Métodos alternativos y complementarios en experimentación animal

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León: Univ. León, 1999: 215-223, ISBN: 84-7719-708-3

Métodos alternativos y complementarios en

experimentación animal

E de la Peña de Torres. A Guadaño Larrauri y G Repetto Kuhn

Introducción

El libro de Rusell y Burch (1959) The

Principies of Human Experimental Technique fue el inicio de la búsqueda

de nuevos métodos que permitieran un menor uso de animales de experi-mentación en la investigación básica y aplicada. Otros elementos de gran trascendencia y que actuaron como motores dinamizadores para el desarrollo de métodos alternativos y complementarios a la experimenta-ción animal fueron: a) la Directiva del Consejo 86/609/CEE, que fue trans-puesta en España en el Real Decreto 223/1988, de 14 de marzo de 1988, b) la Directiva sobre Cosméticos, c) la creación del Centro Europeo de Validación de Métodos Alternativos (ECVAM), d) la publicación del libro

In Vitro Alternatives to Animal

Phar-maco-Toxicology de Castell y

Gómez-Lechón (1992). y e) la creación, dentro de la Asociación Española de lexicología, del Grupo de Trabajo Especializado en Métodos Alternativos (GTEMA), coordinado por el Dr. Guillermo Repetto.

La presión social ha motivado que la comunidad científica se haya intere-sado en el constante desarrollo de nuevos métodos alternativos mucho más refinados que emplean un menor número de animales en la investiga-ción toxicológica y farmacológica de nuevas sustancias.

En el congreso celebrado en honor a Claude Bernard en Lyon en 1978 se elaboró un decálogo con los principios éticos de la experimentación animal; la versión en castellano fue publicada por el Comité Español del ICLAS/CSIC en 1983 (Figura 1).

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

International Council for Laboratory Animal Science

COMITÉ ESPAÑOL DEL KLAS/CSIC/CICyT PRINCIPIOS ÉTICOS DE LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

Principios básicos

Artículo 1. Los progresos del conocimiento humano, son necesarios y sobre todo los de la

biología, de la medicina del hombre y de los animales.

Artículo 2. El hombre tiene necesidad de utilizar el animal en la búsqueda del conocimiento humano igual que para alimentarse, vestirse y trabajar. De ahí el deber de respetar el animal, entre auxiliar y ser viviente común a él.

Artículo 3. Toda persona que emplee animales con fines experimentales debe tener presente que están dotados de sensibilidad y memoria y son susceptibles al dolor y sufrimiento.

Responsabilidades del experimentador

Artículo 4. El experimentador es moralmente responsable de sus actos en el marco de la experimentación animal.

Artículo 5. Las experiencias concernientes a los seres vivos y las extracciones de tejidos a sujetos vivos con fines de investigación deben ser realizados por un científico cualificado o bajo su control directo. Las condiciones de conservación de los animales en experimentación deben ser definidas y controladas por un veterinario o por un científico competente.

Artículo 6. En los estudios sobre la utilización de animales deben existir una probabilidad razonable para que estos estudios contribuyan de manera importante a la adquisición de conocimientos que desembocaran eventualmente en la mejora de la salud y del bienestar del hombre y de los animales.

Articulo 7. Los métodos estadísticos, los modelos matemáticos y los sistemas biológicos in vttro deben ser utilizados cuando sean apropiados para completar la experimentación

animal y para reducir el número de los sujetos utilizados.

Artículo S. El experimentador debe utilizar el animal mejor adaptado a su investigación y tener en cuenta también los grados sensoriales y psíquicos propios de cada especie. Los animales en peligro de extinción no deberán ser utilizados más que en circunstancias excepcionales muy definidas. Mientras sea posible, los animales utilizados en el laboratorio provendrán de crías especializadas para asegurar las mejores condiciones de equilibrio biológico.

Artículo 9. El experimentador debe velar porque las condiciones de conservación del animal de laboratorio sean las mejores posibles y aportar los cuidados necesarios antes, durante y después de las intervenciones.

