JULIAN GUILLERMO CRUMP LOMBANA

HEMOGLOBINA LIBRE DE ESTROMA COMO UN TRANSPORTADOR DE OXIGENO INTRAVASCULAR

JULIAN GUILLERMO CRUMP LOMBANA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA

INTRODUCCION

La hemoglobina es la mayor proteína encontrada en la sangre, que es responsable por el transporte de oxígeno. Pero, existen dos grandes razones por las cuales la hemoglobina que es extraída de los glóbulos rojos no puede ser utilizada como transportador de oxígeno intravascular; primero, la hemoglobina se parte en dímeros después de su infusión, por lo tanto es toxica para el organismo y causa vasoconstricción por su tamaño; y la segunda, es que la hemoglobina afuera del glóbulo rojo, no tiene acceso al cofactor 2,3-DPG, que facilita la unión con el oxígeno en los pulmones y su adecuada liberación en los tejidos. Diferentes soluciones de carácter biotecnológico son propuestas en este trabajo. La primera es la reacción con piridoxal 5’ fosfato que es un análogo al cofactor 2,3-DPG y facilita la unión y liberación de oxígeno. La segunda solución es la polimerización de hemoglobina con glutaraldehido para formar polihemoglobina soluble la cual no se parte en dímeros, y como se incrementa el tamaño de la partícula diluida, tanto la presión oncótica ejercida por la hemoglobina es disminuida a niveles normales, como la vasoconstricción es controlada, debido a que la molécula de polihemoglobina ya no es capaz de atravesar la paredes vasculares.

Otra grandiosa característica de este transportador de oxígeno intravascular, es la posibilidad de ser esterilizado, por micro filtración y/o in activación viral, procesos con los cuales se puede remover a los microorganismos responsables del VIH, hepatitis etc. También, como este no posee antígenos de membrana que determinan el grupo sanguíneo, no hay necesidad de tipificación. Esto ahorra tiempo y dinero y facilita transfusiones in-situ. Además, el transportador de oxígeno intravascular puede ser liofilizado y almacenado por largos periodos de tiempo como un polvo seco y estable que puede ser reconstituido con solución salina justo antes de su utilización.

1. OBJETIVOS

Este trabajo de grado fue llevado acabo teniendo como referencia los siguientes objetivos.

1.1. Objetivo global

Diseñar y implementar una metodología para el entrecruzamiento intermolecular e intramolecular de hemoglobina libre de estroma y su caracterización físico-química, para que pueda ser utilizada como un transportador de oxígeno intravascular.

1.2. Objetivos específicos

• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento intermolecular de hemoglobina libre de estroma.

• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento intramolecular de hemoglobina libre de estroma.

• Diseñar e implementar pruebas físico-químicas a la hemoglobina libre de estroma entrecruzada (polihemoglobina)

• Caracterizar la hemoglobina libre de estroma entrecruzada (polihemoglobina).

• Apropiar tecnología de carácter extranjero a las condiciones tecnológicas accesibles en Colombia.

2. MARCO TEORICO

2.1. Transportadores de oxígeno intravascular (Hemosustitutos)

Las ventajas de un hemosustituto que pueda ser almacenado fácilmente y a seguramente en cualquier momento y lugar indiferentemente de la cantidad y el tipo de sangre, son mas que evidentes para cualquier persona. Debido a las diferentes y complejas funciones se la sangre, el pensar en el desarrollo de un sustituto que supla adecuadamente todas las funciones de la sangre, esta lejos de la tecnología de hoy, pero características diferentes pueden ser suministradas por diferentes sustitutos, que al ser combinados pueden hacer las funciones de un hemosustituto. Las funciones de cada componente sanguíneo y su sustituto correspondiente se describen en la tabla 11.

Tabla 1. Funciones de los componentes sanguíneos y sus sustitutos

Componente sanguíneo Función Sustituto

Proteínas

plasmáticas

Albúmina Mantenimiento del volumen sanguíneo Expansor plasmático

Fibrinogeno Factor de coagulación (dextrano, hidroxietil almidón)

Globulina Anticuerpo Antibióticos

Plasma Electrolitos (Na+_{, K}+_{, Ca}2+_{, Mg}2+_{, Cl}-_{, HCO}

3-, HPO42-)

55% Osmoregulador, transporte de CO2 Reaprovisionado electrolítico

Lípidos (ácidos grasos, colesterol, grasa neutra, lecitina)

Nutrición Microesferas lipídicas

Carbohidratos Nutrición Inyección de glucosa

Glóbulo rojo

Hemoglobina Transporte de O2 y CO2 Glóbulo rojo artificial

Células

Anhidrasa

carbónica Acrecentar la eliminación de CO2

45%

Glóbulo blanco Fagocitosis, producción de anticuerpos Antibióticos, agentes

Quimioterapéuticos

Plaquetas coagulación (hemostasis) Coagulantes sanguíneos

Entonces, si un transportador de oxígeno intravascular o un glóbulo rojo artificial son desarrollados, las demandas de los sustitutos sanguíneos serian completamente establecidas.

2.1.1. Areas potenciales de aplicación

“Debido a que los transportadores de oxígeno intravascular persisten en circulación por 30 horas, sus aplicaciones clínicas potenciales, actualmente se ven restringidas a cinco áreas, las cuales son descritas a continuación.” 2

2.1.1.1. Cirugía

“Es especialmente importante en cirugía de bypass cardiopulmonar, trauma, cáncer, ortopedia y otras cirugías de carácter electivo. Por ejemplo, en cirugía traumática el reemplazo de sangre llega hasta 100 unidades en algunos casos, donde un transportador de oxígeno intravascular puede ser utilizado y al final de la cirugía, sangre autóloga puede ser administrada.”2

2.1.1.2. Resucitacion de emergencia por hemorragia traumática

“Ejemplos incluyen accidentes de transito, desastres naturales como terremotos, accidentes aéreos, casualidades civiles y no civiles en conflictos de carácter mayor y menor. En estos casos, un transportador de oxígeno intravascular puede ser utilizado para reemplazar perdida de sangre en shock hemorrágico. Es importante en situaciones donde no hay tiempo y no existen facilidades para la

tipificación sanguínea y la oferta de sangre donada no es la suficiente para suplir las necesidades del momento.” 2

2.1.1.3. Soporte de glóbulos rojos a corto termino para otras condiciones

“Un ejemplo es anemia hemolítica severa. Otro ejemplo es soporte hasta que el transplante de medula ósea o eritropoyetina humana recombinante comienzan sus efectos esperados, además que puede estimular eritropoyesis en la medula ósea. Otro ejemplo es el soporte para tipos sanguíneos atípicos y por lo tanto poco accesibles en los bancos de sangre.” 2

2.1.1.4. Aplicaciones medicas donde los transportadores de oxígeno intravascular pueden ser mas efectivos que los glóbulos rojos

“Transportadores de oxígeno intravascular en solución serian superiores a los glóbulos rojos en perfusión a través de vasos obstruidos. Ejemplos incluyen infarto del miocardio. Los usos potenciales de transportadores de oxígeno intravascular en la preservación de órganos y en esas situaciones donde la hipotermia es usada son otros ejemplos, esto es porque los glóbulos rojos no liberan oxígeno de una manera adecuada a bajas temperaturas, en comparación con los transportadores

de oxígeno intravascular, los cuales pueden ser preparados con un P50 aceptable

a bajas temperaturas.” 2

2.1.2. Disminuyendo los riesgos de infección

Actualmente, el sustituto de la hemoglobina es sangre donada, la transfusión sanguínea a partir de sangre donada puede causar diferentes problemas como hemólisis, coagulación e infección, aunque esto es bien manejado actualmente pero a altos costos. La sangre donada no puede ser esterilizada actualmente, la transmisión de infecciones son posibles todavía con las siguientes probabilidades3:

Tabla 2. Probabilidades de transmisión de diferentes infecciones en unidades de sangre donada4

infección Probabilidad de transmisión

VIH 1/225,000 unidades Hepatitis B 1/200,000 unidades Hepatitis (otras) 1/3,300 unidades HTLV I/II 1/50,000 unidades

Actualmente, una unidad de sangre donada después de todas la pruebas de laboratorio y todos los requerimientos regulatorios son realizados, tiene un costo

3

en el Mercado de aproximadamente US$250, sin incluir las demandas de las personas que recibieron sangre infectada4.

