Aprovechamiento de semillas de uva sobremaduras para la mejora del color de vinos tintos elaborados en clima cálido

Aprovechamiento de semillas de uva

sobremaduras para la mejora del color de

vinos tintos elaborados en clima cálido

c/ P. García González 2. 41012 SEVILLA (Spain). Tel. (34) 954 55 70 17

La tesis titulada “Aprovechamiento de semillas de uvas sobremaduras para la mejora del color de vinos tintos elaborados en clima cálido”, presentada por el Ldo. D. Francisco José Rivero Granados para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla), bajo la dirección de los Doctores D. Francisco José Heredia Mira, Catedrático de la Universidad de Sevilla , Dª Mª Lourdes González Miret-Martín, Profesora Titular de la Universidad de Sevilla y Dª Belén Gordillo Arrobas, Profesora Ayudante Doctor de la Universidad de Sevilla. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reúne los requisitos necesarios, autorizan su presentación

En Sevilla, a 18 de julio de 2019.

Fdo.: Francisco José Heredia Mira Fdo.: Mª Lourdes González Miret-Martín

Fdo.: Belén Gordillo Arrobas

Los Directores de la Tesis

En primer lugar deseo expresar mi enorme agradecimiento a mis Directores de esta Tesis Doctoral, al Dr. Francisco José Heredia Mira por la oportunidad que me brindó gracias a su confianza, a la Dra. M. Lourdes González Miret-Martín y a la Dra. Belén Gordillo Arrobas. Sin su dedicación, paciencia y saber hubiera sido imposible llevar a cabo este trabajo, y más en las condiciones que han tenido lugar. A través de esta Tesis Doctoral me habéis transmitido vuestra pasión por la ciencia y a luchar por retos complicados, siempre a través de sabios consejos y desde la humildad del talento. Muchísimas gracias por todo.

Agradecer a la Dra. Anna Mignani por admitirme en su laboratorio en el CNR-IFAC de Florencia para la realización de mi estancia doctoral, así como al Dr. Leonardo Ciaccheri y al Dr. Andrea Mencaglia por acogerme con una gran hospitalidad y ayudarme a lograr los objetivos marcados gracias a su profesionalidad y sapiencia.

Agradecimientos a mi maestro y amigo D. Santiago Alonso, su conocimiento en el campo de la enología que me ha transmitido con tanta pasión, siempre me marcará y guiará profesional y personalmente.

A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Color y Calidad de Alimentos José Miguel, Julio, Paco, María José, Berta, María Jesús, Félix, Emi, Pau, Carla…a todos muchas gracias por vuestra ayuda durante todo este tiempo. Siempre pensaré que soy un afortunado por teneros, ya que más que un grupo de compañeros de trabajo sois un gran grupo de amigos.

A mis amigas Ana Benítez y Rocío Álvarez, grandes profesionales y mejores personas. Sin tu constante ayuda, Ana, aunque pienses lo contrario y no lo creas, ha sido clave en este largo camino. Mil gracias

A todo el personal técnico del Servicio de Biología de los Servicios Generales de la Universidad de Sevilla, a la Cooperativa Ntra. Señora del Socorro y muy especialmente a D. Diego Bort por permitirnos realizar las vinificaciones en sus instalaciones, y, a D. Francisco Espinosa y Bodega La Aurora por proporcionarnos de forma altruista las muestras de semillas necesarias para realizar estos estudios.

Gracias a mis queridos padres y hermana por sus constantes consejos y ánimos, a mis suegros, cuñados y amigos por su apoyo moral y humano.

Gracias enormemente a Cristina por su paciencia, por su apoyo y sobre todo por solidarizarse en tantos y tantos momentos. Sin tu ayuda, este momento jamás habría llegado, gracias Cris. Pero sobre todo gracias a ti, Julia. A ti te he robado muchísimo tiempo durante estos últimos meses y por ello, no hemos podido disfrutar de muchas cosas juntos. Espero que a través de esta tesis, al menos te pueda enseñar una gran lección de vida para dentro de unos años cuando tengas momentos difíciles a lo largo de tu camino, recuerda que luchando, trabajando y perseverando se pueden lograr casi todos los retos y sueños, así que levántate siempre y continua hasta conseguirlo.

Este trabajo ha sido realizado con el apoyo institucional de la Universidad de Sevilla a través de la acción II.3 del V Plan Propio de Investigación y del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España con el proyecto “Evaluación de estrategias tecnológicas adaptativas para vinificación en condiciones de cambio climático” (AGL2014-58486-C2-2-R), del que el Dr. Francisco José Heredia Mira es el investigador principal.

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RESUMEN / ABSTRACT

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INTRODUCCIÓN

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1. LA UVA Y EL CAMBIO CLIMÁTICO ... 5

1.1. Composición química de la uva y su evolución durante la maduración ... 6

1.2. Consecuencias del cambio climático en la calidad de la uva madura ... 26

2. EL COLOR DEL VINO TINTO ... 31

2.1. Importancia del color del vino ... 31

2.2. Transferencia de color al vino: Extracción de los compuestos fenólicos durante la maceración ... 33

2.3. Equilibrio de los antocianos en el vino ... 35

2.4. Evolución y estabilización del color durante la vinificación ... 40

3. TÉCNICAS DE VINIFICACIÓN ADAPTATIVAS AL CAMBIO CLIMÁTICO ... 42

3.1. Elaboración de vino tinto mediante vinificación tradicional ... 42

3.2. Técnicas alternativas de vinificación ... 45

4. APROVECHAMIENTO DE SUBPRODUCTOS DE LA UVA. LAS SEMILLAS ... 49

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OBJETIVOS

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MATERIAL Y MÉTODOS

1. MUESTRAS ... 63

1.1. Semillas sobremaduras ... 63

1.2. Extractos fenólicos de las semillas sobremaduras ... 64

1.3. Vinos ... 65 1.4. Disoluciones modelo ... 67 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS ... 68 2.1. Parámetros físico-químicos ... 68 2.1.1. Densidad relativa ... 68 2.1.2. Azúcares reductores ... 69 2.1.3. Acidez Total ... 70 2.1.4. pH ... 71

2.1.6. Acidez volátil ... 72

2.1.7. Fenoles Totales. Método de Folin-Ciocalteau ... 73

2.2. Análisis cromatográficos ... 74

2.2.1. Determinación de pigmentos antociánicos mayoritarios y flavonoles por HPLC-DAD ... 74

2.2.2. Determinación de pigmentos antociánicos y derivados mediante HPLC-DAD-MS ... 76

2.2.3. Determinación de flavan-3-oles y ácidos fenólicos mediante RRLC-DAD-MS ... 77

2.3. Medida del color por Colorimetría Triestímulo. Espacio CIELAB. ... 79

2.4. Medida de la copigmentación ... 80

2.4.1. Medida por espectrofotometría ... 80

2.4.2. Medida por colorimetría diferencial ... 82

2.5. Espectroscopía Raman ... 82

2.6. Métodos estadísticos ... 84

2.6.1. Análisis de la Varianza (ANOVA) ... 84

2.6.2. Análisis de componentes principales (PCA) ... 84

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RESULTADOS

Y DISCUSIÓN

Capítulo 1. MACERACIÓN FERMENTATIVA DE VINOS TINTOS CON SEMILLAS SOBREMADURAS. EFECTO SOBRE EL COLOR Y LA COMPOSICIÓN FENÓLICA ... 87

Publicación: Effect of addition of overripe seeds from white grape by-products during red wine fermentation on wine colour and phenolic composition. LWT-Food Science and Technology. 2017. Vol. 84. Pag. 544-550 Capítulo 2. IMPACTO EN EL COLOR Y LA ESTABILIDAD DE VINOS TINTOS DE LA MACERACIÓN POST-FERMENTATIVA CON SEMILLAS DE UVA SOBREMADURAS ... 93 Publicación: Impact of a post-fermentative maceration with overripe

seeds on the color stability of red wines. Food Chemistry. 2019. Vol. 272. Pag. 329-336.

SOBREMADURAS POR COLORIMETRÍA DIFERENCIAL ... 99 Publicación: Copigmentation potential of overripe seeds from

sun-dried white grapes on anthocyanins colour and stability by Differential Colorimetry. International Journal of Food Science & Technology (Aceptado, Pruebas de imprenta).