Artículo 10. El experimentador tiene el deber de ahorrar al animal todo sufrimiento físico o psíquico inútil. Debe poner en marcha los métodos que permitan limitar el sufrimiento y los dolores en el caso o casos que sean inevitables.

Edita Comité Español del ICLAS/CSIC y Consejos Generales de Farmacéuticos, Médicos y Veterinarios

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Clasificación de los ensayos

alternativos

La Figura 2 muestra la clasificación de los diferentes procedimientos para la disminución del uso de animales de experimentación, que incluye desde evitar la repetición de experimentos innecesarios, la mejora en el diseño, estudios en humanos, empleo de técni-cas in vitro, el uso de modelos teóricos y modelos matemáti-cos, hasta el empleo de mode-los visuales y de realidad vir-tual.

sido homologadas por la OCDE y la CEE. métodos que han sido contras-tados eficazmente por el gran desa-rrollo de los métodos utilizados en la evaluación mutagénica de las sustan-cias químicas.

Métodos alternativos in

vitro

El desarrollo de las técnicas in vitro ha sido espectacular en estos últimos tiempos, tanto por la evolución de métodos moleculares como por las faci-lidades parar el uso de cultivos celulares y cultivos de tejidos. La OCDE tiene una serie de métodos de ensayo homologa-dos y de los que deseamos des-tacar los ensayos de genotoxi-cidad, dado que a lo largo de los años han sido perfecta-mente contrastados y cuya va-lidez y valor predictivo ha quedado bien demostrado. La Figura 3 muestra la clasifi-cación de las técnicas de geno-toxicidad in vitro, que han

1. Evitar la repetición innecesaria de experimentos

Protocolos de ensayo y estudios previos: disponibilidad de la información

2. Mejoras de diseño en la experimentación animal

Reducción en el número de animales usados Refinamiento: disminución del estrés y sufrimiento

3. Estudios en humanos Epidemiológicos Toxicovigilancia Voluntarios 4. Técnicas in vitro Cultivos de Embriones Cultivo y baños de órganos Órganos perfundidos

Explantes. Cultivos organotípicos Cultivos de reagregados celulares Cultivo de células dispersadas

Cultivo de líneas celulares. Clones celulares Modelos libres de células

Organismos inferiores: bacterias, algas, etc.

5. Modelos teóricos de predicción

Relación estructura química-actividad (QSAR) Farmaco-toxicocinética (PB-PK)

6. Modelos en la enseñanza Modelos mecánicos Sistemas audiovisuales Simulaciones por ordenador Realidad virtual

Figura 2. Procedimientos para la disminución del uso de animales de experimentación.

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Tipo de Ensayo Mutaciones génicas Aberraciones cromosómicas Efectos sobre elADN

Tipo de electo y Organismo

Ensayo de mutación reversa de Salmonella typhimuríum Ensayo de mutación reversa de Escherichia coi Mutación génica en cultivos celulares de mamífero Ensayo letal recesivo ligado en Drosophila Mutación génica en Saccharomices cerevisiae Ensayo citogenético in vitro de mamifero Ensayo citogenético in vitro en médula ósea Ensayo de micronúcleos

Ensayo de letal dominante Ensayo de translocación hereditaria

Ensayo citogenético en células germinales de mamífero Síntesis no programada de ADN in vitro

Recombinación mitótica en Saccharomyces cerevisiae Ensayo de intercambio de cromátidas hermanas in vitro

N°UE 471 472 473 477 480 473 475 474 478 485 483 482 481 479 Figura 3. Ensayos de genotoxicidad de la OCDE (1993).

Substratos biológicos

empleados in vitro

La alternativas biológicas al uso de animales son muy variadas y para ello vamos a considerar la descripción que se hace en Repetto y Repetto (1995) (Figura 4).

1. Cultivos de embriones

Se utilizan embriones (pre o postim-plantados) de roedores o embriones de aves (huevos fecundados) para exami-nar las alteraciones en el desarrollo y la diferenciación, se caracterizan por mantener intacto su metabolismo y seguir su desarrollo e interacciones celulares fisiológicas. Además pueden utilizarse en cualquier etapa del

desa-rrollo embrionario. Sin embargo es una técnica muy especifica y que pre-senta dificultades para visualizar la toxicidad a nivel celular y molecular.

