Alcohol deshidrogenasa i aldehid deshidrogenasa de placenta humana

185  Descargar (0)

Texto completo

(1)

/

TUJil Jr

M

rr

UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA FACULTAT DE CIÈNCIES

DKPARTAMENT DI-: BIOQUÍMICA

"ALCOHOL DESH I DROGENASA I ALDEHID DESH I DROGENASA

DE PLACENTA HUMANA"

Tesi p r e s e n t a d a per a d q u i r i r el G r a u de Doctor e n C i è n c i e s Q u í m i q u e s p e r J A U M E F A R R É S i V I C E N , L l i c e n c i a t e n C i è n c i e s Q u í m i q u e s . T r e b a l l r e a l i t z a t e n e l D e p a r t a m e n t d e B i o q u í m i c a , F a c u l t a t d e C i è n c i e s , U n i v e r s i t a t A u t ò n o m a d e B a r c e l o n a , sota la d i r e c c i ó del Dr. X A V I E R P A R E S i C A S A S A M P E R A . V. P.

Jaume Farrés i V i c è n Dr. X a v i e r Parés i C a s a s a m p e r a

(2)
(3)

/ IV. RESULTATS /

Capftol IV : RESULTATS

1. ALCOHOL DESHIDROGENASA DE PLACENTA HUMANA

1.1. C a p a c i t a t d'oxidació d'etanol de la p l a c e n t a humana

Es determinà la c a p a c i t a t d'oxidació d'etanol de la p l a c e n t a humana, mesurant l ' a c t i v i t a t ADH en el sobrenedant dels homogenats de 14 placentes di-ferents (Taula XII).

No es varen observar d i - f e r è n c i e s notables entre les p l a c e n t e s estudiades quant a c a p a c i t a t de m e t a b o l i t z a c i ó de l'etanol. A pH • f i s i o l ò g i c i a les concentracions d'etanol que es poden trobar en sang després de la i n g e s t i ó d'alcohol (33 mM), l ' a c t i v i t a t per gram de t e i x i t •fou quasi i n d é t e c t a b l e , 50.000 vegades menor que l'observada en el -fetge (106, 190, 197). Quan la concentració d'etanol s'incrementà -fins a 500 mM o s'emprà un alcohol de cadena l l a r g a , com octanol 1 mM, l ' a c t i v i t a t de l'ADH de p l a c e n t a a pH 10,0 -fou encara 500 i 40 vegades, r e s p e c t i v a m e n t , in-ferior a la del -fetge (239).

Com ja s'ha dit a n t e r i o r m e n t , els homogenats de p l a c e n t a presenten un e l e v a t c o n t i n g u t en sang. A i x f doncs, es determinà la i n c i d è n c i a d'una possible a c t i v i t a t ADH de la sang en la c a p a c i t a t total d'oxidació d'etanol del sistema p l a c e n t a r i (veure III.4.2.). La concentració d'hemoglobina en p l a c e n t a es c a l c u l à en aproximadament 20 mg/g de t e i x i t , el que s i g n i f i c a uns 75 ml de sang/placenta. Aquests resultats, d'acord amb les dades existents sobre sang p l a c e n t à r i a (44), suposen que una elevada q u a n t i t a t de la prote'ina dels e r i t r ò c i t s c o n t a m i n a r i a els homogenats de p l a c e n t a , podent representar entre un 25 i un 50 'À de la prote'ina soluble t o t a l . La mesura de l ' a c t i v i t a t ADH en la sang d ' i n d i v i d u s sans no revelà a c t i v i t a t amb etanol 33 mM. Amb octanol 1 mM,

(4)

-154-CU e ÍH O) 4J CO CO c CO E 3 JS ca 4-1 c v o ca O) •a o JS o o »O •H U ÇO -a •H x o 4-1 ÇO 4-1 •H U ÇO a. ço o 4-1 •H X •H O) 4J d) T3 00 ÇO 4-1 •H 4J O f. X cu LO SC CU •H U ÇO i-i /-v 4-1 S c e d) *— o c o o 4-1 ÇO O +1 00 CN CN m +1 m o m m +1 vO vO <r o o +1 00 1—I o o o o +1 CN ÇO O +1 ^o oo o n ro oo CN rO «i S Çz CN » rH + Q g * O O iH S3 a « s rH * 0 SC o (0 2 1 (0 c •H u • H 1— 1 Dl o m * r~ E a ^ s G n m SC o (0 2 1 ü •H T! /O cn cn O c o e 4-1 (0 lt-1 U) 0 M-) 1_ 0 a ió 4-1 c cu (0 T3 (0 i-i p cn d) 6 t iH • CN • H H H d) ^D d) > 17-tCJ C 3 O M Cn Ja U <T3 J3 ; 4-1 (0 4J -H > •H 4-1 ü (0 rH 4-1 (Ü 4-1 0 CP cn d) d) w i u d) > (0 .c Tll_) .w \rn *d) ^1 a cn d) t) ^ 4-1 (0 M 4-) cn XI D cn M d) •a '0 -H ü •H T3 T3 (0 iH i (0 /fO •H ü •H C -H cn loï 4-1 C d) M d) LM •H T3 cn d) 4J C d) U «J ^H a •^r «H 0) Tl W 4J (O c d) di 0 6 o A cn iH d)

•i

(0 w 4-1 D DI •H 4J X! 0 cn n 0 (0 > cn ^H d) T3 T3 M 10 T! C /(O 4-1 W d) >0 -H U (0 •H > cn d) •O + 1 (0 c fO •m 4-1 •H e J2 »H 5 m -Pi

(5)

/ IM. RESULTATS /

a pH 10,0, l ' a c t i v i t a t mitjana de 6 preparacions d'eritrocits di-ferents •fou de 0,073 mil/mg d'hemoglobina. La màxima contribució de l'ADH d ' e r i t r o c i t a l ' a c t i v i t a t ADH mesurada en l'homogenat de placenta seria de l,4ó mU/g de t e i x i t , o un 10 X de l ' a c t i v i t a t total. No es va detectar a c t i v i t a t ADH en el plasma, d'acord amb els baixos valors observats en

i n d i v i d u s no afectats per m a l a l t i a h e p à t i c a (51, 279).

1.2. A'i 1 lament i pur i-f í caci o de l'ADH de placenta humana

La p u r i f i c a c i ó de l'ADH de placenta es realitza seguint el mètode emprat per Pari's i V a l l é e <239) per a la pur i-f icac ió de 1'isoenzim ^-ADH de -fetge, i comporta els passos que s'esmenten a c o n t i n u a c i ó (veure també III.1.4. i Fig. 11).

- Exemple de purificació'

En una p u r i f i c a c i ó t f p i c a , es varen homogenitzar 500 g de p l a c e n t a 1:1 (p/v) en tampó Trïs-HCl 10 mM, pH 7,9 a 4'C, centr i-fugant-se a continuació a 11.000 x g durant í h. El sobrenedant (700 ml) es f i l t r a , i es d i a l i t z a enfront de 25 1 del m a t e i x tampó durant 5 h. La mostra s'aplicà a una columna de DEAE-cel.lulosa (5 x 50 cm) e q u i l i b r a d a amb el tampó anterior, i l'enzim va ser e l u i t amb un gradient de O a 0,15 H de NaCl (3.000 ml). Les fraccions a c t i v e s (300 ml) es varen r e u n i r , concentrar f i n s a 25 m l , d i a l i t z a r enfront de tampó fosfat monossòdic-NaOH 10 mM, pH 7,3 i cromatografiar en una columna de 5'AMP-Sepharose (1 x 22 cm), equilibrada amb el mateix tampó. La columna es va rentar successivament amb aquest tampó (300 ml) i amb Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 (300 ml). L'ADH de placenta va ser elu'ida amb un gradient de O a 6 x 10-s M de NADH (500 ml) i concentrada fins a un volum de 1-2 m l ,

amb una a c t i v i t a t estàndard de 1-2 U/ml, apropiada per als estudis f fsico-químies i c i n è t i c s posteriors. La duració" total de la p u r i f i c a c i ó fou de 6 dies.

La Taula XIII resumeix les diverses etapes de l a ' p u r i f i c a c i ó . Seguint aquest procfs, l'enzim va ser p u r i f i c a t 12.000 vegades a p a r t i r de

(6)

-155-losa a pH 7,9 (veure III. 1.4.4.).

L'ADH de p l a c e n t a va ser e l u i d a mitjançant un g r a d i e n t de 0 a 0,15 M de NaCl ( ): a c t i v i t a t amb octanol 1,0 mM (-•-); a b s o r b e n c i a a 280 nm (-•-). El volum de les fraccions fou de 20ml.

(7)

o

o

—HIN)

7

0l * [ 1 D D N ]

o

o

Ö 0|

0l

x

Î D Î Î A U 3 0

(8)

1'homogenat de placenta.

- Cromatoqra-f i a de DEAE-cel . 1 ul osa

En la cromatografía de DEAE-cel . l u i osa, l'ADH de p l a c e n t a va e l u i r a una concentració de 40 mM de NaCl , immediatament abans de la -fracció m a j o r i t à r i a de l'hemoglobina, p r i n c i p a l contaminant dels homogenats de placenta. S o v i n t , un p e t i t p i c d ' a c t i v i t a t amb octanol 1,0 mM seguf al p i c majoritari en el p e r - f i l d'elucicT, tal com succeeix en la puri-f i cae i ó de l'isoenzim T[-ADH de -fetge <319) < F i g . 19). L'el ectro-foresi en gel de m i d ó d'una al fquota d'aquest segon p i c mostrà una banda m a j o r i t à r i a de m o b i l i t a t i d è n t i c a a \. -ADH (veure IV.1.4.).

En una ocasió, per tal de detectar la possible presència d'isoenzims catòdics en placenta, es concentraren exhaustivament les -fraccions elu'ides en el v o l u m d'exclusió de la columna t es mesura la seva a c t i v i t a t en-front d'etanol 33 mM. L ' a c t i v i t a t o b t i n g u d a -fou de 0,0084 mil/g de t e i x i t , i la Km aparent per a l'etanol a pH 10,0, 0,91 mM, s i m i l a r a la dels isoenzims de la classe I de -fetge <Taula II). Una mostra del concentrat s'aplica a una electro-foresi de gel de midó, a p a r e i x e n t una tènue banda c a t ò d i c a de m o b i l i t a t i d è n t i c a a la de l'isoenzim fiï fa > el me's abundant en el -fetge humà <88) <dades no presentades). Encara que l'origen d'aquest isoenzim p o d r i a trobar-se en el t e i x i t p l a c e n t a r i , no es pot descartar que la seva p r o c e d è n c i a s i g u i el -fetge, havent sigut transportat a través del plasma sanguini -fins a la p l a c e n t a <51, 279).