Capítulo 4. APLICACIÓN DE LA ESPECTROSCOPIA RAMAN CON EXCITACIÓN A 1064 nm PARA LA VALORIZACIÓN DE SEMILLAS SOBREMADURAS COMO SUBPRODUCTO ENOLÓGICO ... 105 Publicación: Dispersive Raman spectroscopy excited at 1064 nm for the

nondestructive and rapid valorization of overripe seed byproducts from sundried grapes and phenolic quantification (Enviado a Talanta).

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CONCLUSIONES / CONCLUSIONS

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RESUMEN

Por su gran impacto medioambiental, la gestión y reutilización de residuos agrícolas es uno de los grandes retos de la sociedad actual. En el caso de la vid, uno de los cultivos más extendidos, se producen millones de toneladas de residuos cada año y la industria enológica está en permanente búsqueda de vías de aprovechamiento de los subproductos ya que, además, son residuos ricos en compuestos fenólicos de interés bioactivo.

En Andalucía se elaboran vinos generosos, de alta graduación alcohólica, procedentes de uvas blancas sometidas a concentración de azúcares por exposición directa al sol en paseras, lo que conduce a características fisicoquímicas y sensoriales especiales, tanto en las uvas como en los vinos obtenidos, y cuya elaboración genera un gran volumen de orujos.

Más recientemente, adaptándose a las tendencias del mercado, las bodegas de esta región de clima cálido comenzaron a elaborar vinos tintos, lo que supuso un gran reto por las altas temperaturas que se alcanzan, agravadas por los efectos del cambio climático. Se dificulta la correcta maduración de la uva tinta y se produce un desfase entre las maduraciones tecnológica (azúcares/ácidos) y fenólica, lo que pone en riesgo la obtención de vinos tintos de calidad sensorial, en especial gustativa (astringencia) y visual (intensidad y estabilidad del color). Es conocido que los vinos tintos de clima cálido frecuentemente son desequilibrados, de color inestable y, por lo tanto, poco aceptados por el consumidor.

El principal objetivo de esta Memoria es integrar ambas circunstancias, por un lado, el aprovechamiento de las semillas sobremaduras procedentes de la elaboración de vinos generosos y, por otro, la mejora del color de vinos tintos de clima cálido. Se plantea establecer el valor de las semillas sobremaduras como fuente de fenoles, optimizando su aplicación en la vinificación en tinto (momento, tiempo, dosis), y evaluar su efecto en la calidad y estabilización del color a través del fenómeno de copigmentación. Mediante cromatografía líquida de alta eficacia, se ha analizado el perfil fenólico de semillas de tres variedades de uvas blancas comúnmente usadas para la elaboración de vinos generosos (Pedro Ximénez, Moscatel y Zalema), con diferentes niveles de sobremaduración. Se destaca la riqueza fenólica de estas semillas sobremaduras, principalmente en flavanoles, ácidos benzoicos y procianidinas, siendo las de la variedad Moscatel las que presentaron un mayor contenido en fenoles.

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Se han elaborado vinos tintos de variedad Syrah, y se han añadido semillas sobremaduras de variedad Pedro Ximénez, como fuente alternativa de copigmentos, en diferentes condiciones en cuanto a la cantidad de semillas añadidas (dosis de 3 g/L y 12 g/L), el tiempo de maceración (7, 30 y 60 días) y la etapa de maceración (fermentativa y postfermentativa). Se determinó el perfil fenólico de los vinos y se aplicó la Colorimetría Triestímulo para evaluar el efecto sobre la copigmentación con antocianos y el color de los vinos, así como su evolución en el tiempo.

Los vinos con adición fermentativa de semillas sobremaduras, es decir, coincidiendo con el encubado de los orujos, presentaron un mayor contenido en antocianos y procianidinas que los vinos testigo (sin adición de semillas), lo que condujo a una mayor estabilización de los antocianos en las últimas etapas de vinificación, con un efecto cromático positivo, obteniendo vinos tintos de color más estable, más oscuros y cuyos tonos permanecieron rojos hacia los azulados.

Para poder controlar la duración de la maceración con las semillas, se planteó la adición de semillas sobremaduras tras el descube de los orujos, con diferentes tiempos de contacto. Con maceraciones postfermentativas de 60 días se obtuvieron vinos tintos con mayor calidad y estabilidad cromática.

A partir de los extractos fenólicos en sistemas modelo, se han establecido diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición de las semillas sobremaduras de diferentes variedades de uva blanca. Se estudió la influencia en la evolución de los antocianos monoméricos de hollejos de uvas tintas y la formación de nuevos pigmentos derivados. Aplicando la Colorimetría Triestímulo Diferencial, se ha evaluado la eficacia copigmentante y el efecto sobre la calidad y estabilización del color. Se comprobó que los efectos colorimétricos más positivos (colores más intensos y más estables en el tiempo) se produjeron con los extractos de semillas de Moscatel, seguidos de los de Pedro Ximénez.

Por último, se ha aplicado la Espectroscopía Raman como método rápido y no destructivo, en comparación con el análisis cromatográfico, que implica la destrucción de la muestra, el gasto de tiempo en su preparación y el coste económico por el uso de reactivos. Por Espectroscopía Raman con excitación a 1064 nm, se han caracterizado espectroscópicamente semillas sobremaduras de uvas blancas de distinto perfil fenólico, obteniendo una buena discriminación entre variedades y diferentes estados de sobremaduración.

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ABSTRACT

Due to the environmental impact, the management and reuse of agricultural waste is one of the great challenges of today's society. In the case of vine, one of the most widespread crops, millions of tons of waste are produced each year and the oenological industry is constantly searching for ways to take advantage of byproducts since, in addition, they are rich in phenolic compounds, having bioactive interest. In Andalusia, generous wines of high alcohol content are produced from white grapes subjected to concentration of sugars by direct exposure to the sun in paseras, which leads to special physicochemical and sensory characteristics, both in the grapes and in the wines obtained, and whose elaboration generates a large volume of residues. More recently, adapting to the market trends, the wineries of this warm climate region began to elaborate red wines. This was a great challenge due to the high temperatures that are reached, aggravated by the effects of the climate change. The ripening of the red grape is inadequate being a gap between the technological (sugar/acid) and the phenolic maturation, which puts at risk the obtaining high-sensory quality red wines, mainly taste (astringency) and visual quality (intensity and color stability). Thus, it is known that warm-climate red wines are frequently unbalanced, unstable in color and, therefore, little accepted by the consumer.

The main objective of this Thesis is to integrate both circumstances, on the one hand, the use of overripe seeds originated in the production of generous wines and, on the other hand, the improvement of the color of warm-climate red wines. Thus, the goal is to valorize the overripe seeds as a source of phenols, optimizing their application in red wine (moment, time, dose), and evaluate the effect on the quality and stabilization of color through the copigmentation phenomenon.

By means of high efficiency liquid chromatography, the phenolic profile of seeds of three white grapes varieties commonly used for the production of generous wines (Pedro Ximénez, Moscatel and Zalema), with different levels of over-ripening, has been determined. The phenolic richness of these overripe seeds is highlighted, mainly in flavanols, benzoic acids and procyanidins, having the highest phenolic content in Moscatel variety.

Red wines from Syrah variety have been produced, and Pedro Ximénez variety overripe seeds have been added, as external natural source of copigments, at different conditions regarding the amount of seeds added (doses of 3 g/L and 12 g/L), the

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maceration time (7, 30 and 60 days) and the maceration stage (fermentative and post-fermentative). The phenolic profile of wines was determined and Tristimulus Colorimetry was applied to evaluate the effect on copigmentation with anthocyanins and the color of the wines, as well as their evolution over time.

The wines obtained with fermentative addition of overripe seeds, that is to say, coinciding with the vatting period, showed higher content in anthocyanins and procyanidins than the control wines (without seeds addition), which led to a greater stabilization of the anthocyanins in the last stages of vinification, with a positive chromatic effect, obtaining red wines of more stable color, darker and red towards bluish hues.

Another assay consisted on adding the he overripe seeds after drawing-off (post-fermentative addition), in order to manage the time of contact (maceration) between wine and seeds. Also, different contact times were studied. 60-day post-fermentative macerations lead to red wines with higher quality and chromatic stability.