2. Cultivo y baños de órganos

Se utilizan hígado, cerebro, hipófisis, íleon., que se mantiene, tanto íntegros como en láminas, en baños o en culti-vos. Han de iniciarse a partir de ani-males más maduros (al menos recién nacidos) y se conservan las relaciones especiales entre los distintos tipos de células. Presentan problemas de hi-poxia en el centro del órgano y difi-cultades para la visualización de las comunicaciones intercelulares.

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3. Órganos perfundidos

Determinados órganos como hígado, riñon y páncreas pueden mantenerse en óptimas condiciones mediante sis-temas de perfusión continua. Aunque es una técnica muy sofisticada, facilita los estudios toxicocinéticos de capta-ción y secrecapta-ción de sustancias

4. Explantes. Cultivos organotípicos

Los explantes son pequeñas piezas de tejido, tomadas de animales de cual-quier edad, cuyas células interaccio-nan entre sí y crecen en cultivo du-rante semanas o meses manteniendo la estructura típica del órgano. Sus inconvenientes son la dificultad en la visualización de células individuales y la baja reproducibilidad bioquímica debido a la complejidad técnica que requiere su preparación.

5. Cultivos de reagregados celulares

Cuando las células procedentes de te-jidos fetales se disocian y cultivan en un medio sometido a agitación cons-tante, éstas tienden a reagruparse formando microagregados en los que, en gran parte, se restaura la arquitec-tura tridimensional original.

6. Cultivos de células dispersadas

Las células se siembran tras ser diso-ciadas enzimáticamente o mecánica-mente, obteniéndose un cultivo pri-mario se produce en monocapa. Las

1. Cultivo de embriones 2. Cultivo y baños de órganos 3. Órganos perfundidos

4. Explantes. Cultivos organotípicos 5. Cultivos de reagregados celulares 6. Cultivo de células dispersadas 7. Cultivo de líneas celulares. Clones

celulares

8. Modelos libres de células

Figura 4. Substratos biológicos empleados m

\ritro.

características histoquímicas se man-tienen en parte, y pueden visualizarse fácilmente. La reproducibilidad de los estudios electrofisiológicos, morfoló-gicos y bioquímicos es mayor y puede realizarse sobre células individuales durante largo tiempo. El inconve-niente es que la estructura al ser bi-dimensional pierde una gran propor-ción de la arquitectura tisular origi-nal.

7. Cultivo de líneas celulares. Clones celulares

Se utilizan células de origen animal o humano que se han adaptado a vivir en cultivo por el proceso denominado transformación, que puede ocurrir es-pontáneamente o puede ser inducido por un compuesto químico, radiacio-nes o virus. Las células pasan a tener vida infinita convirtiéndose en una línea celular establecida. Por vida in-finita se entiende la capacidad de és-tas células de multiplicarse in vitro durante periodos prácticamente ilimi-tados.

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

Este tipo de línea células tiene la ven-taja de suministrar gran cantidad ho-mogénea de un mismo tipo celular, siendo muy ade-cuada para estudios bioquímicos cuanti-tativos.

8. Modelos libres de células Este modelo esta

ba-1 2 3 4 5 6 7

Morfología celular y tisular

Viabilidad celular Proliferación celular Actividad Metabólica Membranas Celulares Comunicación intercelular Indicadores específicos Técnicas no invasivas Técnicas invasivas Sustancias reguladoras Uso de la energía, enzimas Síntesis de macromoléculas Inducción selectiva de proteínas Composición y estabilidad Permeabilidad iónica Sistemas de transporte

sado en los diferen-tes componendiferen-tes celulares que se pueden separar

me-diante técnicas de centrifugación. La experimentación con una fracción subcelular presenta la gran ventaja de evitar interacciones tisulares, celula-res y con otros organillos y enzimas. Las fracciones subcelulares más em-pleadas son la fracción completa u homogeneizado total, la soluble, la postmitocondrial, la microsomal, la nuclear, la sinaptosomal, la fracción de membrana plasmática y los dife-rentes componentes purificados.

