente identificados por cromatógrafos equipados com detector de arranjo de diodos (DAD) (SAWAYA;
CUNHA; MARCUCCI, 2011). Inúmeros métodos já foram descritos na literatura à identificação dos compostos fenólicos via CLAE, empregando diversos tipos de coluna, fases móveis e sistemas de eluição isocráticos e em gradiente (para revisão ver GOMEZ-CARAVACA et al., 2006). Embora a CLAE seja uma das técnicas preferidas para análise de fenólicos, o mesmo não se pode dizer à caracterização dos terpenos, uma vez que esta classe de compostos não interage tão intensamente com a radiação UV-Vis (MIORIN et al., 2003). Para tal, a CG, acoplada ou não à espectrometria de massa (EM), é usualmente a técnica de escolha.
A CCD também é uma técnica rotineiramente utilizada na análise de própolis, especialmente para a comparação de extratos (SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). A escolha da fase estacionária e da fase móvel dependerá da classe de compostos a ser analisada (GOMEZ-CARAVACA et al., 2006). Outras aplicações desse método referem-se à investigação de atividades biológicas como fungicida, bactericida e antioxidante; técnica esta conhecida por bioautografia. Adicionalmente, o uso de placas preparativas permite a identificação de compostos de interesse por outras técnicas (e.g. EM, Ressonância Magnética Nuclear
– RMN). Dentre as principais limitações da CCD, a análise de matrizes muito complexas, não raro é dificultada, não permitindo uma adequada separação. Além disso, a identificação dos compostos diretamente na placa é restringida pela disponibilidade de padrões comercias disponíveis, uma vez que muitos compostos encontrados em própolis não são comercializados (SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011).
A CG, especialmente quando acoplada à EM, tem sido extensivamente utilizada na análise de óleos essenciais e composto voláteis de própolis (SAWAYA et al., 2004b; POPOVA et al., 2005; GOMEZ-CARAVACA et al., 2006; POPOVA et al., 2010; SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). Entretanto, para compostos mais polares faz-se necessário derivatizar os analitos para torna-los mais voláteis, ainda que seja comum a própolis conter compostos que não volatilizam adequadamente, mesmo após a derivatização da amostra (BANKOVA et al., 1995, CHRISTOV et al., 1998).
Por se tratar de uma matriz extremamente complexa, a procura por métodos rápidos e robustos de screening, capazes de distinguir amostras de diferentes origens e composições químicas, tem levado ao uso de técnicas capazes de tratar as amostras integralmente, como a RMN e a injeção direta em EM (WATSON et al., 2006; SAWAYA; CUNHA; MARCUCCI, 2011). Para tratar este conjunto de dados complexos apropriadamente, o uso de métodos de estatística
multivariada tem aumentado substancialmente nos estudos sobre própolis (SAWAYA et al., 2004a).
Recentemente, López e colaboradores (2014), utilizando a injeção direta em EM com interface de ionização por electrospray (EM-ESI) e análise multivariada dos dados espectrométricos, demonstraram que amostras de própolis vermelha originárias de diversas regiões do Brasil, apesar de apresentarem a mesma cor, exibiam um perfil químico distinto, revelando pelos menos três tipos de própolis vermelha no país.
Watson e colaboradores (2006), na tentativa de classificar 43 amostras de própolis provenientes de diversos países, utilizaram espectros de 1H-RMN analisados com o auxílio de estatística multivariada. Os autores verificaram que o conteúdo de metabólitos encontrados correlacionava-se com a atividade antioxidante dos extratos. Para estes autores, a RMN é um método rápido e robusto para analisar os extratos de própolis integralmente, uma vez que a CLAE-DAD apenas identifica substâncias que absorvem radiação UV-Vis e o EM-ESI apenas identifica compostos passíveis de ionização nas condições empregadas. Em trabalho de nosso grupo, analisando espectros de 1H-RMN de amostras de própolis coletadas em 19 regiões de Santa Catarina (SC), utilizando diversas abordagens de métodos supervisionados de análise multivariada e.g., PLS-DA, random forest (RF), seleção de variáveis e algoritmos evolucionários, verificou-se que a abordagem quimiométrica permitiu extrair informações relevantes quanto ao perfil químico das amostras. A partir dos dados de 1H-RMN, padrões de reconhecimento foram detectados, discriminando as amostras de própolis, principalmente em função da presença de compostos aromáticos e alifáticos, comumente encontrados em própolis, como ácidos graxos e compostos fenólicos, respectivamente (MARASCHIN et al., 2012).
Apesar dos avanços nas técnicas de identificação do perfil químico da própolis, para Sforcin e Bankova (2011), as técnicas hifenadas como CLAE-DAD, CLAE-EM e CG-EM são as mais apropriadas. Para estes autores, a natureza polar dos constituintes daquela matriz complexa, combinada aos avanços nas técnicas de ionização e cromatográficas, fazem do CLAE-DAD e CLAE-EM as melhores ferramentas à análise dos compostos bioativos daquela biomassa.