Using the phenolic extracts of seeds in model systems, qualitative and quantitative differences have been established in the phenolic composition of overripe seeds from different white grape varieties. The influence on the evolution of monomeric anthocyanins from red grape skins and the formation of new derived pigments was studied. The copigmentation efficiency and the effect on the quality and stabilization of the color have been evaluated by applying Differential Tristimulus Colorimetry. It was found that the most positive colorimetric effects (colors more intense and more stable over time) were produced with Moscatel seed extracts, followed by those of Pedro Ximénez.

Finally, Raman spectroscopy has been applied as a rapid and non-destructive method, in comparison with the chromatographic analysis, which involves sample destruction, time spent in preparing it and economic cost due to the use of reagents. By Raman spectroscopy with excitation at 1064 nm, we have characterized spectroscopically overripe seed of white grapes having different phenolic profile, obtaining a good discrimination between varieties and between different overripening states.

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1.

LA UVA Y EL CAMBIO CLIMÁTICO

Los estudios de fósiles datan la presencia de Vitis silvestris L. por todo el hemisferio norte desde hace más de 3 millones de años. Debido a las glaciaciones que se produjeron en la era cuaternaria, esta planta sólo sobrevivió en las regiones más cálidas como sucedió en la cuenca mediterránea y en los valles de las zonas más septentrionales. Sin embargo, también se extendió por los continentes americano y asiático debido a la unión que existía entre ellos.

La especie original, que presentaba cepas masculinas y cepas femeninas, sufrió una mutación originada en la región del mar Caspio hace 6000-8000 años dando lugar a una nueva especie, Vitis vinífera, con flores hermafroditas, hecho que ayudó en gran medida a su propagación a lo largo de toda la cuenca mediterránea. Durante las épocas griega y romana, el cultivo de Vitis vinifera se extendió por sus colonias, adquiriendo una gran importancia el desarrollo de la viticultura durante este periodo. En el siglo XVI, la planta llegó a América llevada allí por los españoles para su propio suministro de uvas y vino. Estas “vides del Nuevo Mundo”, en siglos posteriores, serían las salvadoras de la viticultura, ya que durante el siglo XIX las vides europeas sufrieron el ataque de la filoxera (Daktylosphaera vitifoliae), un insecto que ataca directamente y destruye las raíces de la planta. Esta plaga, prácticamente, acabó con las vides europeas (Figura 1). Los injertos realizados de vides europeas sobre pies de origen americano, que habían mostrado mayor resistencia, ayudaron a paliar esta plaga (Hidalgo-Togores, 2011).

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El género Vitis cuenta con un gran número de especies, y dentro de cada una de ellas existen diferentes variedades. Si nos centramos en V. vinifera L., se citan 10.000 variedades diferentes, llegándose a hablar de hasta 20.000 teniendo en cuenta las hibridaciones (Martínez de Toda, 1991). Sin embargo, no todas tienen un valor comercial en la producción de vino y como uva de mesa, restringiéndose este enorme número sólo a una fracción

Según la definición dada por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV, 2016), la uva fresca es el fruto maduro procedente de la vid. Estos frutos están compuestos por la piel u hollejo, las semillas o pepitas, la pulpa y el pedicelo, que lo une al raspón o parte del racimo destinado a unirlo con la planta (Figura 2).

a) b)

Figura 2. a) Corte esquemático de un grano de uva, b) Morfología esquemática de los tejidos de un grano de uva madura. (Fuente: Hidalgo-Togores, 2011).

En concreto, uva de vinificación es la uva fresca que, por sus características, se destina esencialmente a vinificación. En ocasiones, puede estar sobremadura, ligeramente pasificada o afectada de podredumbre noble, a condición de que pueda ser estrujada o prensada usando los procedimientos ordinarios de cada bodega y produzca espontáneamente una fermentación alcohólica (OIV, 2016).

1.1. Composición química de la uva y su evolución durante la maduración.

Las características físicas y químicas de la uva están relacionadas, en primer lugar, con la variedad. Además, la composición de la uva puede variar apreciablemente dependiendo de las condiciones medioambientales y agronómicas en las que se desarrolla la vid.

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De manera general, los ácidos orgánicos y azúcares sencillos, junto con el agua, se encuentran sobre todo en la pulpa, mientras que los compuestos fenólicos lo hacen fundamentalmente en las semillas y los hollejos. La composición de las distintas partes de la uva tiene una gran importancia en la elaboración de los vinos y su calidad, ya que una buena parte de los compuestos serán transferidos al mosto durante la vinificación. Esta composición se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Composición de las distintas partes de la uva.

Pulpa: La pulpa supone entre el 75 y el 85% del peso total de la uva debido a que sus vacuolas contienen el mosto, un líquido de base acuosa que, fundamentalmente, contiene azúcares (glucosa y fructosa como mayoritarios), ácidos orgánicos (tartárico, málico y cítrico como prioritarios), minerales (calcio, magnesio y sodio), compuestos nitrogenados (aminoácidos y proteínas solubles) y otros compuestos como aldehídos y esteres en forma de compuestos aromáticos, y fenoles. Por otro lado, los ésteres de ácidos hidroxicinámicos son los compuestos fenólicos que predominantemente se encuentran en la pulpa de la uva (Guchu et al., 2015).

Hollejo: La piel de la uva corresponde al 5-10% del peso total seco de la uva. Actúa como una barrera natural contra factores climáticos o enfermedades fúngicas. En los hollejos se pueden diferenciar 3 partes: cutícula, epidermis e hipodermis. La cutícula es una capa fina que constituye la parte más externa de la piel y es dónde se encuentra la pruina que protege las células interiores de la lluvia y la humedad, y retiene en su superficie los microorganismos transportados por el aire, como las levaduras. Más internamente se encuentran la epidermis y la hipodermis. La composición de esta última capa es muy importante para la vinificación ya que en ella se encuentran compuestosresponsables de atributos sensoriales del vino como el sabor, el aroma y el color (pigmentos antociánicos, ácidos cinámicos, flavonoles y sustancias aromáticas).

Pruina

HOLLEJO o PIEL

Antocianos (pigmentos uva tinta) Ácidos

Flavonoles Sustancias aromáticas Sustancias pépticas, celulosa Enzimas RASPÓN o ESCOBAJO Celulosa, lignina Sustancias nitrogenadas Sales minerales Taninos SEMILLA Flavanoles, Taninos Lípidos Polisacáridos PULPA Agua (70‐85%)

Azúcares: Glucosa y Fructosa Ácidos orgánicos : Tartárico, málico

Ácidos fenólicos Sustancias nitrogenadas Sales minerales

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Semillas: Dependiendo de la variedad de uva, cada grano puede tener de 1 a 4 semillas, aunque también se puede dar que no contengan ninguna (Shi et al., 2003). Las semillas constituyen el 0-6% del peso de la uva y es la parte que alberga el embrión. Están compuestas, fundamentalmente, por agua (25-45%), fibra (40%), aceites esenciales (16%), proteínas (11%), polifenoles (7%) y otros compuestos minoritarios como azúcares o minerales (García-Jares et al., 2015). La semilla es una de las principales fuentes fenólicas de la uva, contribuyendo entre el 20-55% del total de los polifenoles de la baya. Entre los polifenoles más abundantes se encuentran las formas oligoméricas y poliméricas de los flavanoles (procianidinas y taninos, respectivamente). Estos compuestos fenólicos, al igual que los de los hollejos, tienen una gran importancia en las propiedades sensoriales del vino y se transfieren al mosto durante la maceración. Las semillas se dividen en 3 partes: envoltura externa, albumen y embrión. La envoltura externa, rica en compuestos fenólicos, está compuesta de subcapas como la epidermis o la cutícula, además de los tegumentos externos, medio e interno (Figura 4). El albumen es un tejido interno de la semilla donde se encuentra una importante cantidad de aceites con ácidos grasos como el oleico y el linoleico, además de otros compuestos orgánicos como proteínas (Gazzola et al., 2014).

Figura 4. Sección longitudinal de la semilla de uva (Fuente: Hidalgo-Togores, 2011), junto con imágenes gráficas y corte transversal.