9. Organismos inferiores: bacterias, algas, etc

En este apartado entran de lleno los métodos de la clasificación de la OCDE y que han sido homologados por la Unión Europea, donde podemos incluir los métodos de genotoxicidad reseñados en la Figura 3 de ensayos.

Figura 5. Indicadores de toxicidad in vitro (tomado de Repetto y Repello, 1995).

Dentro de éstos destacamos el ensayo de Salmonella typhimurium por ser uno de los ensayos mas utilizados en el mundo y con el que se han eva-luado un elevado número de sustan-cias químicas, por encima de 12.000 productos químicos. No obstante en la actualidad se cuestiona el valor pre-dictivo de los resultados obtenidos con dicho ensayo, dada su baja concor-dancia con los ensayos in vivo. A la vista de lo descrito podemos apreciar el elevado número de ensayos que se están realizando en los que no se emplean animales, siendo en la ac-tualidad de máxima transcendencia la aceptación de dichos resultados por las autoridades.

Indicadores de toxicidad

En la Figura 5 se exponen los diferen-tes tipos de indicadores de toxicidad

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in vitro, siendo la morfología celular y tisular. la viabilidad celular, prolifera-ción celular, actividad metabólica, membranas celulares, comunicación intercelular y los indicadores específi-cos los principales indicadores em-pleados.

Coordinación de actividades:

posibilidades de colaboración

La necesidad de desarrollar y validar nuevos métodos lleva implícito un gran coste económico y la cooperación de grupos de diferentes países. Para facilitar este proceso, la Unión Euro-pea ha creado el Centro para la Vali-dación de Métodos Alternativos (ECVAM) y en USA han constituido un Comité Interagencias (ICCVAM). A continuación relataremos breve-mente las principales actividades lle-vadas a cabo recientemente por algu-nos grupos de trabajo de nuestro país.

Actividades del Grupo de

Trabajo de Métodos

Complementarios de ICLAS

(WGCM-ICLAS)

Tras la creación del WGCM-ICLAS en septiembre de 1994 en Hyderabad (India), en 1995 se celebró en Tala-vera de la Reina (27-30 de Abril, 1995) el Grupo de trabajo ICLAS/CSIC sobre Métodos Com-plementarios, publicando posterior-mente la monografía: ICLAS/CSIC Wortong Group on Complementar)/ Methods (de la Peña et al., 1995);

todo ello ha sido un constante fer-mento para el desarrollo y practica de los métodos alternativos. Como coor-dinador de este Grupo, el Dr. de la Peña ha venido colaborando con el Dr. Repetto, de GTEMA, para la or-ganización de reuniones encaminadas al desarrollo de los métodos comple-mentarios y alternativos a la experi-mentación animal.

El próximo año, durante la celebra-ción de la Reunión ICLAS-FELASA del 22-28 de Mayo, en Palma de Ma-llorca, se celebrará una reunión del citado Comité de ICLAS sobre Méto-dos Complementarios.y Alternativos a la Experimentación Animal.

Actividades del Grupo de

Trabajo Especializado en

Métodos Alternativos de la

Asociación Española de

Toxicología

La creación, dentro de la Asociación Española de Toxicología, del Grupo de Trabajo Especializado en Métodos Alternativos (GTEMA), que coordina el Dr. Guillermo Repetto, ha reactivado las actividades en relación con los métodos alternativos, trabajando para coordinar los esfuerzos de los diferentes grupos de investigación españoles interesados en ellos. El GTEMA dispone de una Red de Intercomunicación Electrónica mediante la cual se distribuye por co-rreo electrónico información puntual sobre los proyectos de validación, ayudas de investigación, congresos,

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

actividades del GTEMA, ECVAM. ICCVAM, etc. Sobre sus actividades puede obtenerse más información en internet en la http://www.ua.es/nq/ aet/. El GTEMA ofrece incluir gratuitamente en su red a los investigadores que lo soliciten, especialmente a los colegas sudameri-canos. Para ello, se ruega enviar un mensaje electrónico solicitándolo al Coordinador del GTEMA, Dr Gui-llermo Repetto, del Instituto Nacional de Toxicología de Sevilla (E-mail: Repetto@cica.es).