- Cromatopra-f i a en 5'AMP-Sepharose

En la cromatografía de 5'AMP-Sepharose l'enzim el u í espec f-f i cament mitjançant el gradient de NADH (Fig. 20), assolint-se -finalment un elevat r e n d i m e n t (Taula XIII). La p u n - f i c a c i o proporcionà quasi 2 mg d'enzim pur, demostrant-se la seva homogeneïtat per electro-foresi en pol i acr i lamí da amb SDS, cromatogra-f i a de gel - f i l t r a c i ó i el ectro-foresi en gel de m i d ó (Figs. 22 i 24). L ' a c t i v i t a t especf-fica de l'enzim pur a pH 10,0 resultà de 2,18 U/mg, mesurada amb octanol 1,0 mM, o 0,60 U/mg amb etanol 0,5 M.

(9)

FIGURA 20 Perfil d'elució de la cromatografía en 5'AMP-Sepha-rose (veure III I.4.6.).

La columna es va rentar successivament amb fosfat monossòdic 10 mM , pH 7,3,i amb Tris-HCl 0,1 M , pH 8,5 (A). L' ADH de placenta va ser eluida amb un g r a d i e n t (B) de O a 6 x 10~5 M de N A D H ( ): activitat amb octanol 1,0 mM (-•-) ; absorbencia a 280 nm (-•-).

(10)

(...)

* [HQVN ]

m

r

;o

u

0|

O

OO

(11)

• co CO c CO e 3 JS CO 4-1 C cu o CO t-H O. <U "Ü te o rH CU -o »o •H O CO O •l-t 4-^ •H Vi 3 PU • " *— < X < „4 Í3 < H 4-1 C Cu £ É? C ^"^ cu « *0 •H u CO O •H H-l •H Vi M 3 CU O. -O CO 00

s >

4-J v»-/ Ü co fa CO o •H U-l «H 0 0) CU CQ CU X~N 4-1 00 co B 4-) a •H S > •H 4-1 O < o r— 1 ÇO 4-1 O 4-1 ^_^ £0 OU c e :-H ^— ^ cu 4-! o v. Pu ,£> rH Cfl 4J O 1-1 /—N 1=1 4-1 ^^-^ CO 4-1 •H •H 4-1 O < *o •H U CO u •H U-l •rl \-t 3 Q. CU •O M co D* O O O O 00 p-i—i •-H <!• O -* 0 CN rH CN 00 i— i o <r o <t ao O O r-H •• •• K O O CN 00 •t O O rH 0 0 in rH • o m m <r o m -cr <r CO CU w w o o i-l·l Vi 3 CO < — 1 -C 4J • CU CO r-l CU c cu co cu o i oo i ex, O M S e •< < o w -33 Q m • -H Vi <0 4-1 c cu u (0 rH a JJ >rJ x -H fi] Urf _J^ CD T3 CP o 0 IT) 0) •a M •H -p Vi <0 a 10 (0 u •H \»Ha 4-1 *0 •rH ü fO U •H 4-1 •rl Vi rj a CT3 C D (0 Vi cu a w 0) T3 D 0> C •H 4J XI 0 co cu T3 (0 Q CO • * rH • iH • rH CN • M M Q) M D (U CJ o in CN (0 « o o rH as a 2 t~H o E O (0 2 1 (0 C •H o •H rH cr> «0 a (0 4-> C Q) ^ ^^ CN rH + Q <C « ë 0 * t"Hj rH 0 c (0 4-1 u o J3 (0 sur à Q) CO CU 4-1 (0 4-1 •H > •H 4-1 ü cd J X! %0 VI 4J (O a o u M O ja 3 V4 /CU co cu •o (O c -H -p c (O N 4-1 •rH rH •rH -P ro 00 0 O Vi O J CU T! O 4-1 /CU E rH CU a n •H e u cu •p 0) •o co cu (O c sH cu 4-1 o VI a cu •o V0 •H ü fO VI •p c 0) ü c o ü CN H H cu Vi D CU (O > J ~

(12)

1.3. E s t a b i l i t a t de l'ADH de placenta

L'enzim pur es mostrà altament ¡nestable en absència de NADH o de DTT. Com s'observa en la Fig. 21, la v i d a mitjana de 1'ADH de p l a c e n t a en presència de NADH (2 mol de NADH/mol d'enzirn) -fou de 20 dies, mentre que amb DTT 1 mM es p e r l l o n g à me's e n l l à d'un mes sense pèrdua aparent en l ' a c t i v i t a t . L'increment en l ' a c t i v i t a t observat durant els primers d i e s d'emmagatzement, es podria deure a un e-fecte de r e a c t i v a c i ó de l'enzim per part dels agents estabi 1 i tzants, sobretot DTT, afegits en - f i n a l i t z a r 1 a pur i-f icac ió.

El rendiment de la pur i-f icac i o mi 11 orà quan els tampons emprats també contingueren DTT 1 mM (dades no presentades), con-firmant la s u s c e p t i b i l i t a t general dels isoenzims de 1'ADH humana al medi oxidant, per raó de l ' e l e v a t c o n t i n g u t en residus de ciste'ina (35, 319).

1.4. A n à l i s i dels isoenzims de 1'ADH de p l a c e n t a

Quan es varen a n a l i t z a r els homogenats de p l a c e n t a m i t j a n ç a n t electroforesi de gel de m i d ó , no s'observà cap banda d ' a c t i v i t a t en la t i n c i ó amb etanol , d'acord amb la b a i x a a c t i v i t a t detectada amb aquest substrat. En la t i n c i ó amb pentanol , tots els homogenats de les 14 placentes examinades mostraren una ú n i c a banda anòdica d ' i n t e n s i t a t m o l t dèbil.

Quan es varen a p l i c a r simultàniament homogenat de placenta, ADH de p l a c e n t a p u r i f i c a d a i homogenat de -fetge, l ' i s o e n z i m de p l a c e n t a presentà una m o b i l i t a t i d è n t i c a a la de l'isoenzim hepàtic de la classe III,\-ADH (Fig. 22). Semblantment a la mostra h e p à t i c a , l'isoenzim de p l a c e n t a es desdoblava en dues bandes de m o b i l i t a t lleugerament d i f e r e n t , essent la me"s intensa la de m i g r a c i ó més l e n t a cap a l'ànode. Aquest comportament

(13)

FIGURA 21 Estabilitat de l'ADH de placenta en tampó Tris-HC1 0,1 M, pH 8,5, a 4°C.

L'enzim va ser emmagatzemat en presència de NADH (2 mols/mol enzim) (-•-) o de DTT 1 mM (-•-). Les fletxes indiquen l'addició de NADH a 1' en-zim (veure III.1.4.7.)

(14)

10

o

U) CL

E

o

_ o

O O O LO O

(15)

FIGURA 22 Electroforesi en gel de midó de 1'ADH humana a pH 8,6 , 220V, durant 16 h (veure III. 3.1.2.) a) Tinció amb etanol 69 mM

b) Tinció amb pentanol 74 mM 1 : Homogenat de fetge

2 : Homogenat de placenta

(16)

< I X ro CM

1

re •4-J fix w u ro o. X

o

C OJ o» l_ a </ u c K) (D

(17)

/ IV. RESULTATS /

7(¿-ADH les bandes de menor i major m o b i l i t a t , respectivament (5, 239).

Sempre que la t i n c i ó es perllongà durant mes de 30 m i n , es detectaren en els homogenats <pero no en la preparació d'enzim pur) dues noves bandes de m o b i l i t a t molt més anòdica. Aquestes també a p a r e i x i e n en absència de substrat i no es v i s u a l i t z a v e n quan s'a-fegia p i r u v a t al tampó de t i n c i ó . En c a n v i , sf es detectaven u t i l i t z a n t lactat com a substrat, el que demostrava que les noves bandes corresponien a isoenzims de la lactat deshidrogenasa, concretament, LDH 1 i LDH 2 (132) <dades no presentades).

1.5. Caracter i t z a c i ó iTsico-qufmica de l'ADH de p l a c e n t a

1.5.1. Pes molecular de l'enzim n a t i u

El pes molecular de l'ADH de p l a c e n t a p u r i - f i c a d a es d e t e r m i n à per cromatogra-f i a de gel -f i 1 trac ió' en una columna de Sephadex 6-200 SF <veure 111.1.4.8.1.). L'enzim e l u T en un pic s i m è t r i c d ' a c t i v i t a t que c o i n c i d f amb el màxim d'absorció a 280 nm <dades no presentades), no e x i s t i n t , doncs, possibles prote'ines contaminants. Corn es pot veure en la F i g . 23, el pes molecular o b t i n g u t , 74.000 d a l t o n , -fou lleugerament i n f e r i o r al de l'ADH de fetge de c a v a l l .

1.5.2. Pes molecular de les subunitats

L'enzim pur va mostrar una ú n i c a banda en electro-foresi en gel de p o l i acr i 1 amida amb SDS i t i n c i ó per prote'ina amb Coomassie B l u e , i n d i c a n t la homogene'i tat de la preparació'. Aquesta banda, de m o b i l i t a t lleugerament més r à p i d a que la de les subunitats de l'ADH comercial de •fetge de c a v a l l , correspongué a un pes molecular de les subunitats de 37.000 dalton < F i g . 24). Aquest r e s u l t a t , juntament amb el pes molecular

(18)

-158-placenta humana per cromatografía de gel fil-tració en Sephadex G-200 SF.

Representació de Kav enfront de log Mr (veure III. 1.4.8.). r2= 0,994 . Vt=370 ml . VQ= 135,6

ml.-Proteïnes patró: 1. Ribonucleasa A, 1,368 x 10 ; 2. Quimotripsinògen A, 2,5 x 10 ; 3. Ovoalbúmina , 4,5 x IÓ4; 4. ADH de fetge de cavall, 8,3 x 104; 5. Hexoquinasa, 10,6 x 104; 6. Aldolasa, 15,8 x 104.

(19)

vj-o

O GO

OsJ

OO

0*

O

Ö"

(20)

ció amb Cooraassie Blue (veure III. 3.2.)

a) Demostració de la homogeneïtat de l'enzim purify cat.

b) Càlcul del pes molecular de les subunitats (Mr) de l'ADH de placenta humana. Representació de log Mr enfront de la migració relativa (Rf).

4 r2= 0,987.

Proteines-patró : 1. A l b ú m i n a de sèrum b o v í , 6,8 x 10 2. Immunoglobulina G, 5,0 x 10 ; 3. Ovoalbúmina, 4,3 x 104; 4. ADH de fetge de cavall 4,0 x 104.

4

5. Anhidrasa carbónica, 3,0 x 10 ; 6. Inhibidor de 4

(21)

1-2

3-4-

ADH placenta

10

0,2

0,4

ADH placenta 5

0,6

0,8 1,0

Rf

(22)

o b t i n g u t en condicions no dissociants (veure IM.l,5.1.), suggereix que l'enzim està composat per dues subunitats idèntiques. Aquestes característiques só'n comunes a totes les ADH de mamífer (veure 1.3.I.).

