www.elsevier.es/gamo
ARTÍCULO
DE
REVISIÓN
El
estado
mutacional
de
las
inmunoglobulinas
en
pacientes
con
leucemia
linfocítica
crónica:
significado
y
pronóstico
Sergio
Yair
Rodríguez
Preciado
ay
Patricio
Barros-Nú˜
nez
b,∗aDoctoradoenGenéticaHumana,CUCS,UniversidaddeGuadalajara,Guadalajara,Jalisco,México bCentrodeInvestigaciónBiomédicadeOccidente.IMSS,Guadalajara,Jalisco,México
Recibidoel21deenerode2016;aceptadoel17defebrerode2016 DisponibleenInternetel16deabrilde2016
PALABRASCLAVE Leucemialinfocítica crónica; Hipermutación somática; Inmunoglobulinas; Pronóstico
Resumen Laleucemialinfocíticacrónicaesunpadecimientomalignocaracterizadopor pro-liferaciónyacumulacióndelinfocitosBdeaspectomaduroenmédulaósea,sangre,ganglios linfáticosyenbazo.Comopartedesuprocesodediferenciación,lasmoléculasde inmunoglo-bulinadelascélulasB,ademásdelosreordenamientoscaracterísticosensuscadenaspesadas yligeras,presentanunconjuntodemutacionessomáticasqueincrementanenormementesu diversidad.Lapresenciaoausenciademutacionessomáticasenlasregionesvariablesdelgen delasinmunoglobulinasenloslinfocitosBmalignosdefinela agresividadyelpronósticodel padecimientoenindividuosconleucemialinfocíticacrónica.
©2016SociedadMexicanadeOncolog´ıa.PublicadoporMassonDoymaM´exicoS.A.Esteesun art´ıculoOpenAccessbajolaCCBY-NC-NDlicencia( http://creativecommons.org/licencias/by-nc-nd/4.0/). KEYWORDS Chroniclymphocytic leukaemia; Somatic hypermutation; Immunoglobulin mutation; Prognosis
Themutationalstatusofimmunoglobulinsinchroniclymphocyticleukaemia patients:Significanceandprognosis
Abstract Chroniclymphocyticleukaemiaisamalignantdiseasecharacterisedbyproliferation andaccumulationofmatureBlymphocytesinbonemarrow,blood,lymphnodes,andspleen. Aspartofitsprocessofdifferentiation,immunoglobulinmoleculesofBcells,inadditiontothe characteristicrearrangementsintheirheavyandlightchains,presentasetofsomaticmutations thatgreatly increase their diversity. The presence orabsence ofsomatic mutations inthe
∗Autorpara correspondencia.División deGenética. Centrode InvestigaciónBiomédica deOccidente.IMSS,Sierra Mojada 800.Col.
Independencia,CP:44340Guadalajara,Jalisco,México,Teléfono:+33-36683000.Ext.31931.Celular:3333407861.
Correoelectrónico:pbarrosgdl@yahoo.com.mx(P.Barros-Nú˜nez).
http://dx.doi.org/10.1016/j.gamo.2016.03.005
1665-9201/©2016SociedadMexicanadeOncolog´ıa.PublicadoporMassonDoymaM´exicoS.A.Esteesunart´ıculoOpenAccessbajolaCC BY-NC-NDlicencia(http://creativecommons.org/licencias/by-nc-nd/4.0/).
variableregionsoftheimmunoglobulingeneinthemalignantB-cellsdefinestheaggressiveness andprognosisofthediseaseinindividualswithchroniclymphocyticleukaemia.
© 2016SociedadMexicana deOncolog´ıa.PublishedbyMassonDoymaM´exico S.A.Thisisan openaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Introducción
La leucemia linfocítica crónica (LLC)es un padecimiento
causadoporlaacumulaciónprogresivadecélulasB
mono-clonales, relativamente inmaduras e inmunológicamente
incompetentes, en médula ósea, sangre, ganglios
linfáti-cos ybazo1.Estas células Bpresentanun inmunofenotipo caracterizadoporunaaltaexpresióndeCD20,CD22,CD43, CD19,CD23CD79a,IgM/IgDyunaligeraexpresióndeFMC7 y CD79b2-4. El desarrollo y la gravedad del padecimiento suelen ser muy variables, desde pacientes en los que la enfermedadprogresamuyrápidamentehastaaquelloscon enfermedadindolentequenorequierenterapia5.