Durante el año 1997 se han celebrado las siguientes reuniones: 1) en mayo, el Seminario sobre "Avances en la Aplicación de los Métodos Alternati-vos in vitro en la Evaluación de Me-dicamentos, Cosméticos y Productos Químicos", organizado por GTEMA/ AET y la empresa Smithkline-Bee-cham. en su Centro de Investigación Básica de Tres Cantos, Madrid; 2 ) en septiembre, dentro del XII Congreso Español de Toxicología, la Mesa Re-donda sobre "Los Métodos In Vitro en la Investigación Básica y Aplicada"; y 3 ) en octubre, la "Reunión para el Desarrollo y la Coordinación con ECVAM de los Grupos Españoles In-teresados en los Métodos Alternati-vos". Estas reuniones han sido coor-dinadas y moderadas por los Dres. Repetto, coordinador de GTEMA/ AET, y de la Peña, coordinador del ICLAS Working Group on Comple-mentary Methods; ambos colaboramos en el Seminario Internacional Com-plutense titulado "Uso y Abuso de la Experimentación Animal-

Conside-raciones Eticas" organizada en la Universidad Complutense de Madrid y en la Mesa Redonda celebrada den-tro del I Congreso Ibérico de Conta-minación y Toxicología Ambientales (CICTA), celebrado en Junio en Leioa, en la Universidad del Pais Vasco.

Actividades de la Junta

Promotora de REMA

Durante la celebración de la Reunión para el Desarrollo y la Coordinación con ECVAM de los Grupos Españoles Interesados en los Métodos Alternati-vos, celebrada en el Centro de Glaxo Wellcome S A, el 21 de Octubre de

1997, bajo la Presidencia de Honor de SM la Reina, se designó una Comi-sión coordinadora para el desarrollo de una Red Española para el desarro-llo de Métodos Alternativos a la Es-perimentación Animal (REMA), que ha redactado un documento tras la celebración de dos reuniones en enero y abril de 1998. Este ocumento es po-sible consultarlo en Internet (http://toxi.umh.es/aet/rema). Todas las ideas y sugerencias son bienveni-das, ello permitirá el desarrollo de los métodos alternativos. Los interesados pueden enviarlas a la Secretaria de la Comisión (Sita. Gema M3 Castro,

e-mail: gmc@glaxowellcome.co.uk).

Agradecimientos

Queremos expresar nuestro agrade-cimiento a los Directores del V Curso de Introducción a la Experimentación

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y Protección Animal (Facultad de Ve-terinaria. Cursos de Verano. Univer-sidad de León, celebrado del 22 al 26 de Septiembre 1997) Dres Inmaculada Diez Prieto y Carlos César Pérez García por invitarnos a participar en el mismo, al Prof. Paulino García Partida por sus comentarios, y a D2.

Antonia Martínez López, Ayudante Diplomada de Investigación del CSIC, por su eficaz ayuda.

Repetto M. Toxicologia fundamental. 3a ed.

Madrid: Díaz de Santos, 1997. Rusell WMS, Burch RL. The principies of

human experimental technique. London: Methuen, 1959.

Bibliografía

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Reinhardt CA, Repetto G, Sladowski D, Spielmann H, Zueco F. Practica! aspects of the validation of toxicity tests

procedures. The report and

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De la Peña E. ICLAS/CSIC Working Group on Complementary Methods. Madrid: Comité Español del ICLAS/CSIC/CICyT, 1995, 101 pp.

De la Peña de Torres E, Guadaño Larrauri A, Repetto Kuhn G. Ensayos alternativos a la experimentación animal. Anim Exp 1997; 3 (2): 30-36.

Repetto G. Recientes avances en la validación y aceptación de métodos alternativos in vivo e in vitro. Rev Toxico/ 1995; 12: 3-9.

Repetto G, Repetto M. Métodos alternativos: Estudios toxicológicos in vitro. En: Repetto M. Toxicologia Avanzada. Madrid: Díaz de Santos, 1995, 37-59.

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