2.1.3. Disminuyendo la carga en el sistema de sangre

“El nivel mínimo de glóbulos rojos en los pacientes antes de realizarles una transfusión ha ido decayendo, debido a la probabilidad y el riesgo de infección. Esto causa una mala oxigenación de los tejidos en pacientes con problemas cardiovasculares o pulmonares, es aquí donde los transportadores de oxígeno intravascular pueden proveer un margen de seguridad mucho mayor para estos y cualquier otro paciente.” 5

“Para administrar sangre antóloga después de una cirugía, se requiere recoger entre 4 y 6 unidades del paciente varias semanas antes de la cirugía, pero, en cirugías mayores de carácter traumático, cardiovascular u ortopédico, el tiempo para la recolección de sangre antóloga no es el adecuado, y por lo tanto el proceso de recolección no puede ser llevado acabo.” 6

En la actualidad, el incremento paulatino de las necesidades para una población en constante aumento y con un mayor tiempo de vida, ha hecho que aumenten las necesidades de tratamientos médicos, donde se incluye la quimioterapia, el

transplante de órganos y la terapia de VIH. Esto ha hecho que los márgenes entre la demanda y la oferta de sangre se haya estrechado a niveles no deseados, sin incluir demandas inesperadas en el sistema de sangre causados por accidentes de transito o aéreos, desastres como terremotos o conflictos armados6, este ultimo, el cual se sufre actualmente en nuestro país Colombia. La posibilidad de escalar a producción en planta industrial un producto como lo es el transportador de oxígeno intravascular, es la solución, no solo disminuiría el margen entre la demanda y oferta de sangre, pero también haría que los costos por unidad de sangre sean menores, no solo por el tipo de producción a gran escala sino también por la eliminación de las pruebas de laboratorio utilizadas para la detección de infecciones. La única pieza faltante es la fuente de hemoglobina necesaria para producción a gran escala, en primera instancia seria de sangre donada vencida, pero otros grupos están trabajando con hemoglobina recombinante, hemoglobina bovina y hemoglobina humana transgénica.

2.1.4. Atributos de un transportador de oxígeno intravascular

“En la tabla 3 se muestran algunos atributos de un transportador de oxígeno intravascular que pueden ser relacionados por su uso cuando se consideren o referencien las posibles aplicaciones en cirugía. El reemplazo es visto como una función primaria y la mejor manera de aparear un “hemosustituto” con su función

5

resultara cuando la necesidad y las propiedades especificas del caso sean determinadas. El nivel de detalle y refinamiento no es obvio actualmente. Mas aún, con la variedad de “hemosustitutos” que están siendo evaluados actualmente no es confiable una comparación debido a que los elementos únicos pueden o no ser conocidos. La función es clara: volumen y entrega de oxígeno. Otros efectos farmacológicos pueden ser evaluadas una vez se tengan documentados y establecidos. Por lo tanto el potencial para posterior refinamiento es real y promisorio.”6

Tabla 3. Algunas propiedades físicas de un

transportador de oxígeno intravascular9

Concentración de hemoglobina Capacidad de transporte de O2

Afinidad de la oxihemoglobina

P50, función alostérica, cooperatividad

Concentración de metahemoglobina

presión osmótica coloidal

Viscosidad pH

Composición Electrolitos, Ca, Mg Tiempo de retención en plasma T1/2

Mecanismo de metabolización Mecanismo de excreción

Aditivos

2.2. Matriz bidimensional de usos de los transportadores de oxígeno intravascular

En la tabla 4 se muestra un modelo de matriz bidimensional de las opciones de un transportador de oxígeno intravascular para usos actuales de donación sanguínea, la “√’ indica las áreas de posible aplicación y la “X” refleja las áreas donde su uso es menos viable.7

Tabla 4. Matriz bidimensional del uso de transportadores de oxígeno intravascular10 CASOS

OPCIONES Preoperativo Intraoperativo Postoperativo Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente Emergencia

Autóloga Predeposito + EPO √ √ X √ √ X √ √ √ Hemodilución: Norvolémica aguda X X X √ √ √ X X X hipovolémica aguda X X X √ √ √ X X X Salvamento intraoperativo X X X √ √ √ X X X Salvamento postoperativo X X X X X X √ √ √

Diluyente para predeposito √ √ X X X X X X X

Alogénica

Tipo y cross match √ √ √ √ √ √ √ √ √

Tipo especifico √ √ √ √ √ √ √ √ √

Donante universal √ √ √ √ √ √ √ √ √

Glóbulos rojos procesados √ √ √ √ √ √ √ √ √

Sangre total X X √ X X √ X X √

Como se puede ver, en un poco mas del 60% de los casos clínicos tratados actualmente, un transportador de oxígeno intravascular es viable, lo que justifica su desarrollo además de las características mencionadas anteriormente.

2.3. Transportadores de oxígeno

Diferentes investigaciones en posibles transportadores de oxígeno, han cerrado el desarrollo a dos sustitutos que son utilizados actualmente y algunos están ya en pruebas clínicas y listos para ser accesibles en el mercado: hemoglobina modificada y perfluorocarbonos, que a diferencia de los glóbulos rojos, estos pueden ser pasteurizados, filtrados o limpiados químicamente como la inactivación viral, par volverlos estériles. Además, como estos no tienen antígenos de grupo sanguíneo, su caracterización no es necesaria. Esto ahorra tiempo y dinero y permite transfusiones in-situ en emergencias reduciendo el tiempo de respuesta, que puede ser clave salvando la vida de una persona herida. Aun mas, estos pueden ser almacenados por mas de un año, comparado con aproximadamente un mes para sangre donada por métodos estándares8, que puede ser aumentado por métodos muy laboriosos y costosos en donde la sangre es congelada para almacenamiento a largo plazo9, este procedimiento es realizado para tipos de sangre raros como B- y AB.

7

Referencia 17

8

2.4. Hemoglobina

“La ecuación de equilibrio para la unión de oxígeno con un material (M), puede ser representada simplemente por:

Como k es la constante de unión al oxígeno, el oxígeno se une con M en una pO2

alta y se disocia de M a pO2 bajas. La presión parcial de oxígeno P50 a la cual la

mitad de las moléculas de M unen oxígeno es usualmente usada para expresar la afinidad del oxígeno con el material M. En el caso de los glóbulos rojos, el material con alta afinidad por el oxígeno es la proteína hemoglobina”.10

Las diferentes investigaciones llevadas a cabo con el fin de encontrar el mayor transportador de oxígeno ha mostrado que ningún material conocido por la humanidad actualmente, transporta oxígeno tan eficientemente como lo hace la hemoglobina, la cual puede ser extraída de los glóbulos rojos. Perutz11 ha llevado a cabo extensos trabajos sobre la función y estructura de la hemoglobina. En una descripción corta, la hemoglobina esta encapsulada dentro del glóbulo rojo con el fin de trabajar durante la circulación sin presentar problemas, el glóbulo rojo tiene

10

Referencia 1pg 9

11

PERUTZ M.F., Proc. R. Soc. Land. B, 1980, 208, 135

b O a b a t cons b a K P M O M K O M bO aM ) ( ] [ ] ) ( ) [( ) ( ) ( 2 2 ) tan ( 2 2 = ⎯→ ← +

en su membrana proteínas, lípidos y colesterol, la suma de estos tres componentes se le conoce como estroma12. La hemoglobina es un tetrámero que consta de cuatro subunidades: dos unidades α y dos unidades β que se encuentran unidas por enlaces no covalentes, que son el resultado de puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals13. Una representación esquemática de la molécula de hemoglobina se muestra en la figura 1.