Actualmente se describe la LLC como un espectro de formasclínico-biológicas.Análisisdelas cadenasde inmu-noglobulinas (Ig) enlinfocitos Bindican que el 60-65% de las LLCmuestran evidencia dehipermutaciónsomáticaen lasregionesvariablesdesuscadenaspesadas(IGHV),loque puedemodificarsuafinidadalosantígenos;el35-40%delas LLCcarecendemutacionessomáticasenlasregionesIGHV6. Elanálisisdelsegmentogénicoquecodificaparalas regio-nesIGHVhaayudadoacomprenderalgunosaspectosdela enfermedad1. Los pacientesqueno presentanmutaciones enIGHVmuestranunaenfermedadmásagresivacon super-vivencia más corta que aquellos pacientesque presentan talesmutaciones7.
Reordenamientos
en
las
secuencias
génicas
e
hipermutación
somática
de
las
inmunoglobulinas
Los exones delosgenes dela regiónvariabledelas Ig se generanatravésdeunreordenamientodesecuenciasque originalmenteseencuentranseparadasenlacadenadeADN original8.LasproteínasRAG1yRAG2sonindispensablesen el procesode reordenamiento de lossegmentos variables (V),dediversidad(D)ydeunión(J)(«recombinaciónVDJ») paraformarlacadenapesadadelaIg(IgH)9.
El reordenamiento de las secuencias génicas dela IgH comienza en loslinfocitos pro-B por acción dela enzima deoxinucleotil transferasa terminal (TdT) y los productos proteicosdelosgenesactivadoresderecombinación1y2 (RAG1yRAG2),conlasqueseiniciaelreordenamiento ini-cialdelossegmentosDyJ delaIgH9.Posteriormente,en elestadodelinfocitospre-BIocurrelaunióndeunodelos segmentosValrearregloinicialDJ,generándoseel rearre-glofinalVDJ10,11(fig.1).Sielreordenamientonodalugara unaIgHfuncional,seiniciaráelreordenamientodelsegundo alelodelaIgH7.
Posteriormente,yyaenloscentrosgerminales,lacélula B naïve (virgen) pasa por un proceso de hipermutación
somática, que genera una enorme diversificación de Ig (fig. 2).Este proceso seiniciacon la enzima denominada «desaminasa inducida por activación» (AID) que cataliza ladesaminaciónselectivaderesiduosdedesoxicitidinaen elADN,transformándolos enresiduosde uracilo.Los pro-cesos destinados a la reparación de las modificaciones o lesionesU:Gprovocadas porlaAID danlugar auna varie-dad de sustituciones de bases en el ADN de las regiones IGHV,loqueconstituyeelllamadoprocesodehipermutación somática.Así, la replicacióndel ADNprovoca mutaciones detransición enlosparesC:G,mientrasquelaenzimade escisiónde uracilo (UNG) yla ADNglicosilasa creansitios abásicos que pueden producir transversiones. Así mismo, elreconocimientodeloserroresdeapareamiento U:Gpor lasproteínasMSH2/MSH6desencadenaunprocesode repa-ración mutagénico en el que la polimerasa desempe˜na unpapel importante yconduce amutacionesenlospares A:T.Enresumen,ladesaminacióndelADNprovocadaporla enzimaAIDpermitelaconversióndelassecuenciasvariables delasIg,elcambiodeclasedeisotipoyalgunas transloca-cionesoncogénicasentumoresdecélulasB12 (fig.2).