Raspón: El raspón o escobajo es el elemento del racimo que sirve de soporte a las bayas, y conduce los nutrientes a través de los vasos situados en su interior (Hidalgo-Togores, 2011). En cuanto a su composición, es pobre en azúcares, contiene sales minerales destacando el potasio, y es rico en compuestos fenólicos como flavanoles, ácidos fenólicos y flavonoles (Souquet et al., 2000). Su riqueza fenólica lo hace interesante en la elaboración de vinos pobres en estos compuestos, pero generalmente se elimina del racimo previamente a la maceración, ya que su composición puede aportar al vino aromas y sabores herbáceos indeseables.

9 Composición fenólica de la uva

Los fenoles son compuestos químicos sintetizados por las plantas a través de mecanismos secundarios, en respuesta a situaciones o factores de estrés abióticos y/o bióticos, como pueden ser la intensa luz solar, las altas temperaturas, el ataque de animales o patógenos, o la propia actividad humana (Hernandez et al., 2006; Oliveira et al., 2013).

En el caso de los fenoles de la uva, la mayor parte se transfiere al vino durante el proceso de vinificación, especialmente en el caso del vino tinto (aproximadamente el 60%). Estos compuestos tienen gran importancia en la calidad del vino debido a que están implicados en propiedades sensoriales como el cuerpo, el aroma, el sabor, la astringencia o el color (Cassassa, 2017). Además de su importancia sensorial, los fenoles de la uva presentan diversas propiedades bioactivas entre las que destaca el efecto antioxidante (Arvanitoyannis et al., 2006; Anastasiadi et al., 2010, Jara-Palacios et al., 2016). Muchos de estos compuestos han demostrado tener capacidad para prevenir ciertas enfermedades como algunos tipos de cáncer, diabetes tipo 2 o anomalías cardiovasculares (He & Giusti, 2010). Por ello, sectores como el alimentario, el farmacéutico o el cosmético muestran gran interés en el estudio y desarrollo de nuevas aplicaciones de los compuestos fenólicos de la uva y el vino (Jayaprakasha et al., 2001; Yilmaz & Toledo, 2004; Feringa et al., 2011; Li et al., 2017; Tomi et al., 2017). Desde el punto de vista químico, en la uva existe una gran diversidad de compuestos fenólicos, con una estructura común cuya unidad principal es el fenol: un anillo aromático que aporta una gran reactividad, con al menos un grupo hidroxilo en su estructura (Monagas et al., 2005). Además, en la uva existen otras estructuras más complejas denominadas polifenoles, los cuales pueden tener en su composición más de un anillo fenólico, y con uno o más grupos hidroxilos. Estos grupos funcionales se pueden encontrar libres o unidos a moléculas de diferente naturaleza, generando así una amplia diversidad química (Cheynier et al, 2010).

La clasificación de los compuestos fenólicos se puede realizar en función de diferentes criterios. Teniendo en cuenta la estructura de su esqueleto carbonado, los fenoles se clasifican en flavonoides y no flavonoides. En las uvas tintas de la especie V. vinifera L., los principales grupos de flavonoides son los antocianos, los flavan-3-oles y los flavonoles; y en menor medida los flavanonoles y las flavonas. Entre los compuestos no flavonoides, se encuentran los ácidos fenólicos (benzoicos e hidroxicinámicos) y los estilbenos. La uva contiene esencialmente compuestos no flavonoides en la pulpa y los flavonoides en los hollejos, semillas y raspones.

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 No flavonoides: Los compuestos fenólicos no flavonoides se caracterizan por tener un único anillo de 6 átomos de carbonos (C6). En este grupo se encuentran los ácidos benzoicos, los ácidos hidroxicinámicos y los estilbenos.

- Ácidos Benzoicos. Poseen una estructura general basada en una disposición de C6-C1 (Figura 5). La diferencia de estos compuestos radica en las hidroxilaciones y metilaciones del anillo aromático. Entre los diferentes ácidos benzoicos, el ácido gálico se ha descrito como uno de los fenoles más importantes en la uva por ser precursor de todos los taninos hidrolizables y participar en la composición de taninos condensados (Naumann et al., 2013; Garrido & Borges,. 2013). La uva también contiene otros derivados benzoicos como el ácido p-hidroxibenzoico, ácido vaníllico, ácido protocatéquico, siríngico, o elágico.

Figura 5. Estructura básica de los ácidos benzoicos (adaptado de Monagas et al., 2005). - Ácidos hidroxicinámicos. Son los ácidos fenólicos mayoritarios en la uva y en el

vino (Baderschneider & Winterhalter, 2001; Chamkha et al., 2003). Son compuestos que estabilizan eficientemente el color del vino tinto y que poseen importantes propiedades antioxidantes (Teixeira, J. et al. 2013; Trouillas et al. 2016). La estructura general consiste en un anillo aromático, un grupo alifático y un ácido carboxílico en el extremo (C6-C3) (Figura 6). En el anillo aromático pueden existir uno o varios grupos hidroxilos, lo que produce una gran variabilidad de ácidos dentro de esta familia. En este grupo se engloban ácidos como el cafeico, p-cumárico, sinápico o ferúlico. Estos ácidos se encuentran en forma cis o trans, siendo esta última la más abundante en la naturaleza. Estos isómeros son convertibles en una forma o en otra a través de la acción de la luz solar o la acción enzimática.

Usualmente, los ácidos hidroxicinámicos se encuentran en forma de ésteres unidos al ácido tartárico, dando lugar a derivados como los ácidos trans-caferoiltartárico (ác. caftárico), ácidos trans-p-cumaroiltartárico (ác. coutárico) y ácidos trans-feruloiltartárico (ác. fertárico). Estos ésteres, junto a sus ácidos hidroxicinámicos, son los compuestos fenólicos más abundantes en vinos blancos, y los no flavonoideos en vinos tintos (Vanzo et al., 2007).

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Figura 6. Estructura básica de losácidos hidroxicinámicos y sus ésteres derivados (Adaptado de Monagas et al., 2005)

- Estilbenos. La estructura de estos compuestos se basa en 2 anillos fenólicos unidos por un enlace etileno (C6-C2-C6). Los estilbenos pueden encontrarse libres o formando heterósidos, a veces poliméricos. El resveratrol (Figura 7) es el compuesto más destacado dentro de esta familia, y se encuentra en la hoja de la vid y los hollejos de las uvas, por lo que las maceraciones prolongadas en las vinificaciones de uvas tintas producen una gran concentración de este compuesto en el vino (Pussa et al., 2006; Garrido & Borges,. 2013).

Figura 7. Estructura del resveratrol, principal representante de los estilbenos. Algunos autores consideran el resveratrol como una fitoalexina, es decir, una toxina o compuesto antimicrobiano producido por las uvas en respuesta a una infección fúngica o a un estrés abiótico. Entre los fenoles, este compuesto en particular ha gozado de gran importancia en los últimos tiempos debido a los estudios sobre sus propiedades antioxidantes y anticancerígenas (Chang et al. 2011; Jian et al., 2016).

 Flavonoides: Los flavonoides son los compuestos mayoritarios dentro de los polifenoles de la uva. De hecho, hasta el momento se han descrito alrededor de 5000 flavonoides (Tanwar & Modgil., 2012), con un origen biosintético común. La estructura general de los flavonoides (Figura 8) está formada por 15 átomos de carbono, que se encuentran constituyendo dos anillos aromáticos, unidos entre sí

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mediante una cadena carbonada de 3 átomos, que a su vez puede formar parte de un tercer anillo aromático (C6-C3-C6) .

Figura 8. Estructura básica de los flavonoides

Existen diferentes familias dentro de los flavonoides, dónde la diferencia principal radica en el grado de oxidación y los tipos de sustituyentes del anillo C.

Los diferentes compuestos dentro de cada familia difieren en el patrón de sustitución en los anillos A y B (Middleton et al., 1998). En el grupo de flavonoides se engloban las flavonas, flavanonas/flavanonoles, flavanos/flavanoles, flavonoles, antocianos (Garrido & Borges, 2013).