Figura 1. Representación esquemática de la molécula de hemoglobina14

Cada unidad de globina a consiste de 141 aminoácidos y tiene un peso molecular de 15,126 Daltons, cada subunidad de globina b tiene 146 aminoácidos y tienen

12

Referencia 1

13

un peso molecular de 15,867 Daltons15. Una molécula de hemoglobina pesa 61,986 Daltons.

Cada subunidad contiene un grupo hemo (hierro-protoporfirina IX), que es el sitio de unión del oxígeno, tiene un hierro central con un bajo estado de oxidación (bivalente) que permite la unión reversible del oxígeno.

“Debido a la atmósfera hidrofóbica que se encuentra en el bolsillo de la hemoglobina, el hierro no se oxida a su estado trivalente, y por lo tanto, no pierde su capacidad de unir oxígeno reversiblemente, cuando esto une el oxígeno tan fuertemente que bloquea la transferencia de oxígeno. A este tipo de hemoglobina en su estado trivalente se le conoce con el nombre de metahemoglobina.”16

“La hemoglobina constituye alrededor del 90% de toda la proteína que se encuentra en un glóbulo rojo”17_{. “Un glóbulo rojo puede transportar 23 ml de}

oxígeno por cada 100 ml de sangre, esto es alrededor de 80 veces mas alto que la solubilidad física del oxígeno en el plasma”18. “La hemoglobina esta “oxi”, relajada o en su estado R cuando transporta oxígeno (oxihemoglobina). Para liberar el oxígeno, la hemoglobina conlleva un cambio conformacional con una rotación de 15°, así la molécula esta “deoxi”, tensa o en su estado T (deoxihemoglobina).”17

15 www.msstate.edu/org/MAS/julyjournal/hamil.htm 16 Referencia 1pg 6-8 17 Referencia 3 col. 3 : 33-34

“El cofactor 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) es el causante de este cambio conformacional, debido a sus capacidades alostéricas . Por lo tanto, en presencia de el cofactor 2,3-DPG, la hemoglobina puede liberar oxígeno mas fácil y activamente a mayores tensiones de oxígeno tisular.”19

2.4.1. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo

Dentro del glóbulo rojo, la hemoglobina forma un tetrámero, y la membrana celular retiene el cofactor 2,3 DPG para que pueda interaccionar con la hemoglobina. La concentración de hemoglobina dentro del glóbulo rojo es de 35 g/L (14 g/L en la sangre total) que es posible porque la hemoglobina no ejerce presión osmótica en el plasma fuera del glóbulo, únicamente el glóbulo rojo completo ejerce presión osmótica. Los glóbulos rojos tienen un tiempo medio de vida de alrededor de 100 días20.

“El diámetro de un glóbulo rojo es de 8.5 µm, y la forma geométrica es de una vesícula en forma de disco, bicóncavo, con un grosor mínimo de 1 µm y máximo de 2.4 µm” 21 _{como se muestra en la figura 3.}

18 Referencia 1pg 8 19 Referencia 2 pg 10 20 Referencia 2 pg 11

Figura 2. Representación esquemática de la estructura y función de un glóbulo rojo.22

El volumen total de sangre en una persona es alrededor de 4 litros, lo que implica una cantidad de hemoglobina de aproximadamente 650 g, claramente con diferencias individuales19.

“Un glóbulo rojo encapsula diferentes iónes , reguladores y enzimas, al igual que hemoglobina. Aparte del cofactor 2,3-DPG, el glóbulo rojo transporta anhidrasa carbónica para acrecentar el transporte de dióxido de carbono, superóxido dimutasa y catalasa disminuir la formación de radicales de oxígeno, y sistemas enzimáticos para reducir la formación de metahemoglobina y metabolitos glicolíticos”.19

2.4.2. La hemoglobina como un hemosustituto

Obviamente, la primera reacción en busca del desarrollo de un transportador de oxígeno intravascular es administrar directamente hemoglobina como transportador de oxígeno. Pero la hemoglobina fuera del glóbulo rojo presenta diferentes problemas que se describirán a continuación.

Cuando lo eritrocitos hemolizados son administrados, se ha encontrado que los componentes de estroma son extremadamente tóxicos, resultando en coagulopatía y una falla renal asociada23. “Esto fue solucionado por Rabiner en 1967 cuando preparo una solución de hemoglobina libre de estroma (SF-Hb) por procedimientos de ultrafiltración y centrifugación.”23,24 Inclusive otros problemas aparecen cuando se administra SF-Hb como transportador de oxígeno. Cuando se

22

Referencia 1 pg 8

23

extrae la hemoglobina de su microatmósfera celular, liga oxígeno tan fuertemente que este no es liberado en los tejidos a los niveles requeridos25, esto pasa debido a la ausencia del cofactor 2,3-DPG en el plasma sanguíneo, el cual regula la liberación y unión del oxígeno.

“Además, el tetrámero se dimeriza, donde cada dímero contiene una unidad alfa y una beta, y estos son filtrados rápidamente por los riñones y eliminados del sistema circulatorio. Estos dímeros son tóxicos para los riñones, causan falla renal y tienen un tiempo medio en la circulación de tan solo 2 horas.“26

El oxido nítrico posee un papel importante en el control del tono vascular, su disminución resulta en la vasoconstricción, y su aumento resulta en la vasodilatación. Las uniones intercelulares del endotelio celular permiten que la hemoglobina tetramérica cruce desde la circulación debido a su tamaño. “La hemoglobina tiene también una alta afinidad por el oxido nítrico y actúa como un sifón removiendo oxido nítrico y dando como resultado la vasoconstricción.”27

“La concentración del numero de partículas solubles decide la cantidad de presión osmótica. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo esta separada del plasma y no disuelto en el. Por lo tanto no ejerce presión osmótica. Por el contrario,

25 Referencia 3 col. 4 : 15-18 26 Referencia 2 pg 12 27 Referencia 23

hemoglobina libre cuando es administrada como solución, se comporta como una proteína disuelta en el plasma y cada hemoglobina se comporta como una partícula soluble por lo que incrementa la presión osmótica.”28

“Para mantener el punto isoosmótico del plasma, una solución de hemoglobina a una concentración de 7 g/dl debe ser administrada, reduciendo la capacidad de transporte de oxígeno a la mitad, ya que la concentración normal de hemoglobina es de 14 g/dl.”27

Como se comento anteriormente, la hemoglobina dentro del glóbulo rojo interacciona con superóxido dimutasa y catalasa y con sistemas enzimáticos para reducir la oxidación del hierro central, y entonces, evitar la formación de metahemoglobina. Cuando se administra hemoglobina libre en el plasma, no tiene ningún tipo de interacción con estos compuestos y tiende a formar metahemoglobina.

2.5. Que se puede hacer para solucionar estos problemas

2.5.1. Piridoxilación de hemoglobina libre de estroma

“La afinidad de la hemoglobina es regulada por un fosfato orgánico como el 2,3-DPG. Benesch y Benesch demostraron en 1967, que en la presencia del cofactor 2,3-DPG, la hemoglobina tiene un P50 mas alto. Este fosfato orgánico altamente

aniónico esta presente en los glóbulos rojos en la misma concentración molar que la hemoglobina. La hemoglobina puede entonces puede liberar mas fácil y efectivamente el oxígeno en los capilares que suplen los tejidos.”29

“El sitio de unión del cofactor 2,3-DPG es importante ya que en el se encuentra la base para diferentes modificaciones para formar transportadores de oxígeno intravascular basados en hemoglobina modificada. El bolsillo del cofactor 2,3-DPG es la cavidad central de la deoxihemoglobina, y consiste de tres residuos cargados positivamente en la cadena β: el grupo α-amino, lisina EF6 y la histidina H21. Estos grupos cargados positivamente en al cavidad central de la hemoglobina interactúan con la fuerte y negativamente cargada molécula de 2,3-DPG. De esta manera, el 2,3-DPG estabiliza la estructura cuaternaria de la deoxihemoglobina

28

Referencia 2 pg. 35

29

entrecruzando las monómeros β de la hemoglobina. Esto lleva al equilibrio hacia la forma tensa o T de la hemoglobina”30.