1.5.3. Nombre ¿''àtoms de z i n c

El contingut mitjà en zinc d'una mostra d'enzim pur» mesurat per espectrofotometria d'absorc \6 atòmica (veure 111.2.6.), -fou de 4,08^0,38 àtorn-g Zn/mol d'enzim (Taula XIV), o s i g u i 2 àtoms de z i n c per s u b u n i t a t . En el m a t e i x experiment es determinà com a control el contingut en zinc d'una mostra d'ADH comercial de fetge de c a v a l l , el que donà un r e s u l t a t de 4,09 Í 0,24 àtom-g Zn/mol d'enzim, d'acord amb les dades p u b l i c a d e s , demostrant-se la f i a b i l i t a t del mètode emprat. El nombre d'àtoms de z i n c de 1'ADH de p l a c e n t a és, doncs, i d è n t i c al de tots els altres isoenzims de TADH humana i de mamífer estudiats fins ara (Taula I).N

1-5.4. I n h i b i c i ó de l ' a c t i v i t a t ADH amb agents quelants de m e t a l l s

Els agents q u e l a n t s de m e t a l l s , 1 ,10-fenantroli na, àcid p i r idin-2,ó-dicarboxíl i c i àcid 8-hidrox¡quino!ina-5-sulfònic, i n h i b i r e n p a r c i a l m e n t l ' a c t i v i t a t de 1'ADH de p l a c e n t a a pH 10,0, suggerint que al menys alguns dels àtoms de z i n c son essencials per a l ' a c t i v i t a t

c a t a l i t i c a (Taula XV).

1.ó. C a r a c t e r i t z a c i ó c i n è t i c a p r e l i m i n a r de 1'ADH de p l a c e n t a

1.6.1. pH ò p t i m per a l ' o x i d a c i ó d'alcohols

Emprant octanol 0,5 mM com a substrat (veure 111.2.2.1.1.), la m à x i m a a c t i v i t a t es presentà a pH 10,8, d e c r e i x e n t r à p i d a m e n t per sobre d'aquest

(23)

U E •H N C CU O e c 00 I co e o 4-1 rH 00 <r> CN CO CO 4-1 C 0) u CO rH CX 0) •O SB n •0 co 0) co o e to c cu )-i cu IM •r* ta cu •o u c •H N C CU 3 oo c c o u x «c _J s < H C N e ex ex m o m co CN en i-H CO VO •» •* •» o o o ÇO I—I CN r^ o ON i—i <r r» o o o ^ •* •* o o o e •H N C 0) 00 =M CN o-<í oo co u JJ co o 00 n o +1 00 o •o-CO c CO *p~) 4-1 •H 2 tO o «!_! 1 a M A cu en

s

\J u i-H (TÍ *U 4J 10 Q •rH íO *w i i +^ to ^ •rH O ^_J o ü] Xi 03 rrtW (T* "J .Jrn ^_j 4-) ÜJ o 4-1 O *4-l o ^( 4-1 U cu a W QJ ^ OÎ ü tn /i» Vl> TlW fO N 1 1 •H i frt *u fQ •H W Ü) TJ OJ 4J Q fO ^_j _jj M 0) w ÇJ OJ li w {^ ^_j ^ QJ >-¿4 •fH N g (1) rr-t U w 2 ¿t i * w ^ i H

s s

•J (0 ro (0

S

ü S in o rH 0 c, (0 4-1 cu 4-1 C tO N 4-1 •H rH .,_) 4-1 3 O O rH œ a (0 tO u •H 4-> 'i •H N C cu 4-1 iO p •H > •H 4-1 ü fO -rH 0) •o (0 M 3 cn cu e M 8, /<0 rH 3 U tO U cn cu fO c :H cu 4-) 0 M a cu T3 *0 •rH ü 10 M 4-) C cu u o u ro |J XI • ro • r-t • H •H • co • rH • CN • M M M CU i-l 3 cu > tp •••x D vD O CU T3 (0 U •H MH VH ü CU ato CU •p fO •P •rH •rH 4-1 ü tO tO c 3 4-1 c 10 r4 cu T) •rH CO C o u •H * 4-1 tO M •P W XI 3 CO 1 tO )-l 4-1 rH •H 4-1 rH cu en cu •a ta •H 4H 10 ^ en o 4-1 tO o ^_i o V-l

ä

4-1 3 en C •H •P XI 0 •» O o 0 * ^t f^. cu T3 ^ tO rH 3 U cu rH 0 E co

a

c 3 C 0) 0) en i 4-1 c (0 to tO XI «0 rH 3 U rH fO ü to CU í-i tO rH O e (0 •H M 4-1 CU O •H 3 D1 CU 4-1 tn cu j u • *-^ • rH • m • (H • > H CU •n 3 0) cu c •H MH M 0) a D W o 0 CN 1 ü X 0) T) m a CU w c cu »0 •H U

(24)

ca co 4J C cu oo ca •H co o •o •H C •H ca o co cu •a co •H o c 'O) co cu S-i CU c cu CO 4-1 c CU u cfl cu •o en Q 4-1 CO •H 4-1 U CU e O! •O X CO CO •H CO rH Q) ^^ U &-S cd »i •H •H 4-1 O ü OI m CN ca •rl C U -H cd S J*> ^ s 3 O c •H ca o. E cu H O U ca i* x~\ 4-1 S e e CU ^— ' u c o o 1-1 o •o 43 43 U U o o o m O O -í v£> i— 1 i— t m m co o CN i — t CN CN O O rH rH rH i— 1 O •H »H X O 43 ÍH CO O •H •a ca i C vO 0) CU -H rH i— 1 i— 1 CN O 0 O 1 N N (-i C ca ca 4-1 -H l-i (-< C -O •rl -H CO -H a. a. e >-• rH rH CU -H u vO en o CN rH i — t 1 CO C •rl rl·lo c •H •3 U a1 -H •H C ><! 'O O '4-4 S-l rH T3 3 •H CO r«; | i m o T) •H ^ • H J3 C •H •ü sinci a X! (0 C 0) r- 1 íO •P^ U -r-l C • H JJ (0 4-1 •H > •H 4J U n3 dP O 0 rH II (0 •H 4-1 <d 0) t-l 4-1 4-> g o u d "1 o r-l O c 4-1 u o 4-1 c (d N 4-1 •H rH "jj 3 ^ 1 CN i— 1 Q Z t~-a k s CD U •H cn w 0 o e 4-1 id M-l w o <*-! a e 4-1 Q) C 0) (Tl C •H S-l 0 4-1 0) T) CO CU 4-1 m 4-1 •H • > 4-1 W X) 3 Cfl (0 e 0 u s e o fe rH rH O c fd 4-1 U o 4-1 C N 4-1 •rl • H 4-1 3

i

CN Q Z • O o rH 33 a a rH O as O 2 1 <d c •H U •H jiiiii-j N a (d c Q) _1 'c -rl e 0) 4-1 cu co cu 4-1 (d 4-1 •H

(25)

/ IV. RESULTATS /

pH, signe de la i n a c t i v a c i o de l'enzim degut al m e d i alcalí" < F i g . 25). El pH ò p t i m està comprès d i n s del rang de pH ò p t i m observat per als

isoenzirns hepàtics de l'ADH humana (pH 9-11) (85, 190, 319). A pH 7,5, l ' a c t i v i t a t -fou només el 3 X de l ' a c t i v i t a t màxima, a di-ferència dels isoenzims me's comuns de la classe I, que a pH neutre encara posseeixen un 40 V. de l ' a c t i v i t a t màxima (190). A pH 6,0, l'ADH de placenta -fou pràcticament i n a c t i v a .

Aquest comportament a valors de pH propers a la n e u t r a l i t a t qü'estiona seriosament el paper d'aquest enzim en l ' o x i d a c i ó d'alcohols en condicions -fisiològiques.

1.6.2. Espec i-f í c i tat de coenzim

Amb octanol i octanal com a substrats, l'enzim u t i l i t z à pre-ferentment NAD i NADH com a coenzims, amb una Km de 64 uM i 3,6 ^iM, r e s p e c t i v a m e n t , a pH 7,5 (Taula XX). Quan NADP * 1,2 mM va s u b s t i t u i r al NAD*, no es detectà a c t i v i tat ADH.

Quan s'emprà NADPH 0,26 mM, juntament amb octanal 4 mM com a substrat, l ' a c t i v i t a t -fou el 20 '/. de l'observada amb NADH.

1.6.3. O x i d a c i ó dels alcohols a l i - f à t i c s de cadena curta

Com es pot observar en la Taula XVI, els alcohols al i-f àtics de menys de 5 carbonis no saturaren l'ADH de p l a c e n t a , àdhuc a les elevadfssimes concentracions de substrat emprades. A i x f , arnb etanol 2,5 M, e q u i v a l e n t a un 12 '/. (v/v) d'etanol , no es detectà saturació, i n d i c a n t que l ' a - f i n i t a t de l'enzim per a aquest substrat és pràcticament nul.la. En aquestes c o n d i c i o n s , l ' a c t i v i t a t és d i r e c t a m e n t proporcional a la concentraci o de substrat, no podent-se calcular Km ni kcat, però sT la constant d'especi i i c i tat kcat/Km (veure III.2.2.2.) (Fig. 26). Aquest p e c u l i a r comportament c i n è t i c r e f l e c t e i x aparentment u n a reacci ó b i m o l e c u l a r entre

l'enzim i el substrat.

(26)

-160-del pH per a l'oxidació -160-dels alcohols (veure III. 2.2.1.1.).

(27)

o.

o

o"

(28)

Representació directa de v/ CE] enfront de ES] , mostrant-se la manca de saturació de 1'enzim. La relació kcat/ km es calcula a partir de la gràfica tal com s'explica a III.2.2.2.

(29)

activitat específica (U/mg)

o

c

o

* o

o

o

no

O

O

rsi

O

O

(30)

La baixa a-fin i tat de l'enzim per l'etanol e x p l i c a l'escassa a c t i v i t a t detectada amb etanol 33 mM en homogenat de placenta i l'absència de la banda anodica en 1a tinció" amb etanol de l'electro-foresi en gel de midó (veure IV.1.1. i IV.1.4.).

1.6.4. I n h i b i c i ó amb derivats del pirazole

L'enzim de placenta resulta totalment insensible a una concentració' 12 mM dels derivats del pirazole, 3-meti 1 pirazole i 4-metiIpirazole, conservant el 100 '/, de l ' a c t i v i t a t i n i c i a l quan octanol 1,0 mM era u t i l i t z a t com a substrat a pH 7,5 (Taula XV).

1.7. I d e n t i t a t de les propietats de 1'ADH de placenta amb les de 1'isoenzim t-ADH de fetge

Com s'ha v i s t -fins ara, les propietats -ffsiques de l'ADH de placenta eren similars a les de les altres ADH de -fetge, però les propietats el ectro-f orèt i ques i c i n è t i q u e s contrastaven marcadament amb les dels

¡soenzims més estudiats de les classes I i II de 1'ADH humana.

En c a n v i , l'enzim p u r i - f i c a t a p a r t i r de p l a c e n t a presentava notables s i m i l i t u d s amb 1 ' i soenzim T(-ADH de -fetge, recentment descobert per Fare's

i Vallée <239) (veure I. 3,5.3.). Aquestes analogies es concretaven en els següents punts:

a) Un punt i s o e l è c t r i c extraordinàriament b a i x , responsable de la m o b i l i t a t electro-forètica netament anòdica, idèntica per als dos

i soenz ims.

b) Un característic per-fil d ' a c t i v i t a t d'ox idac lo dels alcohols en -funció del pH, amb una a c t i v i t a t quasi n u l . l a a pH neutre.