Estado
mutacional
de
las
regiones
variables
de
las
cadenas
pesadas
de
la
inmunoglobulina
Comoneoplasia maligna de células B, la LLC puede evo-lucionar a partir de células B en estado pregerminal o posgerminal.EstodividelasLLCen2subconjuntos:1) leuce-miascuyascélulasBhanpasadoconéxitoatravésdelcentro germinalyhancompletadolosrearreglosdelacadena ori-ginalylosprocesosdehipermutaciónsomáticadelaIg13-15. LospacientesquepresentanlinfocitosBconregionesIGHV mutadastienenunamayorfrecuenciadedeleciones13q14 (65%vs.48%p=0.004)16,y2)leucemiasque seoriginana partir de linfocitos B que no han completado los reorde-namientosdelíneagerminaloelprocesodehipermutación somática,enlasqueeleventomutacionalsehabríainiciado enlinfocitostipopro-BoencélulasBnaïve13-15.Estetipode célulastienen, con mayor frecuencia,aberraciones genó-micasde malpronóstico como ladeleción 17p13 (10%vs. 3%,p=0.03)o ladeleción11q23(27%vs. 4%,p<0.001)16. ParaanalizarlavariacióndelasregionesIGHVseconsidera quelas secuencias que tienenmenosde2% dehomología conrespectoalADNdelíneagerminalyahanpasadoporel procesodehipermutaciónsomática17.Seconocequela acti-vidadtranscripcionaldelasregionesIGHVestáreguladapor proteínasespecíficas,como:PTEN,FOS,TNF,IFGR2,etc.18. LasupervivenciamediadepacientesconLLC,cuyos linfoci-tosnomuestranhipermutaciónsomática,esde95mesesen comparacióncon293mesesenpacientesconLLCcuyos lin-focitossufrieronelprocesomutacional(p<0.001)7,19.EstaG G U C GCA TC AAT TGA G ATCGAT TGA GU AT CGA T TGA CGT AGUT AAC T CGT AG T AACT GCA TCGAT TGA GXA TCGAT TGA CY TAGC T AACT CGT AGC T AAC T GXA TCGYT TGA CY TAGC XAACT GAA TC T AT TGA C T T A Transiciones o transversiones en C:G Mutaciones en A:T ó C:G GAT AAC T CG TAGT T AAC T G A T T A C G G U A T T A T A G C A T G G C C Desaminación A A T T AID 1 3 MSH2/6 UNG U Reparación 2 Procesamiento por UNG Replicación del ADN Mutaciones C por T Replicación del ADN C C C GA AA T T T T GA
Figura1 Procesodehipermutaciónsomática.LuegodequelaenzimaAIDconviertelacitosinaenuraciloenunadelashebrasdel
ADN,elprocesopuedecontinuarenvariasformas:1)lareplicacióndelADNconteniendoeluracilonoprocesadogeneramutaciones C→T;2)laescisióndelosuraciloporlaenzimaUNGgenerasitiosabásicos,mismosquetraslareplicacióndelADNpermitenuna gamamás ampliademutaciones detransiciónotransversión;3) lasproteínasMHS2/6 llevanacabounproceso dereparación mutagénicogenerandocambiosenlosparesdebaseA:ToC:G.
diferenciahaceque elanálisisdelas secuencias IGHVsea importante con propósitos depronóstico de lospacientes conLLC.
LossegmentosgénicosIGHVpresentesenlascélulasde LLCdifierendeloslinfocitosBCD5+normales.Así,los linfo-citosdeLLCutilizanpredominantementesegmentosgénicos de las familias HV1, HV3 y HV4, en una distribución que esdiferentedelareportada paraloslinfocitosBnormales CD5+20,21.Específicamente, enlinfocitosde pacientescon LLClafamiliaHV1sesobreexpresa,entantoquelafamilia HV3muestrabajaexpresiónencomparaciónconlos linfo-citos normales.Las secuencias génicas utilizadas con más frecuenciadentro de estas familias son: HV1-69, HV3-07, HV3-23yHV4-34,aunquela frecuenciarelativa enlaque estossegmentosgénicossemuestranendiferentescohortes deLLCvaría20,22,23.
Es importante destacar que las mutaciones somáticas noparecen producirse con frecuencia uniforme entre los subgruposde segmentos génicos IGHV, sino que muestran unajerarquíadefrecuencias(IGHV3>IGHV4>IGHV1)20.Por ejemplo,lossegmentosgénicosHV3-07,HV1-69yHV4-34se encuentranmásfrecuentementeenLLC-Bqueenla pobla-cióngeneraldecélulasBnormalesoCD5+. Lossegmentos
génicosHV3-07,HV3-23seencuentranmásfrecuentemente encélulasmutadas,mientrasqueHV1-69enlamayoríade loscasosseencuentraencélulasnomutadas24.ParaHV4-34 ladistribuciónessimilarenlas2formas25.