“La perdida del cofactor 2,3-DPG y otros ligandos orgánicos de tipo fosfato, conlleva en soluciones de hemoglobina con una afinidad por el oxígeno mucho mayor que la de la sangre total. La alta afinidad puede ser disminuida por la modificación química de la hemoglobina con piridoxal 5’ fosfato” 31. “Benesch en el año 1975 hizo este importante descubrimiento, y mostró que el piridoxal 5’ fosfato es análogo al cofactor 2,3-DPG, por lo que mejora el P50 de la hemoglobina libre

de estroma.” 32

“Benesch descubrió que una variedad de derivados del piridoxal que contienen un grupo aniónico en la posición 5’ reaccionan con la grupo amino terminal NH2 de la

hemoglobina humana. Sus estudios muestran que el piridoxal 5’ fosfato reacciona con el tetrámero de la deoxihemoglobina para formar una base de Schiff específicamente con el grupo amino terminal NH2 de una cadena β. En la figura 3

se muestra la reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la hemoglobina para formar la polihemoglobina.

30

Referencia 2 pg 24

31

Figura 3. Reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la hemoglobina para formar

polihemoglobina

Esta imina puede ser convertida a la correspondiente y estable amina secundaria por la reducción con borohidruro de sodio dando como resultado un tetrámero monosustituido” 33_{. En la figura 4 se puede ver una representación esquemática de}

la hemoglobina libre de estroma piridoxilada (PLP-SFHb).

2.5.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

Como se explico anteriormente, cuando la hemoglobina es administrada directamente, esta se dimeriza causando falla renal. La principal razón por la cual se polimeriza la hemoglobina es formar una macromolécula, que no se dimeriza, evitando así la falla renal y además, se aumenta su vida media en circulación de 2 a 30 horas. Claramente aumenta su tamaño molecular, previniendo que la nueva macromolécula de hemoglobina cruce las uniones intercelulares del endotelio y retire el oxido nítrico, el cual es el responsable de regular la vasoconstricción. En la figura 5 se muestra una representación esquemática de la hemoglobina polimerizada con un agente bifuncional: cloruro de sebacilo.

Figura 5. Hemoglobina polimerizada con un agente bifuncional (Cloruro de sebacilo).34

33

2.5.2.1. Agentes de polimerización, regulación y terminación del proceso de polimerización

"Los agentes bi- o polifuncionales convenientes para la polimerización deben ser solubles en agua, y reactivos con los sitios de entrecruzamiento de la hemoglobina, para producir un producto polimerizado soluble en agua. Los agentes de polimerización no deben afectar la hemoglobina de una manera adversa como desnaturalizándola, afectando su solubilidad o su función de unir reversiblemente el oxígeno para suplirlo a los tejidos y órganos. Los agentes bi- o polifuncionales tienen al menos dos grupos funcionales , que pueden ser iguales o diferentes. Estos grupos son capaces de reaccionar y entrecruzarse con los grupos amino y otros sitios de entrecruzamiento de la molécula de hemoglobina. Por grupo amino se quiere decir el grupo alfa N-terminal de las cadenas de la hemoglobina, y aquellos de los residuos básicos de aminoácidos como la lisina y la arginina.

Los grupos funcionales del agente de polimerización pueden estar unidos covaléntemente entre ellos o pueden estar separados por un anillo alifático o aromático. Ejemplos de grupos funcionales aromáticos estabilizados son azo y halo activados con un grupo nitro. Estos incluyen compuestos con un anillo heterocíclico con grupos reactivos unidos al anillo. Por ejemplo, triazinas con la formula:

Figura 6. Formula de la triazina.35

Donde R1 es un halógeno como fluor, cloro y bromo, y R2 es un sustituto

nucleofílico como un grupo alifático o aromático, un halógeno, o un alquilo menor de 1 a 8 carbonos, y aminas. Agentes de polimerización que caen dentro de este grupo son 2-amino-4,6-dicloro-s-triazina y cloro-s-triazina. Los agentes de polimerización incluyen agentes estabilizados aromáticos preparados por la diazotación de una diamina aromática, por ejemplo, bencidina y sus derivados con ácido nitroso para producir bis-diazobenzidinas de la formula:

Figura 7. Formula de la bis-diazobencidina.31

Donde R3 es un miembro del grupo que consiste de un enlace covalente, alquileno

de 1 a 5 carbonos, fenileno, éter, sulfona y secamina, R4 es un halógeno o nitro,

R5 es un hidrógeno, nitro, alquilo menor de 1 a 8 carbonos, sulfonato (SO3H) y

carboxilato, y R6 es un halógeno, diazo (-N:N-), isocianato (NCO), e isotiocianato (NCS). Agentes de polimerización representativos de esta formula incluyen bisdiazobenidina 2,2-ácido sulfónico , 4,4’-difluoro-3,3’-dinitrofenilsulfona y difenil-4,4’-diisocianato.

Agentes de polimerización incluyen compuestos de la formula:

Figura 8. 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.36

Donde R7 es un halógeno y R8 un nitro, o un hidrogeno con al menos un nitro en

R8, como el agente comercial halogenado activado 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.

36

Agentes de polimerización también incluyen compuestos de la formula (R9)2C=O

donde R9 es un hidrogeno o un halógeno, y los compuestos de la formula

R10−(CH2)n−R10 donde R10 es el mismo o diferente y n esta entre 1 y 8. los

agentes de polimerización también incluyen compuestos que contienen un grupo funcional unido a cicloalquilos representados por la formula:

Figura 9. Formula del cicloalquilo.37

Donde R10 es igual o diferente, p varia entre 0 y 4, y q varia entre 1 y 4. Los

agentes de entrecruzamiento incluyen compuestos que tienen grupos funcionales unidos a una cadena alifática interrumpida con un grupo no funcional o que tienen grupos no funcionales unidos a la cadena como se representa en los compuestos con formula R10−(CH2)x−R11−(CH2)x−R10 donde R10 es igual o diferente, R11 es

seleccionado del grupo que consiste en un puente de éter, una amina divalente y una sulfona, y x es un alquileno de 1 a 5 átomos de carbono, con cada x igual o diferente. Compuestos representativos del grupo funcional que abarca R10 incluye

isocianato, vinilo, imina, isotiocianato, isocianuro, aldehído, epóxido, cloroformato, tiocloroformato, imido esteres de alquilo menores y tiolactonas de la formula:

Figura 10. Formula de la tiolactona.30

Donde a varia entre 1 y 3. R10 también puede ser un grupo activado formado al

reaccionar ácido carboxílico con haluro de tionilo o haluro de fósforo, o un grupo activado formado al reaccionar una amida o un ester de alquilo del ácido carboxílico con hidracina y después con ácido nitroso para generar el correspondiente grupo activado COR12 donde R12 es un halógeno o una azida. El

grupo activado puede ser formado también reaccionando el ácido carboxílico con N,N'-carbonil diimidazola de la formula R13−N=C=N−R13 donde R13 es igual o

diferente y son un alquilo menor, un cicloalquilo menor, amino alquileno menor, y heterocíclico alquilo menor . R12 puede ser también

Figura 11. Formula de alquilo menor.38

Figura 12. Otra posibilidad para R12.34

Donde n varia entre 1 y 2.