(31)

/ IV. RESULTATS /

c) Manca de saturació amb etanol i altres alcohols a l i f à t i c s de cadena curta com a substrats.

d) I n s e n s i b i l i t a t a la inh i b i c i ó " per 4-metiIpirazole.

Les propietats observades en aquesta caracterització' p r e l i m i n a r permetien afirmar que l'únic isoenzira de 1'ADH detectat en placenta era i d è n t i c a l'isoenzim /(-ADH de -fetge, a la vegada que recolzaven els resultats obtinguts , primer per Fare's i V a l l é e (239), i després per Wagner i col. (319), per a la -forma hepàtica.

Una vegada demostrada aquesta i d e n t i t a t , la recerca es va centrar en completar, amb l'isoenzim p u r i - f i c a t a partir de placenta, el treball de caracterització de ^-ADH que s'havia i n i c i a t a partir de -fetge, sobretot en a q u e l l s aspectes de l'estudi que presentaven "a p r i o r i " mes c o m p l e x i t a t en el t e i x i t h e p à t i c . La placenta constituïa un sistema singular per a l'estudi de T[-ADH, al - f a c i l i t a r tant el seu a'il lament i p u r i f i c a c i ó com els estudis de local itzacid subcel.lular. L'existència d'un únic isoenzim excloïa qualsevol p o s s i b i l i t a t de contaminació per part d'altres -formes de l'ADH, presents i n e l u d i b l e m e n t en el -fetge.

Per altra banda, les peculiars propietats c i n è t i q u e s de "X-ADH, a i x f com la seva presència e x c l u s i v a en p l a c e n t a , plantejaven importants interrogants arran de la seva possible -funció" en el metabolisme normal d'aquest òrgan durant la gestació'. Per aquest m o t i u es va d e c i d i r investigar amb mfs p r o f u n d i t a t l ' e s p e c i f i c i tat de substrat de l'isoenzim 3[-ADH. Al m a t e i x temps, s'intentà esbrinar el mecanisme c i n è t i c de ^-ADH,

estudi que no h a v i a sigut abordat en els treballs p r e v i s u t i l i t z a n t 1'i soenz im hepàt i c.

(32)

-102-1.8. Aprofundiment en l'estudi c i n è t i c de 1' isoenz¡m X-ADH

Per a l'estudi c i n è t i c i d'especifici tat de substrat de \ -ADH s'empraren alcohols i aldehids amb diferents estructures moleculars i grups -funcionals (Figs. 27 i 28), que serviren de model de les molècules •f isiològicament actives mes usuals.

1.8.1. Especif i c i tat de substrat

1.8.1.1. O x i d a c i ó d'alcohols

L'estudi de l'especi iici tat de substrat es r e a l i t z à a pH 10,0, ja que a aquest pH l ' a c t i v i t a t enzimàtica es molt me's elevada que a pH neutre <veure IV.1.6.1.). Per altra banda, la major part de les dades c i n è t i q u e s de les classes I i II h a v i e n s i g u t obtingudes a aquest pH <85, 318).

- Els valors de Km, kcat i kcat/Km de ^-ADH per a l'oxidació d'alcohols a l i f à t i c s p r i m a r i s , u>-hidroxiàcids i alguns isoprenoides

apareixen en la Taula XVI.

L'hexanol fou l'alcohol de cadena més curta per al qual es pogué" calcular la Km. Per als alcohols a l i f à t i c s p r i m a r i s de me's de 5 carbonis, la Km va d i s m i n u i r al augmentar la l o n g i t u d de la cadena carbonada, arribant a 0,4 mM per al nonanol . Aquest fenomen es comú" a les altres classes de l'ADH humana i de rnamffer, i es degut a la p a r t i c i p a c i ó de les interaccions hidrofòbiques en la f i x a c i ó del substrat. A i x T , la molècula de ~1( -ADH podria presentar una confrmaciò' s i m i l a r a la de l'ADH de fetge de c a v a l l , amb un túnel hidrofòbic en l'entrada del centre a c t i u <veure 1.3.I.). Els valors de Krn de T(-ADH foren, però, d'un a tres ordres de m a g n i t u d mes e l e v a t s que per als altres isoenzims de l'ADH humana. A i x í , la Krn per a 1'octanol fou de 0,6 mM, comparada amb valors de 5 a 17 uM i 7 uM, per a les classes I i II, respectivament <85, 318).

(33)

CH2OH CH2OH

II

CH2OH

CH2OH

X I I I X I V

FIGURA 27 Estructures moleculars dels alcohols emprats com a substrats de x~ADH :

octanol (I), geraniol (II), nerol (III), tot trans-retinol (IV), alcohol benzílic (V), 2-(4-hidroxi--3-metoxifenil)etanol (VI) , 2-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil) etanodiol (VII), alcohol cinnàmic (VIII), 5|3-dihidrotestosterona (IX), 30-hidroxi-50-andros-tan-17-ona (X), l7ß-estradiol (XI), 17$-estradiol--3-sulfat (XII), estriol (XIII), 2-(5-hidroxiindol--3-il)etanol (XIV).

(34)

0 0 l—! SC Q. cd co rH O o u rH CO co i-H CO }H d) p.. 33 O 1 X co c co j5 co ace n 1 cu •o 33 O «. i — | d) •a co cu D cr •H 4-1 »CU c •H o CQ 4-1 C ÇO j i CO c o C_5 • 1 1 x e rH 1 2 ^~/ S ^¿ ^~~^ 4-1 co u ^ f— í i c •H E s—' 4J CO U •* ï E N— ^ E HM O 9? E v, / C/1 r*> 4-1 CO •O TJ o o o o o o g o o o C N v O O O O O ^ O O O r - i O O O - < t O O ° O O O • . . . ' . . . m c M i n o ' - ' o o c M m o oo <-) o CN sí r» r^- ° o r» * m in • o o o o ^ o o c o c a c o r - i s í - c r < í r^ i n i n . m -if co ^ sí <r C G ""> 00 \o sí ^ in vu o • in i ^ - o o ° o o o CO CO - rH • in c c ** *~1 ^ o o o i n c N o o < - i ^ H O O O rH rH m m • CM d) U •rH O C co UH 0 ^-N d) in "O o r^ "O ^ -H X EC 0 CX »H v_x T3 d) 00 ¿ rH rH rH rH rH rH | O rH * . rH • CN H H (H <0 3 •H M CJ CO d) Ti CO cu w c O D1 d> CO * S E CN * ^ + < "i «S * O ^ o rH E a * 2* rH ^* o X o f íd c u *a

's

Û4 E ro 4-1 C d> ro T! ro rl 3 CO d) E 4-1 4J •H * CN • Cn •H b (0 rH c d) c d) x -H ^1 a to 4-> ro N 4-1 rH •H 3 CO lo }_l Jj tß A 3 CO co 1— 1 d) co c C7* fO w •a co ^) (0 rH fj dl o (n 03 H _Tj U 3 M 4-1 CO ,j i <o M 4-1 CO 3 CO d) T3 4-> (0 -H •H A o ro *~H .^ cu a ro 4-1 •H E rH 0) 3 •H > co 0 co rd CJ co 4-1 rH 0 e c W • fT\ W * •H (0 ÇO co ro • rH C CU CO CU 4-1 (0 4-1 ro M 4-1 co ja co co E •H x /(O e 'r *•* »o • H ü ra à ^ CN • CN CN • H ^ cu N s • R • w" . . 4-1

s

'S

(D

fö y c « '-R

ü

c Cfl g SL: p (0

s

-y fB 4_J rH Fn dï

Js

"g H q H -S Jj

s

12s pt fH 'n >, " i TJ w £_L| »u 4J 'j 1 /— •» CTi n CN CU cu rH rH (0 > •H CO \o> ro 0) o. 4-1 C 0) rH •H 4J C 0) Cn co d) rrj 10 4-1 •H rH -H U ra <w . = CN i-H 4-D "i (0 IT) ffi a fc s j fe o ü •H T! /O 10 w 0 o E 4-1 ro li i »H co o MH Xa e <0 4-1 C cu (0 •o 10 i^ 3 CO d) 4-1 ro 4-> •H • *-^ CN n — d) N N ro CQ -r» CU dl rH rH (0 > 0) T3 <0 •0 3 C -H O • e •H N c cu • rH d) •a -H ü ro ^3 4J ra CO <0 > M d) CO .Q 0 co 0

(35)

/ IV. RESULTATS /

Els valors de kcat es mantingueren pràcticament constants (300-400 min-1*) per als m i l l o r s substrats, independentment de la seva estructura,

suggerint un m a t e i x pas l i m i t a n t en el mecanisme c i n è t i c , probablement l ' a l l i b e r a c i ó del NADH. Aquest comportament s'ha observat també" en les classes I i II de l 'ADH humana <85, Í90, 318) i en isoenzims anàlegs al

en altres espècies animals (72, 172).

L'octanol U), amb una constant d'especi-f ici tat (kcat/Km) 7.000 vegades superior a la de l'etanol, -fou un dels m i l l o r s substrats de T[-ADH, i s'emprà en la major part dels estudis realitzats amb 1 'ADH de

placenta. El m i l l o r substrat en termes de kcat/Km és l'àcid 12-hidrox idodecanoic , amb una Km de 55 juM, del m a t e i x ordre que les observades per als isoenzims catòdics de 1 'ADH humana <85, 318). Sembla que la presència d'un grup hidro-fflic al -final d'una cadena a l i - f à t i c a llarga, l l u n y del grup h i d r o x i l , a-favoreix en tots els isoenzims la u n i ó del substrat al centre a c t i u de l'enzim. La i n t e r a c c i ó d'una cua carregada negativament amb el solvent o amb algun r e s i d u amb d e n s i t a t de càrrega p o s i t i v a , com el seti de -f i xacid del s anions (veure 1. 3.I.), podria col·laborar en la -fixació del substrat.

El geraniol (II) i el seu isòmer, nero! (III), alcohols pol i insaturats de de la -família dels terpens i components dels o l i s essencials, presentaren constants c i n è t i q u e s s i m i l a r s a les de l'octanol (I). La presència de dobles enllaços i de ram i -f i cac ions en la cadena de 8 carbonis no semblà massa important en la de-f i n i c i ó ' de l 'espec i i ic i tat enzimàtica. Tampoc no varen variar Km ni kcat per la presencia d'un doble enllaç en conformació cis en el nerol .

El tot trans-ret i noi (IV), o v i t a m i n a A, é's o x i d a t e-f ic i entment pels isoenzims catòdics d'home i d'altres mamf-fers (216, 222, 259), amb valors de Km de l'ordre de iuM, postulant-se com un dels posssibles substrats - f i s i o l o g i e s de l 'ADH en el -fetge. Per altra banda, la presència d'una cadena pol i insaturada llarga semblava una estructura favorable per a l'acció de 1j[-ADH. D'acord amb a i x ò , el r e t i n o l , -fou el substrat pel

(36)

-104-qual 7[-ADH presentà una Krn més baixa (80 uM). L'eficiència catalTtica (kcat/Km) aparegué, però, molt disminu'ida, degut al valor extraordinàriament b a i x de kcat <3,5 min-4). Una kcat tant b a i x a

r e f l e c t i r i a un pas l i m i t a n t mes lent que la dissociació del coenzim, amb el que el mecanisme c i n è t i c seria probablement d i f e r e n t de l ' e x h i b i t amb els alcohols al i-f à t i c s de cadena llarga (veure IV.i.8.2.).