Generalmente, los flavonoides existen en la naturaleza como agliconas o derivados esterificados a través de sus grupos hidroxilos con moléculas de azúcar (O-glicoxilación) o con grupos metilos (O-metilación) (Kumar & Pandey, 2013). Sin embargo, estas esterificaciones no se producen de manera uniforme en todos los flavonoides, participando diversos grupos hidroxilos situados en diferentes carbonos según el tipo de flavonoide esterificado (Mattivi et al., 2006; Jing et al., 2008).

- Flavonas. Se caracterizan por tener un doble enlace entre los carbonos C2 y C3 por la ausencia de un grupo hidroxilo en el C3 (Figura 9). Estos compuestos, a pesar de existir en gran cantidad en el reino vegetal, no son muy abundantes en los frutos, se han identificado en hojas de Vitis vinifera luteolina o apigenina y sus derivados 7-glucósidos (Fang et al., 2008). Además, son compuestos con importantes propiedades farmacológicas (Singh et al., 2014).

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- Flavanonas / Flavanonoles. También llamadas dihidroflavonas, muestran un carbono saturado entre los carbonos C2 y C3. Algunas flavanonas como el eriodicitol, la naringenina y la hespertina se han identificado en uvas y en muestras de vinos (Jandera et al.; 2005; Perestrelo et al., 2012). La estructura de los flavononoles es similar a las de las flavanonas (Figura 10). La diferencia radica en que en el caso de los flavononoles la ausencia del doble enlace se debe a la presencia de un grupo hidroxilo, mientras que las flavanonas no presentan este grupo hidroxilo. Entre los flavanonoles identificados se encuentran diversos dihidroflavonoles, algunos de ellos glucosilados en posición 3 con glucosa, ramnosa o xilosa, siendo los más destacados la astilbina (dihidroquercetina 3-O-ramnósido), y la engeletina (dihidrokaempferol 3-O-ramnosido) (Monagas et al., 2005)

Figura 10. Estructura química de las principales flavononoles en uva. (Adaptado de Monagas et al., 2005)

- Flavanos / Flavanoles. Los flavanos poseen un enlace saturado entre los carbonos C2 y C3, sin grupo carbonílico en C4. Estos compuestos, muy abundantes en frutas inmaduras, son los precursores de los flavanoles (Swanson, 2003).

Los flavanoles presentan un grupo hidroxilo en el carbono C3. En la naturaleza se pueden encontrar dos tipos: flavan-3-oles, generalmente en los frutos, y flavan-3,4-dioles o leucoantocianidinas, frecuentemente en las maderas.

Los flavan-3-oles monoméricos más abundantes en uva y vino son catequina y su enantiómero epicatequina, aunque también se pueden encontrar otros compuestos como galocatequina o epigalocatequina (Figura 11). Aunque los flavan-3-oles, a diferencia de otros flavonoides, se encuentran usualmente en forma libre y no en forma glicosilada en los frutos, también se presentan esterificados con el ácido gálico como es el caso de la epicatequina-3-O-galato, compuesto identificado en uvas (Bonetti et al., 2017).

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Figura 11. Estructura de los flavan-3-oles monoméricos de la uva.

Los flavan-3-oles se pueden encontrar en los hollejos de las uvas pero, sobre todo, en sus semillas (Miljić et. al, 2014). Son responsables de sensaciones organolépticas como el amargor o la astringencia debido a la formación de complejos con las proteínas de la saliva (McRae & Kennedy., 2011).

Además, en uvas y vinos es característico encontrar proantocianidinas y taninos condensados, que son oligómeros y polímeros de los flavan-3-oles monoméricos, respectivamente. Su diferencia radica en el grado medio de polimerización, siendo de 2 a 5 unidades para las proantocianidinas y de más de 5 unidades para los taninos condensados.

Los monómeros más usuales en la formación de las proantocianidinas son la catequina, epicatequina o epicatequina-3-O-galato (Souquet et al., 2000), formándose estos compuestos a través de la condensación de los diferentes monómeros mediante enlaces C4→C6 o C4→C8.

Las proantocianidinas tienen la propiedad de liberar en su hidrólisis antocianidinas a través de catálisis ácidas (Lorrain et al., 2013). Por ello, según la antocianidina liberada se pueden distinguir procianidinas y prodelfinidinas que liberan cianidinas y delfinidinas respectivamente. Las semillas sólo contienen procianidinas mientras que los hollejos tanto procianidinas como prodelfinidinas (Monagas et al., 2005).

Dependiendo del tipo de unión interflavánica, las procianidinas se clasifican como tipo A y B. En las de tipo A, las unidades de flavanol poseen un enlace tipo éter entre C2-C5 o C2-C7 y las de tipo B están formadas por monómeros unidos por enlaces C4-C6 o C4-C8, siendo este último más abundante (Terrier et al., 2009). La mayoría de las procianidinas identificadas en la uva son tipo B, como la procianidina B1 que se muestra en la Figura 12. La estructura de otros oligómeros identificados en uvas y vinos se presenta en la Tabla 1.

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Figura 12. Estructura química de la procianidina B1.

Tabla 1. Dímeros y trímeros de proantocianidinas identificadas en la uva (Adaptado de Monagas et al., 2005) Dímeros de procianidinas B1 Ec-(4β→8)-Cata B2 Ec-(4β→8)-Ecb B3 Cat-(4α→8)-Cat B4 Cat-(4α→8)-Ec B5 Ec-(4β→6)-Ec B6 Cat-(4α→6)-Cat B7 Ec-(4β→6)-Cat B8 Cat-(4α→6)-Ec

Dímeros esterificados con ácido gálico

B1-3-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4β→8)-Cat B2-3-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4β →8)-Ec B2-3'-O-gallato Ec-(4β →8)-Ec-3-O-gallato B3-3-O-gallato Cat-3-O-gallate-(4α →8)-Cat B4-3'-O-gallato Cat-(4β →8)-Ec-3-O-gallate B5-3-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4β →6)-Ec B6-3-O-gallato Cat-3-O-gallate-(4β →6)-Cat B7-3-O-gallateo Ec-3-O-gallate-(4β →6)-Cat

B1-3,3'-di-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4β →8)-Cat-3-O-gallato B2-3,3'-di-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4β →8)-Ec-3-O-gallato B3-3,3’-di-O-gallato Cat-3-O-gallate-(4α →8)-Cat-3-O-gallato B7-3,3’-di-O-gallato Ec-3-O-gallate-(4α →6)-Cat-3-O-gallato Trímeros de procianidinas

C1 Ec-(4β→8)-Ec-(4β→8)-Ec

C2 Cat-(4α→8)-Cat-(4α→8)-Cat

T2 Ec-(4β→8)-Ec-(4β→8)-Cat

T3 Ec-(4β→8)-Ec-(4β→6)-Cat

a _{Cat = (+)-catequina}; b_{Ec= (-)-epiccatequina}

A lo largo de procesos de envejecimiento, los taninos condensados van formando cadenas mayores lo que produce precipitaciones debido a la disminución de solubilidad en el vino (Yildrim & Altindişli, 2015). Es posible diferenciar los taninos de semillas y del hollejo ya que los primeros son ricos en procianidinas

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altamente galoiladas y poseen un grado medio de polimerización alrededor de 10 unidades. En cambio, los taninos del hollejo no presentan tanta galoilación, están compuestos de procianidinas y prodelfinidinas y poseen cerca de 30 unidades (Busse-Valverde et al., 2011).

- Flavonoles. Se caracterizan por tener un doble enlace entre los carbonos C2 y C3 y un grupo hidroxilo en el C3. La mayoría de los flavonoles tienen además grupos hidroxilos en los carbonos C5 y C7 por lo que son llamados derivados 3,5,7-trihidoxilatos.

Los flavonoles de uva se encuentran principalmente en los hollejos. Esta familia comprende glucósidos, galactósidos y glucurónidos de seis agliconas: quercetina, miricetina, isorhamnetina, kaempferol, laricitrina y siringetina; junto con la quercetina 3-rutinósido. Recientemente, derivados acetilados y p-coumaroilados de la isoramnetina, laricitrina y siringetina (3-O-glucosidos) han sido identificados por primera vez en los hollejos de uvas Vitis vinífera de las variedades Tannat, Marselan y Syrah, así como en sus vinos (Favre et al., 2018). Sus estructuras químicas se presentan en la Figura 13.