Reactivos para entrecruzamiento disponibles comercialmente abarcados por la formula anterior incluyen divinil sulfona, epiclorohidrina, butadieno diepóxico, etilen glicol diglicil éter, glicerol diglicil éter, dimetil suberimidato dihidrocoloruro, dimetil malonimidato dihicrocloruro, y dimetil adipimidato dihidrocloruro.

Ejemplos de los compuestos que incluyen un grupo funcional isocianato o isotiocianato son los compuestos listados abajo. Adicionalmente, los isocianatos o tioisocianatos pueden ser sintetizados reaccionando un alquilo o aril amina con fosfogén o tiofosfogén. Los isocianatos usados para entrecruzamiento son diisocianatos y reaccionan con el grupo amino libre de la hemoglobina produciendo sitios de unión tipo urea o tiourea. Compuestos típicos incluyen ácido difenil-4,4'-diisotiocianato-2,2'-disulfónico, tolueno diisocianato,

isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4,4'-diisocianato, propileno diisocianato, butileno diisocianato y hexametileno diisocianato.

Ejemplos de agentes de entrecruzamiento que contienen el grupo funcional aldehído o dialdehído incluyen formaldehído, paraformaldehído, ureas activadas de formaldehído como 1,3-bis(hidroximetil)urea, N,N'-di(hidroximetil) imidazolidinona preparadas de la condensación del formaldehído con urea según la formula:

CH2O+R16HN−CO−NHR16 → HOCH2NR16−CO−NR16−CH2OH

Donde R16 es un hidrogeno, alquilo, arilo o un anillo heterocíclico. Otros agentes

de entrecruzamiento tipo dialdehído incluyen aquellos de la formula OCH−R17−HCO donde R17 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de

un enlace covalente y una cadena de alquileno lineal o ramificada de 1 a 8 carbonos. Dialdehídos encontrados dentro de este grupo incluyen gloxal, dialdehído malónico, dialdehído succínico, glutaraldehido, adipaldehído, 3-metilglutaraldehido, propiladipaldehido, dialdehído ftálico, tereftaldehido y aldehído malónico.

Otros agentes de entrecruzamiento incluyen derivados de ácidos carboxílicos y sus residuos de hemoglobina activados in situ para dar un reactivo derivativo de hemoglobina que se entrecruzara con las aminas de otras hemoglobinas. típicos

ácidos carboxílicos utilizados para este propósito tienen la formula CO2H(CH2)nCO2H, y [(CH2)nCOOH]3CH donde n varia entre 1 y 8. Los ácidos

carboxílicos incluyen cítrico, malónico, adípico y succínico. Iniciadores del ácido carboxílico incluyen cloruro de tionilo, carbodiimidas, N-etil-5-fenil-isoxazolium-3'-sulfonato (reactivo K de Woodward), N,N'-carbonildiimidazola, N-t-butil-5-metilisoxazolium perclorato (reactivo L de Woodward), 1-etil-3-dimetil aminopropilcarbodiimda, 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida meto-p-tolueno sulfonato. La reacción de entrecruzamiento cuando se usa un ácido carboxílico se puede representar por la ecuación:

Otros grupos de entrecruzamiento que pueden ser usados son preparados de esteres y tioésteres activados por tiolactonas, hidroxisuccimida ester, esteres de ácidos carboxílicos halogenados e imidatos.

El reactivo de entrecruzamiento puede ser un dialdehído precursor que forma un dialdehído bifuncional en el medio de reacción. Estos precursores incluyen dímero de acroleina o 3,4-dihidro-1,2-piran-2-carboxaldehido que conlleva a un clivaje de anillo en un ambiente acuoso para dar alfa-hidroxi-adipaldehido. Otros precursores, que en hidrólisis producen un agente de polimerización, incluyen 2-etoxi-3,4-dihidro-1,2-piran que produce glutaraldehido, 2-etoxi-4-metil-3,4-dihidro-1,2-piran que produce 3-metil glutaraldehido, 2,5-dietoxi tetrahidrofurán que

Hb H RCON RCOX H RCO ⎯activator⎯ →⎯⎯ ⎯⎯Hb−⎯NH⎯2→ − − 2

produce dialdehído succínico y 1,1,3,3-tetraetoxipropano que produce dialdehído malónico y formaldehído de trioxano. Similarmente, los agentes de polimerización pueden ser preparados por procedimientos de síntesis conocidos como malonaldehído de tetraetil acetal, succinaldehido de dietoxitetrahidrofurán y adipaldehído de la oxidación de ciclohexanodiol.

En la formula anterior, la expresión “un alquileno que varia entre 1 a 8 carbonos” se incluyen cadenas lineales y ramificadas como el metileno, etileno, propileno, isopropileno y hexileno. La expresión “alquilo menor de 1 a 8 carbonos” incluye cadenas lineales y ramificadas como metil, etil, propil, isopropil y hexil.

Las aminas de bajo peso molecular adicionadas al proceso de polimerización para regular el entrecruzamiento o terminarlo, es un agente mono-, di- o multifuncional, preferiblemente una amina primaria de la fórmula R-NH2. La amina debe ser

soluble en solución acuosa para asistir en el mantenimiento de las características de solubilidad de la hemoglobina polimerizada. Aminas de bajo peso molecular típicas utilizadas para desactivar el exceso de agente de entrecruzamiento son glicina, lisina, serina, treonina, alanina, etanolamina, ácido 2-aminoadípico y glutationa. Otros compuestos capaces de desactivar los agentes polimerizantes son terminadores tales como bisulfitos y dioles capaces de desactivar aldehídos,

alcoholes de bajo peso molecular para desactivar ácidos carboxílicos activos, haluros e isocianatos activos, y sulfhidrilos para desactivar epóxidos y vinilos.” 39

2.5.2.2. Que agentes para entrecruzamiento, regulación y terminación serán utilizados

La selección de los agentes de polimerización o entrecruzamiento, regulación y terminación, dependió de su facilidad de adquisición, y que algún tipo de comparación pudiera ser realizada con otros grupos que ya han polimerizado hemoglobina libre de estroma, los grupos de N.P. Kuznetsova40, L.R. Sehgal41, Alza Corporation42 y T.M.S. Chang43,44 usan como agente de polimerización el glutaraldehido y como agente de regulación y terminación la lisina monohicrocloruro, por lo tanto estos agentes serán utilizados en el presente trabajo para que haya manera de comparar con estos otros trabajos. El resultado final es hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada (Poly-PLP-SFHb), un diagrama esquemático puede ser visto en la figura 12.

39 Referencia 7 40 Referencia 8 41 Referencia 9 42 Referencia 7 43 Referencia 2 pg 30-31

Figure 13. Resultado final, hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada.45

2.5.3. Cinética de la reacción de polimerización

2.5.3.1. Definición de la velocidad de reacción

“La velocidad con que se efectúa una reacción química se puede expresar de varias maneras. Se puede expresar como la velocidad de desaparición de los reactivos o como la velocidad de formación de los productos. La polihemoglobina se produce a partir de hemoglobina libre de estroma y glutaraldehido.

HB NH CO CH CO NH HB NH HB H CO CH CO H− −( 2)3− − + − 2 ⎯⎯→ − − −( 2)3 − − − 45 Referencia 2 pg 21

Si el símbolo A representa al glutaraldehido, el valor numérico de la velocidad de reacción –rA, se define como el numero de moles de glutaraldehido que

reaccionan (desaparecen) por unidad de tiempo por unidad de volumen (mol/dm3s).” 46

2.5.3.2. La ecuación general de balance de moles

“Para realizar el balance de moles en un sistema, hay que especificar sus fronteras. El volumen del sistema esta delimitado por estas fronteras. Se realiza un balance de moles de la especie j, que representa la especie química a analizar.