- En la Taula XVII es mostren les constants c i n è t i q u e s obtingudes per a l'ox idac ió'd'alcohols aromàtics.

L'alcohol benzflic <V), el mes s i m p l e dels alcohols aromàtics estudiats, no saturà l'enzim, àdhuc a una concentració" de 100 mM, presentant un comportament i una constant d'espec i-f ic i tat s i m i l a r s als de Tétano! i alcohols de cadena curta <veure IV.l.ó.3.). Cal afegir que l'alcohol benzflic e"s un dels m i l l o r s substrats per a les altres formes de 1'ADH humana, a excepció* de l'isoenzim ß,ß, (318). Aixf, l'isoenzim -ADH posseeix per a aquest substrat una Km de 7 jjM i una kcat de 550 min-* (85).

Quan l'anell aromàtic presentà substituents, com en el cas del 2-<4-hidroxi-3-metoxifeni1)etanol (VI) i 2-<4-hidroxi-3-metoxifen i 1)etanodiol (VII), derivats del metabolisme de les catecolamines, es pogué calcular la Km, encara que el seu valor fou molt alt i la kcat molt p e t i t a . Per analogia amb altres isoenzims de TADH, el valor de kcat més b a i x per al compost VII que per al compost VI es podria e x p l i c a r per la presencia d'un grup h i d r o f f l i c proper al carboni que soporta el grup alcohol. Aquest es el cas del 1,2-etanodiol comparat amb Tétano! (Taules III i IV).

El m i l l o r substrat en termes de kcat/Km fou l'alcohol c i n n à m i c (VIII), molt bon substrat també per a altres isoenzims de fetge huma i de cavall (245). La seva Km (0,1? mM) fou però molt més alta que la mesurada per als altres isoenzims.

(37)

o o K ex co co rH O £. O O rH CO CO rH CO 1-4 CU Cu 33 O •< I X CO n ço E 3 C cu u CO I— I CU cu •o 33 o (U •o CO CU 3 cy • •H 4-1 CO 'CU d ^N •H »O U -H ü CO CO 4J S c c CO -H eo c c o o o O v^ x <c rJ 3 «s §1 I c •H E rH I S E 4J CO U .Ü I c •H e CO u •o o r~ r^-o o -* o <í o o o * o o CN co » c 00 o CN S e \_/ E m co CN • e u y*"N 2S E v-x r—i C/> O O oo CO tl·l 4-Î CO .C D en »H N C CU ja o JS o o rH CO I •H X o 4-1 0) E I ro I rH •H O X C 0 CO IH 4-1 •o cu •H _c *-* 1 rH v^ C I CU CN «4-1 •H X O 4-> CU E rH I O en -H l T3 •H O X C 0 co r-l 4-> •o cu •H .C ^ 1 rH -* -H ^ C I CU CN M-l O •H E 'co C C •H U O JS o u rH CO • 1 — 1 * tH ÍN (_j H i t to 3 -H » . W u co cu •0 co cu 0 o en cu co s C (N rH ü 2 "i (0 O o f— 4 x a s i o

§

(Q 2 1 10 C •rH u .j ^H tj.

1

(0 4-> CU mesurad a Activita t co * r-CN en .,_{ fa to rH <u c 0) x •H cu t-l rfl a (0 CO 4J (0 N 4J •H rH -H 4-1 3 CO 4-> 10 V4 4-) CO J3 3 CO ÇO rH CU T3 co M m ,_( 3 U Q) rH O CO CU M 3 4-1 Le s estru ç £> ubstra t co rH CU "O 4J tO 4J •H rH -H XI 3 rH O co m rH U 0) a 10 T) (0 4-1 -H •H rH V0) 3 Cn C •H > CO o w (0 Ü co 4-> »H 0 E C u v Ü> •H to co co 10 rH C 0) (0 co cu 4-) (0 4J ro M subs t CU T3 ió màxim a Concentra c u • H H H CU r4 3 CU T "í W i — i 0) T! 4J C O t . M in C CU cu T3 10 4J U 0) M •H •o *0 •H U m 4J c Q) m cu M a cu ^ 10 rH CU •o 4J c to 4J rH 3 CO Q) M to 4J O 0) M (0 iH CU •D 4J C cu T! C CU a rH (D •o ^ •H 4J V4 10 a « 4J m rH 3 U rH * U "-V-i (N 0 • rH ÍN (0 • > CN -O - • e -H N C CU rH CU T! VO -H U (0 M 3 4-> 10 observ à s co o c II • co c

(38)

- Donada l'activa p a r t i c i p a c i ó de la u n i t a t -feto-placentària en la síntesi d'hormones esteroides durant la gestació" (83) i l'anteriorment descrita a c t i v i t a t de diferents ADH de mamf-fer en-front d'alguns esteroides (245), s'investiga la possible oxidació d'aquests compostos per part de ")[-ADH. Com es pot observar en la Taula XIX, cap dels esteroides assajats <IX, X, XI, XII i XIII) fou substrat de 1-ADH, malgrat les elevades concentracions ateses, a diferència dels isoenzims catòdics de -fetge humà i de cavall que es revelaren actius en un assaig dut a terme paralelament (els isoenzims catòdics de 1'ADH de cavall oxiden amb e f i c i è n c i a el grup h i d r o x i l en posició" 3 de molècula d'esteroide (245». A i x f m a t e i x , ^-ADH de -fetge presenta molt poca o n u l . l a a c t i v i t a t en-front d'alcohols c í c l i c s com el ciclohexanol (241), amb bona correlació' amb la manca d'oxidació'dels grups h i d r o x i l en els anells de les molècules d'esteroides.

Tampoc es registrà a c t i v i t a t amb el 2-(5-hidroxiindol-3-i1)etanol (5-hidroxi tripto-fol) (XIV), d e r i v a t del metabolisme de la serotonina que, pel contrari, -fou oxidat e f i c i e n t m e n t per l'enzim de -fetge de c a v a l l .

1.8.1.2. Reducció d'aldehids

Per a totes les classes d'isoenzims de 1'ADH humana, l ' a c t i v i t a t màxima per a la reducció dels a l d e h i d s es detecta entre pH 6 i pH 7 (76). Ademes, a pH fisiològic, la kcat per a la reduce ió" dels aldehids és en general de l'ordre de 30 a 100 vegades me's elevada que la d'oxidac ió" del s corresponents alcohols (317, 243). Aquests resultats i m p l i q u e n que la •funció' de l'ADH " i n v i v o " podria ser l'el iminac ió' d'aldehids o cetones endògenes, me's que la d'alcohols. Per tant, s'investiga l'especi-f ic i tat de substrat de ^-ADH en-front de diversos aldehids.

Els resultats obtinguts per a la reduce ió" d'aldeh ids a pH 7,5 es presenten en la Taula XVIII.

(39)

02N

XIX X X X X I

FIGURA 28 Estructures moleculars dels aldehids emprats com a substrats de x~ADHî

octanal (XV), citral (XVI), retinal (XVII), benzal-dehid (XVIII), 3-nitrobenzalbenzal-dehid (XIX), 4-nitroben_ zaldehid (XX), vainillina (XXI).

(40)

x a ço 93 -O •H 43 CU "O rH Cfl Vi co l-l CU o. SC Q < I X ca n ço E D 43 ÇO 4-1 C cu u ÇO Q) "O X n «e CU •O co cu D er •H c •H O en 4-1 C CO ¿J CO c o u x C •H E f— i 1 S E fc¿ j_) co u .ü ¿•-N |~H 1 C •H E N^X 1 j 4-* co ü 4¿ x~^ S E v_/ E Ni O X™ N S E *»_x en 42 4-1 co CU o o vO O f-i O 0 m r— 1 • O co <o • CO c • CN CO • CM C O sj O 00 -o •o •H 43 CU •O rH cu O O 0 0 O O O 0 o ""> m o co T~l o m rH O Sí i— i • • o co CO CO CM VO • sí n c • • sí m co co * • » — i c c rH O O CO r— 1 i— 1 •0 -0 •H -H 43 43 cu cu •O "O rH rH CO CO •O N N •H c: c 43 CU CU OJ 43 43 •O O O f—l r-l • CN • M H H rO 3 •H Vl U co cu •O CQ CU CQ C O Cn cu cn * <S E CN fe tH + Q à z f fO te in r-K a tH fe O o •H T3 X) CQ CO 0

i

4-1 <0 »H CO O «-I V8a E (0 4-1 C o (0 T> (0 Vl 3 CO cu E 4-1 <0 4-1 •H • Cfl •o -H alde h W rH CU •O *0 • H u (0 4-) ÍO Vl n -H 43 (0 rH (0 VI

ft

c cu VI •H o> cu Vl Vl o o CQ cu o c CQ Vl o rH 10 • 00 ÍN • o> •H h (0 rH c cu c cu x •H apar e co 4J <0 N 4-1 •H rH •H 4-> 3 co 4-1 (0 Vl 4J ca 43 3 CO CQ rH CU -a ca Vl ffl rH 3 U cu iH 0 E ca 0) Vl 3 4J U 3 Vl 4J CO 4J (0 Vl 4-1 CO 43 3 CO rH Q) ts 4-1 CO 4-) -H rH •H 43 3

'S

to (0 rH ^_j Q) ft (0 •O ro 4-1 •H E •H rH VCU 3 cr> c •H > CQ O CO (0 u co 4-1 rH O c u • DI •H (0 (0 ca (0 r— { C 0) (0 to cu 4J «3 4-1 (0 Vl 4-1 CQ 43 3 ca cu T) (0 •H X /w ^0 •H CJ (0 Vl 4-1 c • *-^ CTi ro CN cu cu rH r-4 <0 > •H CQ \Q) Vl ¡d cu Vl cu ft 4-1 c Q) E rH •H 4-1 C cu Dl (B T3 <0 4-1 •H iH • H U (0 • co cu •a 4J c o Vl 14-1 d ni \í> > 0) •a írt ÍU 4-1 U OJ M •H •O ^o •H u to 4-1 cu ca cu Vl ft cu Vl <0 rH CU Tl 4J C (0 4-1 rH 3 CO 0) V4 ffl 4-1 U cu Vl (0 rH CU T3 4-1 (U -Ü CU ft rH CU •a Vl •H 4-1 Vl «5 ft (0 4-> (0 rH 3 CJ rH (0 CJ • •H N CU rH 0) 'O vo •H ü (0 Vl 3 4-> (0 to /(O ser v 43 0 CO o

(41)