Linfocitos
de
leucemia
linfocítica
crónica
sin
mutaciones
en
las
regiones
variables
de
las
cadenas
pesadas
de
la
inmunoglobulina
El procesodehipermutaciónsomática enlosgenesdelas Igimplicaciertogradodeestimulación/seleccióndelos lin-focitosenmaduración,porloqueesnecesarioentenderla existenciadeLLCconregionesIGHVnomutadas.Unmodelo explicaelorigendeestascélulasnomutadascomoderivadas delinfocitosqueresidenenlazonamarginalyallíreciben estimulaciónantigénica. Porlo tanto,esprobable quelas células madre queoriginan este tipode leucemias B pro-vengandelaproliferacióndecélulasvírgenesoquehayan sufridoestimulaciónfueradelcentrogerminalpor antíge-nosT-independientes(comoeselcasodelospolisacáridoso lipopolisacáridos),loscualesinducendichaproliferaciónsin acumulacióndemutacionesenlasregionesIGHV21(fig.3).
A
B
L1
ADN de línea germinal
Rearreglo inicial V L1 V1 Ln V FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 DJ C Rearreglo final D J C V1 Ln Vn D1 D2 D3 D4 D5 Dn J1 2 CACAGTG RAG1 HMGB1 HMGB2 RAG2 OH D D D D J J J J OH
ACAAAAACC ACAAAAACC CACAGTG
345 C D D 12 nt D J 12nt 23nt 12nt 12nt 12nt 12nt 23nt 23nt 23nt 23nt 23 nt J Unión de RAG 1/2 y HMGB 1/2
Sinapsis y formación del complejo emparejado Corte de la hebra del DNA Formación de la horquilla y escisión Escisión de la horquilla Factores NHEJ y TdT Unión de señal Unión de codificación 12nt 23nt J
Figura2 A)Reordenamientodelossegmentosgénicosdelacadenaoriginaldelgendelascadenaspesadasdelainmunoglobulina.
Elrearregloinicial lograla reuniónde lossegmentosD-Jyelrearreglo finalla delossegmentosV-D-J. Elrearreglofinalestá conformadoporsecuenciasconstantesdenominadasmarcos(FR)ysecuenciasvariablesdenominadasregionesdeterminantesde complementariedad(CDR).B)MecanismomolecularderecombinacióndelasregionesV-D-J.LasproteínasRAG1/2(óvalosmorados) junto conlasproteínasHMGB1/2 (óvalosrojos)se unenala secuenciadeheptámeros ynonámeros; lasproteínasHMGB1/2 le confierenflexibilidadalADNylasproteínasRAG1/2cortanunasolahebradelADNgenerandounextremo3’OHlibre,elcualse unecovalentementeal enlace fosfodiésterdela cadenaopuesta,formandounahorquilla enelextremodecodificacióny una se˜nal5’fosforilada;losextremospermanecenasociadosalcomplejoproteicodenominadocomplejodepostescisión.Finalmente, losextremosenhorquillaseprocesanconayudadelcomplejoformadoporlaproteínade«uniónfinalnohomologa»(NHEJ)yla deoxinucleotiltransferasaterminal(TdT)paracrearelrearregloinicialdelainmunoglobulina43,44.
A
B
1 2 Centro germinal Célula B naïve Célula BCélula B activada Célula dentritica Linfocito B de
memoria
Linfocito TH Factor mutagénico Célula neoplasica Antígeno 3
1 2
3 4 5
1
Figura3 A)LLCconregionesIGHVnomutadas:1)Estimulaciónmedianteantígeno(Ag)independientedecélulasT;2)activación
dellinfocitoB,y3)eventoneoplásico.B)LLCconregionesIGHVmutadas:1)activacióndelacélulaBnaïvedependientedelinfocito T;2)expansiónclonalehipermutaciónsomática;3)estimulacióndellinfocitoBporellinfocitoTcooperador(TH);4)ellinfocitoB seactivaypasaalinfocitoBdememoria,5)eventoneoplásico.