Un balance de moles de la especie j en cualquier instante de tiempo t da la siguiente ecuación:

velocidad de velocidad de velocidad de velocidad de flujo de j hacia generación de j flujo de j desde acumulación el sistema + por reacción - el sistema = de j dentro (moles/tiempo) química dentro (moles/tiempo) del sistema

del sistema (moles/tiempo)

(moles/tiempo)

entrada + generación - salida = acumulación Fj0 + Gj - Fj = dNj/dt

Donde Nj representa el numero de moles de la especie j en el sistema en el

tiempo. Si todas las variables del sistema (p.e. temperatura, actividad catalítica, concentración de la especie química) son espacialmente uniformes dentro de todo el volumen del sistema, la velocidad de generación de la especie j, Gj, es el

producto del volumen de reacción, V, por la velocidad de formación de la especie j, rj. volumen volumen tiempo moles tiempo moles V r Gj j ⋅ ⋅ = ⋅ =

Si se supone que la velocidad de formación de la especie j para la reacción varia con la posición en el volumen del sistema , la velocidad de generación ∆Gj1, en

términos de rj1 y el subvolumen ∆V1 es:

1 1

1 r V

Gj = j ∆

∆

Se pueden escribir expresiones similares para los demás subvolumenes del sistema ∆Vi. La velocidad total de generación dentro del volumen del sistema es la

suma de todas las velocidades de generación de cada uno de los subvolumenes. Si el volumen total del sistema se divide en M subvolumenes, la velocidad total de generación es:

∑

∑

Si se toman los limites apropiados (es decir M → ∞ y ∆V → 0) y usando la definición de integral, se puede rescribir la expresión anterior de la forma:

∫

j r dV

G

Esta ecuación dice que rj es una función indirecta de la posición, puesto que las

propiedades de los materiales que reaccionan (p.e. temperatura, concentración) pueden tener diferentes valores en diferentes puntos del reactor. Ahora si se sustituye esta expresión en la ecuación de balance de moles, tenemos:” 47

dt dN dV r F F j V j j j0 − +

∫

2.5.3.3. Reactor por lotes

“Un reactor por lotes no tiene flujo de entrada ni flujo de salida de productos mientras la reacción se esta efectuando: Fj0 = Fj = 0. El balance general de moles

de la especie j es entonces:

∫

Si la mezcla de reacción es perfectamente homogénea, y por lo tanto no hay variación en la rapidez de reacción en todo el volumen del reactor, en la ecuación de balance de moles rj es constante y la integral de dV es V:” 48

V r dt dN j j =

2.5.3.4. Cinética de reacciones no elementales de polimerización por pasos o también conocida como reacción de condensación

“Un polímero es una molécula formada por unidades estructurales que se repiten llamadas monómeros (p.e. la hemoglobina libre de estroma es el monómero de la polihemoglobina).

La polimerización es el proceso por el cual los monómeros se enlazan por reacción química para formar cadenas largas. Estas cadenas largas diferencian a los polímeros de otras especies químicas y les confiere propiedades y características determinadas que los diferencian entre si. Las reacciones de

48

polimerización se dividen en reacciones por pasos o reacciones de condensación y reacciones en cadena o reacciones de adición. La polihemoglobina es formada por reacción por pasos o condensación. Las reacciones por pasos requieren monómeros bi- o polifuncionales. Los grupos funcionales que reaccionan se encuentran en monómeros diferentes, el grupo amina (NH2) en la hemoglobina y

el grupo aldehído (COH) en el glutaraldehido., que al unirse forman la unidad estructural repetitiva de la polihemoglobina o monómero de polihemoglobina. Para el caso de la polimerización de hemoglobina libre, si hacemos:

CO CH CO R H B NH HB NH R H A − − = = − − = = 3 2 2 1 ) (

Monómero A-R1-B + B-R2-B → A-R1-R2-B

Dímero A-R1-R2-B + A-R1-R2-B → A-(R1-R2)2-B

Trímero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)3-B

Tetrámero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)4-B

A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)4-B

Pentámero A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)5-B

A-R1-R2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)5-B

Hexámero A-(R1-R2)3-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)6-B

A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)6-B

Al hablar del avance de una polimerización por pasos no tiene sentido usar la conversión de monómero como medida, porque la reacción continua aunque se haya consumido todo el monómero., ya que todavía hay grupos funcionales A y B que pueden reaccionar. El avance de la polimerización se mide con el parámetro p que es la fracción de grupos funcionales, A, B, que han reaccionado.

0 0 M M M p= −

Que es la fracción de grupos funcionales A o B que han reaccionado y M es la concentración de grupos funcionales A o B (mol/dm3).

Si suponemos que la velocidad de desaparición es de primer orden con respecto a A y B, el balance de A es: ] ][ [ ] [ B A k dt A d = −

Si la alimentación molar es igual tenemos

∫

∫

Si t0=0 entonces al integrar a ambos lados resulta t akM M M M akt M M M akt M akt M M 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 + = + = + = == −

En términos de la conversión fraccionaria de grupos funcionales, p,

1 1 1 0 + = −p akM t

El grado de polimerización es el promedio numérico es el numero promedio de unidades estructurales por cadena.

p X_n − = 1 1

El peso molecular promedio numérico es el peso molecular promedio de una unidad estructural Ms, multiplicado por el promedio de unidades estructurales de

cadena Xn, mas el peso molecular de los grupos del extremo Mge.” 49

ge s n

n X M M

M = +

2.5.3.5. Determinación de las concentraciones de polímeros en polimerización por pasos

“Para determinar la concentración y fracción molar de los polímeros con cadena de longitud j en términos de la concentración inicial de ARB, M0, la concentración de grupos funcionales que no ha reaccionado (M), la constante de propagación (k) y el tiempo t, entonces sea P1=A-R-B, P2=A-R2-B,...,Pj=A-Rj-B, tenemos:

reacción Leyes de velocidad (1) 2P1 → P2 -r1P1 = 2kP12, r1P2 = -0.5r1P1 = kP12 (2) P1 + P2 → P3 -r2P1 = -r2P2 = r2P3 = 2kP1P2 (3) P1 + P3 → P4 -r3P1 = -r3P3 = r3P4 = 2kP1P3 (4) P2 + P2 → P4 -r4P2 = 2kP22, r4P4 = -0.5r4P2 = kP22 49 Referencia 16 pgs. 354-358

El factor 2 en el termino de desaparición se debe a que hay dos formas en que A y B pueden reaccionar

A - Rn - B

A - Rm – B

Las velocidades de reacción netas de P1, P2 y P3 para las reacciones de (1) a (4) son: 3 2 3 1 2 1 3 2 2 2 1 2 1 2 3 1 2 1 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 1 P kP P kP P kP r r kP P kP kP r r P kP P kP kP r r P P p − − = ≡ − = − = ≡ − − − = ≡

Si se continúan de esta manera se comprobará que la velocidad de formación neta de P1 es

∑

Sin embargo la sumatoria de Pj no es mas que la concentración total de grupos funcionales de A o B, que es M.

M kP

r_P 2 ₁

1 =−

De forma similar, podemos generalizar las reacciones (1) a (4) para obtener la velocidad de formación neta del j-mero, para j ≥ 2.

M kP P P k r j j i j i j 2 1 1 1− =

∑

En un reactor por lotes, el balance de moles de P1 para eliminar M da:

2 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = + − = − = kt M M P despejando t kM M kP M kP dt dP

Al despejar P1, se puede usar rj para despejar sucesivamente Pj

2 0 0 4 0 2 0 2 2 1 2 2 1 1 2 1 1 2 P kt M k M kt M kM M kP kP r dt dP ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + − ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = − = = con P2 = 0 en t = 0, entonces 1 0 0 2 0 0 2 1 1 1 − ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = j kt M kt M kt M M P

Continuando de esta manera se puede generalizar que

1 0 0 2 0 0 1 1 1 − ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = j j kt M kt M kt M M P

Si recordamos que 1 2 0 0 0 ) 1 ( − − = − = j j M p p P entonces M M M p

La fracción molar del polímero con longitud de cadena j es simplemente

M P y_j = j

Recordando que M = M0(1-p), se obtiene

1 ) 1 ( − − = j j p p y

Esta es la distribución de Flory-Schulz.” 50

2.5.3.6. Distribución de pesos moleculares

“Lo que le confiere a un polímero sus propiedades únicas son la concentración de polímero, el peso molecular promedio y la distribución de longitudes de cadena.