/ IV. RESULTATS /

Similarment al que succe'ia amb els alcohols al if aties de cadena curta, 1 'acetaldeh id i els altres a l d e h i d s a l i f a t i c s de cadena curta no saturaren l'enzim. La poca s o l u b i l i t a t dels aldehids a l i f à t i c s de cadena llarga, unies per als que possiblement es podria calcular la Km, agreujava la situació", d i f i c u l t a n t la caracterització c i n è t i c a de l'enzim. L'octanal <XV) fou T únic aldehid al i fat i c estudiat que mostrà c i n è t i c a de saturació', amb una Km de 2,2 rnM i una de les m i l l o r s relacions kcat/Km. Recentment, s'ha demostrat que l'octanal é's també el m i l l o r substrat per a les altres classes de 1 'ADH humana, al posseir la constant d'espec if ici tat , kcat/Km, me's elevada de tots els a l d e h i d s assajats (76). En el cas de "3[~ADH, però, la kcat per a l'octanal é's me's baixa si la comparem amb els altres isoenzims (Taules III i

Citral (XVI) i r e t i n a l (XVII), productes de 1 'oxidac \o del geraniol (II) i retinol (IV), respectivament, no foren bons substrats per a ^-ADH. El c i t r a l , degut a la seva poca s o l u b i l i t a t , no arribà a saturar l'enzim i la seva kcat/Km fou 10 vegades més b a i x a que 1a del corresponent aldehid a l i f à t i c , octanal . Amb el r e t i n a l no es detectà a c t i v i t a t . Probablement, el doble e n l l a ç situat en el carboni 2 d'aquestes molècules afavoreix l'oxidació* dels corresponents alcohols, però d i f i c u l t a la reducció' dels a l d e h i d s per part de T[-ADH. Una observació' s i m i l a r h a v i a sigut efectuada per Pietruszko i col. (243) emprant formes catòdiques de 1 'ADH humana enfront d'alcohols de cadena curta. A p a r t i r de l'anàlisi de les kcat dels isoenzims de la classe I per a alguns alcohols i els seus corresponets aldehids, Deetz i col. (7ó) han suggerit que a un alcohol que es bon substrat l i correspondrà un a l d e h i d que també es bon substrat per a la reacció' inversa. Aquesta afirmació' no sembla extrapolable als isoenzims de la classe III, doncs encara que octanol i octanal compleixen la regla, no ho fan a i x f geraniol i c i t r a l .

Amb un a l d e h i d aromàtic, tal com benzaldehid (XVIII) , "¡(."ADH mostra caràcter fst i ques s i m i l a r s a les observades amb el seu alcohol corresponent: no saturació i una baixa rel ac i ó kcat/Km, diferenciant-se clarament dels trets propis dels isoenzims de les classes I i II. Aquests isoenzims tenen en el benzaldehid un dels seus m i l l o r s substrats (Taules

(42)

-107-detectà activitat ADH. Substrat3 [S] max (mM)b Alcohol c m e t a n o l 1.200 2 - ( 5 - h i d r o x i i n d o l - 3 - i l ) e t a n o l 10 5 { 3 - d i h i d r o t e s t o s t e r o n a 1 3 ß h i d r o x i 5 ß a n d r o s t a n --17-ona 0,1 1 7 ß - e s t r a d i o l 0 , 1 1 7 3 - e s t r a d i o l - 3 - s u l f a t 10 e s t r i o l 1 Aldehid o c e t o n a r e t i n a l 0 , 2 v a i n i l l i n a 33 5 ß - d i h i d r o t e s t o s t e r o n a l

a Les estructures moleculars dels possibles substrats apareixen en les

Fig. 27 i 28.

Concentració màxima de substrat atesa en l'assaig. En molts casos vingué limitada per la solubilitat del substrat.

c Assaig realitzat en tampó glicina-NaOH 0,1 M , pH 10,0, NAD+ 1,2 mM.

(43)

/ IV. RESULTATS /

III i IV).

Per altra banda, 1a presencia de grups n i t r o en l'anell benzènic, com en el 3-nitrobenzaldehid <XIX) i 4-nitrobenzaldehid <XX), va afavorir enormement la reducció del grup carboni!, sobretot quan el grup n i t r o es trobi en p o s i c i ó meta. No -fou aixf, però, quan els substituents -foren de naturalesa mè*s hidrof fi ica, com en el cas de la v a i n i l l i n a (XXI), que posseeix una estructura s i m i l a r a la d'alguns a l d e h i d s derivats de catecolamines.

Tampoc es detectà a c t i v i t a t de reducció del grup carbonil en posició" 3 de la cetona 5/3-dihidrotestosterona <IX), que en canvi é"s substrat de l'ADH de -fetge de cavall (245). Aquest resultat està en consonància amb la manca d ' a c t i v i t a t de ^[-ADH en-front de la ciclohexanona <7ó).

1.8.2. Mecanisme c i n è t i c i constant d ' e q u i l i b r i

Donat que ^-ADH d i - f e r i a sign i-f icat i vament dels isoenzims de les classes I i II en el comportament c i n è t i c , semblà interessant investigar el seu mecanisme c i n è t i c . L'estudi es realitzà a pH 7,5 per tal d'obtenir resultats comparables als ja existents per als altres isoenzims. Com a substrats, s'empraren octanol i el seu a l d e h i d corresponent, octanal , parella mes específica per a ^-ADH atenent al valor de Kcat/Km. Malgrat que etanol i a c e t a l d e h i d h a v i e n sigut els substrats mes u t i l i t z a t s en els estudis mecanfstics de les classes I i II <31, 88), no varen poder e"sser emprats en aquest cas, doncs mancaven d'una c i n è t i c a de saturació'.

S'examinaren les propietats c i n è t i q u e s de "^-ADH en l'estat estacionari mitjançant estudis d ' i n h i b i c i ó " creuada i d ' i n h i b i c ió" per producte, u t i l i t z a n t NAD"*" , octanol, octanal i NADH, tal com s'explica a III.2.2.5. Les representacions de Lineweaver-Burk dels valors obtinguts exper¡mentalment apareixen en la F i g . 29. L'anàlisi de l ' a c t i v i t a t en absència de productes, v a r i a n t s i m u l t à n i a m e n t les concentracions de NAD*" i octanol, proporcionà la gràfica de la Fig. 2?a, on les rectes

(44)

-108-ques d'inhibició creuada i d'inhibició per produc_ te de x~ADH amb NAD+, octanol,octanal i NADH.

L' activitat enzimàtica es mesura en tampó fosfat monossòdic 0,1 M, pH 7,5 a 25oc.

a) Cinètica amb variació simultània de les concen_ tracions d"octanol i de NAD+.

b) Cinètica d'inhibició de la reducció del NAD pel NADH. [octanoL] =1,5 mM.

c) Cinètica d'inhibició de l'oxidació de 1"octanol per l'octanal. [NAD+] = 1,2 mM.

(45)

20 30 1/[NAD*](mM)'' 20 40 1/tNAD'HmM)-1 1.0 60 h 1.0 2,0 3.0 1/[octanol] (rnM)-1

(46)

s' intersecten seguint un model de t i p u s m i x t e . En quant als e s t u d i s d ' i n h i b i c i ó per producte, la i n h i b i c i ó de la r e d u c c i ó del NAD*pel NADH, amb una concentració constant d'octanol , resultà de naturalesa c o m p e t i t i v a (Fig. 29b) . En c a n v i , la i n h i b i c i ó de l ' o x i d a c i ó de l'octanol per l'octanal -fou m i x t a (Fig. 29c). No va ser possible obtenir la corresponent representació de la i n h i b i c i ó de la reducció de l'octanal per acció de l'octanol, a causa de la baixa s o l u b i l i t a t d'aquest ú l t i m . No obstant a i x ò , el comportament descrit per a >(-ADH é's consistent amb un mecanisme seqüencial ordenat B i B i , amb unió' pre-ferent del NAD*, s i m i l a r a l'observat en altres -formes de l 'ADH humana (31, 88) i de cavall (9<5, 335).

Basant-se en aquest mecanisme, les dades de la F i g . 29 -foren u t i l i t z a d e s , segons el mètode descrit per Segel (272) per al calcul de les constants c i n è t i q u e s r e c o l l i d e s en la Taula XX. Kia i Ka varen ser calculades de les dades de la F i g . 29a; K i q , de la F i g . 29b; i Kip s'extrapolà de les dades de la Fig. 29c . Kq es calcula a partir de la Kq aparent, o b t i n g u d a amb octanal 4 mM (concentració" no saturant), u t i l i t z a n t l'equació per al mecanisme seqüencial ordenat B i B i (272)

Kq = Kq app . ( l+Kp/[P] )/( 1+Ki q .Kp/Kq . [P]) = concentració d'octanal = 4 mM

Els valors de Kb, Kp , V.) / [E]¿ i V¿/[E]^ h a v i e n sigut obtinguts anteriorment u t i l i t z a n t NAD*1,2 mM o NADH Q, 26 mM.

Les constants de M i c h a e l i s per als coenzims (Ka per al NAD* i Kq per al NADH), a i x f com les constants de d i s s o c i a c i ó dels complexos b i n a r i s E. NAD4" (Kia = kj/K-f) i E. NADH (Kiq = K7/ke) (veure 1. 3. 3.), que apareixen en la Taula XX, són del m a t e i x ordre que els valors p u b l i c a t s per als

isoenzims de les classes I i II (31, 35, 88). En c a n v i , com ja s'ha comentat, les constants de M i c h a e l i s per a l'octanol (Kb) i l'octanal (Kp) son 1.000 vegades superiors a les dels isoenzims de les altres classes, que son de l'ordre de 10-6 M (76, 85, 318). Aquest -fet suggereix una b a i x a a-f i n i t a t de ">[-ADH per als alcohols a l i - f a t i c s p r i m a r i s i a l d e h i d s a l i - f à t i c s , el que -fa suposar l ' e x i s t è n c i a de di-ferènc ies en el

(47)

4-1 Oír-, TD W 4-1 iH

S

> 4-1 • CD 4-1 C C O Q) u e CD 0) •H 4-1 U d) O) TÍ a CD D'Q) M -H CD Q) O <0 W > iH s el vt v£> O CM O ço in K O. 33 n < i x Q) •o ço cu 3 cr •H 4-1 'O) c ço 4-J c ÇO u (O c o o x x «c H o c ço CO + o CO •H n ço -* CM CM O ON O CM O rH O • * • • • * • * O CM O O O CM /V ^^ 1— 1 '-^ I— 1 O rH CO C CO C /-^ CO C ^ ÇO Œ 4J CO W 4J Q u 4-1 n o •< O 0 •< O ^ *~s o Sz ^-/ *~s xi O. cr •H O. O* -H -H Uá íxS b¿ ïa Ua ^ rH 'c 'n B B E c 00 00 in CM ço X*s ^~^ rH —i o n S c CO CO 4-1 4J 0 U 0 o »O »o •H -H ço u •a 3 •H -ri x cu O r4 ^^ *^^ 4-1 4-1 r-t r— t ïï ÏÏ -v^ ^ rH CM > > £>Z Q) TD —H 10 O [ 1 ^^ -1— 1 X tO U Q) C U T3 (0 3 C4-) TI •H ü CU • XI O M — 3 CM co •. to r~ rH rH CM ço O ^-rH C 10 W (0 rH 4-> W Q) • u cu cr> ^ o a cu CM W VD « 4-1 ^ H- (0 CD Q ü C •o < w o C S DI (0 ( 0 0 ) rH C rH CD 0) d) rH 4-1 CO CO U C Q) 4-1 Q) tO d) ÇO 4-)rH T3 Q)" 3 M H CJ (0 ai— ' rH >-l 0)^ tO 3 M :N o ti ><0— rl rH -H Q) d) U W r< CD C ^4-> cu c c 6 O 0) d) o -H e M C U 10 •H « > Xj XI rH E -r) O -H (0 J3 C C (0 rH C -H 4-1 10 d) - U C CD T) O (0 ÇO - 4J Q) COrH ü M 4-1 O a c cu -X (OT3 rH d) 4-1 - CD O d) CD C-H T3 0 U co u m o Q) -O -H 3 CD -H CJ D1 d) X m •H rH O 4-) 4 - 1 - 1 0 Q) d)r-l M C T) T) •H (0 -r( CJ -rl .C }. 1 co --~ d) to 4-1 w a C ^ H to 4-J d) 4-1 co to a CO -H U c rH A: c O Q) d) U (0 10 l-i .CrH -H co u en d) -H CO d) •J S Q) n o (0 U

(48)

seti de - f i x a c i ó del substrat respecte als altres isoenzims de l'ADH.