Figura 13. Estructura química de los principales flavonoles de la uva y sus respectivas agliconas. (Adaptado de Favre et al., 2018)

En las uvas, los flavonoles están presentes como 3-O-glicósidos, mientras que sus correspondientes agliconas libres también se pueden encontrar en vinos debido a la hidrólisis ácida que se produce durante la vinificación y el envejecimiento. En general, los derivados glicosilados más abundantes son los glucósidos, mientras que los galactósidos y glucurónidos son minoritarios, exceptuando a la quercetina 3-O-glucurónido, que se encuentra en cantidad similar a la quercetina 3-O-glucósido (Mattivi et al., 2006). En cuanto a las agliconas, las mayoritarias son la quercetina y miricetina (Castillo-Muñoz et al., 2007).

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- Antocianos. Los antocianos son pigmentos fenólicos que se encuentran en la piel de las uvas tintas. Su estructura consta de un esqueleto con dos anillos bencénicos unidos por una cadena de tres átomos de carbono ciclada en un heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico, denominado catión flavilio o antocianidina (Figura 14).

Figura 14. Estructura básica del catión flavilio.

Las distintas antocianidinas se diferencian entre sí según el número de grupos hidroxilos y grupos metilos que presentan como sustituyentes en el anillo bencénico B. En las variedades tintas de Vitis vinifera, se han encontrado 5 antocianidinas diferentes: cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina y petunidina (Figura 15).

Figura 15. Estructura química de las principales antocianidinas de uvas y vinos Una de las características de Vitis vinifera es la glucosilación en posición 3 de las antocianidinas formando las antocianinas o monoglucósidos no acilados. Los azúcares más comunes son los 3-monoglucósidos, siendo la malvidina 3-O -glucósido el compuesto mayoritario. En los últimos años, se ha confirmado la presencia de 3,5 o 3,7-diglucósidos en uvas y vinos tintos mediante técnicas de espectrometría de masas (Alcalde-Eón et al., 2006; García-Marino et al., 2010). Además, las antocianinas pueden encontrarse unidas a través de la posición 6 del azúcar a ácidos orgánicos, en mayor medida al ácido acético, cumárico o cafeico formando los derivados antociánicos acilados. Entre los distintos antocianos

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acilados identificados en vinos, los derivados acetilados y cumaroilados de la malvidina 3-O-glucósido son los mayoritarios, cuyas estructuras químicas se presentan en la Figura 16.

Figura 16. Estructura de los antocianos monoglucósidos y los que presentan acilación. El color exhibido por los antocianos, debido a la estructura resonante del catión flavilio, fue explicado por Pauling (1940). Los flavonoides muestran una absorción intensa en el intervalo espectral UV de 250-270 nm. Particularmente, los antocianos absorben, además, en el intervalo espectral visible de 520-560 nm (λmáx=520 nm) (Figura 17).

Figura 17. Espectro de absorción de antocianos y sus variaciones según presenten glucosilaciones y acilaciones.

Con la espectroscopía visible es posible diferenciar los distintos antocianos, ya que su color y su forma espectral varían según las metilaciones, glicosilaciones o acilaciones. Estas combinaciones químicas son responsables de la gran variedad de tonalidades que exhiben, y a los ligeros desplazamientos hipsocrómicos o batocrómicos en torno a la λmax (Heredia et al., 1998). Así, la peonidina y cianidina exhiben tonos rojo-anaranjados (dos sustituyentes en el anillo B); mientras que la delfinidina, petunidina y malvidina exhiben tonos rojo-azulados (tres sustituyentes en el anillo B).

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Evolución de la composición de la uva durante la maduración

El proceso de desarrollo de la baya de uva se suele dividir en tres etapas (Figuras 18 y 19): fase inicial de crecimiento rápido (fase I), fase de latencia, sin crecimiento o con un crecimiento muy lento (fase II), y fase final (fase III), de crecimiento lento, que se inicia con el final del envero y finaliza con la completa maduración de la uva (Stafne, 2011).

Figura 18. Etapas en el desarrollo y maduración de la uva (Adaptado de Stafne, 2011).

Figura 19. Cambio de tamaño y color en la uva tinta desde la etapa de crecimiento hasta la completa maduración.

La fase inicial de crecimiento rápido (fase I) está relacionada a la formación del fruto. Esta fase inicia en la floración y dura aproximadamente 50-60 días durante la cual se produce una importante acumulación de solutos, como los ácidos tartárico y málico, pero con baja concentración de azúcar. Al inicio de esta etapa, se forman las semillas,

Envero

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donde comienzan a acumularse los taninos. En esta etapa las bayas alcanzan al menos la mitad de su volumen y su peso final.

La fase de latencia (fase II) se corresponde con el final del crecimiento herbáceo de la uva. No hay un tiempo específico ya que la duración depende de la variedad de la uva y de los factores agronómicos y de cultivo. Al inicio de la fase II, los frutos han alcanzado al menos la mitad del tamaño que tendrán al final de su crecimiento y continúan acumulando ácidos y taninos, los cuales alcanzarán su máximo nivel en el envero. En esta etapa, las semillas alcanzan la madurez y su tamaño final, aproximadamente, 10 días antes del envero, comenzando entonces su lignificación. El final de la fase II coincide con el comienzo del envero, etapa en la que se produce un cambio en la coloración de las bayas debido a que se reduce o se anula la fotosíntesis (disminución de la clorofila) y a la síntesis de nuevos pigmentos (Figura 20). En particular, las variedades tintas desarrollan tonalidades rojas azuladas debido a la acumulación de antocianos en las células de la hipodermis (y también en la pulpa en variedades tintóreas), mientras que en las variedades blancas se sintetizan otros pigmentos fenólicos (flavonoles, flavononoles, etc.) dando tonalidades amarillas (Hidalgo-Togores, 2011).El envero representa una transición entre el crecimiento de la uva y su maduración.

Figura 20. Cambio de coloración de la uva tinta durante el envero.

La fase de post-envero y maduración del fruto (fase III) comienza con el final del envero, el cual marca el comienzo de la maduración de la uva, y a partir de aquí, prácticamente, se detiene su crecimiento herbáceo. La maduración puede durar entre 5 y 10 semanas dependiendo, en gran parte, de factores agronómicos, de la variedad de uva y de las condiciones climatológicas. La maduración de la uva es el resultado de múltiples cambios fisiológicos y bioquímicos de cada uno de sus componentes (pulpa, semilla y hollejo), que no son necesariamente correlativos entre sí. Desde un punto de vista biológico, la madurez de la baya se alcanza en el momento en que las semillas adquieren capacidad de viabilidad para formar un nuevo individuo al germinar, denominándose madurez fisiológica (Hidalgo-Togores, 2011). Este proceso comienza los días posteriores al envero, momento en el cual, el aporte de nutrientes en la baya se desvía desde la semilla, al completarse su formación, y comienzan a acumularse en la pulpa y el hollejo. En términos generales, la baya aumenta de peso y tamaño hasta

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alcanzar un tamaño estable, pero no por multiplicación celular sino por acumulación en la pulpa de nutrientes, principalmente azúcares libres y agua, pero también cationes, ácidos aminados y compuestos fenólicos, mientras que las concentraciones de ácidos tartárico y málico disminuyen. En el hollejo continúa la acumulación de pigmentos antociánicos, así como fenoles, aromas, aminoácidos, etc. Al mismo tiempo, a partir de la fase de envero, se produce una modificación de las paredes celulares de los tejidos vegetales de la uva. En la pulpa, las paredes celulares se debilitan porque el crecimiento celular y de su tamaño no está acompañado del engrosamiento de éstas. El hollejo crece en menor medida que la pulpa, por lo que se produce un aumento progresivo de la tensión de la piel.

El aprovechamiento de la uva para la vinificación determina que su estado de maduración sea el factor principal y uno de los más determinantes de la calidad global del vino. Desde un punto de vista enológico, el momento óptimo de madurez se alcanza cuando se produce una evolución armoniosa de las transformaciones que ocurren en las distintas partes de la baya. A pesar de los numerosos cambios bioquímicos que ocurren durante la maduración, de forma simplificada, se establece que la madurez óptima está condicionada por la concentración de azúcar y ácidos alcanzada en la pulpa en el momento de cosecha, así como el contenido y tipo de compuestos fenólicos y aromáticos acumulados en las semillas y los hollejos (Ozcan et al., 2017). Sin embargo, la síntesis y acumulación de todos estos compuestos en las distintas partes de la uva no ocurren simultáneamente durante la maduración, y además están influidos por factores genéticos, edáficos, climáticos y agronómicos. Como consecuencia, en enología se define el concepto de madurez según diferentes criterios (Ribereau-Gayon et al., 2006): Madurez tecnológica (la relación entre azúcares y ácidos), fenólica (contenido y extractabilidad de fenoles), y aromática (mayor potencial en aromas).