En la figura 14 se muestra unas distribución típica de las longitudes de cadena para todos los Pj (j = 1 a j = n).

Figura 14. Distribución típica de pesos moleculares de un polímero

Si dividimos el eje y entre la concentración total de polímero, ∑Pj, ese eje se

convierte en la fracción molar del polímero con j unidades repetidas incorporadas en el, es decir yj.

Los parámetros que se obtienen de la distribución de pesos moleculares de los polímeros y que podemos utilizar para cuantificar la distribución que se muestra en la figura 13 son:

• Los momentos de la distribución

∑

• El momento cero es la concentración total de polímero

∑

• El primer momento esta relacionado con el numero total de unidades de monómero

∑

• El primer momento dividido entre el numero cero de la longitud de cadena media numérica (NACL), µn

∑

∑

Que también se le conoce como el grado de polimerización. Es el numero promedio de unidades estructurales por cadena y también se puede calcular a partir de p Xn n − = ≡ 1 1 µ

• El peso molecular promedio numérico

s n

n M

M =µ

donde Ms es el peso molecular promedio de las unidades estructurales.

• El segundo momento da preponderancia a las cadenas mas largas

∑

• La masa por unidad de volumen de cada especie polimérica es MsjPj. La

longitud de cadena promedio por masa es el cociente del momento 2 entre el momento 1

∑

∑

• El peso molecular promedio por peso es

w s

w M

• El índice de polidispersidad (D) es 2 1 2 0 λ λ λ µ µ = = n w D

Una polidispersidad de 1 implica que todos los polímeros tienen la misma longitud, y una polidispersidad de 3 implica que existe una distribución muy amplia de tamaños de polímero. El valor típico se encuentra entre 2 y 10.” 51

2.5.3.7. Estadísticas de Flory de la distribución de pesos moleculares

“La fracción molar de polímero con longitud de cadena j es

1 ) 1 ( − − = j j p p y

En términos de la concentración de polímero

1 2 0(1 ) − − = = j j j y M M p p P

El peso molecular promedio numérico es

∑

∑

∑

La fracción por peso de polímero con longitud de cadena j es

1 2 2 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 ) 1 ( ) 1 ( 1 ) 1 ( ) 1 ( − ∞ = − ∞ = − − ∞ = ∞ = ∞ = − = − = − − = = = =

∑

∑

∑

∑

∑

El peso molecular promedio por peso es” 52

∑

∑

2.5.3.8. Variaciones en la velocidad de reacción de la polimerización de hemoglobina libre de estroma

La manipulación de las diferentes variables de polimerización, puede tener efectos sobre la velocidad de reacción. Uno de los principales requisitos para el escalado

52

industrial de un proceso, es hacer mas eficiente el proceso con respecto a sus costos y su tiempo de desarrollo, esto hace que el estudio de la cinética de polimerización sea un proceso muy importante en el desarrollo de transportadores de oxigeno intravascular basados en la polimerización de hemoglobina libre de estroma.

2.5.3.8.1. Efecto de la razón molar de hemoglobina a glutaraldehido

La variación en concentración de los dos agentes que hacen parte del proceso de polimerización, el glutaraldehido y la hemoglobina, causan variaciones sobre la velocidad de reacción de la polimerización. Al aumentar la cantidad de glutaraldehido y manteniendo la cantidad de hemoglobina estable, se supone que el proceso de polimerización se ve acelerado, ya que se aumenta la probabilidad de encuentro entre los grupos amino de la hemoglobina y el grupo aldehído del glutaraldehido que causan el entrecruzamiento.

Hay que tener en cuenta que el glutaraldehido es un agente desnaturalizante de la hemoglobina, y que su razón molar con relación a la hemoglobina no puede ser aumentada de manera infinita ya que el efecto deseado seria el contrario, y la polimerización no se llevaría acabo, desnaturalizando la hemoglobina, y haciendo inutilizable el producto de polimerización. Chang, a modificado recientemente el proceso de polimerización aumentando la razón molar de agente de

polimerización a hemoglobina de 16:1 a 17:1 y con una concentración de glutaraldehido de 0.5 M, obteniendo tiempos de polimerización de 5 horas, comparado con tiempos previos de 12 a 18 horas.53,54

2.5.3.8.2. Efecto de la variación del pH

La hemoglobina tiene 44 grupos amino que se encuentran ionizados (NH3+) y

cuatro grupos amino terminales que no se encuentran ionizados (NH2) a pH = 7.4.

los grupos amino no ionizados son los que reaccionan con el glutaraldehido formando la base de Schiff permitiendo el proceso de polimerización.

La hipótesis presentada en este trabajo, es el manejo del pH de la solución de hemoglobina libre de estroma, ya que la velocidad de reacción se puede ver acelerada, al aumentar el numero de sitios activos donde el glutaraldehido puede reaccionar. Al variar el pH de la solución de hemoglobina libre de estroma, los grupos amino que se encuentran ionizados se pueden desionizar y se convierten en un sitio activo de polimerización. La formación de los puentes intermoleculares depende en el numero total de grupos amino reactivos y en particular de su distribución en la superficie de la hemoglobina.

53

Referencia 18

54

Existen limitaciones en el proceso de variación de pH, ya que la hemoglobina conserva su estructura cuaternaria entre pH’s entre 6 y 8, por debajo o por encima de estos valores la hemoglobina se desnaturaliza haciendo inutilizable el producto de polimerización.

2.5.4. Otros procesos utilizados

Durante la producción de la solución de hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada, otros procesos son necesarios, diferentes a los de piridoxilación y polimerización de la hemoglobina, para preparar una adecuada solución de hemoglobina para el siguiente paso.

2.5.4.1. Ultrafiltración

2.5.4.1.1. Definición

“La ultrafiltración es un proceso de membrana a baja presión usado para separar compuestos de alto peso molecular la una línea de alimentación. La ultrafiltración tiene poros de mayor diámetro que la nanofiltración y osmosis reversa y es por lo tanto la menos costosa de las tres. Como resultado, la ultrafiltración requiere de menores elementos de membrana y menores requerimientos de presión para su operación. La ultrafiltración es excelente para separar materiales delicados, como

proteínas, ya que es un método de separación no desnaturalizante. En general, sales y especies de bajo peso molecular pueden pasar a través de la membrana mientras los sólidos suspendidos van aumentando su concentración en el otro lado de la membrana. El flujo tangencial al poro es comúnmente utilizado para la concentración y purificación de proteínas y otras partículas biológicas de suspensiones. La ultrafiltración es capaz de concentrar bacterias, proteínas como la hemoglobina y constituyentes que tiene pesos moleculares mayores a 10,000 Daltons. La ultrafiltración es independiente de la carga de la partícula y es mas concerniente con el tamaño de esta.” 55

2.5.4.1.2. Proceso de ultrafiltración

El proceso es llevado acabo en una unidad de ultrafiltración, que básicamente consta de un medio mecánico que genera presión como bombas de desplazamiento positivo y/o de vacío, y un ultraflitro el cual separa las fases. Esta puede ser llevada acabo en una unidad de diálisis que debe ser bypaseada y ningún tipo de solución de diálisis es puesta en contacto en contraflujo con la solución a ultrafiltrar. El tamaño de poro del ultrafiltro depende en las propiedades de la solución que es ultrafiltrada, y de que se quiere separar en esta solución, lo cual depende del tamaño de la proteína o proteínas a concentrar.