Per altra banda, com es desprèn de les dades de la Taula XX, la kcat que présenta ^[-ADH a pH 7,5 per a la reducció de l'octanal, 328 min-'', es nome*s unes 5 vegades superior a la kcat per a l'ox idac \6 de l'octanal, 58 min-4. En c a n v i , com ja s'ha dit anteriorment, per als isoenzims de les classes I i II, els valors de kcat per als a l d e h i d s son de 30 a 100 vegades superiors als corresponents alcohols. Aquest ú l t i m -fet s'explica perquè el pas l i m i t a n t de la catàlisi en ambdós s e n t i t s de la reacció es la dissociació" del complex enz im-coenz im, i perquè la v e l o c i t a t de dissociació del complex enzim-NAD* e's mes r à p i d a que la del complex enzim-NADH <7ó). En el cas de ^[-ADH, si es suposa que el pas l i m i t a n t de la reacció és també' la dissoc i ac ió" del coenzim (veure IV. 1.8.1.1.), el seu p e c u l i a r comportament c i n è t i c es p o d r i a e x p l i c a r per la di-ferent relació" develocitats de dissociació dels complexos enzim-coenzim. A i x ò i n d i c a r i a per a 1 ' i soenz im ^-ADH una estructura del seti de - f i x a c i ó del coenzim d i f e r e n t de la dels isoenzims de les altres classes, d'acord amb el que suggereixen Deetz i col. (7<5). Tanmateix, el valor de les constants de dissociació, Kia i K i q , no revela d i f e r è n c i e s substancials amb els altres isoenzims.

Per altra banda, emprant la r e l a c i ó de Haldane <272)

Keq = V< .Kp.Kiq.[H]Vv¿.Kb.Kia

es c a l c u l à el valor de 1a constant d ' e q u i l i b r i a pH 7,5 i a 25*C per a la reacció d'interconversió de l'octanol i l'octanal, que resulti ísser de 1,58 x 10- 4° M. Com en el cas de l ' e q u i l i b r i entre l'etanol i

l ' a c e t a l d e h i d (Keq = 1,0 x lO-^ M (90)), la reducció* de T a l d e h i d és m o l t me's afavorida termodinàmicament que no pas l'ox idac ió" de l'alcohol

(49)

/ IV. RESULTATS /

1.9. L o c a l i t z a c i ó intracel . l u i ar de 1 ' i soenz im

7(-A d i - f e r e n c i a de l '7(-ADH h e p á t i c a que presenta m ú l t i p l e s -formes i soenz imat iques, l 'ADH de placenta esta constitu'ida per un sol isoenzim, pel que es pot determinar la seva l o c a l i t z a c i ó subcel.lular sense ambigüitats, doncs no hi ha p o s s i b i l i t a t de contaminació per part d'altres -formes amb a c t i v i t a t ADH.

Amb aquest objectiu, 20 g de t e i x i t -fresc de p l a c e n t a varen ser homogen i tzats en un aparell Potter S (B. Braun Weisungen AG, Weisungen, R. F. A.), a 1.000 r. p. m. i amb 10 baixades del pistó, en condicions

isotoniques (veure tambe III. 4. 1.2.). La suspensió' es centri-fugà a 100.000 x g durant 1 h. El 98 '/. de l ' a c t i v i t a t ADH i el 90 V. de l ' a c t i v i t a t lactat desh idrogenasa, marcador c i t o s ô l i c , es varen detectar en el sobrenedant, mentre que en el sediment varen a p a r è i x e r el 80 X i ¿5 '/., respectivament, de les a c t i v i t a t s totals monoamino ox i dasa i g1ucosa-6--fos-fatasa, marcadors de les -fraccions m i t o c o n d r i a l i microsomal, r e s p e c t i v a m e n t < v e u r e III. 4. 1.4.).

Aquest primer -fraccionament ens i n d i c a que X~^DH es l o c a l i t z a v a molt probablement en el citoplasma de la cel. l u l a placentería. Aquesta e v i d è n c i a es con-firmà posteriorment quan es va r e a l i t z a r un estudi mes exhaustiu, p a r a l e l a m e n t a la l o c a l i t z a c i ó subcel.lular de 1 'ALDH de placenta (veure IV. 2. 7.).

1.10. Desenvolupament de l ' a c t i v i t a t ADH en el fetge

Una vegada determinada la c a p a c i t a t d'oxidació d'etanol de la placenta a terme i caracteritzat l ' ú n i c isoenzim de 1'ADH present en aquest òrgan, era necessari o b t e n i r una v i s i ó mes d i n à m i c a del metabolisme materno—fetal de l'alcohol en el transcurs d'un determinat p é r i o d e de la gestació. Per una banda era altament interessant completar el treball e-fectuat en placenta amb estudis paraléis sobre la capacitat

(50)

-171-de metabol i tzac ió -171-del -fetge -fetal durant el -171-desenvolupament. Per l'altra banda, c a l i a esbrinar s i , en les primeres etapes de la gestació', la placenta p o d i a jugar algun paper en l ' e l i m i n a c i ó de l'etanol, complementari al del -fetge -fetal. La p l a c e n t a a terme podria posseir una a c t i v i t a t ADH disminu'ida respecte a la placenta en altres estadis de l'embaràs, degut al procés d ' e n v e l l i m e n t so-fert per aquest òrgan (veure I 1.5.1.).

•v

Òbviament, l'obtenció de t e i x i t s fetals i de placentes normals en estadis primerencs de la gestació comportava en l'espècie humana importants problemes ètics. Quan no, el nombre de mostres v à l i d e s per a l'anàlisi era molt l i m i t a t . A i x f , per e x e m p l e , la major part de placentes p r o v i n e n t s de parts prematurs corresponen h a b i t u a l m e n t a mares d i a b è t i q u e s , el que les exclo'ia d'un estudi de la població normal. Es va d e c i d i r , doncs, u t i l i t z a r un model a n i m a l per a aquest t i p u s de recerca. La rata és l'animal u t i l i t z a t en la majoria d'estudis del metabolisme de l'etanol. Recentment, el nostre grup de treball ha p u r i f i c a t i caracteritzat els isoenzims de 1'ADH de rata, d i v i d i n t - e l s en tres classes, cada una amb p r o p i e t a t s anàlogues a la classe corresponent de l'ADH humana (172). Aixf, l'isoenzim ADH-2 de rata posseeix propietats moleculars i c¡nétiques mol t s i m i l a r s a T[-ADH (172) (veure també V.1.ó.) . Malgrat que l'home i la rata son dues espècies que arriben al terme de la

gestació amb d i f e r e n t grau de desenvolupament (269), les comparacions interespecffiques p o d i e n ser de gran ajut per a la consecució del nostre objectiu. A i x f doncs, s'escoli T la rata com a animal model per als estudis de l ' a c t i v i t a t ADH en fetge de fetus i en placenta al l l a r g del desenvolupament. El treball en rata p e r m e t e r i a ademes l ' a n à l i s i d'un gran nombre de mostres de t e i x i t d'una forma ràpida i sistemàtica.

S'estudiaren les a c t i v i t a t s ADH d'un fetge de fetus humà de 6 mesos, i de fetges de fetus de rata dels darrers dies de la gestació, a i x f corn de les seves corresponents placentes. En la Taula XXI apareixen els resultats obtinguts al mesurar l ' a c t i v i t a t ADH amb etanol 33 rnM i amb octanol 1,0 mM, comparant-se amb les a c t i v i t a t s dels fetges d ' i n d i v i d u s adults i amb les a c t i v i t a t s especffiques dels isoenzims anòdics^-ADH

(51)

^ I CO CU m o. ço ço c cu cu oo ço O 4-1 >H CO •a 4-1 •H -H .c > CO -H 0) 4-> •o o CO t-H o en c ai co i-i U J3 o E co •H »o CO -H CO U co ca c t-i CU CO oo a. o e i-> o •o o co •H 4-1 .c • co co co i-i 0) 4J •a co cu l-i -O tH O <U CN C T3 I co tn j-i -H n cu <: N_X Q) E -H A O O .C CÜ •< - E T3 O CO .C 41 CO -CO 4-1 T3 4J C •H 0) 33 > Ü O •H CO «fl 4J i-H I U C*. X CO •H CO CO E CU V -H f-H 00 N 4-1 C cu cu a; •o «w o co 4-J CU -H C T3 cu ca E 4-> i-H co co cu o. c -a 3 ai rH 00 CQ O O Q) > E 3 e o cr Q) .C «H CQ 14-1 CU C -H O Cl) U x x «í H o c co 4-> o o 2? ro n o CO 4J

s «

cu •o oo

í

S O o" o 33 CX CO O te c g co u •H 4-1 U S E oo n o c co 4J w co co w 4-1 CO O OI <M o o r^ cT o o CO t~- CN VO O CM 1^ O o o o o" o" o m oo in O i—H CO C7^ CN m • CM o o m CN CN o <r CM r~- •—i CM m CM r-l·l r-1 -<í co CN o o r- o vO CM O CM oo O O 1-H r- O CM 00 r-l CO i-i vO c E O SC oo. E 1 ^~s co 4-1 C O) CQ 01 E O O £ CQ co r4. <u fl·l "^ g O. 4-1 vO 4J •S ra « ^

^ « 3 *°

D 4-1 CU CO O. C U-i g S « J < CO 4j 4-) I i-l CU <U X OH [t, fe ,, co 4-1 co K 00 E § cu oo 4-1 cu cu •o (^ £3 ex CN \ 33 Q «C 0 CQ CU •H -O i— \ CM •H O CM O i—I co c cu u co i—i P-, CQ CU •H •o O I— 1 CQ 3 4-1 (U 14-1 cu oo 4-1 cu fe CQ CU •H •o i— 1 CM CO 3 4-1 CU «4-1 CU •o cu 00 4-1 cu CO c 3 o c cu 00 4-1 cu 4-J 1—1 3 •o CO cu oo 4-1 cu fe

(52)

d'home i ADH-2 de rata <172). Paral e l a m e n t , es r e a l i t z a r e n a n á l i s i s dels homogenats per el ectro-foresi en gel de midó" (Fig. 30).