La madurez tecnológica o madurez de la pulpa se refiere a la concentración de azúcares, la acidez total y el pH, y a la relación azúcares/acidez (Nogales-Bueno et al., 2014). La acumulación de azúcares en la pulpa ocurre lentamente desde las primeras etapas del desarrollo hasta el envero, con niveles de 10 a 15 g/kg de uva, y posteriormente se incrementa rápidamente hasta la completa maduración, donde se alcanzan niveles de 150-200 g/L de mosto. En casos excepcionales de vendimias sobremaduras el contenido en azucares puede llegar a los 300 g/L. Este importante incremento a partir del envero es debido a que el exceso de glúcidos no utilizados por las semillas se almacena en la pulpa por su proximidad y por los aportes diarios realizados por la fotosíntesis de las hojas (Hidalgo-Togores, 2011). Por ello, en climas

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cálidos, donde hay una mayor actividad fotosintética, las uvas alcanzan una mayor acumulación de azúcares. En la uva, los azúcares mayoritarios son la glucosa y la fructosa, dándose en la maduración contenidos prácticamente iguales.

Los ácidos orgánicos se encuentran en todas las partes verdes de la planta y en la pulpa tienden a disminuir a medida que avanza la maduración por la combustión o respiración e incluso pueden transformarse en azúcares, especialmente en la última etapa de la maduración. Los ácidos más importantes son el tartárico, el málico y, en menor medida, el cítrico. La evolución de los ácidos tartárico y málico en la maduración es distinta, debido a que su síntesis, origen y degradación también lo son, estando a su vez influidos por condiciones edafoclimáticas. En particular, el ácido málico desaparece más rápidamente que el tartárico, que es más estable y en gran parte el responsable de la acidez del vino (Figura 21). La acidez de un mosto puede estar entre 3 y 7 g/L expresados en ácido tartárico (pH entre 2.8 y 3.8.).

Figura 21. Representación gráfica de la evolución de los ácidos tartárico y málico durante el desarrollo de la baya de uva y su maduración. (Adaptado de Deloire, 2010).

De forma global, la uva adquiere la madurez tecnológica óptima cuando la relación azúcar/acidez alcanza su valor máximo. La evolución de los azúcares, los ácidos y el peso de baya durante la maduración se muestran en la Figura 22.

Cuando se habla de madurez fenólica, se hace referencia al potencial de compuestos fenólicos presentes en las uvas en el momento de cosecha y su extractabilidad durante la vinificación (Zamora, 2003; Ribereau-Gayón et al., 2006). Fundamentalmente, está condicionada por la cantidad y tipo de antocianos y flavonoles en el hollejo, así como taninos en las semillas y el hollejo.

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Figura 22. Evolución del peso de la baya, azúcares, ácido tartárico, ácido málico y acidez total a lo largo del proceso de maduración (Fuente: Instituto de Investigación y Formación Agraria y

Pesquera, JUNTA DE ANDALUCÍA, 2012).

En el hollejo, la síntesis de los pigmentos antociánicos se produce a partir del envero, donde su concentración aumenta durante la fase de maduración alcanzando un máximo que generalmente coincide con la madurez tecnológica. Posteriormente, la cantidad de antocianos disminuye hasta las fechas de la vendimia y en etapas de sobremaduración (Kennedy et al., 2002; Obreque-Slier et al., 2010). Este patrón de comportamiento es similar al mostrado por los flavonoles en los hollejos. En cuando a los taninos de la piel, se sintetizan rápidamente durante el periodo herbáceo, acumulándose estos compuestos hasta el envero. A partir del envero y durante la maduración, su síntesis se va ralentizando y, aunque se produce una estabilización durante las últimas fases de la maduración, su máximo se alcanza ligeramente después que el de los antocianos. El patrón de síntesis de procianidinas afecta activamente a la síntesis de los compuestos que forman parte de su estructura, los flavanoles monoméricos. La concentración de estos compuestos aumenta radicalmente durante la fase herbácea hasta el envero, a partir de dicho momento estos compuestos decrecen debido a la síntesis de las procianidinas.

En relación a los taninos de la semilla, su concentración disminuye tras el envero hasta la maduración. Simultáneamente las semillas cambian de coloración de verde a amarillo y finalmente a tonalidades marrón grisáceo (Figura 23), lo cual puede ser usado como indicador de la madurez de la uva (Braidot et al., 2008; Rodriguez-Pulido 2012; Quijada-Morín et al., 2016). Se ha podido comprobar que no se producen diferencias en la composición de las procianidinas durante la maduración, aunque sí se producen variaciones en su grado medio de polimerización, el cual aumenta

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progresivamente hasta el momento de la recolección de la uva (Kontoudakis et al., 2011a; Gil et al., 2012).

Figura 23. Evolución de semillas de uva y cambios de color asociados a la maduración.

La evolución de antocianos y flavanoles en las distintas partes de la uva se muestra en la Figura 24.

Figura 24. Evolución de los compuestos fenólicos durante la maduración de la uva (Adaptado de R. Gayón, 2006).

Por otra parte, la concentración de ácidos hidroxicinámicos se incrementa rápidamente en la baya durante el periodo herbáceo hasta el envero, decreciendo en etapas posteriores y manteniéndose constante hasta la vendimia. La concentración de los ácidos benzoicos y concretamente el mayoritario, el ácido gálico, aumenta de una manera constante hasta el envero, momento en el que se produce una disminución progresiva hasta la vendimia (Obreque-Slier et al., 2010).

Durante el proceso de maduración se producen también cambios en la estructura de la pared celular de los polisacáridos y lignificaciones, lo que afecta la extractabilidad de los compuestos según su procedencia de la semilla, pulpa u hollejo (Bautista-Ortin et al., 2012). Conforme la uva madura, la capa interna de la piel se vuelve más fina y, en presencia de etanol, la capa externa se solubiliza, lo que facilita una mayor extracción de compuestos del hollejo. Por el contrario, las semillas endurecen su superficie con una cutícula lignificada que dificultará la extracción.

Recientemente, la combinación de técnicas ópticas basadas en imágenes hiperespectrales en el infrarrojo cercano y espectroscopía Raman, junto con técnicas

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quimiométricas, se ha aplicado para estimar el contenido fenólico extraíble en semillas y hollejos de uva (Quijada-Morín et al., 2015; Nogales-Bueno et al., 2017a, 2017b; Baca-Bocanegra et al., 2018a; 2018b, 2019). Estos estudios aportan una información muy útil para predecir el potencial fenólico extraíble de las partes sólidas de la uva según su estado de madurez y por tanto optimizar las condiciones de maceración durante la vinificación. En particular, se ha confirmado que semillas con un mayor grado de madurez presentaron una menor cantidad de fenoles extraíbles (Baca-Bocanegra et al., 2018a).

Por otro lado, en términos generales, la uva menos madura posee una baja concentración de antocianos que, además, son de difícil extracción. Asimismo, presenta una mayor extractabilidad de taninos procedentes de las semillas que además son más astringentes. Por el contrario, la uva más madura tiene una alta concentración de antocianos fácilmente extraíbles y taninos menos astringentes (Zamora, 2003; Kontoudakis et al., 2011b).

Sobremaduración. Una vez finalizada la maduración completa de la uva, comienza un periodo de sobremaduración que no puede considerarse una etapa más de su ciclo vegetativo ya que la baya resulta prácticamente aislada del racimo debido a la lignificación del raspón o escobajo y al agostamiento de los sarmientos (Hidalgo-Togores, 2011). Durante esta fase, las bayas evaporan agua con lo que se produce la pérdida de peso del fruto y la concentración de alguno de los componentes del mosto, como los azúcares (Figura 25).