55

http://www.rpi.edu/dept/chem-2.5.4.2. Diálisis

2.5.4.2.1. Definición

“La diálisis es un proceso que separa electrolitos y coloides que se encuentran en disolución, dependiendo de su velocidad de difusión a través de una membrana semipermeable. La solución que debe ser dializada es introducida entre la membrana semipermeable y los electrolitos pasan a través de la membrana que retiene los coloides.” 56

2.5.4.2.2. Proceso de diálisis

Remover el exceso de reactivos es muy importante. Diálisis contra Lactato de Ringer remueve glutaraldehido libre y el exceso de lisina, además que permite que los electrolitos sean ajustados a condiciones y niveles fisiológicos57_{. El proceso de}

diálisis es llevado acabo usando un tubo de membrana de diálisis, como los de celulosa regenerada. Es recomendado permitir una buena relación superficie-volumen para un adecuado proceso de diálisis, para esto, pequeños volúmenes, por ejemplo 10 ml , son colocados en el tubo y dejados en diálisis por lo menos 3 horas, en este tiempo el dializado se equilibra con la solución de diálisis.

eng/BiotechEnviron/Projects00/memfilt/ultrafiltration.htm

56

2.5.4.3. Electroforesis SDS-PAGE

2.5.4.4. Definición

“La base de la separación de proteínas con el procedimiento de SDS-PAGE, es recubrir las proteínas con dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate) para que todas las proteínas tengan una carga uniforme. Por lo tanto la separación es dependiente de tamaño del complejo proteína - dodecil sulfato de sodio. Este detergente aniónico se une fuertemente a la mayoría de proteínas a una razón de 1.4 mg SDS/mg de proteína, dándole a todas la proteínas una carga negativa. El SDS interrumpe todos los enlaces no covalentes y causa que las moléculas se desdoblen. Las partículas cargadas son forzadas a girar hacia el electrodo de carga positiva bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado externamente. Las fuerzas generadas por el campo eléctrico son contrarrestadas por las interacciones con la matriz de gel de poliacrilamida, que actúa como un tamiz. La fuerza generada por el campo eléctrico y la fuerza opuesta generada por la matriz de gel resultan en diferentes tasas de migración para las diferentes proteínas.

Para obtener un campo eléctrico con magnitud y dirección constante a través de un volumen de espacio especifico, dos placas planas de metal son colocadas paralelamente, como se indica en la figura 15. Cuando las terminales de una terminal de poder con un voltaje V son conectadas a estos platos, como se indica

en la figura, un campo eléctrico uniforme E es producido entre los platos. Afuera de estos platos y cerca de los extremos el campo no es uniforme.

Figura 15. Diagrama de una electroforesis55

Por lo tanto, todas las proteínas recubiertas por SDS (cargadas negativamente), migran hacia el ánodo a tasas inversamente proporcionales al logaritmo de su peso molecular. Esto es:

donde r es la tasa de migración y PM es el peso molecular. Las proteínas de bajo peso molecular migran mas rápido que las de mayor peso molecular. El peso molecular es determinado por medio de comparación con estándares de peso molecular. ) log( 1 PM r=

Generalmente la electroforesis en SDS-PAGE es realizado en geles horizontales. Este tipo de electroforesis es un sistema discontinuo compuesto por dos geles diferentes: un gel de separación o inferior y un gel superior o de apilamiento. Los geles se funden con diferentes porosidades, pH’s y fuerzas iónicas.” 58

58

3. METODOLOGIA

3.1. Piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma

La primera modificación realizada a la hemoglobina libre de estroma es la piridoxilación, este proceso, como se explico anteriormente, mejora el P50 de la

hemoglobina libre de estroma entrecruzando intermolecularmente las dos subunidades β de la hemoglobina formando un puente de fosfato entre ellas.

3.1.1. Materiales y equipo

3.1.1.1. Reactivos

• TRIS-HCl buffer (polvo) • NaOH (pellets)

• Glucosa (polvo) • Glutationa

• ácido ascórbico (polvo) • Gas nitrógeno

• Borohidruro de sodio (polvo) • HCl (liquido)

• Agua destilada

3.1.1.1.1. Equipo

• Balanza de peso • pH-metro

• Flujómetro de nitrógeno conectado a un dispersor de burbujas por medio de una manguera.

• Material de laboratorio como pipetas, vasos, erlenmeyers, vasos volumétricos etc. Sus capacidades dependen de la cantidad de hemoglobina libre de estroma a ser piridoxilada.

• Medidor de concentración de hemoglobina. • Agitador magnético con su barra de agitación.

3.1.2. Preparación de soluciones utilizadas

Además de la solución de hemoglobina libre de estroma, se necesita una solución de NaOH 2 M, para ajustar el pH de la solución de hemoglobina al valor deseado. Durante todo el proceso de piridoxilación y polimerización, se puede decir que para una cantidad de 500 ml de hemoglobina libre de estroma, no mas de 30 ml son necesarios generalmente. Por cada mililitro de NaOH 2 M a preparar se pesan 80 mg de NaOH y se añade agua hasta alcanzar un volumen de un mililitro. Se recomienda trabajar con una solución de hemoglobina libre de estroma con una concentración inicial de 18 g/dl, con el fin de que al terminar los procesos de piridoxilación y polimerización la concentración final de hemoglobina este en 14.5 g/dl.

3.1.3. Proceso de piridoxilación

Todo el proceso debe ser llevado a cabo a 4°C, de lo contrario la formación de metahemoglobina será marcada durante el proceso. La solución de hemoglobina libre de estroma es agitada continuamente. Se mide la concentración de hemoglobina con la ayuda de un medidor de concentración de hemoglobina total. Por cada 100 ml de hemoglobina libre de estroma al 18% w/v, se añaden se añaden 1.576 g de TRIS-HCl buffer para obtener una concentración final de 0.1 M. Se ajusta el pH de la solución a 7.4 ya sea con NaOH, HCl o ácido láctico (este

ultimo es preferible). Por cada gramo de hemoglobina presente en la solución, se añaden 17.11 mg de piridoxal 5’ fosfato para obtener una relación molar de 4:1 con la hemoglobina (PM = 61986 Da). Se añade glucosa y glutationa hasta obtener una concentración de 2 g/L, y de ácido ascórbico para obtener una concentración de 1 g/L. Estos se añaden para minimizar la formación de metahemoglobina. Se pueden añadir antibióticos para remover cualquier contaminante, así: 50,000 unidades/L de penicilina, 50 mg/L de gentamicina y 50 mg/L de streptomicina para así garantizar la esterilidad. Se revisa nuevamente el pH y se ajusta a 7.4, nuevamente con NaOH, HCl o ácido láctico. La solución de hemoglobina se desoxigena por 2 horas, se debe tener cierta precaución, ya que la hemoglobina produce espuma durante el proceso de desoxigenado. El enlazado covalente de la hemoglobina con el piridoxal 5’ fosfato se lleva acabo añadiendo 12.206 mg de NaBH4 (96%) por cada gramo de hemoglobina presente en la

solución para obtener una razón molar de NaBH4 a hemoglobina de 20:1, diluido

en un volumen manejable pero mínimo de NaOH 0.001 M, que es preparado diluyendo 2000 veces una parte de NaOH 2 M en agua destilada.

El burbujeo con nitrógeno se continua por otras 12 horas, para que la formación del enlace entre la hemoglobina y el piridoxal 5’ fosfato se lleve acabo. En el apéndice I se muestra un diagrama de flujo del proceso de piridoxilación.

3.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada

La segunda modificación realizada a la ahora hemoglobina libre de estroma piridoxilada, es el entrecruzamiento intermolecular de los tetrámeros de hemoglobina para formar una hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada (Poly-PLP-SFHb). Este proceso previene la dimerización de la molécula de hemoglobina.

3.2.1. Materiales y equipo

3.2.1.1. Reactivos

• Glutationa

• L-lisina monoclorhidrato

• Buffer de fosfato (K2HPO4 y KH2PO4)

• Glutaraldehido (liquido al 25%) • Agua destilada

3.2.1.2. Equipos