LosreceptoresdecélulasB(BCR)poliespecíficosseríanla primeralíneadedefensacontrapatógenos.Sehavistoque losBCRenalgunasLLCpresentareminiscencias estructura-lesdeanticuerposquehanreaccionadocontrapolisacáridos capsularesdeantígenos bacterianos21,26. Esto,unido a las observaciones logradas en ratones, enlos que las células de la zona marginal median la respuesta de antígenos T independientes,sugierequelascélulasprogenitoraspodrían derivar de este conjunto. En principio, la formación del repertorioBCRylatransformaciónmalignapuedenocurrir conjunta o secuencialmente. La transformación también puedecomenzar cuandola célula estásiendoestimulada, ounacélulaconunBCRdeterminadopuedetransformarse conposterioridad.Repetidasobservacionesmuestranqueen algunascélulasdeLLClaestimulaciónantigénicacontinúa durantelatransformación27,28.
En general, la hipótesis del origen de las células no mutadasenel precentro germinal(CG) es factibley con-cordante con los datos disponibles actualmente, pero no lograexplicar porquélosperfilesdeexpresióndecélulas deLLCmutadasmuestransolopeque˜nasdiferenciasentre sí,apesardesuspresuntosprogramasfuncionalesyorígenes celularesdiferentes29,30.
Linfocitos
de
leucemia
linfocítica
crónica
con
mutaciones
en
las
regiones
variables
de
las
cadenas
pesadas
de
la
inmunoglobulina
Se ha propuesto un modelo por el cual los linfocitos con regionesIGHVmutadasseoriginandelinfocitosBde memo-riaque han abandonadoel CG, dado que la presenciade mutacionesesunmarcadordecélulasBpost-CG30.En gene-ral,lascélulasdeLLCnomuestranmutacionesprogresivas, comoenel caso dellinfomafolicular, enelque todaslas transformacionesocurrenenel CGysus célulasmuestran unprocesomuyactivodediversificacióndelosgenesIGHV. Además, las células de LLC mutadas también presentan mutacionesenel genBCL-6,comolamayoríadecélulasB post-CG.Estemodeloplanteaciertasdiferencias,por ejem-ploque en lamayoría de las células Bpost-CG el isotipo predominanteesIgG,mientrasquelascélulasdeLLC expre-sanensumayoríaIgMeIgD31,32(fig.3).
Enotroescenarioseplantealaposibilidaddeque,tanto lascélulasmutadascomonomutadas,derivandeunacélula BdelazonamarginalIgM+,IgDlow(fig.3).Estascélulas res-pondenaantígenosT-independientesypuedentenerIGHV mutado o no mutado30. Existen evidencias, aunque indi-rectas, de que estas células pueden ser estimuladas por bacterias,antígenosviralesoantígenospropiosdentrodela zonamarginalyacumularmutacionesfueradelCG21. Ade-más,las células deLLCmutadas yno mutadasderivarían delamismacélula,aunquequizásendiferentesestadiosde maduración,locualestaríaenconcordanciaconlosestudios deperfilesdeexpresiónsimilarentreambosgrupos29,30.
Enunaterceralíneadeposibilidades,yaceptandoquela estimulaciónpuedadarseporunantígenoTindependiente, loslinfocitosdela zona marginalpodrían ira losórganos linfoidesyayudar acrearlosCGdonde ocurreel proceso demutación,como sucedeenratones.Eneste modelo la transformación podría ocurrir después de la salida de las célulasdelCG21.
Enestosúltimosmodelos,silosprogenitoressoncélulas B de la zona marginal IgM+ e IgDlow, el proceso de acti-vaciónal que sonexpuestaslas células deLLC,tanto por estimulaciónporantígenospropiosy/otransformación leu-cémica,podríaninduciralaaparicióndenuevosmarcadores desuperficie.Así,laactivacióndecélulasquiescentesdela zonamarginalinducelaexpresióndemoléculasde activa-cióncomoCD5,CD23yCD3821.
Correlación
entre
CD38,
ZAP-70
y
el
estado
mutacional
de
las
regiones
variables
de
las
cadenas
pesadas
de
la
inmunoglobulina
LadefinicióndeLLCmutadaynomutadasedaporunlímite establecidoarbitrariamentede98%dehomologíaconelgen delalíneagerminal.Engeneral,elfenotipoleucémicode peor pronósticoseasociatípicamenteconlapresenciade regionesIGHVnomutadas7,conexpresiónincrementadadel marcador de superficie CD3819 yde la proteína ZAP-7033, yconlapresenciadeaberracionescromosómicascomolas deleciones17p13(proteínap53)y11q23(ataxia telangiec-tasiaATM)34,mientrasqueelfenotipodemejorpronóstico seasociaalinfocitosquepresentanregionesIGHVmutadas, bajaexpresióndeCD38yZAP-70,ycariotiponormalocon deleciones13q1435,36.