Figura 25. Uvas en estado de sobremaduración

En procesos de sobremaduración, la concentración de algunos compuestos fenólicos continúa disminuyendo en la baya, mientras que otros se mantienen estables o incluso se incrementan (Mencarelli et al., 2010). Se ha comprobado que, generalmente, estos descensos en la concentración se producen en los ácidos benzoicos (ácido gálico) y en

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algunos flavanoles monoméricos y procianidinas de determinadas variedades de uva (Obreque-Slier et al., 2010). Por otro lado, sin embargo, la mayor parte de las procianidinas y los flavanoles monoméricos de otras variedades como Cabernet Sauvignon o Tempranillo incrementan su concentración durante la sobremaduración (Obreque-Slier et al. 2010, Talaverano et al., 2016). A su vez, se ha descrito que en periodos de sobremaduración también se producen procesos enzimáticos que favorecerían la extracción de compuestos fenólicos (Pinelo et al., 2006, Casassa & Harbertson, 2016).

En regiones donde el clima lo permite (otoños soleados, secos, cálidos y casi sin lluvia), como es el sur de España y zonas similares del Mediterráneo, se provoca la sobremaduración de las uvas mediante un proceso tradicional de secado natural por exposición directa al sol que se conoce como “soleo” (Peinado et al., 2009). Este proceso produce la pasificación parcial de la uva y la concentración de azúcares en la pulpa hasta 300 g/L, usándose para la elaboración de vinos blancos dulces de alta graduación alcohólica (Ruiz et al., 2014). Los orujos obtenidos de estos vinos constituyen un subproducto agrícola abundante con interesantes aplicaciones enológicas como su uso alternativo para modular las pérdidas de color durante las vinificaciones de vinos tintos en climas cálidos. Esto es debido a un contenido y composición fenólica particular propiciado por el proceso de sobremaduración al que es sometida la uva. El proceso de soleo y los cambios fisicoquímicos producidos en la uva asociados a éste se describen en mayor detalle en el apartado 4 de esta memoria.

1.2. Consecuencias del cambio climático en la calidad de la uva madura

El cultivo de la vid presenta unas exigencias climáticas bien determinadas y definidas, cultivándose tradicionalmente en climas no extremos, de tipo mediterráneo, en continentes de ambos hemisferios (Europa, América del Norte y del Sur, Australia, Nuevo Zelanda y Sudáfrica). Su área general de cultivo corresponde a las dos zonas terrestres comprendidas entre los paralelos 30° y 50° latitud Norte, y los 30° y 40° de latitud Sur, límites que en la viticultura actual se amplían suprimiendo la zona intermedia, con la aparición de la viticultura tropical (Jones, 2018). Es una planta exigente en calor y sensible a las heladas en invierno y primavera, no sólo para su desarrollo vegetativo, sino también para la maduración de sus frutos, que precisan de iluminación y temperaturas adecuadamente altas (13-21 °C durante su crecimiento vegetativo).

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Dentro de los factores determinantes de la producción vitícola, el clima de una determinada zona geográfica es posiblemente el que más influye en el tipo de vino que se produce (Tabla 2), ya que condiciona las variedades y la calidad de las uvas que pueden ser cultivadas.

Tabla 2. Influencia del tipo de clima (frío, templado y cálido) en el estilo de vino según la zona geográfica (Fuente: Jones, 2018).

Wine Characteristic Cool Climate Intermediate to

Warm Climate

Warm to Hot Climate

Fruit Style Lean, Tart Ripe, Juicy Overripe, Lush White Flavors Apple, Pear Peach, Melon Mango, Pineapple

Red Flavors Cranberry, Cherry Berry, Plum Fig, Prune

Body Light Medium Full

Acidity Crisp,Tangy Integrated Soft, Smooth

Alcohol Low to Moderate Moderate to High High to Very High Overall Style Subtle, Elegant Medium Intensity Bold

Los efectos del cambio climático son cada vez más evidentes. Desde el comienzo de la era industrial en el siglo XIX se ha producido un constante crecimiento en el consumo de los combustibles fósiles como el carbón y el petróleo. Este hecho junto a otros factores como la eliminación generalizada de los bosques y conlleva a un aumento lento, pero constante, de la temperatura promedio del planeta. Este fenómeno denominado calentamiento global ha producido en los últimos años un aumento en la temperatura de la Tierra de más de 1 °C desde la época preindustrial (Hawkins et al., 2017; Schurer et al., 2017), junto a un importante descenso en las precipitaciones en algunas regiones (Dore, 2005).

Atendiendo a los datos de temperatura y precipitaciones previstos, se puede inferir que la vitivinicultura del sur de Europa será especialmente sensible a estos efectos (Leolini et al., 2018). Estudios realizados en diferentes países europeos han puesto de manifiesto que las fechas de las vendimias cada vez son más tempranas (Figura 26). Así, en el sur de Francia, a través de estudios se comprobó que la vendimia se adelantó entre 18 y 21 días en el periodo comprendido entre 1940 y 2001, mientras que en Alsacia (este de Francia) a través de otro estudio comprendido entre los años 1972 y 2002, se comprobó que en este periodo se recolectaron las uvas dos semanas antes debido a un aumento de la temperatura de 1.8 °C (Ganichot, 2002; Duchêne & Schneider, 2005). Por otro lado, se ha comprobado que la península ibérica, junto al

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sur de Francia, fue la región europea que más sufrió los efectos del calentamiento global, aumentando la temperatura en los últimos 50 años en aproximadamente 2.5 °C (Jones, 2007).

Como se ha explicado anteriormente, el estado de maduración de la uva en el momento de vendimia influye de forma importante en la calidad del vino. Idealmente, el momento óptimo de vendimia debe ser aquel en el que las uvas alcanzan la madurez tecnológica, fenólica y aromática simultáneamente, pero las condiciones climáticas ambientales y sus variaciones pueden provocar importantes desfases entre ellas, aspecto que se hace aún más evidente y frecuente a medida que progresa el calentamiento global (Jones, 2018).

Figura 26. Fecha de vendimia de zonas vitícolas europeas (Fuente: Comisión Europea, 1994).

La Figura 27 muestra las curvas de evolución en la relación entre la madurez fenólica del hollejo y la madurez tecnológica de la pulpa. Se observa la situación ideal de acumulación de los antocianos en el hollejo coincidente con la máxima relación azúcar/acidez de la pulpa (curva 1), frente a otras situaciones de desfase, con retrasos (curva 2 y 3) o adelantos (curva 4) de la maduración fenólica con respecto a la tecnológica

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Figura 27. Situaciones de desfase entre la madurez fenólica del hollejo y la madurez tecnológica de la pulpa (Adaptado de Ribereau-Gayón, 2006).

Así, las altas temperaturas producen una mayor aceleración de la madurez de la uva, disminuyendo la concentración de ácidos y aumentando el contenido de azúcares, con los correspondientes problemas sensoriales y operacionales que esto puede ocasionar (Villangó et al., 2015).

La temperatura también juega un importante papel en la síntesis de los flavanoides debido a que, tal como sucede con otros factores como la radiación solar, producen un estrés en la uva que puede afectar a su metabolismo (Huglin & Schneider, 1998; Teixeira, A. et al., 2013). Así, bajas temperaturas durante el día y la noche (14/9 °C) pueden impedir la correcta síntesis de antocianos, al igual que sucede con temperaturas elevadas, superiores a 30 °C (Cheng et al., 2015). Esta influencia parece no afectar a los distintos tipos de antocianos de igual manera. En ese sentido, Tarara et al. (2008) observaron mayores descensos en delfinidinas, petunidinas, cianidinas y peonidinas, mientras que la concentración en malvidina permaneció estable.Por otro lado, también se ha descrito que la diferencia de temperatura entre el día y la noche es favorable para la síntesis de antocianos (Yamane & Shibayama, 2006; Giaotti et al., 2018), comprobándose que temperaturas nocturnas más frías (17 o 18 °C) aumentan la concentración de estos pigmentos, mientas que si no son suficientemente bajas tienden a disminuirla.

En relación a otros flavonoides, el efecto de las altas temperaturas y la radiación solar ocasionadas por el cambio climático es más variable. Así, se ha descrito que la concentración de procianidinas en semillas está directamente influenciada por la