El -fetge de -fetus humà presenta un 2 X de l ' a c t i v i t a t del -fetge a d u l t , mesurada amb etanol 33 mM, i un 6 X mesurada amb octanol 1,0 mM. L'electro-foresi r e v e l a la presència de 1 ' i soenz im Y-ADH i dels isoenzims de la classe I, o<o( , o(fa i fitfi¡ . La banda corresponent a ^ßi -fou la mes

intensa, característica d'un -fetus d'edat gestacional avançada (281) (dades no presentades).

En els -fetges de -fetus de rata, tant l ' a c t i v i t a t etanol deshidrogenasa (veure III .2.1.1.2.) com octanol deshidrogenasa (veure 111.2.1 .1.1 . ) s'incrementaren notablement els ú l t i m s dies de la gestació, essent del m a t e i x ordre que les trobades en -fetus humans. A i x f , l ' a c t i v i t a t amb etanol 33 mM passa del 3 X de l ' a c t i v i t a t a d u l t a el dia 19, al 19 X el dia del naixement (dia 22), dades que estan d'acord amb el model de desenvolupament proposat per altres autors (veure I.5.2.).

L'increment en l ' a c t i v i t a t etanol deshidrogenasa durant aquest p é r i o d e del desenvolupament es correlaciona d i r e c t a m e n t amb un augment notable de la i n t e n s i t a t de les bandes catòdiques en l'electro-foresi dels homogenats (Fig. 30). En c a n v i , les bandes anòdiques, de m o b i l i t a t i d è n t i c a a l'isoenzim ADH-2 de -fetge a d u l t , es mostraren i n v a r i a b l e s en la seva i n t e n s i tat.

En p l a c e n t a de rata, només es detecta a c t i v i t a t amb octanol 1,0 mM, no havent-se observat cap d i s m i n u c i ó de l ' a c t i v i t a t ADH durant els darrers d i e s de la gestació, que h a u r i a i n d i c a t una pèrdua en la • f u n c i o n a l i t a t d'aquest òrgan (veure 1.5.I.). Els homogenats de placenta, anàlogament al que succeeix en home, revelaren una ú n i c a banda anòdica en l'electo-foresi de gel de m i d ó i t i n c i ó amb pentanol , de m o b i l i t a t i d è n t i c a a l'isoenzim anòdic present en els -fetges de -fetus i a l'isoenzim ADH-2 de -fetge a d u l t (171).

La relació' entre les a c t i v i t a t s mesurades amb etanol 33 mM i octanol 1,0 mM es r e v e l à una mesura i n d i c a t i v a de la composició isoenzimàti ca de

(53)

FIGURA 30 Electroforesi en gel de midó de 1'ADH de rata a pH 7,6, 720 V, d u r a n t 5 h (veure III.4.3.5.)-1 : Homogenat de fetge adult.

2 : Homogenat de fetges de nadons.

3 i A : Homogenat de fetges de fétus de 20 i 19 dies de gestació, r e s p e c t i v a m e n t .

5, 6 i 7: Homogenats de placentas de 19, 20 i 21 dies de gestació, r e s p e c t i v a m e n t .

ADH-2 i ADH-3 són isoenzims anàlegs : als isoen-de les classes III i I d ' h o m e , r e s p e c t i v a m e n t (172).

(54)

i_ 0) •D re -«-> C (U u Q < O) O)

ï ».

* i

' .J (O ir» ^í ro <N CM I I O ro I

(55)

/ IV. RESULTATS /

les mostres analitzades. A i x f , en placenta i -fetges de -fetus, la r e l a c i ó •fou sempre in-ferior a 1, com succeeix en les preparacions d'enzim pur de 7(-ADH humà i ADH-2 de rata. En els -fetges d ' i n d i v i d u s adults, la r e l a c i ó

•fou sempre superior a 1, i n d i c a n t el p r e d o m i n i de les -formes catòdiques. En el transcurs del desenvolupament, la r e l a c i ó a c t i v i t a t etanol 33 mM/act i v i tat octanol 1,0 mM va anar sempre en augment, r e - f l e c t i n t la progressiva a p a r i c i ó dels isoenzims catòdics, molt actius a baixes concentracions d'etanol (Taula XXI).

(56)

-174-2. ALDEHID DESHI DROGENASA DE PLACENTA HUMANA

2.1. C a p a c i t a t cToxidació d'acetaldehid i de propanal de la p l a c e n t a humana

Foren estudiades 11 placentes humanes a terme, mesurant l ' a c t i v i t a t ALDH dels seus homogenats enfront d'acetaldehid i propanal, a a l t a i

baixa concentració" de substrat (veure III .2.1 .2.2.) i a dos pH diferents, 7,5 i 8,5 (Taula XXII). L ' a c t i v i t a t ALDH total per gram de t e i x i t -fresc •fou de ló,43 mU/g, mesurada amb propanal 13,3 mM a pH 8,5, el que significà unes 50 vegades menys a c t i v i t a t que el t e i x i t hepàtic adult, que presentà per terme m i t j à 870 mU/g de t e i x i t (106). Amb a c e t a l d e h i d 18 mM, l ' a c t i v i t a t fou de 7,14 mU/g de t e i x i t , valor aproximat a les 4,Ió mU/g de t e i x i t detectades per Kouri i col. (181) tambe' en p l a c e n t a humana.

L ' a c t i v i t a t mitjana mesurada a b a i x a concentració d'acetaldehi d, 0,74 mU/g de t e i x i t , fou també s i m i l a r al valor p u b l i c a t per Kouri i col. (0,89 mU/mg de t e i x i t ) (181), v a r i a n t à m p l i a m e n t segons els homogenats i essent pràcticament i n d é t e c t a b l e en alguns d'ells (Taula XXII). Amb propanal 66 jjM, l ' a c t i v i t a t en p l a c e n t a (1,10 mU/g de t e i x i t ) resultà unes 500 vegades menor que en fetge (500 mU/g de t e i x i t ) (106), i n d i c a n t un pobre c o n t i n g u t de la placenta en isoenzims de baixa Km.

Es determinà també" la possible contr ¡buc ió" de l'ALDH present en la sang (veure 1.4.4.1.2. i III.4.2.) a l ' a c t i v i t a t ALDH de la placenta. Amb aquest objecte, es va mesurar l ' a c t i v i t a t ALDH en el plasma i en els e r i t r ò c i t s de la sang d ' i n d i v i d u s adults sans. No es va detectar a c t i v i t a t en el plasma. L ' a c t i v i t a t ALDH en e r i t r ò c i t s fou de 0,038 i 0,051 mU/mg d'hemoglobina, mesurada amb propanal 66 uM i 13,3 mM, r e s p e c t i v a m e n t . Aquesta a c t i v i t a t fou deguda a ALDH II, ú'n i c isoenzim

(57)

QJ S r-i O) CO c ca E 3 -C CO 4-1 C CU U CO I—I ex cu •a CO c CO ex o s-, Q. cu •a T— l ço 4-1 O) u CO •H o CO •a 4-1 CO 4-1 •H O co ex CO u X X CO s-*, 4-1 •H X *rH 0) 4-1 cu -o oo 3 S > — y 4-1 CO 4-1 •H > •H 4-1 O <s m * 00 K ex m •* t~-sc ex *0 •H u CO «J ^-^ 4-12 C S fl\ ^ , lií N^rff CJ C o 0 4-1 CO Vi 4-1 co J3 3 co ro o m o o <t ~cr vo •> v> n r< '-i O -3- O + 1 +1 +1 +1 <r <r co o i— i r- -* i-H r-- o vo •— i i — i .— l vO 00 CN CN CN r~ CO •. n *t v> rH O CN O +1 +1 +1 +1 ^o o r-- o <r sr CN vo <f O O O i — i u U vO CO 43 vO r-l·l CO O f"^ H H » CO O CO O 1 — 1 1 — 1 T3 -O •H -H -C JZ CU 01 rH rH •a -o ca ca rH rH C C CO CO CO CO 4-1 4-1 ex ex 01 0) O O u o v. V4 co ca ex ex a g in •• o Q ¿f f** * O o" rH 33 a s 1—1 ^ 0 EC o (0 2 1 ü •H 73 /O co 4-1 to 4-1 CO 0 4-1 0 Vi •H a o m * r-33 a * sg ro ro 33 O <d 2 1 U •H 73 'O CO 0 C o e 4-1 <o 4-1 Cfl 0 4-1 ^0 a g tO 4J c CU m 73 tO vi 3 CO 01 g 4-1 (0 4-1 •rH > •H 4-1 ü < H M 0) Vi 3 0) > 73 C 3 O Vi en 4¿ U (d XI 4-1 10 4-1 -rH > •H 4-1 ü (0 1— 1 4-1 tO 4-1 O Dl CO CU cu co 1 Vi cu > tO £ Q) 73 CO \0) Vi a Cfl <D 73 4-1 10 Vi 4-1 CO X) 3 CO rH CU 13 \o •H U • rH 73 73 (0 rH n g <d /tO •H o •H C • H CO VO • H ü ü fO cu Vi (0 J • u o m CN (d i c CU u tO rH a rH rH CU 73 to 4J tO C CU Cn 0 O £ CO rH 0) X! g (0 co 4-1 3 DI c •H 4-1 X) O cn Vl 0 r- 1 ro > co 1— 1 01 73 73 Vl tO 73 C /ro -P Cfl CU ^0 •H U tO •H > Cfl Q) 13 + 1 tO C tO •n 4-1 •H g (d i—i \n\j Cfl Cfl 4-1 tO 4J •H > •rH 4-1 U tO Cfl cu j • X-N rl·l• in • i—i CN Cfl 4-1 C cu Vl 0) 4-1 •rH 73 cn cu 4-1 s^. • CN * CN • rH t CN • M M 1— 1 0) Vl 3 01 > N^ * rH 10 4-1 O 4-1 D: Q J < 4-1 tO 4-1 •H > • H 4-1 ü ro rH Vl tO Vl 3 cn OI 6 rO » i 01 a 4-1 ro Vi -P Cfl X! 3 cn cu T3 '0 •H o rt! Vl 4-1 c 0) ü c o u , — í. • CN • CN • rH • CN • H H H 0) Vl 3 0) > g W (0 X •H fO X) 0) 73 33 Q J < • 1— 1 cu 73 cn g •H N C 0) O cn •rH cn rH cu 73 4-> rO 4-> •H > • H -P ü 10 -Vl tO Vl 3 cn cu g tO Vl cu a \o -H U ro Vl 4-1 C 01 0 c o u

Figure

Actualización...

Referencias

Actualización...

Related subjects : Alcohol deshidrogenasa