Seha vistoquelospacientesdeLLCconregionesIGHV nomutadaspresentanunamayorexpresióndeCD38(≥30%) encomparacióncon aquellosquepresentanregionesIGHV mutadas; porel contrario, la disminuciónenla expresión deCD38(<30%) seasocia aungenotipoderegionesIGHV mutadas36.Damleetal.demostraronquelosresultadosdel tratamientoparapacientesconregionesIGHVnomutadasy pacientesmostrandoexpresiónaumentadadeCD38(≥30%) fueronsimilares;esdecir,el79.2%delospacientesconIGHV nomutadoyel76.5%delospacientescon≥30%CD38 requi-rierontratamientoscontinuos.Porelcontrario,el52.2%con los pacientes que presentan linfocitos con regiones IGHV mutadasyel73%delospacientesconexpresióndisminuida deCD38(<30%)norequirieronterapiaofuemínima19.
Elimpactonegativo dela sobrexpresión deCD38 enla evolucióny supervivenciade estospacientes tambiénfue demostradopordelPoetaetal.,quienesencontraron que unaexpresióndeCD38≥30%enelmomentodeldiagnóstico seasoció conetapasderaiintermedias/altas37.La expre-sióndeCD38 yel estadomutacionaldeIGHVson factores deriesgoindependientesquepodríanserutilizadosparala estadificaciónclínica37,38.
Del mismo modo, Rassenti et al. encontraron que la expresióndelaproteínaZAP-70+(≥20%)enel71% delos casosdeLLCseencontrabaasociadaconregionesIGHVno mutadas,perosoloconel17%deloscasosdeIGHV muta-das(p<0.001).EstosautoressugierenqueZAP-70puedeser unpredictormásimportantequela presenciaderegiones IGHVnomutadas,paradeterminareliniciodelaterapiaen pacientesconLLC39.
Mediantecuantificación entiempo real (RQ-PCR)de la expresióndeZAP-70sedemostróqueel94%delospacientes con LLCque presentaban regiones IGHVno mutadas fue-ron ZAP-70+ yel 92% de los pacientescon IGHVmutadas fueron ZAP-70---40. Sinembargo, algunos estudios sugieren quelaexpresióndeZAP-70puedecambiar conel tiempo,
particularmente en el momento de la progresión de la enfermedad41,42.
Conclusiones
Marcadores biológicos como el estado mutacional de las regiones IGHV y la expresión de CD38 y ZAP-70 parecen sereficientesindicadorespronósticosparaayudaradefinir unamejorestadificación deloscasosde LLCylograrque lospacientesrecibanelmejorymásoportunotratamiento parasuenfermedad.LospacientesconLLC,cuyoslinfocitos muestran regiones IGHV nomutadas, presentan un pade-cimientomásagresivo, puestoque elevento neoplásicoo transformantetiene lugarenetapasmástempranas desu evolución,probablementeenprecentrosgerminales.
Seguramentenuevosymayoresestudiospermitiránsaber enquémomentoellinfocitoBpasaaserunacélula neoplá-sica,entenderelpapelquedesempe˜naelantígenoeneste procesodeevoluciónycomprenderacabalidadlasvíasque sigueellinfocitoBenelprocesodehipermutaciónsomática.
Conflicto
de
intereses
Los autores declaran notenerningún conflicto de interés conrespectoaestemanuscrito.
Referencias
1.García-Mu˜noz R, Galiacho VR, Llorente L. Immunological aspectsinchronic lymphocyticleukemia(CLL)development. AnnHematol.2012;91:981---96.
2.LewisRE,Cruse JM,Pierce S, Lam J,Tadros Y. Surface and cytoplasmicimmunoglobulinexpressioninB-cellchronic lymp-hocyticleukemia(CLL).ExpMolPathol.2005;79:146---50.
3.RawstronAC,BennettFL,O’ConnorSJ,etal.MonoclonalB-cell lymphocytosisandchroniclymphocyticleukemia.NEnglJMed. 2008;359:575---83.
4.GaidanoG, FoàR,dalla-FaveraR.Molecularpathogenesis of chroniclymphocyticleukemia.JClinInvest.2012;122:3432---8.
5.GribbenJG.HowItreatCLLupfront.Blood.2010;115:187---97.
6.ChiorazziN,FerrariniM.Cellularorigin(s)ofchronic lymphocy-ticleukemia: Cautionarynotesand additionalconsiderations andpossibilities.Blood.2011;117:1781---91.
7.Hamblin TJ, Davis Z, GardinerA, Oscier DG, Stevenson FK. UnmutatedIgV(H)genesareassociatedwithamoreaggressive formofchroniclymphocyticleukemia.Blood.1999;94:1848---54.
8.HuangL,LangeMD,YuY,LiS,SuK,ZhangZ.Contributionof V(H)replacementproductsinmouseantibodyrepertoire.PLoS One.2013;8:e57877.
9.WesemannDR,PortugueseAJ,MageeJM,etal.Reprogramming IgHisotype-switchedBcellstofunctional-gradeinduced pluri-potentstemcells.ProcNatlAcadSciUSA.2012;109:13745---50.
10.LúcioP,ParreiraA,vandenBeemdMW,etal.Flowcytometric analysisofnormalBcelldifferentiation:Aframeofreference forthedetection ofminimal residualdiseasein precursor-B-ALL.Leukemia.1999;13:419---27.
11.Van Lochem EG, van der Velden VH, Wind HK, te Mar-veldeJG,WesterdaalNA,vanDongen JJ.Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bonemarrow:Referencepatternsforage-relatedchangesand disease-inducedshifts.CytometryBClinCytom.2004;60:1---13.
12.DiNoiaJM,NeubergerMS.Molecularmechanismsofantibody somatichypermutation.AnnuRevBiochem.2007;76:1---22.
13.ChiorazziN,RaiKR,FerrariniM.Chroniclymphocyticleukemia. NEnglJMed.2005;352:804---15.
14.Strefford JC. Thegenomiclandscape ofchronic lymphocytic leukaemia:Biologicalandclinicalimplications.BrJHaematol. 2015;169:14---31.
15.OppezzoP, Dighiero G. Whatdo somatichypermutation and class switch recombination teach us about chronic lymp-hocyticleukaemiapathogenesis?CurrTopMicrobiolImmunol. 2005;294:71---89.
16.KröberA,BloehdornJ,HafnerS,etal.Additionalgenetic high-risk features such as 11q deletion, 17p deletion, and V3-21 usagecharacterizediscordanceofZAP-70andVHmutation sta-tus in chronic lymphocyticleukemia. J ClinOncol. 2006;24: 969---75.
17.GhiaP,StamatopoulosK,BelessiC,etal.ERICrecommendations onIGHVgenemutationalstatusanalysisinchroniclymphocytic leukemia.Leukemia.2007;21:1---3.
18.Álvarez-Silva MC, Yepes S, Torres MM, Barrios AF. Proteins interaction network and modeling of IGVH mutational sta-tus inchronic lymphocytic leukemia.Theor Biol MedModel. 2015;12:12.
19.Damle RN,Wasil T, Fais F,et al. Ig V gene mutationstatus andCD38expressionasnovelprognosticindicatorsinchronic lymphocyticleukemia.Blood.1999;94:1840---7.
20.FaisF,GhiottoF,HashimotoS,etal.Chroniclymphocytic leu-kemiaBcellsexpressrestrictedsetsofmutatedandunmutated antigenreceptors.JClinInvest.1998;102:1515---25.
21.ChiorazziN,FerrariniM.Bcellchroniclymphocyticleukemia: LessonslearnedfromstudiesoftheBcellantigenreceptor.Annu RevImmunol.2003;21:841---94.
22.SchroederHWJr,DighieroG.Thepathogenesisofchronic lymp-hocyticleukemia:Analysisoftheantibodyrepertoire.Immunol Today.1994;15:288---94.
23.TobinG,ThunbergU,JohnsonA,etal.SomaticallymutatedIg V(H)3-21genescharacterizeanewsubsetofchronic lymphocy-ticleukemia.Blood.2002;99:2262---4.
24.VardiA,DagklisA,ScarfòL,etal.Immunogeneticsshowsthat notallMBLareequal:Thelargertheclone,themoresimilarto CLL.Blood.2013;121:4521---8.
25.YeungCC,PowersML,NguyenTD,etal.RelevanceofIgVHgene somatichypermutationand interphasecytogenetics in lymp-homatouspresentationofchroniclymphocyticleukemia/small lymphocyticlymphoma.IntJSurgPathol.2011;19:563---9.
26.ChiorazziN. Cellproliferationand death:Forgotten features ofchronic lymphocyticleukemia Bcells.BestPractRes Clin Haematol.2007;20:399---413.
27.Hoffmann R. Gene expression patterns in human and mouse B cell development. Curr Top Microbiol Immunol. 2005;294:19---29.
28.KleinU,Dalla-FaveraR.Newinsightsintothephenotypeand cellderivationofBcellchroniclymphocyticleukemia.CurrTop MicrobiolImmunol.2005;294:31---49.
29.Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotypeinBcellchroniclymphocyticleukemia.JExpMed. 2001;194:1639---47.
30.KleinU,TuY,StolovitzkyGA,etal.Geneexpressionprofiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homoge-neous phenotype related to memory B cells. J Exp Med. 2001;194:1625---38.
31.Capello D, Fais F, Vivenza D, et al. Identification of three subgroups of B cell chronic lymphocytic leukemia based upon mutationsof BCL-6and IgVgenes. Leukemia.2000;14: 811---5.
32.PasqualucciL, NeriA, BaldiniL, dalla-FaveraR, MigliazzaA. BCL-6mutationsareassociatedwithimmunoglobulinvariable heavychainmutationsinB-cellchroniclymphocyticleukemia. CancerRes.2000;60:5644---8.
33.Crespo M, Bosch F, Villamor N, et al. ZAP-70 expression as a surrogatefor immunoglobulin-variable-region mutations in chroniclymphocyticleukemia.NEnglJMed.2003;348:1764---75.
34.DöhnerH,StilgenbauerS,BennerA,etal.Genomicaberrations and survivalinchronic lymphocyticleukemia. NEngl JMed. 2000;343:1910---6.
35.Del Principe MI, del Poeta G, Buccisano F, et al. Clinical significanceofZAP-70proteinexpressioninB-cellchronic lymp-hocyticleukemia.Blood.2006;108:853---61.
36.Sagatys EM, Zhang L. Clinical and laboratory prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Control. 2012;19:18---25.
37.DelPoetaG,MaurilloL,VendittiA,etal.Clinicalsignificance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2001;98:2633---9.
38.HamblinTJ,OrchardJA,IbbotsonRE,etal.CD38expression andimmunoglobulinvariableregionmutationsareindependent prognosticvariablesinchroniclymphocyticleukemia,butCD38 expressionmayvaryduringthecourseofthedisease.Blood. 2002;99:1023---9.
39.Rassenti LZ,Huynh L, ToyTL, et al. ZAP-70 compared with immunoglobulinheavy-chaingenemutationstatusasa predic-torofdiseaseprogressioninchroniclymphocyticleukemia.N EnglJMed.2004;351:893---901.
40.Catherwood MA, Matthews C, Niblock R, Dobbin E, Morris TC, Alexander HD. ZAP-70 mRNA quantification in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Haematol. 2006;76: 294---8.
41.PoulainS,BenardC,DaudignonA,leBaronF,MorelP,Duthilleul P.IsZAP-70expressionstableovertimeinBchroniclymphocytic leukaemia?LeukLymphoma.2007;48:1219---21.
42.HamblinTJ.ZAP-70levelsdochangeinCLLbutnotveryoften. LeukLymphoma.2007;48:1059---60.
43.NishanaM,RaghavanSC.Roleofrecombinationactivatinggenes inthe generationof antigen receptor diversityand beyond. Immunology.2012;137:271---81.
44.SchatzDG,JiY.Recombinationcentresandtheorchestration ofV(D)Jrecombination.NatRevImmunol.2011;11:251---63.
